FKPA的纯化及其用于生产重组多肽的用途
阅读：1001发布：2021-07-12
专利汇可以提供FKPA的纯化及其用于生产重组多肽的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了以极高的纯度 水 平生产FKBP型肽基脯 氨 酰基顺反异构酶(FkpA)多肽的方法。还提供了超纯FkpA及其使用方法，例如用于 免疫测定 法以显示从细菌中产生的 生物 制剂中去除FkpA。另外，本发明提供了纯化过表达一种或多种分子伴侣的细菌中产生的多肽(例如多特异性 抗体 )的方法。方法包括亲和层析法、混合模式层析法和疏水相互作用层析法。在一些方面，本发明提供了基本上不含产物特异性杂质的多肽(例如多特异性抗体)组合物。，下面是FKPA的纯化及其用于生产重组多肽的用途专利的具体信息内容。
1.一种从包含FkpA多肽的细胞裂解物中纯化FkpA多肽的方法，所述方法包括
a)通过离心澄清细胞裂解物，
b)将包含FkpA多肽的澄清的细胞裂解物施加到阳离子交换层析材料，
c)从阳离子交换层析材料洗脱FkpA多肽以产生包含FkpA多肽的阳离子交换洗脱液，d)将包含FkpA多肽的阳离子交换洗脱液施加到疏水相互作用层析法(HIC)材料，e)从HIC材料洗脱FkpA多肽以产生HIC洗脱液，
f)将包含FkpA多肽的HIC洗脱液施加到尺寸排阻层析法，
g)从尺寸排阻层析法中洗脱FkpA多肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中包含FkpA多肽的裂解物为约pH6.0。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中阳离子交换层析材料是强阳离子交换剂。
4.如权利要求3所述的方法，其中强阳离子交换剂包含磺丙基。
5.如权利要求4所述的方法，其中磺丙基与交联的琼脂糖连接。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在洗脱之前在25mM2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)中洗涤阳离子交换材料。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中使用盐梯度从阳离子层析材料中洗脱FkpA。
8.如权利要求7所述的方法，其中盐梯度是线性梯度。
9.如权利要求8所述的方法，其中盐梯度是9个柱体积的从约25mM MES，300mM NaCl至
25mM MES 300mM NaCl的0-30％的梯度。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中将阳离子交换洗脱液收集在级分中。
11.如权利要求10所述的方法，其中在疏水相互作用层析法之前，通过尺寸排阻层析法分析级分。
12.如权利要求11所述的方法，其中选择包含至少约25％FkpA的级分用于进一步纯化。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中HIC材料包含丁基部分。
14.如权利要求13所述的方法，其中丁基部分与交联的琼脂糖连接。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中在HIC之前将阳离子交换洗脱液调整为包含约0.6M硫酸钠和约50mM PO4，约pH 7。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中在洗脱之前，用40mM磷酸盐、300mM硫酸钠，pH7.0洗涤FkpA结合的HIC材料。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中使用水从HIC材料中洗脱FkpA。
18.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中将HIC洗脱液收集在级分中。
19.如权利要求18所述的方法，其中汇集包含FkpA的级分。
20.如权利要求19所述的方法，其中汇集包含至少约25％FkpA的级分。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中尺寸排阻层析材料包含交联的琼脂糖和葡聚糖的球形复合物。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中尺寸排阻流经液收集在级分中。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中在尺寸排阻层析法之前浓缩HIC洗脱液。
24.如权利要求23所述的方法，其中在尺寸排阻层析法之前浓缩HIC洗脱液约6倍至约
10倍。
25.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其中汇集包含FkpA的尺寸排阻级分。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中FkpA多肽是大肠杆菌FkpA多肽。
27.如权利要求26所述的方法，其中FkpA多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
28.如权利要求27所述的方法，其中FkpA多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少约80％的同一性。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中FkpA在细胞中表达。
30.如权利要求29所述的方法，其中细胞是原核细胞。
31.如权利要求29或30的方法，其中细胞是大肠杆菌细胞。
32.如权利要求29-31中任一项所述的方法，其中细胞被工程化以表达比FkpA的内源表达更高水平的FkpA。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中使用微流化器裂解细胞。
34.一种包含通过权利要求1-33中任一项的方法纯化的FkpA多肽的组合物。
35.一种包含纯化的FkpA多肽的组合物，其中所述组合物包含至少约98％的单体FkpA多肽。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述组合物包含少于约2％的低分子量物质。
37.如权利要求35或36所述的组合物，其中所述组合物包含不多于约5％的高分子量物质。
38.如权利要求35-37中任一项所述的组合物，其中通过尺寸排阻层析法检测单体FkpA多肽的百分比。
39.如权利要求38所述的组合物，其中所述组合物包含少于约5％、约4％、约3％、约
2％、约1％的杂质。
40.如权利要求39所述的组合物，其中杂质相对于FkpA是高分子量和/或低分子量多肽物质。
41.如权利要求39或40所述的组合物，其中杂质是大肠杆菌蛋白(ECP)、FkpA的聚集体、FkpA的片段、核酸或细胞培养基组分中的一种或多种。
42.如权利要求34-41中任一项所述的组合物，其中FkpA对一个或多个冻融循环稳定。
43.如权利要求42所述的组合物，其中FkpA对三次冻融循环稳定。
44.如权利要求34-43中任一项所述的组合物，其中通过层析法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳或蛋白印记分析中的一种或多种测量组合物中FkpA多肽的纯度。
45.如权利要求34-44中任一项所述的组合物，其中通过高效液相层析法(HPLC)测量组合物中FkpA多肽的纯度。
46.如权利要求34-45中任一项所述的组合物，其中通过尺寸排阻层析法(SEC)测量组合物中FkpA多肽的纯度。
47.如权利要求34-44中任一项所述的组合物，其中通过使用荧光成像或银染色的SDS凝胶电泳测量组合物中FkpA多肽的纯度。
48.如权利要求47所述的组合物，其中通过凝胶电泳鉴定物质的存在来鉴定组合物中非FkpA多肽的存在，所述物质通过蛋白质印迹分析显示不与抗-FkpA抗体发生免疫反应。
49.如权利要求48所述的组合物，其中通过由蛋白质印迹分析的比天然FkpA分子量大的物质的存在来鉴定组合物中FkpA多肽的聚集体的存在。
50.一种用于产生特异性结合FkpA的抗体的方法，包括将动物暴露于或免疫于包含通过权利要求1-33中任一项的方法纯化的FkpA的组合物。
51.一种用于产生特异性结合FkpA的抗体的方法，包括将动物暴露于或免疫于权利要求34-49中任一项的组合物。
52.如权利要求50或51所述的方法，还包括从动物中收集血清，其中所述血清包含特异性结合FkpA的抗体。
53.如权利要求52所述的方法，其中血清包含特异性结合FkpA的多克隆抗体。
54.如权利要求52或53所述的方法，其中从血清分离一种或多种单克隆抗体。
55.如权利要求50-54中任一项所述的方法，其中动物是山羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
56.一种包含特异性结合FkpA的多克隆抗体的组合物，其中所述多克隆抗体通过将动物免疫于包含通过权利要求1-33中任一项的方法纯化的FkpA的组合物产生。
57.一种包含特异性结合FkpA的多克隆抗体的组合物，其中所述多克隆抗体是通过将动物免疫于权利要求34-49中任一项所述的组合物产生。
58.如权利要求56或57所述的组合物，其中从动物的血清收集多克隆抗体。
59.一种包含特异性结合FkpA的单克隆抗体的组合物，其中所述单克隆抗体通过将动物免疫于包含通过权利要求1-33中任一项的方法纯化的FkpA的组合物产生。
60.一种包含特异性结合FkpA的单克隆抗体的组合物，其中所述单克隆抗体通过将动物免疫于权利要求34-49中任一项的组合物产生。
61.如权利要求56-60中任一项所述的组合物，其中所述动物是山羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
62.一种用于纯化特异性结合FkpA的抗体的方法，包括使包含抗-FkpA抗体的权利要求
56-61中任一项的组合物与硫酸铵接触至约60％的硫酸铵终浓度、离心溶液、去除上清液并将沉淀物溶解在磷酸盐缓冲液中。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述磷酸盐缓冲液包含约pH7.0的约50mM磷酸钠。
64.一种用于纯化特异性结合FkpA的抗体的方法，包括
a)使包含抗-FkpA抗体的权利要求56-61中任一项的组合物与硫酸铵接触至约60％的硫酸铵终浓度、离心溶液、去除上清液和将沉淀物溶解在磷酸盐缓冲液中以产生抗-FkpA抗体溶液；
b)将抗-FkpA抗体溶液施加到亲和层析材料，
c)从亲和材料中洗脱抗体以产生包含抗-FkpA抗体的亲和洗脱液；和
d)使硫酸铵上清液进行尺寸排阻层析法，和
e)从尺寸排阻层析法收集包含纯化的抗体的级分。
65.如权利要求64所述的方法，其中磷酸盐缓冲液包含约pH 7.0的约50mM磷酸钠。
66.如权利要求64或65所述的方法，其中亲和层析材料包含与层析介质连接的FkpA。
67.如权利要求66所述的方法，其中层析介质是交联的葡聚糖。
68.如权利要求66或67所述的方法，其中通过权利要求1-33中任一项的方法纯化FkpA。
69.如权利要求66或67所述的方法，其中FkpA来源于权利要求34-49中任一项的组合物。
70.如权利要求66-69中任一项所述的方法，其中FkpA与层析介质共价连接。
71.如权利要求66-70中任一项所述的方法，其中连接FkpA至使用甘油可控孔度玻璃(甘油基-CPG)的与层析介质。
72.如权利要求64-71中任一项所述的方法，其中从亲和柱洗脱抗-FkpA抗体。
73.如权利要求64-72中任一项所述的方法，其中尺寸排阻层析材料包含交联的琼脂糖和葡聚糖的球形复合物。
74.如权利要求73所述的方法，其中交联的琼脂糖和葡聚糖的球形复合物的分离范围为分子量10,000道尔顿至600,000道尔顿的分子。
75.如权利要求64-74中任一项所述的方法，其中将尺寸排阻流经液收集在级分中。
76.如权利要求75所述的方法，其中汇集包含抗-FkpA抗体的尺寸排阻级分。
77.如权利要求64-76中任一项所述的方法，其中抗体是多克隆抗体。
78.如权利要求64-77中任一项所述的方法，其中根据权利要求50-55中任一项的方法制备抗体。
79.如权利要求64-78中任一项所述的方法，其中少于约1％的抗体特异性结合非FkpA化合物。
80.通过权利要求62-79中任一项的方法纯化的分离的抗-FkpA抗体。
81.一种用于定量样品中FkpA的方法，包括使用检测系统检测样品中的FkpA和将样品中检测到的FkpA的量与一种或多种浓度的超纯FkpA参照标准的检测比较。
