致瘫痪的水生有壳类动物中毒由摄取含来自腰鞭毛虫的毒素的鱼，水生 有壳类动物或软体动物引起，由于导致严重的人类疾病，通常导致死亡，目 前成为一个世界范围问题。中毒由致瘫痪水生有壳类动物毒素(PSTs)引起， 其属于原型分子蛤蚌毒素(STX)相关毒素家族。并且，有毒淡水海藻的繁盛 能以相同神经毒素污染供水，可以引起致瘫痪的水生有壳类动物中毒。这种 毒素污染的水会给人，牲畜以及野生动物造成可怕的后果。
PSTs的一般结构如下：

    R1     R2     R3     R4     STX     H     H     H     CONH2     dcSTX     H     H     H     H     B1     H     H     H     CONHSO3 -     B2     OH     H     H     CONHSO3 -     C1     H     H     OSO3 -     CONHSO3     C2     H     OSO3 -     H     CONHSO3 -
    C3     OH     H     OSO3 -     CONHSO3 -     C4     OH     OSO3 -     H     CONHSO3 -     neoSTX     OH     H     H     CONH2     dcNeoSTX     OH     H     H     H     GTX2     H     H     OSO3 -     CONH2     GTX3     H     OSO3 -     H     CONH2     GTX1     OH     H     H     CONH2     GTX4     OH     OSO3 -     H     CONH2
毒素家族可分成3大类：蛤蚌毒素(saxitoxins)，高强活性神经毒素，并 且没有被硫酸酯化；gonyautoxin(GTXs)，为单硫酸酯化；以及N-磺基氨基 甲酰-11-硫酸氢盐(hydrosulphate)C-毒素，其毒性小于STXs或GTXs。
PSTs毒性源自其与电压依赖性钠通道的结合，其阻断钠离子的内流，因 此阻断神经肌肉的传输。这导致呼吸麻痹，目前没有有效的治疗措施。在一 些爆发的致瘫痪的水生有壳类动物中毒事件中，40％以上的受害者已经死 亡。PSTs与河豚毒素具有完全不同的结构，但却结合到钠通道的相同位点 (Hall等，1990)。在一些场合下，河豚毒素可与PSTs一起发生作用，因此 任何用于检测PSTs的分析必须能够将其与河豚毒区分开。
腰鞭毛虫，是PSTs的源头，周期性地形成海藻繁盛，也就是闻名的赤 潮(Anderson，1994)。软体动物，鱼，以及水生有壳类动物，包括有商业意 义或使用水产技术养殖的物种，可能会吞食腰鞭毛虫从而聚集毒素。不可能 检测对每一只海产动物进行检测判断是否包含毒素，因此就存在人类由于不 注意而食用包含毒素的动物的风险。因此就需要监控人类消费的物种中存在 的PSTs，以避免中毒的危险以及预防社会及经济损失。
目前已经知道有超过20种蛤蚌毒素的天然类似物，以及它们对哺乳动 物的毒性。一些天然存在的PSTs列在表1中。
                                                        表1
                                                 一些天然存在的PSTs 俗名 常见文献缩 写                                    系统命名 CAS登记号 蛤蚌毒素 STX 2，6-二氨基-4[[(氨基羰基)氧基]甲基]-3a，4，8，9-四氢-1H，10H-吡咯并 [1，2-c]嘌呤-10，10-二醇，[3aS-(3aα，4α，10aR*)] 35523-89-8 α-蛤蚌毒素醇 (saxitoxinol) 2，6-二氨基-3a，4，9，10-四氢-10-羟基-，α-氨基甲酸酯-1H，8H-吡咯并 [1，2-c]嘌呤-4-甲醇，[3aS-(3aα，4α，10β，10aR*)] 75420-34-7 蛤蚌毒素醇 2，6-二氨基-3a，4，9，10-四氢-10-羟基-，α-氨基甲酸酯-1H，8H-吡咯并 [1，2-c]嘌呤-4-甲醇，[3aS-(3aα，4α，10α，10aR*)] 75352-30-6 新蛤蚌毒素 (Neosaxitoxin) neoSTX 2-氨基-4-[[(氨基羰基)氧基]甲基]-3a，4，5，6，8，9-六氢-5-羟基-6-亚氨基 -1H，10H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-10，10-二醇，[3aS-(3aα，4α，10aR*)] 64296-20-4 Gonyautoxin I GTX I或 GTX1 2-氨基-2-[[(氨基羰基)氧基]甲基-3a，4，5，6，8，9-六氢-5-羟基-6-亚氨基 -9-(氢硫酸酯)-1H，10H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-9，10，10-三醇，[3aS-(3aα， 4α，9β，10aR*)] 60748-39-2 Gonyautoxin II GTX II或 GTX2 2，6-二氨基-4-[[(氨基羰基)氧基]甲基]-3a，4，8，9-四氢-9-(氢硫酸 酯)-1H，10H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-9，10，10-三醇，[3aS-(3aα，4α，9β， 10aR*)] 60508-89-6 Gonyautoxin III GTX III或 GTX3 2，6-二氨基-4-[[(氨基羰基)氧基]甲基]-3a，4，8，9-四氢-9-(氢硫酸 酯)-1H，10H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-9，10，10-三醇，[3aS-(3aα，4α，9α， 10aR*)] 60537-65-7 Gonyautoxin IV GTX IV或 GTX4 -2-氨基-4-[[(氨基羰基)氧基]甲基]-3a，4，5，6，8，9-六氢-5-羟基-6-亚氨 基-9-(氢硫酸酯)-1H，10H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-9，10，10-三醇， [3aS-(3aα，4α，9α，10aR*) 64296-26-0 Gonyautoxin V GTX V， GTX5或B1 氨基甲酸，磺基-，C-[(2，6-二氨基-3a，4，9，10-四氢-10，10-二羟基 -1H，8H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-4-基)甲基]酯，[3aS-3aα，4α，401aR*)] 64296-25-9 Gonyautoxin VI GTX VI， GTX5或B2 氨基甲酸，磺基-C-[(2-氨基-3a，4，5，6，9，10-六氢-5，10，10-三羟基-6-亚 氨基-1H，8H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-4-基)甲基]酯，[3aS-(3aα，4α，10aR*)] 82810-44-4 Gonyautoxin VIII GTX VIII或 GTX8或C2 氨基甲酸，磺基-，C-[[2，6-二氨基-3a，4，9，10-四氢-10，10-二羟基-9-亚 砜(sulfoxy)-1H，8H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-4-yl]甲基]酯，[3aS-(3aα，4α， 9α，10aR*)] 80226-62-6 epi-Gonyautoxin VIII epi-GTX VIII或C1 氨基甲酸，磺基-，C-[[2，6-二氨基-3a，4，9，10-四氢-10，10-二羟基-9-亚砜 (sulfoxy)-1H，8H-吡咯并[1，2-c]嘌呤-4-yl]甲基]酯，[3aS-(3aα，4α，9β， 10aR*)] 80173-30-4
海藻繁盛的发生在全球出现上升的态势，可能是沿海水超营养作用增加 及全球变暖的结果，结果导致致瘫痪的水生有壳类动物中毒或水生有壳类 动物或带PSTs其他生物污染的发生率也上升。例如，单在2000年，在马来 西亚的沙巴就有四人中毒，甲壳类渔业停业四个月。在菲律宾的马尼拉湾， 甲壳类渔业停业数月；在华盛顿州，9人中毒并且5人需要住院治疗，在2000 年Cape Cod和南缅因州的甲壳类渔业也遭停业数月，这两起事件都发生在 美国；2000年5月，新西兰North Island的西海岸的所有甲壳类渔业由于海 藻繁盛，都遭停止，其逼近绿色环绕的(greenlipped)蚌类产区，每年产生价 值8千4百万新元的蚌类；在苏格兰在2000年6月甲壳类渔业被禁止；并 且海藻繁盛导致在南非和中国发生不少致瘫痪的水生有壳类动物中毒事件； 加拿大2000年7月检测到的污染结果，是将3000条养殖的大麻哈鱼(salmon) 消灭。特别是，在美国，在过去的10年内发生了约150起水生有壳类动物 污染事件，导致甲壳类渔业最长达12个月的停顿；在苏格兰的一些地方， 停业达3年之久；1994在摩洛哥，导致4人死亡，74人住院接受治疗；在 菲律宾自1983年已有约1600人中毒，而在1983年之前，几乎没有此类事 件的发生；1997年在印度爆发了一次，导致7人死亡，500人住院接受治疗， 禁止甲壳类渔业导致1000户家庭失去工作。