82.如权利要求81所述的方法，其中超纯FkpA参照标准包含至少约95％、约96％、约
97％或约98％的单体FkpA多肽。
83.如权利要求81或82所述的方法，其中超纯FkpA参照标准通过权利要求1-33中任一项的方法制备、或包含权利要求34-49任一项的FkpA组合物。
84.如权利要求81-83中任一项所述的方法，其中检测系统是免疫测定法。
85.如权利要求84所述的方法，其中免疫测定法包含特异性结合超纯FkpA参照标准的抗体。
86.一种用于分析重组多肽样品的FkpA的存在和/或量的方法，包括使用免疫测定法检测样品中的FkpA和将样品中检测到的FkpA的量与一种或多种浓度的超纯FkpA参照标准的检测比较。
87.如权利要求86所述的方法，其中超纯FkpA参照标准包含至少约98％的单体FkpA多肽。
88.如权利要求86或87所述的方法，其中通过权利要求1-33中任一项的方法制备超纯FkpA参照标准。
89.如权利要求84-88中任一项所述的方法，其中免疫测定法包含特异性结合超纯FkpA的抗体。
90.如权利要求89所述的方法，其中特异性结合超纯FkpA的抗体是多克隆抗体。
91.如权利要求89或90所述的方法，其中特异性结合超纯FkpA的抗体用作免疫测定法中的捕获抗体。
92.如权利要求89-91中任一项所述的方法，其中特异性结合超纯FkpA的抗体用作检测抗体。
93.如权利要求92所述的方法，其中检测抗体与检测试剂缀合。
94.如权利要求89-93中任一项所述的方法，其中检测试剂是辣根过氧化物酶。
95.如权利要求89-94中任一项所述的方法，其中特异性结合FkpA的抗体包含在权利要求56-61中任一项的组合物中或如权利要求50-55中任一项的方法制备。
96.如权利要求81-95中任一项所述的方法，其中FkpA是大肠杆菌FkpA。
97.如权利要求81-96中任一项所述的方法，其中样品包含宿主细胞中制备的重组多肽。
98.如权利要求97所述的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌细胞。
99.如权利要求97或98所述的方法，其中宿主细胞过表达FkpA。
100.如权利要求81-99中任一项所述的方法，其中样品是细胞裂解物。
101.如权利要求81-100中任一项所述的方法，其中样品获自重组多肽制剂，并且其中已经使重组多肽制剂进行一个或多个层析法纯化步骤。
102.如权利要求101的方法，其中重组多肽制剂是最终纯化的产物。
103.如权利要求81-102中任一项所述的方法，其中包含在重组多肽样品中的重组多肽是抗体或免疫粘附素。
104.如权利要求103所述的方法，其中抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。
105.如权利要求103或104所述的方法，其中重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
106.一种用于检测样品中的FkpA的免疫测定方法，其中所述样品从来自宿主细胞系的重组多肽制剂获得，所述方法包括：
(a)使结合FkpA的捕获抗体与样品接触从而产生样品-捕获抗体组合物质；
(b)使结合FkpA的检测抗体与样品-捕获抗体组合物质接触；和
(c)检测与样品-捕获抗体组合物质结合的抗体。
107.如权利要求106所述的方法，还包括使用标准滴定曲线定量结合的检测抗体水平。
108.如权利要求107所述的方法，还包括基于结合的检测抗体水平计算样品中存在的FkpA的量。
109.如权利要求108所述的方法，其中通过将标准滴定曲线与用超纯FkpA组合物产生的标准滴定曲线比较确定样品中存在的FkpA的量。
110.如权利要求109所述的方法，其中超纯FkpA组合物包含至少约98％的单体FkpA多肽。
111.如权利要求109或110所述的方法，其中通过权利要求1-33中任一项的方法制备组合物中的超纯FkpA。
112.如权利要求106-111中任一项所述的方法，其中捕获抗体特异性结合超纯FkpA。
113.如权利要求106-112中任一项所述的方法，其中检测抗体特异性结合超纯FkpA。
114.如权利要求112或113所述的方法，其中特异性结合超纯FkpA的抗体是多克隆抗体。
115.如权利要求106-114中任一项所述的方法，其中结合FkpA的第二检测抗体缀合辣根过氧化物酶。
116.如权利要求106-115中任一项所述的方法，其中根据权利要求50-55中任一项的方法产生多克隆抗体。
117.如权利要求106-116中任一项所述的方法，其中免疫测定法是夹心测定法。
118.如权利要求117所述的方法，其中夹心测定法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
119.如权利要求106-118中任一项所述的方法，其中FkpA是大肠杆菌FkpA。
120.如权利要求106-119中任一项所述的方法，其中来自宿主细胞系的重组多肽制剂获自大肠杆菌。
121.如权利要求120所述的方法，其中宿主细胞系表达外源FkpA。
122.如权利要求106-121中任一项所述的方法，其中样品是细胞裂解物。
123.如权利要求106-122中任一项所述的方法，其中样品获自重组多肽制剂，并且其中重组多肽制剂已经进行一个或多个层析法纯化步骤。
124.如权利要求123所述的方法，其中重组多肽制剂是最终纯化的产物。
125.如权利要求106-124中任一项所述的方法，其中包含在重组多肽制品中的重组多肽是抗体或免疫粘附素。
126.如权利要求125所述的方法，其中抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。
127.如权利要求125或126所述的方法，其中重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
128.如权利要求125所述的方法，其中重组多肽是包含结合IL13的第一结合结构域和结合IL17的第二结合结构域的双特异性抗体。
129.如权利要求128所述的方法，其中IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
130.如权利要求128或129所述的方法，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。
131.如权利要求128-130中任一项所述的方法，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL序列。
132.如权利要求128-131中任一项所述的方法，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链。
133.如权利要求128-132中任一项所述的方法，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链。
134.如权利要求128-133中任一项所述的方法，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。
135.如权利要求128-134中任一项所述的方法，其中IL17是人IL17。
136.如权利要求128-135中任一项所述的方法，其中第二结合结构域结合人IL17AA、IL17FF和IL17AF。
137.如权利要求128-136中任一项所述的方法，其中IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
138.如权利要求128-137中任一项所述的方法，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3。
139.如权利要求128-138中任一项所述的方法，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VL序列。
140.如权利要求128-139中任一项所述的方法，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。
141.如权利要求128-140中任一项所述的方法，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链。
142.如权利要求128-141中任一项所述的方法，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链。
143.一种用于包含由细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物的质量测定法，所述质量测定法包括使药物组合物的样品进行如权利要求106-142中任一项的免疫测定方法以检测在药物组合物中FkpA的存在或量。
144.如权利要求143所述的质量测定法，其中药物组合物中的FkpA的量不超过约
30ppm、约25ppm、约20ppm、约15ppm、约14ppm、约13ppm、约12ppm、约11ppm、约10ppm、约9ppm、约8ppm、约7ppm、约6ppm、约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约
0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm。
145.如权利要求143或144中任一项所述的质量测定法，其中细菌细胞是大肠杆菌细胞。
146.如权利要求143-145中任一项所述的质量测定法，其中细菌细胞表达外源FkpA。
147.如权利要求143-146中任一项所述的质量测定法，其中样品是细胞裂解物。
148.如权利要求143-147中任一项所述的质量测定法，其中样品获自重组多肽制剂，并且其中重组多肽制剂已经进行一个或多个层析法纯化步骤。
149.如权利要求148所述的质量测定法，其中重组多肽制剂是最终纯化的产物。
150.如权利要求143-149中任一项所述的质量测定法，其中重组多肽是抗体或免疫粘附素。
151.如权利要求150所述的质量测定法，其中抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。
152.如权利要求151所述的质量测定法，其中重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
153.如权利要求151所述的质量测定法，其中重组多肽是包含结合IL13的第一结合结构域和结合IL17的第二结合结构域的双特异性抗体。
154.如权利要求153所述的质量测定法，其中IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
155.如权利要求153或154所述的质量测定法，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。
156.如权利要求153-155中任一项所述的质量测定法，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL序列。
157.如权利要求153-156中任一项所述的质量测定法，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链。
158.如权利要求153-157中任一项所述的质量测定法，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链。
159.如权利要求153-158中任一项所述的质量测定法，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。
160.如权利要求153-159中任一项所述的质量测定法，其中IL17是人IL17。
161.如权利要求153-159中任一项所述的质量测定法，其中第二结合结构域结合人IL17AA、IL17FF和IL17AF。
162.如权利要求153-161中任一项所述的质量测定法，其中IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
163.如权利要求153-162中任一项所述的质量测定法，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3。
164.如权利要求153-163中任一项所述的质量测定法，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VL序列。
165.如权利要求153-164中任一项所述的质量测定法，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。
166.如权利要求153-165中任一项所述的质量测定法，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链。
167.如权利要求153-166中任一项所述的质量测定法，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链。
168.如权利要求153-167中任一项所述的质量测定法，所述测定法还包括检测药物组合物中DsbA和/或DsbC的量的步骤。
169.如权利要求168所述的质量测定法，其中DsbA的量不超过约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm。
170.如权利要求168或169所述的质量测定法，其中DsbC的量不超过约5ppm、约4ppm、约
3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约
0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm。
171.如权利要求168-170中任一项所述的质量测定法，其中通过免疫测定法测量DsbA和/或DsbC的量。
172.一种用于检测包含由细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的FkpA的试剂盒，所述试剂盒包含通过权利要求50-55中任一项的方法制备的抗FkpA抗体或权利要求56-61中任一项的抗FkpA抗体的组合物。
173.如权利要求172所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含超纯FkpA，用作参照标准产生用于定量样品中的FkpA的标准曲线和/或用作阳性对照。
174.如权利要求172所述的试剂盒，其中根据权利要求1-33中任一项的方法制备超纯FkpA。
175.一种包含重组多肽的组合物，其中所述重组多肽在表达内源FkpA的宿主细胞中产生，其中组合物包含浓度不超过约6ppm、约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约
0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约
0.1ppm的FkpA。
176.如权利要求175所述的组合物，其中通过免疫测定法测定组合物中FkpA的量。
177.如权利要求175所述的组合物，其中通过权利要求106-124中任一项的免疫测定法测定组合物中FkpA的量。
178.一种包含重组多肽的组合物，其中所述重组多肽在被工程化以表达外源FkpA的宿主细胞中产生，其中组合物包含浓度不超过约15ppm、约14ppm、约13ppm、约12ppm、约11ppm、约10ppm、约9ppm、约8ppm、约7ppm、约6ppm、约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约
0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约
0.1ppm的FkpA。
179.如权利要求175-178中任一项所述的组合物，其中重组多肽是抗体。
180.如权利要求179所述的组合物，其中抗体是双特异性抗体。
181.如权利要求175-180中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少约0.2ppm的FkpA。
182.如权利要求175-181中任一项所述的组合物，其中宿主细胞表达外源FkpA，其中组合物包含不超过约13ppm。
183.如权利要求175-182中任一项所述的组合物，其中宿主细胞表达外源FkpA，其中组合物包含不超过约0.7ppm。
184.如权利要求175-183中任一项所述的组合物，其中宿主细胞表达外源FkpA，其中组合物包含不超过约6ppm。
185.如权利要求175-184中任一项所述的组合物，其中重组多肽是双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含结合IL13的第一结合结构域和结合IL17的第二结合结构域。
186.如权利要求185所述的组合物，其中IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
187.如权利要求185或186所述的组合物，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。
188.如权利要求185-187中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL序列。
189.如权利要求185-188中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链。
190.如权利要求185-189中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链。
191.如权利要求185-190中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。
192.如权利要求185-191中任一项所述的组合物，其中IL17是人IL17。
193.如权利要求185-192中任一项所述的组合物，其中第二结合结构域结合人IL17AA、IL17FF和IL17AF。
194.如权利要求193所述的组合物，其中IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
195.如权利要求185-194中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3。
196.如权利要求185-195中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VL序列。
197.如权利要求185-196中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。
198.如权利要求185-196中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链。
199.如权利要求185-198中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链。
200.如权利要求185-199中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含浓度不超过约
5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约
0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm的DsbA。
201.如权利要求200所述的组合物，其中通过免疫测定法测量所述组合物中DsbA的浓度。
202.如权利要求185-201中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含浓度不超过约
5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约
0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm的DsbC。
203.如权利要求202所述的组合物，其中通过免疫测定法测量所述组合物中DsbC的浓度。
204.一种包含双特异性抗体的组合物，其中重组多肽通过以下方法产生，所述方法包括：
a)向宿主细胞导入
i)编码第一重链和第一轻链的核酸，其中所述第一重链和所述第一轻链形成第一抗原结合结构域；
ii)编码第二重链和第二轻链的核酸，其中所述第二重链和所述第二轻链形成第二抗原结合结构域；
iii)编码FkpA多肽的核酸；
其中第一重链和第二重链形成Fc结构域；和
b)纯化抗体，
其中所述组合物包含少于约5ppm的FkpA。
205.如权利要求204所述的组合物，其中所述组合物包含少于约1ppm的FkpA。
206.如权利要求175-205中任一项所述的组合物，其中宿主细胞是原核宿主细胞。
207.如权利要求206所述的组合物，其中宿主细胞是革兰氏阴性细菌。
208.如权利要求207所述的组合物，其中革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。
209.如权利要求175-208中任一项所述的组合物，其中FkpA是大肠杆菌FkpA。
210.如权利要求175-209中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体是纯化的。
211.如权利要求175-210中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体包含结合IL13的第一结合结构域。
212.如权利要求175-211中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体包含结合IL17的第二结合结构域。
213.如权利要求211或212所述的组合物，其中IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
214.如权利要求211-213中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。
215.如权利要求211中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL序列。
216.如权利要求211-215中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链。
217.如权利要求211-215中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链。
218.如权利要求211-217中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第一结合结构域包含含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。
219.如权利要求211-218中任一项所述的组合物，其中IL17是人IL17。
220.如权利要求211-219中任一项所述的组合物，其中第二结合结构域结合人IL17AA、IL17FF和IL17AF。
221.如权利要求220所述的组合物，其中IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
222.如权利要求219-221中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3。
223.如权利要求219-222中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VL序列。
224.如权利要求219-223中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。
225.如权利要求219-223中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链。
226.如权利要求219-225中任一项所述的组合物，其中双特异性抗体的第二结合结构域包含含有SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链。
227.如权利要求175-226中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含不超过约15ppm的DsbA。
228.如权利要求175-227中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含不超过约5ppm的DsbA。
229.如权利要求175-228中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含不超过约15ppm的DsbC。
230.如权利要求175-229中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含不超过约5ppm的DsbC。