不幸地，尽管急需简单、耐用及可靠的方法来检测人类食用的海洋生物 的中污染，现有方法却不能令人满意。急需常规的水生有壳类动物检测方法 以保证有毒产品不进入市场(VanEgmond和Dekker，1995)。目前，唯一获得 官方认可的方法是小鼠致死生物分析方法，由官方分析化学家联合会(AOAC) 批准：官方分析方法，959.08E部分，1990。这种方法需要对小鼠腹膜内注 射潜在的毒性生物体例如水生有壳类动物的盐酸提取物，并且观察从注射到 死亡的时间(Sommer和Meyer，1937；Hungerford，1995)。小鼠必须来自小 鼠群体，定期地参考毒素样品对其灵敏度进行标准化，并且样品必须进行稀 释以保证死亡在5～7分钟内发生。该分析方法不人道、昂贵、不普及，由于 动物保护条例也冒着被禁止的风险，特别是在有些国家如欧盟，荷兰和德国。 更值得关注的是小鼠生物分析方法的灵敏度只有180μg STX/1(Johnson和 Mulberry，1966)。
使用灵敏度较差的方法意味着存在着下列严重危险：可能检测不出足 以引起人中毒的PSTs水平。例如，菲律宾的儿童由于食用水生有壳类动物 而死亡，但小鼠致死生物分析表明水生有壳类动物只含40μg STX/100g水 生有壳类动物肉，将由于提取溶剂以及水生有壳类动物的稀释作用考虑在 内，其约等于约200μg。该毒性水平与小鼠致死生物分析的检测限相同。
该问题导致人们致力于开发替代分析方法的尝试，基于
(a)用生物观察的方法检测中毒生物的存在，
(b)利用如DNA探针的方法进行原位检测，或
(c)用生化，生理或化学分析检测海洋生物中的毒素。
一种方法利用阻滞电压门控(voltage-gated)钠通道(VGSC)原理来进行检 测，后者为兴奋细胞中大跨膜蛋白，当其响应细胞电位差的改变而开启的时 候，导致离子通过中孔(central pore)(参见如Doucette等，1997；Jellett等， 1992；Vieytes等，1993)。这些分析都基于放射配体分析方法(Weigele和 Barchi，1978)，可以改成微量滴定板形式，以增加样品通量(Doucette等， 1997)。也可以使用强刺激(hyperstimulated)细胞培养以增加通过钠通道的离 子流量(Jellett等，1992；美国专利5,420,011和5,858,687)。
但是，这些分析方法费用昂贵且技术复杂，需要放射性标记的试剂或细 胞培养。并且对pH波动敏感，因为在pH大于6.7时，PSTs很容易被从离 子通道上替换下来，类似地，也对阳离子浓度敏感，并且，更重要地，由于 它们也能检测河豚毒素，为非特异的方法。这些方法中没有一种方法适合现 场使用。化学分析方法由于下列事实而变得复杂：每种毒素在结构上千变万 化，从强极性到亲脂性，从低分子量到大分子量。而且，那些化学方法需要 用已知毒素的标准样品，且不能用这些方法测量任何一种新的生物活性的 PSTs。因此基于抗体检测或用化学方法如高效液相色谱，质谱，或毛细管电 泳的分析方法不能检测广谱的毒素。
一种简单快速初步纯化(clean-up)水生有壳类动物粗提物的方法与长形 工作台(bench)或桌面(desktop)侧流(lateral flow)免疫色谱分析方法(由Jellett Biotek销售)联用，可以在10分钟内得到初步的结果；但是，需要用液相色 谱-质谱来确证筛选的结果。初步纯化用甲酸铵流动相在适和亲脂性毒素分 离的5cm固相柱上进行，接着用60-90％梯度的四腈(tetranitrile)-2mM甲酸铵 (pH3.5)在Tosoh-Haas酰胺40柱上进行LCMS分析。初步的结果由M. A.Quilliam于2000年9月在国际海产生物技术会议(International Marine Biotechnology Conference，Townsville)上报告。
我们使用了一种不同的方法，所述方法基于已知为亲蛤蚌毒素蛋白的 受体蛋白，无论是在氨基酸序列还是功能特性上与VGSC完全无关，能特异 地与STX结合，但不与河豚毒素结合(Llewellyn和Moczydlowski，1994)。 亲蛤蚌毒素蛋白与STX的结合能力已经用于低通量的放射配体结合分析， 用于检测蓝色绿藻、甲壳类和软体动物中的PSTs(Carmichael等，1997；Negri 和Llewellyn，1998)。该方法利用从亲蛤蚌毒素蛋白中替代3H-标记的STX。 我们已经应用包含亲蛤蚌毒素蛋白的粗制提取物来开发检测PSTs的微量滴 定板分析方法(Llewellyn等，1998；Llewellyn和Doyle，2000)。尽管这种分 析方法提供了高通量、灵敏度和精确性，也具有不受水生有壳类动物提取物 中存在的其他化合物干扰的影响或在从水生有壳类动物提取过程中保持毒 素稳定性所必须酸性pH的影响的优点，但该方法仍然具有需要放射性标记 物的缺点。
分析中使用的亲蛤蚌毒素蛋白是通过在含蛋白酶抑制剂混合液 (cocktail)的缓冲液中匀浆蜈蚣Ethmostigmus rubripes样本得到的粗制品。尽 管这种制备方法可以提供了良好的灵敏度，在试剂的易得性以及制备的规定 及可重复性上仍然存在问题。因此仍然需要一种适合快速，耐用的分析技术， 合适现场使用，例如在捕鱼船上，或在水产养殖场，并且能够检测较宽范围 的STXs。