231.一种从包含多肽和一种或多种杂质的组合物中纯化多肽的方法，
a)使组合物进行亲和层析法以产生亲和洗脱液，
b)使亲和洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和
c)使混合模式洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多肽的级分，
其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
232.一种用于从包含多特异性抗体和一种或多种杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，所述方法包括以下有顺序的步骤：
a)使组合物进行蛋白A层析法以产生蛋白A洗脱液，
b)使蛋白A洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和
c)使混合模式洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多特异性抗体的级分，其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
233.如权利要求231或232所述的方法，其中混合模式层析法是混合模式阴离子交换层析法。
234.如权利要求231所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行亲和层析法。
235.如权利要求232或233所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行蛋白A层析法。
236.如权利要求231-235中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行混合模式层析法。
237.如权利要求231-236中任一项所述的方法，其中以流经模式进行HIC。
238.一种用于从包含多特异性抗体和一种或多种杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，其中多特异性抗体的每个臂分别产生，所述方法包括以下有顺序的步骤：
a)使多特异性抗体的每个臂进行蛋白A层析法以产生多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液，
b)在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液的混合物，
c)使包含多特异性抗体的组合物进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和d)使混合模式洗脱液进行疏水相互作用层析法(HIC)和收集包含多特异性抗体的级分，
其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
239.如权利要求238所述的方法，其中混合模式层析法是混合模式阴离子交换层析法。
240.如权利要求238或239所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行蛋白A谱法。
241.如权利要求238-240中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行混合模式层析法。
242.如权利要求238-241中任一项所述的方法，其中以流经模式进行疏水相互作用层析法。
243.如权利要求231-242中任一项所述的方法，其中在疏水相互作用层析法之前使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法。
244.如权利要求243所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行阴离子交换层析法。
245.如权利要求231-244中任一项所述的方法，所述方法还包括使包含多肽或多特异性抗体的疏水相互作用层析法级分进行阳离子交换层析法和收集包含多肽或多特异性抗体的级分的步骤。
246.如权利要求245所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行阳离子交换层析法。
247.一种用于从包含多肽和一种或多种杂质的组合物中纯化多肽的方法，
a)使组合物进行亲和层析法以产生亲和洗脱液，
b)使亲和洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和
c)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，
d)使阴离子交换洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多肽的级分，
其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
248.一种用于从包含多特异性抗体和一种或多种杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，所述方法包括以下有顺序的步骤：
a)使组合物进行蛋白A层析法以产生蛋白A洗脱液，
b)使蛋白A洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和
c)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，
d)使阴离子交换洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多特异性抗体的级分，其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
249.一种用于从包含多特异性抗体和一种或多种杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，其中多特异性抗体的每个臂分别产生，所述方法包括以下有顺序的步骤：
a)使多特异性抗体的每个臂进行蛋白A层析法以产生多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液，
b)在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液的混合物，
c)使包含多特异性抗体的组合物进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和d)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，
e)使阴离子交换洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多特异性抗体的级分，和收集包含多特异性抗体的级分，
其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
250.如权利要求247-249中任一项所述的方法，其中混合模式层析法是混合模式阴离子交换层析法。
251.如权利要求247所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行亲和层析法。
252.如权利要求248-250中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行蛋白A层析法。
253.如权利要求247-252中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行混合模式层析法。
254.如权利要求247-253中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行阴离子交换层析法。
255.如权利要求247-254中任一项所述的方法，其中以流经模式进行疏水相互作用层析法。
256.如权利要求247-255中任一项所述的方法，所述方法还包括使包含多肽或多特异性抗体的疏水相互作用层析法级分进行阳离子交换层析法的步骤。
257.如权利要求247-256中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行阳离子交换层析法。
258.一种用于从包含多肽和一种或多种杂质的组合物中纯化多肽的方法，
a)使组合物进行亲和层析法以产生亲和洗脱液，
b)使亲和洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和
c)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，
d)使阴离子交换洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多肽的级分，
e)使疏水相互作用洗脱液进行阳离子交换层析法和收集包含多肽的级分，
其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
259.一种用于从包含多特异性抗体和一种或多种杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，所述方法包括以下有顺序的步骤：
a)使组合物进行蛋白A层析法以产生蛋白A洗脱液，
b)使蛋白A洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和
c)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，
d)使阴离子交换洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多特异性抗体的级分，e)使疏水相互作用洗脱液进行阳离子交换层析法和收集包含多肽的级分，
其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
260.一种用于从包含多特异性抗体和一种或多种杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，其中多特异性抗体的每个臂分别产生，所述方法包括以下有顺序的步骤：
a)使多特异性抗体的每个臂进行蛋白A层析法以产生多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液，
b)在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液的混合物，
c)使包含多特异性抗体的组合物进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和d)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，
e)使阴离子交换洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多特异性抗体的级分，和收集包含多特异性抗体的级分，
f)使疏水相互作用洗脱液进行阳离子交换层析法和收集包含多肽的级分，
其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
261.如权利要求258-260中任一项所述的方法，其中混合模式层析法是混合模式阴离子交换层析法。
262.如权利要求258所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行亲和层析法。
263.如权利要求259-261中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行蛋白A层析法。
264.如权利要求258-263中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行混合模式层析法。
265.如权利要求258-264中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行阴离子交换层析法。
266.如权利要求258-265中任一项所述的方法，其中以流经模式进行疏水相互作用层析法。
267.如权利要求258-266中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行阳离子交换层析法。
268.一种用于从包含多肽和一种或多种杂质的组合物中纯化多肽的方法，所述方法包括以下有顺序的步骤：
a)使组合物进行亲和层析法以产生亲和洗脱液，
b)使亲和洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和
c)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，
d)使阴离子交换洗脱液进行羟磷灰石层析法和收集包含多肽的级分，
其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
269.一种用于从包含多特异性抗体和一种或多种杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，所述方法包括以下有顺序的步骤：
a)使组合物进行蛋白A层析法以产生蛋白A洗脱液，
b)使蛋白A洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和
c)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，
d)使阴离子交换洗脱液进行羟磷灰石层析法和收集包含多特异性抗体的级分，
其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
270.一种用于从包含多特异性抗体和一种或多种杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，其中多特异性抗体的每个臂分别产生，所述方法包括以下有顺序的步骤：
a)使多特异性抗体的每个臂进行蛋白A层析法以产生多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液，
b)在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液的混合物，
c)使包含多特异性抗体的组合物进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和d)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，
e)使阴离子交换洗脱液进行羟磷灰石层析法和收集包含多特异性抗体的级分，和收集包含多特异性抗体的级分，
其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
271.如权利要求268-270中任一项所述的方法，混合模式层析法是混合模式阴离子交换层析法。
272.如权利要求271所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行亲和层析法。
273.如权利要求269-272中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行蛋白A层析法。
274.如权利要求268-273中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行混合模式层析法。
275.如权利要求268-274中任一项所述的方法，其中以结合和洗脱模式进行阴离子交换层析法。
276.如权利要求268-275中任一项所述的方法，其中以流经模式进行羟磷灰石层析法。
277.如权利要求231-245或256-267中任一项所述的方法，所述方法还包括使包含多肽或多特异性抗体的羟磷灰石相互作用层析法级分进行超滤的步骤。
278.如权利要求245-246或256-267所述的方法，所述方法还包括使包含多肽或多特异性抗体的阳离子交换级分进行超滤的步骤。
279.如权利要求267-276所述的方法，所述方法还包括使包含多肽或多特异性抗体的羟磷灰石层析法级分进行超滤的步骤。
280.如权利要求277-279中任一项所述的方法，其中超滤顺次包括第一超滤、渗滤和第二超滤。
281.如权利要求232-233、235-246、248-250、252-257、259-261、263-270或269-276中任一项所述的方法，其中蛋白A层析法包含与琼脂糖连接的蛋白A。
282.如权利要求281所述的方法，其中蛋白A层析法是MabSelectTM、MabSelectTMSuRe和MabSelectTMSuRe LX、ProSep-VA、ProSep-VA Ultra Plus、Protein A Fast
Flow、或Toyopearl蛋白A层析法。
283.如权利要求281或282所述的方法，其中蛋白A层析法使用蛋白A平衡缓冲液、蛋白A加载缓冲液或蛋白A洗涤缓冲液中的一种或多种，其中平衡缓冲液、加载缓冲液和/或洗涤缓冲液是约pH 7至约pH 8。
284.如权利要求283所述的方法，其中蛋白A平衡缓冲液为约pH 7.7。
285.如权利要求283或284所述的方法，其中蛋白A平衡缓冲液包含约25mM Tris和约
25mM NaCl。
286.如权利要求283-285中任一项所述的方法，其中在加载后用平衡缓冲液洗涤蛋白A层析法。
287.如权利要求286所述的方法，所述方法还包括第二次洗涤和第三次洗涤，其中所述第二次洗涤是1M精氨酸，所述第三次洗涤是平衡缓冲液。
288.如权利要求283-287中任一项所述的方法，其中通过pH梯度从蛋白A层析法洗脱多特异性抗体。
289.如权利要求283-288中任一项所述的方法，其中通过将具有低pH的蛋白A洗脱缓冲液施加到蛋白A层析法从蛋白A洗脱多特异性抗体。
290.如权利要求289所述的方法，其中蛋白A洗脱缓冲液包含约150mM乙酸，约pH2.8或约pH2.9。
291.如权利要求283-290中任一项所述的方法，其中当洗脱液的OD280大于约0.5时，汇集蛋白A洗脱液。
292.如权利要求231-291中任一项所述的方法，其中混合模式层析法包含季胺和疏水部分。
293.如权利要求231-292中任一项所述的方法，其中混合模式层析法包含季胺和与高度交联的琼脂糖连接的疏水部分。
294.如权利要求231-293中任一项所述的方法，其中混合模式层析法包含N-苄基-n-甲基乙醇胺。
295.如权利要求294所述的方法，其中混合模式层析法是CaptoTM粘附层析法。
296.如权利要求231-295中任一项所述的方法，其中混合模式层析法使用混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液、混合模式加载缓冲液或混合模式洗涤缓冲液中的一种或多种，其中混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液为约pH6至约pH7。
297.如权利要求296所述的方法，其中混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液约pH 6.5。
298.如权利要求296或297所述的方法，其中混合模式预平衡缓冲液包含约200mM乙酸盐或约500mM乙酸盐。
299.如权利要求296-298中任一项所述的方法，其中混合模式平衡缓冲液包含约50mM乙酸盐。
300.如权利要求296-299中任一项所述的方法，其中在加载后用洗涤缓冲液洗涤混合模式层析法。
301.如权利要求300所述的方法，其中洗涤缓冲液是约50mM乙酸盐，约pH 6.5或约
200mM乙酸盐，约pH 6.5
302.如权利要求231-301中任一项所述的方法，其中通过pH梯度从混合模式层析法中洗脱多肽或多特异性抗体。
303.如权利要求231-302中任一项所述的方法，其中通过将具有低pH的混合模式洗脱缓冲液施加到混合模式阴离子交换层析法上从混合模式层析法洗脱多肽或多特异性抗体。
304.如权利要求303所述的方法，其中混合模式洗脱缓冲液包含约pH 5.2或约pH 5.0的25mM乙酸盐。
305.如权利要求231-304中任一项所述的方法，其中当洗脱液的OD280大于约0.5至约
1.0时汇集混合模式洗脱液。
306.如权利要求231-267中任一项所述的方法，其中疏水相互作用层析法(HIC)包含疏水部分。
307.如权利要求306所述的方法，其中疏水相互作用层析法包含苯基部分。
308.如权利要求306或307所述的方法，其中疏水相互作用层析法包含与交联的琼脂糖连接的疏水部分。
309.如权利要求306-308中任一项所述的方法，其中疏水相互作用层析法包含与交联的琼脂糖连接的苯基部分或丁基部分。
310.如权利要求309所述的方法，其中疏水相互作用层析法是Phenyl 层
析法或Butyl 层析法。
311.如权利要求306-310中任一项所述的方法，其中疏水相互作用交换层析法使用HIC平衡缓冲液、HIC加载缓冲液或HIC洗涤缓冲液中的一种或多种，其中HIC平衡缓冲液、HIC加载缓冲液和/或HIC洗涤缓冲液是约pH 5至约pH6。
312.如权利要求311所述的方法，其中HIC平衡缓冲液、加载缓冲液和/或洗涤缓冲液为约pH 5.5。
313.如权利要求311或312所述的方法，其中HIC平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含约170mM乙酸盐。
314.如权利要求311-313中任一项所述的方法，其中HIC加载缓冲液是50mM Tris、
100mM乙酸钠，pH约5.5。
315.如权利要求311-314中任一项所述的方法，其中在加载后用HIC洗涤缓冲液洗涤疏水相互作用层析法。
316.如权利要求306-315中任一项所述的方法，其中疏水相互作用层析法包含己基部分。
317.如权利要求306所述的方法，其中疏水相互作用层析法包含与羟化甲基丙烯酸聚合物连接的疏水部分。
318.如权利要求316或317所述的方法，其中疏水相互作用层析法包含与羟化甲基丙烯酸聚合物连接的己基部分。
319.如权利要求318所述的方法，其中疏水相互作用层析法是
Hexyl 650C。
320.如权利要求316-319中任一项所述的方法，其中疏水相互作用交换层析法使用HIC平衡缓冲液、HIC加载缓冲液或HIC洗涤缓冲液中的一种或多种，其中HIC平衡缓冲液、HIC加载缓冲液和/或HIC洗涤缓冲液是约pH6至约pH8。
321.如权利要求320所述的方法，其中HIC平衡缓冲液、加载缓冲液和/或洗涤缓冲液是约pH 7.0。
322.如权利要求320或321所述的方法，其中HIC平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含约50mM
3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和125mM乙酸盐。
323.如权利要求316-322中任一项所述的方法，其中在加载后用HIC洗涤缓冲液洗涤疏水相互作用层析法。
324.如权利要求306-323中任一项所述的方法，其中当洗脱液的OD280大于约0.5至约
1.0时，汇集疏水相互作用洗脱液。
325.如权利要求243、244或247-324中任一项所述的方法，其中阴离子交换层析法包含季胺。
326.如权利要求325所述的方法，其中阴离子交换层析法包含与交联的琼脂糖连接的季胺。
327.如权利要求326所述的方法，其中混合模式阴离子交换层析法是QSFF层析法。
328.如权利要求325-327中任一项所述的方法，其中阴离子交换层析法使用阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液或阴离子交换加载缓冲液中的一种或多种，其中阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液和/或阴离子加载缓冲液是约pH8至约pH9。
329.如权利要求328所述的方法，其中阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液和/或阴离子交换加载缓冲液为约pH 8.5。
330.如权利要求328或329所述的方法，其中阴离子交换预平衡缓冲液包含约50mM Tris和约500mM乙酸钠或约100mM乙酸钠。
331.如权利要求328-330中任一项所述的方法，其中阴离子交换平衡缓冲液包含约
50mM Tris。
332.如权利要求328-331中任一项所述的方法，其中在加载后用阴离子交换平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析法。
333.如权利要求328-332中任一项所述的方法，其中通过盐梯度从阴离子交换层析法洗脱多肽或多特异性抗体。
334.如权利要求328-333中任一项所述的方法，其中通过将具有增加盐浓度的阴离子交换洗脱缓冲液施加到阴离子交换层析法从阴离子交换层析法洗脱多肽或多特异性抗体。
335.如权利要求334所述的方法，其中阴离子交换洗脱缓冲液包含约50mM Tris和约