可以很清楚地理解，尽管这里参考了许多现有的技术公开，但这些参 考并不能形成这样的事实，即这些文献中的任何一种可以形成本领域的共知 知识，无论是在澳大利亚或在其他任何国家。
发明概述
本发明一方面提供了一种检测和/或测量样品中致瘫痪水生有壳类动物 毒素(PST)的方法，包括下列步骤：
1)提供分离的亲蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒素结合位点的片段；
2)将其与样品接触；
3)测量PSTs与分离的亲蛤蚌毒素蛋白的结合；以及
将结合量与样品中PSTs的有无或PST浓度相关联。
分离的亲蛤蚌毒素蛋白，或其片段，可偶联到可检测的标记物或固定 到固相支持物上。可检测的标记可为任何合适的标记，如本领域普通技术人 员理解的那样，可用任何方便的方法偶联到固相载体上。
本发明另一方面提供了测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素(PST) 量的方法，包括下列步骤：
(a)用聚阳离子预处理微量滴定滤板的滤器；
(b)向微孔中加入已知量的标记的亲蛤蚌毒素蛋白，包括用可检测的标 记进行标记的分离的亲蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒素结合位点的片段， 以及怀疑包括致瘫痪水生有壳类动物毒素物质的系列稀释液；
(c)将板孵育足够长时间，以容许存在的任何致瘫痪水生有壳类动物毒 素与标记的亲蛤蚌毒素蛋白结合；
(d)通过孔的滤器吸出每孔中的内容物，以除去除标记的亲蛤蚌毒素蛋 白和其化合物结合以外的组分；
(e)清洗每孔以及滤器以除去残留的未结合的化合物；以及
(f)测量滤器截留的标记的亲蛤蚌毒素蛋白量，
其中标记的亲蛤蚌毒素蛋白结合程度与对照样品对比时，可以显示出 样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素蛋白量。
本发明进一步提供分离的亲蛤蚌毒素蛋白偶联到固相载体上。
本发明更进一步提供分离的亲蛤蚌毒素蛋白用可检测标记物进行标 记。
本发明进一步提供了无脊椎动物亲蛤蚌毒素蛋白的分离方法，包括下 列步骤：
(a)将产生亲蛤蚌毒素蛋白节肢动物的个体在含蛋白酶抑制剂的生理缓 冲液中进行匀浆；
(b)将匀浆液进行低速离心以除去细胞碎片；
(c)将从步骤(b)得到上清进行高速离心；以及
(d)从上清用硫酸铵沉淀出亲蛤蚌毒素蛋白。
所述方法进一步包括下列步骤：
(e)纯化沉淀的亲蛤蚌毒素蛋白。
有利地，亲蛤蚌毒素蛋白用40-60％硫酸铵沉淀。在进行该步骤之前， pH可暂时地降低到5.0以沉淀一些非亲蛤蚌毒素蛋白。
典型地，纯化沉淀的亲蛤蚌毒素蛋白包括下列步骤：
(i)在pH5.0-6.5重新溶解沉淀，离心除去非亲蛤蚌毒素蛋白分子；
(ii)将从(e)得到的上清与亲蛤蚌毒素蛋白结合到其上的基质，如玻璃纤 维聚乙烯亚胺(PEI)载体基质进行接触；以及
(iii)在高盐条件下从基质上洗脱结合的物质。
在步骤(iii)中，亲蛤蚌毒素蛋白典型地用溶解在pH5-9的缓冲液中、浓 度为600mM至饱和的NaCl或KCl洗脱。可以使用多种不同的缓冲液。
任选地，可进行进一步的纯化，例如用
(f)在用100ml 25mM乙酸钠在10mM MES-NaOH，EDTA(pH6.0) 中的溶液进行平衡的肝磷脂琼脂糖(凝胶)上层析，用300～800mM乙酸钠的 MES-NaOH，EDTA(pH6.0)溶液进行梯度洗脱，以及
(g)在用25mM三乙胺pH10.5平衡的PBE 118树脂上进行层析聚焦 (chromatofocussing)，并用Polybuffer 96溶液(包含8.9ml Polybuffer96，1.8ml Pharmalyte 8-10.5)进行洗脱，得到250ml的终体积，pH为8.0。
可以利用大小排阻色谱或在柱上脱盐，例如Amersham PharmaciaBiotech的PD-10柱实现Polybuffer去除以及缓冲液变换。
节肢动物可为任何产生亲蛤蚌毒素蛋白的物种。参见例如Llewellyn 等，1997。优选的节肢动物为蜈蚣，例如Ethmostigmus rubripes，等脚类的 动物(isopod)，例如Oniscus物种，蜘蛛，例如Araneus.c.f.Cavaticus， Xanthid crab，或Clopterygidae家族的昆虫。
更优选节肢动物为蜈蚣，最优选Ethmostigmus rubripes。从该物种分 离的亲蛤蚌毒素蛋白已经被证明可与PST家族所有的结构亚类的PSTs以相 似的亲和力进行结合。节肢动物可以方便地通过降低体温使其麻醉。匀浆可 用任何方便的仪器进行，如Heidolph组织匀浆器。合适的匀浆缓冲液是20mM HEPES-NaOH，pH7.4，含0.5mM EDTA 1μM亮抑肽酶，1μM抑胃酶肽，0.5μM 抑蛋白酶肽，以及1μM苯基甲基磺酰氟。合适地，每克节肢动物材料使用 2ml缓冲液。低速离心可方便在8000g进行10分钟，然后在50,000g高速 离心20分钟。高速离心后的上清液可在液氮中冻存，进一步处理前保存在 80C。
PEI载体基质用常规方法制备，例如将玻璃纤维用0.3％PEI的水溶液 (v/v)孵育至少1小时，通过真空排干(draining)或抽吸(aspiration)以除去PEI。
分离的亲蛤蚌毒素蛋白可用来检测PSTs，用我们已经描述的微量滴定 板分析方法(Llewellyn和Doyle 2000；Lewellyn等，1998)，利用用非放射性 标记物标记的亲蛤蚌毒素蛋白。本领域普通技术人员应该了解合适的标记 物，其包括荧光和化学发光标记，胶体金，胶乳微珠，脂质体封装的染料以 及酶标记，尽管这些标记物由于需要发生酶反应导致信号增强是时间依赖性 的，而显得不太有利。脂质体封装染料可为生物素化或以其他方式标记的， 以促进其在分析中的捕获。使用这些标记每一种的合适检测方法都是本领域 公知的方法。
本发明分离的亲蛤蚌毒素蛋白也有用于制备PSTs纯化、富集或提取的 亲和材料，例如用于怀疑被海藻繁盛污染水的水质测试。例如，分离的亲蛤 蚌毒素蛋白可偶联到合适的固相载体上，其可装填在柱或柱体中。在优选的 技术方案中，固相载体装填在适合连接到注射器的柱体中。本领域的普通技 术人员知道合适的偶联方法及载体，例如溴化氰活化的基质例如琼脂糖；环 氧活化的基质；羧基甲基纤维素酰肼；聚丙烯酰胺酰肼以及环氧乙烷丙烯酸 的珠。PSTs可从亲和材料用小体积(例如1-5ml)的酸，脲或浓缩盐处理而洗 脱下来。
对在实验室中进行的分析，这种初步纯化可在怀疑被PSTs污染物质的 样品分析之前进行。
适合本发明分析或初步富集方法中使用的物质可为组织提取物，例如 从脊椎动物例如鱼或可能吞食PST污染的物质的哺乳动物种类；无脊椎动物 例如软体动物，包括水生有壳类动物或头足类动物(cephalopods)；肉眼可见 的海藻(macroscopic algae)例如海草；微藻类包括藻青菌，腰鞭毛虫等；或细 菌。也可以测试生物体液例如怀疑PST中毒的病人的血，尿或唾液，或水样， 例如怀疑被污染的饮用水供应或来自海藻繁盛区域的水，其可能包含由繁盛 生物释放的溶解毒素。并且，也可以应用包含合成PSTs的样品。
PSTs可从待测的组织中，使用任何合适的水或醇溶剂进行提取；由于 蛤蚌毒素在碱性条件下易于降解，优选溶剂在酸性pH下。任选地提取在升 高的温度下进行。所述方法中使用的特别合适的溶剂是，由Association of Official Analytical Chemists认可的，即0.1N HCl。
有多种特异方法可以进行本发明的分析，下面将描述多种优选的本发 明技术方案。
本发明的一种技术方案提供了一种测量样品中致瘫痪水生有壳类动物 毒素量的方法，包括下列步骤：
(a)用聚阳离子预处理微量滴定过滤板的滤器；
(b)向板孔中加入已知量的可检测标志物标记的亲蛤蚌毒素蛋白，以及 一系列怀疑包括致瘫痪水生有壳类动物毒素的物质的稀释液；
(c)将板孵育足够的时间以容许致瘫痪水生有壳类动物毒素与亲蛤蚌毒 素蛋白的结合；
(d)通过孔的滤器吸出每孔的内容物，以除去除亲蛤蚌毒素蛋白和其结 合的化合物以外的组分；
(e)清洗每一个孔及滤器以除去残留的未结合的化合物；以及
(f)测量滤器保留的标记的亲蛤蚌毒素蛋白量，
其中标记的亲蛤蚌毒素蛋白结合程度，当与对照样品比较的时候，就 可以表示出样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素量。
优选步骤(b)中的样品包括缓冲液，以保持pH的范围为6.5～9，并任选 地也包括氯化物盐类，例如氯化钠或氯化钾，浓度可达500mM。典型地孔 中的总体积为50～350μl，优选100～200μl，更优选150μl。在步骤(c)中，孵 育在0～30℃进行，优选在室温下，至少进行30分钟；孵育优选进行60～120 分钟，更优选90分钟，但可以持续到约8小时。在步骤(e)中，可使用任何 合适的溶液进行清洗，例如用与步骤(b)相同的pH的缓冲液。单次清洗通常 就足够了；但是，每孔典型地清洗2～3次。
依据本发明优选的技术方案，方案使用150μl的总体积，包含20mM MOPS-NaOH(pH7.4)，200mM NaCl，以及1nM标记的STX蜈蚣亲蛤蚌 毒素蛋白，通过滤器吸出之前在室温下(～25℃)孵育90分钟。用180μl冰冷 的水对每孔清洗三次。亲蛤蚌毒素蛋白的最适宜量可以很方便用常规实验来 确定。
本发明进一步提供了一种用来测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素 量的试剂盒，包括
(a)微量滴定板；
(b)依据本发明用可检测标志物标记的亲蛤蚌毒素蛋白；
(c)提取缓冲液，用于从待测试生物体或组织的样品提取测试物质；以 及任选地，
(d)一种富集装置(means)，用来富集提取物中的致瘫痪水生有壳类动物 毒素或去除去可能干扰分析的污染物。
优选的富集方法为柱或柱体，依据本发明所述方法包括偶联有纯化的 亲蛤蚌毒素蛋白的固相载体材料。