100mM乙酸钠，约pH 8.5。
336.如权利要求328-335中任一项所述的方法，其中当洗脱液的OD280大于约0.5至约
1.0时汇集阴离子交换洗脱液。
337.如权利要求267-280中任一项所述的方法，其中羟磷灰石层析法是陶瓷羟磷灰石层析法。
338.如权利要求337所述的方法，其中羟磷灰石层析法是CHT I型陶瓷羟磷灰石层析法。
339.如权利要求337或338所述的方法，其中羟磷灰石层析法使用羟磷灰石缓冲液A或羟磷灰石缓冲液B中的一种或多种，其中与羟磷灰石缓冲液A相比，羟磷灰石缓冲液B具有更高的电导率。
340.如权利要求339所述的方法，其中羟磷灰石缓冲液A是包含约pH 6.8的约10mM磷酸钠的平衡缓冲液。
341.如权利要求339或340所述的方法，其中羟磷灰石缓冲液B包含约10mM磷酸钠和约
1M氯化钠，约pH 6.8。
342.如权利要求339-341中任一项所述的方法，其中使用羟磷灰石缓冲液A中的羟磷灰石缓冲液B的梯度从羟磷灰石层析法洗脱多肽或多特异性抗体。
343.如权利要求342所述的方法，其中梯度是线性梯度。
344.如权利要求342或343所述的方法，其中梯度从0％羟磷灰石缓冲液B增加至100％羟磷灰石缓冲液B。
345.如权利要求342-344中任一项所述的方法，其中梯度在约20个柱体积中从0％羟磷灰石缓冲液B增加至100％羟磷灰石缓冲液B。
346.如权利要求337-345中任一项所述的方法，其中当洗脱液的OD280大于约0.5至约
1.0时，汇集羟磷灰石洗脱液。
347.如权利要求245-246或256-326所述的方法，其中阳离子交换层析法包含羧酸部分或磺酸部分。
348.如权利要求347所述的方法，其中羧酸部分或磺酸部分是磺丙基、磺乙基、磺基异丁基或羧基部分。
349.如权利要求347或348所述的方法，其中阳离子交换层析法包含与交联的琼脂糖连接的羧酸部分或磺酸部分。
350.如权利要求348或349所述的方法，其中阳离子交换材料是 HS 50、
HS 20、SO3Monolith、S Ceramic HyperD、sulphopropyl- Fast
Flow(SPSFF)、SP- XL(SPXL)、CM Fast Flow、CaptoTM S、
Fractogel Se HiCap、Fractogel SO3或Fractogel COO。
351.如权利要求347-350中任一项所述的方法，其中阳离子交换加载密度小于约20g/L。
352.如权利要求347-351中任一项所述的方法，其中阳离子交换层析法使用阳离子交换预平衡缓冲液、阳离子交换平衡缓冲液、阳离子交换加载缓冲液或阳离子交换洗涤缓冲液中的一种或多种，其中阳离子交换预平衡缓冲液、阳离子交换平衡缓冲液、阳离子交换加载缓冲液和/或阳离子交换洗涤缓冲液是约pH 5.0至约pH 6.0。
353.如权利要求352所述的方法，其中阳离子交换阳离子交换平衡缓冲液、阳离子交换加载缓冲液和/或阳离子交换洗涤缓冲液为约pH 5.5或pH 5.8。
354.如权利要求352或353所述的方法，其中阳离子交换平衡缓冲液包含50mM乙酸钠。
355.如权利要求352-354中任一项所述的方法，其中阳离子交换洗涤缓冲液包含50mM乙酸钠。
356.如权利要求352-355中任一项所述的方法，其中在加载后用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析法。
357.如权利要求352-356中任一项所述的方法，其中通过盐梯度从阳离子交换层析法洗脱多肽或多特异性抗体。
358.如权利要求352至357中任一项所述的方法，其中通过将具有增加盐浓度的阳离子交换洗脱缓冲液施加到阳离子交换层析法从阳离子交换层析法洗脱多肽或多特异性抗体。
359.如权利要求358所述的方法，其中阳离子交换洗脱缓冲液包含500mM乙酸钠，pH5.8。
360.如权利要求359所述的方法，其中洗脱是10％至100％阳离子交换洗脱缓冲液的梯度洗脱。
361.如权利要求352-360中任一项所述的方法，其中当洗脱液的OD280大于约0.5至约
1.0时汇集阳离子交换洗脱液。
362.如权利要求251-361中任一项所述的方法，其中多肽或多特异性抗体在细胞中产生。
363.如权利要求361所述的方法，其中多特异性抗体的臂在细胞中产生。
364.如权利要求362或363所述的方法，其中细胞是原核细胞。
365.如权利要求364所述的方法，其中原核细胞在大肠杆菌细胞中。
366.如权利要求364或365所述的方法，其中细胞被工程化以表达一种或多种分子伴侣。
367.如权利要求366所述的方法，其中分子伴侣是FkpA、DsbA或DsbC中的一种或多种。
368.如权利要求366或367所述的方法，其中分子伴侣是大肠杆菌分子伴侣。
369.如权利要求362-368中任一项所述的方法，其中裂解细胞以产生包含多肽或多特异性抗体的细胞裂解物。
370.如权利要求369所述的方法，其中在蛋白A层析法之前裂解细胞以产生包含多特异性抗体或多特异性抗体的臂的细胞裂解物。
371.如权利要求369或370所述的方法，其中使用微流化器裂解细胞。
372.如权利要求369-371中任一项所述的方法，其中在层析法之前将聚乙二醇亚胺(PEI)加入到细胞裂解物中。
373.如权利要求372所述的方法，其中将PEI加入到裂解物中至约0.4％的终浓度。
374.如权利要求369-373中任一项所述的方法，其中通过离心澄清细胞裂解物。
375.如权利要求251至373中任一项所述的方法，其中产物特异性杂质是非配对抗体臂、抗体同二聚体、聚集体、高分子量物质(HMW)、低分子量物质(LMW)、酸性变体或碱性变体中的一种或多种。
376.如权利要求251-375中任一项所述的方法，其中所述方法减少组合物中的大肠杆菌蛋白(ECP)、FkpA、DsbA、DsbC、浸出的蛋白A、核酸、细胞培养基组分或病毒杂质中任一种的量。
377.如权利要求232-245、247-257、259-267或269-376中任一项所述的方法，其中多特异性抗体是双特异性抗体。
378.如权利要求377所述的方法，其中多特异性抗体的第一臂结合IL13。
379.如权利要求378所述的方法，其中IL13是人IL13。
380.如权利要求378或379所述的方法，其中IL13包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
381.如权利要求378-380中任一项所述的方法，其中多特异性抗体的第一臂包含含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L3。
382.如权利要求378-381中任一项所述的方法，其中多特异性抗体的第一臂包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VL序列。
383.如权利要求378-382中任一项所述的方法，其中多特异性抗体的第一臂包含含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链。
384.如权利要求378-383中任一项所述的方法，其中多特异性抗体的第一臂包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的重链。
385.如权利要求378-384中任一项所述的方法，其中多特异性抗体的第一臂包含含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链。
386.如权利要求378-385中任一项所述的方法，其中抗体的第二臂结合IL17。
387.如权利要求386所述的方法，其中IL17是人IL17。
388.如权利要求386或387所述的方法，其中IL17包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
389.如权利要求386-388中任一项所述的方法，其中多特异性抗体的第二臂包含含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L3。
390.如权利要求386-389中任一项所述的方法，其中多特异性抗体的第二臂包含含有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VL序列。
391.如权利要求386-390中任一项所述的方法，其中多特异性抗体的第二臂包含含有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链。
392.如权利要求386-391中任一项所述的方法，其中多特异性抗体的第二臂包含含有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链。
393.如权利要求386-393中任一项所述的方法，其中多特异性抗体的第二臂包含含有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的轻链。
394.包含通过权利要求231-393中任一项的方法纯化的多肽或多特异性抗体的组合物，其中所述组合物包含不超过约5％、4％、3％、2％或1％的产物特异性杂质。
395.如权利要求394的组合物，其中产物特异性杂质是非配对抗体臂、抗体同二聚体、聚集体、高分子量物质(HMW)、低分子量物质(LMW)、酸性变体或碱性变体中的一种或多种。
396.如权利要求394或395所述的组合物，其中组合物包含少于约组合物包含不超过约
5％、4％、3％、2％或1％的组合物中的大肠杆菌蛋白质(ECP)、FkpA、DsbA、DsbC、浸出的蛋白A、核酸、细胞培养基组分或病毒杂质中的任一种。
FKPA的纯化及其用于生产重组多肽的用途
相关申请的交叉引用
[0001] 本申请要求2015年8月20日提交的美国临时专利申请No.62/207,908、2015年8月20日提交的美国临时专利申请No.62/207,910、以及2015年8月26日提交的美国临时专利申请No.62/210,378的权益；其中每个公开都通过整体引用并入本文用于所有目的。
提交ASCII文本文件的序列表
提交ASCII文本文件的序列表
[0002] 以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：146392033640_Sequence_Listing.txt，记录日期：2016年8月19日，大小：58KB)。
技术领域
[0003] 本发明提供了以非常高的纯度水平生产FKBP型肽基脯氨酰基顺反异构酶(FkpA)多肽的方法。还提供了超纯FkpA及其使用方法，例如用于显示FkpA从细菌产生的生物制品中去除或减少的免疫测定法中。在一些实施方案中，本发明提供了用于从包含多肽和至少一种杂质的组合物纯化多肽(例如多特异性抗体)的方法以及包含通过所述方法纯化的产物的制剂。在一些实施方案中，杂质是产物特异性杂质；例如，多特异性抗体的前体、聚集体和/或变体。
背景技术
[0004] 经常修饰通过在发酵条件下在细菌宿主细胞中表达整批产生的真核生物多肽的产率和质量以改善分泌的异源多聚体蛋白质(例如抗体)的正确组装和折叠。伴侣蛋白(如FKBP型肽基脯氨酰基顺反异构酶(FkpA))的过表达促进在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白(如抗体)的正确折叠和溶解度。FkpA催化寡肽中脯氨酸亚胺肽键的顺反异构化(Missiakas,D.等人,Molecular Microbiology(1996)21(4),871–884)。
[0005] 对于可接受用于人患者施用的重组生物药物蛋白，重要的是将由制造和纯化方法产生的残留杂质从最终生物产物中去除或减少到少量。这些方法组分包括培养基蛋白、免疫球蛋白亲和配体、病毒、内毒素、DNA和宿主细胞蛋白质。这些宿主细胞杂质包括方法特异性宿主细胞蛋白质(HCP)，其是来源于重组DNA技术的生物产物中的方法相关杂质，例如过表达以促进蛋白质折叠的分子伴侣，如FkpA、DsbA和DsbC。尽管HCP通常以小量(以预期重组多肽的百万分之几或纳克/毫克的量)存在于最终药物物质中，但认识到HCP是不合需要的并且其量应该最小化。例如，美国食品和药物管理局(FDA)要求旨在用于人体内使用的生物药品应该尽可能地无外源杂质，并且要求检测和定量潜在的杂质(如HCP)的测试。此外，国际协调会议(International Conference on Harmonization,ICH)为生物技术/生物产物的检测程序和验收标准提供了指南。该指南建议，对于HCP，可以使用能够检测大范围蛋白杂质的敏感的免疫测定法。已经开发了用于检测免疫球蛋白、DNA、内毒素、病毒和总HCP(例如总大肠杆菌蛋白(ECP)或总CHO蛋白(CHOP))的测定法和试剂，但是这样的测定法和试剂可能不能准确地检测辅助蛋白质杂质如FkpA。目前没有以足够的特异性和灵敏度来检测和定量蛋白质(如FkpA)的商业试剂或分析方法，这些蛋白质通常在细菌中不是以高水平表达，但是可在重组细菌宿主细胞中过表达以促进生物产物的折叠和分泌。
[0006] 特别需要用于检测FkpA的试剂、方法和试剂盒，因为没有足够的一致性、灵敏度、特异性或效率的现有测定法和试剂。本文描述的本发明满足了上述某些需求并提供了其他益处。另外，多特异性抗体的制剂具有独特的产物特异性杂质，如非配对抗体臂和错配抗体。因此，需要开发用于多特异性抗体的纯化方案，以去除这些产物特异性杂质。
[0007] 本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)通过引用整体并入。
发明内容
[0008] 本发明提供了从包含FkpA多肽的细胞裂解物中纯化FkpA多肽的方法，所述方法包括a)通过离心澄清细胞裂解物，b)将包含FkpA多肽的澄清的细胞裂解物施加到阳离子交换层析材料，c)从阳离子交换层析材料洗脱FkpA多肽以产生包含FkpA多肽的阳离子交换洗脱液，d)将包含FkpA多肽的阳离子交换洗脱液施加到疏水相互作用层析法(HIC)材料，e)从HIC材料洗脱FkpA多肽以产生HIC洗脱液，f)将包含FkpA多肽的HIC洗脱液施加到尺寸排阻层析材料，g)从包含纯化的FkpA多肽的尺寸排阻层析法中收集级分。在一些实施方案中，包含FkpA多肽的裂解物为约pH6.0。
[0009] 在一些实施方案中，阳离子交换层析材料是强阳离子交换剂。在一些实施方案中，强阳离子交换剂包含磺丙基。在一些实施方案中，磺丙基与交联的琼脂糖连接。在一些实施方案中，洗脱之前在25mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)中洗涤阳离子交换材料。在一些实施方案中，使用盐梯度从阳离子层析材料中洗脱FkpA。在一些实施方案中，盐梯度是线性梯度。在一些实施方案中，盐梯度是在9个柱体积的0-30％的梯度，从约25mM MES，300mM NaCl至25mM MES 300mM NaCl。在一些实施方案中，将阳离子交换洗脱液收集在级分中。在一些实施方案中，在疏水相互作用层析法之前，通过尺寸排阻层析法分析各级分。在一些实施方案中，选择包含至少约25％FkpA的级分用于进一步纯化。
[0010] 在本发明的一些实施方案中，HIC材料包含丁基部分。在一些实施方案中，丁基部分与交联的琼脂糖连接。在一些实施方案中，在HIC之前将阳离子交换洗脱液调整为包含约0.6M硫酸钠和约50mM PO4，约pH 7。在一些实施方案中，在洗脱之前，用40mM磷酸盐、300mM硫酸钠，pH7.0洗涤FkpA结合的HIC材料。在一些实施方案中，使用水从HIC材料中洗脱FkpA。
在一些实施方案中，将HIC洗脱液收集在级分中。在一些实施方案中，汇集包含FkpA的级分。
在一些实施方案中，汇集包含至少约25％FkpA的级分。
在一些实施方案中，将HIC洗脱液收集在级分中。在一些实施方案中，汇集包含FkpA的级分。
在一些实施方案中，汇集包含至少约25％FkpA的级分。
[0011] 在本发明的一些实施方案中，尺寸排阻层析材料包含交联的琼脂糖和葡聚糖的球形复合物。在一些实施方案中，尺寸排阻流经液(flowthrough)收集在级分中。在一些实施方案中，在尺寸排阻层析法之前浓缩HIC洗脱液。在一些实施方案中，在尺寸排阻层析法之前浓缩HIC洗脱液约6倍至约10倍。在一些实施方案中，汇集包含FkpA的尺寸排阻级分。
[0012] 在上述实施方案的一些实施方案中，FkpA多肽是大肠杆菌FkpA多肽。在一些实施方案中，FkpA多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，FkpA多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少约80％的同一性。在一些实施方案中，FkpA在细胞中表达。在一些实施方案中，细胞是原核细胞。在一些实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，细胞被工程化以表达比FkpA的内源表达更高水平的FkpA。在一些实施方案中，使用微流化器裂解细胞。
[0013] 在一些方面，本发明提供了包含通过本文所述的方法纯化的FkpA多肽的组合物。在一些实施方案中，组合物包含至少约98％FkpA多肽(例如，98％单体FkpA多肽；例如，如通过尺寸排阻层析法测量的)。在一些实施方案中，组合物包含少于约2％的低分子量物质。在一些实施方案中，组合物包含不多于约5％的高分子量物质。在一些实施方案中，组合物包含少于约2％的高分子量物质。在一些实施方案中，通过尺寸排阻层析法检测FkpA多肽(例如单体FkpA)的百分比。在一些实施方案中，组合物包含少于约5％、约4％、约3％、约2％、约
1％的杂质或基本上不含杂质。在一些实施方案中，杂质相对于FkpA是高分子量和/或低分子量多肽物质。在一些实施方案中，杂质是大肠杆菌蛋白(ECP)、FkpA的聚集体、FkpA的片段、核酸或细胞培养基组分中的一种或多种。
1％的杂质或基本上不含杂质。在一些实施方案中，杂质相对于FkpA是高分子量和/或低分子量多肽物质。在一些实施方案中，杂质是大肠杆菌蛋白(ECP)、FkpA的聚集体、FkpA的片段、核酸或细胞培养基组分中的一种或多种。
[0014] 在上述组合物的一些实施方案中，纯化的FkpA对一个或多个冻融循环稳定。在一些实施方案中，FkpA对三次冻融循环稳定。在一些实施方案中，在冻融后组合物包含至少约70％的FkpA。在一些实施方案中，在冻融后组合物包含至少约80％的FkpA。
[0015] 在上述组合物的一些实施方案中，通过层析法、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳或蛋白质印记分析中的一种或多种测量组合物中FkpA多肽的纯度。在一些实施方案中，通过高效液相层析法(HPLC)测量组合物中FkpA多肽的纯度。在一些实施方案中，通过尺寸排阻层析法(SEC)测量组合物中FkpA多肽的纯度。在一些实施方案中，通过使用荧光成像或银染色的SDS凝胶电泳测量组合物中FkpA多肽的纯度。在一些实施方案中，通过凝胶电泳鉴定物质的存在来鉴定组合物中非FkpA多肽的存在，所述物质通过蛋白质印迹分析显示不与抗-FkpA抗体发生免疫反应。在一些实施方案中，通过由蛋白质印迹分析的比天然FkpA分子量大的物质的存在来鉴定组合物中FkpA多肽的聚集体的存在。
[0016] 在一些方面，本发明提供了用于产生特异性结合FkpA的抗体的方法，包括将动物暴露于或免疫于包含通过本文所述方法纯化的FkpA的组合物。在一些实施方案中，用于产生特异性结合FkpA的抗体的方法包括将动物暴露于或免疫于本文所述的FkpA组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括从动物中收集血清，其中所述血清包含特异性结合FkpA的抗体。在一些实施方案中，血清包含特异性结合FkpA的多克隆抗体。在其他实施方案中，从血清分离一种或多种单克隆抗体。在一些实施方案中，动物是山羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
[0017] 在一些方面，本发明提供包含特异性结合FkpA的多克隆抗体的组合物，其中所述多克隆抗体通过将动物免疫于包含通过本文所述的任何方法纯化的FkpA的组合物产生。在一些实施方案中，通过将动物免疫于本文所述的纯化的FkpA组合物产生多克隆抗体。在一些实施方案中，从动物的血清收集多克隆抗体。在其他实施方案中，本发明提供了特异性结合FkpA的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体通过将动物免疫于包含通过本文所述的任何方法纯化的FkpA的组合物产生。在一些实施方案中，通过将动物免疫于本文所述的纯化的FkpA组合物产生单克隆抗体。在一些实施方案中，动物是山羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
[0018] 在一些方面，本发明提供了用于纯化特异性结合FkpA的抗体的方法，包括使包含抗-FkpA抗体的组合物与硫酸铵接触至约60％的硫酸铵终浓度、离心溶液、去除上清液并将沉淀物溶解在磷酸盐缓冲液中。在一些实施方案中，磷酸盐缓冲液包含约pH 7.0的约50mM磷酸钠。在一些实施方案中，用于纯化特异性结合FkpA的抗体的方法包括a)使包含抗-FkpA抗体的组合物与硫酸铵接触至约60％的硫酸铵终浓度、离心溶液、去除上清液和将沉淀物溶解在磷酸盐缓冲液中以产生抗-FkpA抗体溶液；b)将抗-FkpA抗体溶液施加到亲和层析材料，c)从亲和材料中洗脱抗体以产生包含抗-FkpA抗体的亲和洗脱液；和d)使亲和洗脱液进行尺寸排阻层析法，其中从尺寸排阻层析法收集包含纯化的抗体的级分。在一些实施方案中，磷酸盐缓冲液包含约pH 7.0的约50mM磷酸钠。在一些实施方案中，亲和层析材料包含与层析介质连接的纯化的FkpA。在一些实施方案中，层析介质是交联的葡聚糖。在一些实施方案中，通过本文所述的任何方法纯化FkpA。在一些实施方案中，FkpA来源于本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，FkpA与层析介质共价连接。在一些实施方案中，使用甘油可控孔度玻璃(Glyceryl Controlled Pore Glass，甘油基-CPG)连接FkpA与层析介质。在一些实施方案中，使用约pH2.0的磷酸盐缓冲盐水从亲和柱洗脱抗-FkpA抗体。在一些实施方案中，将洗脱池(elution pool)收集到约1M Tris，约pH8.0中。在一些实施方案中，尺寸排阻层析材料包含交联的琼脂糖和葡聚糖的球形复合物。在一些实施方案中，交联的琼脂糖和葡聚糖的球形复合物对分子量为10,000道尔顿至600,000道尔顿的分子具有分离范围。在一些实施方案中，将尺寸排阻流经液收集在级分中。在一些实施方案中，汇集包含抗-FkpA抗体的尺寸排阻级分。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，根据本文所述的任何方法制备抗体。在一些实施方案中，少于约1％的抗体特异性结合非FkpA化合物。在一些实施方案中，本发明提供通过本文所述的任何方法纯化的分离的抗-FkpA抗体。
[0019] 在一些实施方案中，本发明提供了用于定量样品中FkpA的方法，包括使用检测系统检测样品中的FkpA和将样品中检测到的FkpA的量与一种或多种浓度的超纯FkpA参照标准的检测比较。在一些实施方案中，超纯FkpA参照标准包含至少约95％、约96％、约97％或约98％的单体FkpA多肽。在一些实施方案中，超纯FkpA参照标准通过本文所述的任何方法制备、或包含本文所述的任何FkpA组合物。在一些实施方案中，检测系统是免疫测定法。在一些实施方案中，免疫测定法包含特异性结合超纯FkpA参照标准的抗体。
[0020] 在一些实施方案中，本发明提供了用于分析重组多肽样品的FkpA的存在和/或量的方法，包括使用免疫测定法检测样品中的FkpA和将样品中检测到的FkpA的量与一种或多种浓度的超纯FkpA参照标准的检测比较。在一些实施方案中，超纯FkpA参照标准包含至少约98％的单体FkpA多肽。在一些实施方案中，通过本文所述的任何方法制备超纯FkpA参照标准。在一些实施方案中，免疫测定法包含特异性结合超纯FkpA参照标准的抗体。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体用作免疫测定法中的捕获抗体。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体用作检测抗体。在一些实施方案中，检测抗体与检测试剂缀合。在一些实施方案中，检测试剂是辣根过氧化物酶。在一些实施方案中，根据本文所述的任何方法制备特异性结合FkpA的抗体。在一些实施方案中，FkpA是大肠杆菌FkpA。在一些实施方案中，样品包含宿主细胞中制备的重组多肽。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞过表达FkpA。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物。在一些实施方案中，样品获自重组多肽制剂，并且其中已经使重组多肽制剂进行一个或多个层析法纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制剂是最终纯化的产物。在一些实施方案中，包含在重组多肽样品中的重组多肽是抗体或免疫粘附素。在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。在一些实施方案中，重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