本发明进一步提供一种装置，用来测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒 素(PST)量，包括：
固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素结合位点的片段；
将样品与所述固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或其片段的方法接触的装置；
用来测量样品中包含PSTs与所述固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或其片段结 合的装置；以及
用来关联结合量与样品中PSTs有无或PST浓度的方法。
本发明进一步提供一种用来测量样品中致瘫痪水生有壳类动物毒素 (PST)量的装置，包括：
固定的PST；
将样品与所述固定的PST接触的装置；
用来测量加到样品中的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素结合位点的片 段结合与所述固定的PST结合的装置；以及
用来关联结合量与样品中PSTs有无或PST浓度的方法。
典型地使用无脊椎亲蛤蚌毒素蛋白，并且其有利地用上述方法进行纯 化。
所述装置可为生物传感器，因此包括将结合结果转化成电信号的装置。
有利地，可以检测结合后蛋白的质量变化。因此应该意识到，由于亲蛤 蚌毒素蛋白是相对大的蛋白，使用包含蛤蚌毒素结合位点的片段可以实现提 高检测灵敏度的目的。如果使用片段，应该意识到结合后质量的变化将在体 系总质量中占更大的比例。
本发明更进一步提供一种用来富集、纯化和/或提取致瘫痪水生有壳类动 物毒素(PSTs)的方法，包括下列步骤：
提供固定的亲蛤蚌毒素蛋白，或包含蛤蚌毒素结合位点片段；
将怀疑包含PST的样品与所述固定的亲蛤蚌毒素蛋白接触足够长的时 间，以使PST与固定的亲蛤蚌毒素蛋白结合；以及
任选地，从固定的亲蛤蚌毒素蛋白上洗脱结合的PST。
所述方法也可以用来，作为其他方法中的一种，对水生有壳类动物进行 解毒以及纯化水。
本发明也提供将分离的亲蛤蚌毒素蛋白用于制备亲和材料，用来富集、 纯化和/或提取致瘫痪水生有壳类动物毒素。
本发明也提供一种亲和材料，用于富集、纯化和/或提取致瘫痪水生有壳 类动物毒素，其包括偶联有分离和纯化的亲蛤蚌毒素蛋白，或其包含蛤蚌毒 素结合位点片段的固相载体。
有利地固相载体，选自噁唑酮基质，溴化氰活化的基质；环氧活化的 基质；羧基甲基纤维素酰肼；聚丙烯酰胺酰肼以及环氧乙烷丙烯酸的珠。
为了更好的理解本说明书目的，应该清楚地理解术语″包括″方法指″包括 但不限于″。
附图的简单说明
图1为示意性地表示用于检测PSTs有无的诊断测试条的上视图及侧视 图。
图2为示意性地表示另一种诊断测试条；
图3为示意性地表示说明微量滴定板分析PSTs的原理；
图4示意性地显示表面等离子体共振(SPR)传感器的竞争性结合；
图5示意性的表示用于PSTs快速定量的基于亲蛤蚌毒素蛋白的表面等 离子体共振(SPR)传感器；
图6表示实施例3中的结合实验的放射性洗脱图；
图7的条形图显示图6中pH5.0的峰的放射性的特异结合；以及
图8显示实施例3中描述的稳定性测试中的洗脱曲线。
发明详述
本发明现在将通过只参考下列非限制性的实施例以及附图进行详细描 述。
实施1：亲蛤蚌毒素蛋白的纯化
亲蛤蚌毒素蛋白粗品通过对蜈蚣Ethmostigmus rubripes样本在10 mMTris-HCl，0.2mM EDTA(pH7.4)(2×10秒脉冲(bursts)，用Waring blender的最大设置；3ml缓冲液：1g蜈蚣)包含蛋白酶抑制剂的混合液(5 mM EDTA，1μM胃酶抑制剂，1μM抑蛋白酶肽，100μM苯基甲基磺酰基氟) 中匀浆而得到。匀浆液在24,000g离心20分钟后，碎片进行如上所述的再 匀浆、离心。合并两次上清，并将其通过0.2μm醋酸纤维素滤器(Nalgene)。 亲蛤蚌毒素蛋白然后用40～60％硫酸铵从上清中沉淀出来，接着通过重新溶 解在pH5.0-6.5的缓冲溶液中及离心得到包含亲蛤蚌毒素蛋白的上清，从所 述沉淀中除去非亲蛤蚌毒素蛋白分子。
上清用玻璃纤维聚乙烯亚胺(PEI)载体基质处理，后者通过将玻璃纤维 用0.3％PEI的水溶液(v/v)孵育至少1小时以及在真空下除去PEI通过排水 或抽吸进行制备得到。亲蛤蚌毒素蛋白用高盐从基质上洗脱下来，亲蛤蚌毒 素蛋白典型地用NaCl或KCl在从600mM到饱和浓度下，在pH5-9进行洗 脱。
进一步纯化通过在用100ml 25mM醋酸钠(10mM MES-NaOH，EDTA (pH6.0)中)平衡的肝磷脂-琼脂糖(凝胶)进行色谱而实现，用300～800mM 醋酸钠的MES-NaOH，EDTA(pH6.0)溶液梯度洗脱亲蛤蚌毒素蛋白。所述 蛋白然后在PBE 118树脂上进行层析聚焦，用pH10.5的25mM三乙胺平 衡，并且用包含8.9ml Polybuffer 96，1.8ml Pharmalyte 8-10.5的Polybuffer 96溶液进行洗脱，得到终体积为250ml，pH为8.0。用大小排阻色谱或脱 盐柱，例如Amersham PharmaciaBiotech的PD-10柱实现Polybuffer的去除 以及缓冲液交换。
实施例2：纯化的亲蛤蚌毒素蛋白在分析中的应用
a)诊断测试条
本发明使用纯化的亲蛤蚌毒素蛋白来定性检测PSTs的诊断试剂盒是测 试条的形式。试剂盒使用固相基质，或″芯(wick)″，反应在其上发生。试剂 盒在该固相基质的一端有蛤蚌毒素带，使用已知的″印刷″方法。该过程固定 蛤蚌毒素，″印刷″蛤蚌毒素作为流过修饰的亲蛤蚌毒素蛋白(下文将描述)锚 定剂。如果修饰的亲蛤蚌毒素蛋白已经结合测试样品中的PST，那么它就不 能结合与″印刷″的蛤蚌毒素结合，将继续流动，就没有色斑的形成。如果受 试样品中没有PSTs，则修饰的亲蛤蚌毒素蛋白将结合到″印刷″的蛤蚌毒素带 上，形成有色斑点。为了使锚定的亲蛤蚌毒素蛋白产生有色斑点，亲蛤蚌毒 素蛋白偶联到胶体金或有色的胶乳微珠上。原理是胶体金，一种强成色试剂， 当偶联的亲蛤蚌毒素蛋白结合到固定在膜上的STX时候，聚集成人眼可观 察的明显斑点。当其流过蛤蚌毒素的印刷带时，将停滞并聚集，或继续前进， 并不形成人眼可视的斑点。该过程示意性地在图1中来进行了说明。因此这 种分析形式对样品中PSTs的存在提供了定性的″是/否″分析。测试条提供了 阳性对照。
另一个替代的方法是使用脂质体封装的染料。脂质体提供了即时的增 强，并且具有相当大的自动分析的可能性。
实验体系是竞争性受体分析，并由包含包裹染料的蛤蚌毒素/生物素标 记的脂质体的芯试剂以及塑料支撑的硝化纤维素条组成，其以向上的顺序具 有固定的亲蛤蚌毒素蛋白竞争区以及脂质体抗生物素蛋白捕获区(图2)。芯 试剂以及包含未知量PSTs样品的混合物通过毛细管作用沿测试条迁移。在 亲蛤蚌毒素蛋白区，发生与PSTs受体的竞争性结合。未结合的脂质体，与 样品中蛤蚌毒素量成正比，被运载到脂质体捕获区，在该区其被富集。亲蛤 蚌毒素蛋白区以及抗生物素蛋白区的颜色强度可通过视觉上或扫描密度测 定仪(scanning densitometry)进行估计。
固定的亲蛤蚌毒素蛋白量必须尽可能的低以增加检测PST的灵敏度， 但也应足够的浓度，以便于脂质体的视觉检测。
典型的迁移分析需要大约100μL的样品溶液，在少于10分钟内应该 能达到ppb的检测水平，相应于PSTs在低ng范围内的检测限。脂质体为高 度稳定的分子，可以在+4C保存至少1年的时间，在室温可以保存数月。所 述分析很方便用于现场检测，不需要任何特殊的仪器或技能。该试剂盒可包 括单个测试条使用的特殊容器(holder)，其中有便于加入样品以及光学读数的 开口。这种低成本的亲蛤蚌毒素蛋白迁移传感器有利于方便及快速筛选环境 样品并构成PSTs风险评估无可比拟的及可靠的工具。
(b)微量滴定板分析
建立微量滴定板形式的分析方法可以使其满足更复杂的应用，并能得 到定量结果。一种优选的形式是结合抑制分析。将蛤蚌毒素包被到96孔微 量滴定板上。测试样品与标记的亲蛤蚌毒素蛋白混合，并加到96孔板中。 无毒素样品不能阻止标记的亲蛤蚌毒素蛋白与96孔板包被孔表面的蛤蚌毒 素的结合，形成有色区域。包含毒素的样品抑制有色形成，抑制程度与存在 的毒素量成比例。然后用分光光度读板器进行读数并对毒素进行定量。
进一步可能的PSTs定量技术包括高效液相色谱，偶联有柱后 (post-column)氧化体系及荧光检测器。该方法复杂且需要昂贵的PSTs标准 品。但是，通过表面等离子体共振(SPR)方法的灵敏检测，合并高特异基于 亲蛤蚌毒素蛋白的鉴定，克服了色谱技术相关的缺点。
所述装置需要PST，例如蛤蚌毒素偶联到活化的金表面，在分析的过 程中与液体样品接触。SPR传感器检测由在金属液体界面折射率变化引起的 激光反射变化。因此，当蛤蚌毒素偶联到传感器的活化金表面的时候，由亲 蛤蚌毒素蛋白结合诱导折射率发生改变(图4)。在这种PSTs为样品的情况下， 在游离PSTs和结合的蛤蚌毒素之间发生竞争，产生的信号下降值可以定量。
这种流动-注射(flow-injection)受体分析由下列步骤组成：i)试剂泵送及 样品注射系统，ii)混合池(mixing cell)，在这里发生竞争性受体分析以及 iii)SPR传感器，包括流动池及光学装置装置(图5)。该体系可完全自动化， 如BiacoreAB制造的BIACORE 2000。
实施例3：亲和柱制备
通过将亲蛤蚌毒素蛋白连接到固相，其与蛤蚌毒素的结合能力可用来 从液体样品中分离出蛤蚌毒素，所述样品流过亲蛤蚌毒素蛋白连接的固相载 体。由于与蜈蚣亲蛤蚌毒素蛋白的结合为pH依赖的，结合的毒素然后可以 洗脱。
亲蛤蚌毒素蛋白亲和柱的制备
分离的亲蛤蚌毒素蛋白用来制备亲和柱，使用UltralinkTM试剂盒 (PierceChemical Company制造)。所述树脂使用噁唑酮偶联化学，并使用具 有介质快速冲洗特性的惰性半刚性(semi-rigid)树脂。
所述方法按下述步骤进行：
1.硫酸铵沉淀的亲蛤蚌毒素蛋白重新悬浮于Pierce提供的偶联缓冲液 (BupH柠檬酸盐-碳酸盐缓冲液，pH9)中。
2.重新溶解的亲蛤蚌毒素蛋白加到0.15g的3M Emphaze生物载体 介质AB1(Pierce提供)，后者可使树脂水合并使可利用的蛋白结合。树脂膨 胀到1ml。
3.1小时的轻微混合后，树脂和亲蛤蚌毒素蛋白配制品装填到微柱中， 并且树脂沉降。
4.然后用用磷酸盐缓冲液(15mls)洗柱。
5.然后加入4ml终止缓冲液(3M乙醇胺，pH9.0)，在这种缓冲液中轻 微混合树脂2.5小时。
6.然后用15ml磷酸盐缓冲液洗柱。
7.用带孔的圆塞(disk insert)密封树脂上部。
8.用15ml 1M NaCl洗柱
9.用15ml 100mM HEPES-NaOH(pH7.4)洗柱，可以用来测试结合 蛤蚌毒素的能力。
柱结合蛤蚌毒素能力的测试
氚标的蛤蚌毒素(Amersham Pharmacia Biotech)用来测量柱结合蛤蚌毒 素的能力。
3等份发2μl的3H-STX(60nM)计数用闪烁计数器来测量应用到柱的 放射性。这些等份样每分钟包含2113±42记数(cpm)。
200μl的3H-STX(＝211，300cpm-参见上述说明)加到柱上，并流进树 脂中。3H-STX用商品供应的3H-STX(在含2％乙醇0.01M醋酸溶液中)用1 mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)进行150倍的稀释制备得到。柱然后用5ml 100 mM HEPES-NaOH(pH7.4)洗。收集流出的液体。柱然后依次用5ml的下列 溶液洗，分别收集每一种洗脱的样品：
      第二次洗(2nd wash)100mM HEPES-NaOH(pH7.4)
      第三次洗100mM HEPES-NaOH(pH7.4)
      100mM HEPES-NaOH(pH6.0)
      100mM HEPES-NaOH(pH5.0)
      0.001N HCl
      0.005N HCl
      0.01N HCl
      0.05N HCl
      0.1N HCl
      0.5N HCl。
洗脱放射性描述在图6中。
可以看出，有两个放射性主峰。在第一级分中的第一个洗脱液基本上未 结合柱的物质。第二峰用100mM HEPES-NaOH pH5.0洗脱。氚标的蛤蚌毒 素包含游离氚，因此这两个峰通过测量其与两个已知的蛤蚌毒素受体，即钠 通道及亲蛤蚌毒素蛋白结合的能力，来测试其生物活性。
从亲蛤蚌毒素蛋白柱洗脱峰生物活性的测量
分析条件是：
钠通道：100mM MOPS-NaOH(pH7.4)，100mM氯化胆碱，100μl 的组分1和5(洗以及分别用第一次pH7.4洗，pH5.0洗)，10μl包含钠 通道的大鼠脑囊(vesicles)，终体积为250μl。样品制备成双份；也设置阴性 对照，包含过量的非标记的河豚毒素，用来进行确定任何结合的3H-STX特 异水平。
亲蛤蚌毒素蛋白：100mM MOPS-NaOH(pH7.4)，100mM氯化钠， 100μl的级分1和5(洗以及分别第一次pH7.4洗，pH5.0洗)，1.5μl表征 的蜈蚣亲蛤蚌毒素蛋白配制品，终体积为250μl。样品制备成双份；也设置 阴性对照，包含过量的未标记的蛤蚌毒素，用来确定的任何结合的3HSTX 特定水平。
从图7中可以看出，只有pH5.0的放射性的柱洗脱峰保留生物活性，即 其可与两个已知的蛤蚌毒素受体结合。pH7.4峰不包含任何这种生物活性(除 了亲蛤蚌毒素蛋白分析中最少量的受体结合活性)表明放射性为未掺入到蛤 蚌毒素中的氚所导致(商品供应3H-STX的已知性质)。
初处理后柱稳定评价
用最终的0.5N HCl洗后，柱用20ml的100mM HEPES-NaOH(pH7.4) 洗，4℃保存过夜。移出该柱并恢复到室温，重复上述洗脱实验，得到图8 中的曲线图。
可以看出，有活性的第二峰迁移到洗脱用HEPES-NaOH(pH7.4)进行的 第3次冲洗的洗脱，表明亲蛤蚌毒素蛋白有降解。这些峰没有进行生物活性 测试。
因此可以理解亲蛤蚌毒素蛋白可以结合到固相色谱树脂上，如Pierce 的Emphaze生物载体介质AB1。在该柱上蛤蚌毒素可被亲蛤蚌毒素蛋白结 合并与其它物质分离(如游离的氚)，然后蛤蚌毒素可用pH5.0的缓冲液从柱 上洗脱下来。洗脱的蛤蚌毒素保留生物活性。用酸(如0.5N HCl)处理可能会 裂解连接的亲蛤蚌毒素蛋白。处理后的树脂的3H-STX非特异保留作用不明 显。
对本领域普通技术人员而言很明显的是：尽管本发明为了说明清楚和 便于理解，进行了详细的描述，也可以对上述描述的技术方案和方法的进行 一些修改和改变，只要不偏离本说明书中公开的发明观点的范围。
上述引用的参考文献都列在下页，引入作为参考文献。
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