[0021] 在一些实施方案中，本发明提供了用于检测样品中的FkpA的免疫测定方法，其中所述样品从来自宿主细胞系的重组多肽制剂获得，所述方法包括：(a)使结合FkpA的捕获抗体与样品接触从而产生样品-捕获抗体组合物质；(b)使结合FkpA的检测抗体与样品-捕获抗体组合物质接触；和(c)检测与样品-捕获抗体组合物质结合的抗体。在一些实施方案中，免疫测定法还包括使用标准滴定曲线定量结合的检测抗体水平。在一些实施方案中，免疫测定法还包括基于结合的检测抗体水平计算样品中存在的FkpA的量。在一些实施方案中，通过将标准滴定曲线与用超纯FkpA组合物产生的标准滴定曲线比较确定样品中存在的FkpA的量。在一些实施方案中，超纯FkpA组合物包含至少约98％的FkpA多肽(例如单体FkpA)。在一些实施方案中，通过本文所述的任何方法制备组合物中的超纯FkpA。在一些实施方案中，捕获抗体特异性结合超纯FkpA。在一些实施方案中，检测抗体特异性结合超纯FkpA。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，结合FkpA的第二检测抗体缀合辣根过氧化物酶。在一些实施方案中，根据本文所述的任何方法产生多克隆抗体。在一些实施方案中，免疫测定法是夹心测定法。在一些实施方案中，夹心测定法是酶联免疫吸附测定法(ELISA)。在一些实施方案中，FkpA是大肠杆菌FkpA。在一些实施方案中，重组多肽制剂或宿主细胞系获自大肠杆菌。在一些实施方案中，宿主细胞系表达外源FkpA。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物。在一些实施方案中，样品获自重组多肽制剂，并且其中重组多肽制剂已经进行一个或多个层析法纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制剂是最终纯化的产物。
[0022] 在一些实施方案中，免疫测定法用于分析抗体或免疫粘附素的制剂。在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体，其包含结合IL13的第一结合结构域和结合IL17的第二结合结构域。在一些实施方案中，IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，IL17是人IL17。在一些实施方案中，第二结合结构域结合人IL17AA、IL17FF和IL17AF。在一些实施方案中，IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链。
[0023] 在一些实施方案中，本发明提供了用于包含由细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物的质量测定法，所述质量测定法包括使药物组合物的样品进行如本文所述的免疫测定方法以检测在药物组合物中FkpA的存在或量。在一些实施方案中，药物组合物中检测到的FkpA的量不超过约30ppm、约25ppm、约20ppm、约15ppm、约14ppm、约13ppm、约12ppm、约11ppm、约10ppm、约9ppm、约8ppm、约7ppm、约6ppm、约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约
0.1ppm，如通过免疫测定法测定的。在一些实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，细菌细胞表达外源FkpA。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物。在一些实施方案中，样品获自重组多肽制剂，并且其中重组多肽制剂已经进行一个或多个层析法纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制剂是最终纯化的产物。在一些实施方案中，重组多肽是抗体或免疫粘附素。在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。在一些实施方案中，重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
0.1ppm，如通过免疫测定法测定的。在一些实施方案中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，细菌细胞表达外源FkpA。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物。在一些实施方案中，样品获自重组多肽制剂，并且其中重组多肽制剂已经进行一个或多个层析法纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制剂是最终纯化的产物。在一些实施方案中，重组多肽是抗体或免疫粘附素。在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体、双特异性抗体、半抗体或抗体片段。在一些实施方案中，重组多肽是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
[0024] 在一些实施方案中，本发明提供用于双特异性抗体的质量测定法，所述双特异性抗体包含结合IL13的第一结合结构域和结合IL17的第二结合结构域。在一些实施方案中，IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，IL17是人IL17。在一些实施方案中，第二结合结构域结合人IL17AA、IL17FF和IL17AF。在一些实施方案中，IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，所述测定法还包括检测药物组合物中DsbA和/或DsbC的量的步骤。在一些实施方案中，DsbA的量不超过约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约
0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约
0.1ppm。在一些实施方案中，DsbC的量不超过约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约
0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约
0.1ppm，如通过免疫测定法测定的。
0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约
0.1ppm。在一些实施方案中，DsbC的量不超过约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约
0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约
0.1ppm，如通过免疫测定法测定的。
[0025] 在一些实施方案中，本发明提供了用于检测包含由细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的FkpA的试剂盒，所述试剂盒包含通过本文所述的任何方法制备的抗FkpA抗体或本文所述的抗FkpA抗体的任何组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含超纯FkpA，用作参照标准产生用于定量样品中的FkpA的标准曲线和/或用作阳性对照。在一些实施方案中，根据本文所述的任何方法制备超纯FkpA。
[0026] 在一些方面，本发明提供了包含重组多肽的组合物，其中所述重组多肽在表达内源FkpA的宿主细胞中产生，其中所述组合物包含浓度不超过约6ppm、约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约
0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，通过免疫测定法测定FkpA的浓度。在一些实施方案中，通过本文所述的任何免疫测定法测定FkpA的浓度。在一些实施方案中，在被工程化以表达外源FkpA的宿主细胞中产生重组多肽，其中组合物包含不超过约
15ppm、约6ppm、约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约
0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm。在一些实施方案中，重组多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，组合物包含至少约0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，宿主细胞表达外源FkpA，其中组合物包含不超过约
13ppm。在一些实施方案中，宿主细胞表达外源FkpA，其中组合物包含不超过约0.7ppm。在一些实施方案中，宿主细胞表达外源FkpA，其中组合物包含不超过约6ppm。
0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，通过免疫测定法测定FkpA的浓度。在一些实施方案中，通过本文所述的任何免疫测定法测定FkpA的浓度。在一些实施方案中，在被工程化以表达外源FkpA的宿主细胞中产生重组多肽，其中组合物包含不超过约
15ppm、约6ppm、约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约
0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm。在一些实施方案中，重组多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，组合物包含至少约0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，宿主细胞表达外源FkpA，其中组合物包含不超过约
13ppm。在一些实施方案中，宿主细胞表达外源FkpA，其中组合物包含不超过约0.7ppm。在一些实施方案中，宿主细胞表达外源FkpA，其中组合物包含不超过约6ppm。
[0027] 在一些实施方案中，本发明提供了包含双特异性抗体的组合物，其中双特异性抗体包含结合IL13的第一结合结构域和结合IL17的第二结合结构域。在一些实施方案中，IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，IL17是人IL17。在一些实施方案中，第二结合结构域结合人IL17AA、IL17FF和IL17AF。在一些实施方案中，IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，DsbA的量不超过约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约
1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm。在一些实施方案中，通过免疫测定法测定DsbA的量。在一些实施方案中，DsbC的量不超过约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约
0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm。在一些实施方案中，通过免疫测定测定DsbC的量。在一些实施方案中，组合物基本上不含FkpA。在一些实施方案中，组合物基本上不含DsbA。在一些实施方案中，组合物基本上不含DsbC。
1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm。在一些实施方案中，通过免疫测定法测定DsbA的量。在一些实施方案中，DsbC的量不超过约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm、约1ppm、约0.9ppm、约0.8ppm、约0.7ppm、约
0.6ppm、约0.5ppm、约0.4ppm、约0.3ppm、约0.2ppm或约0.1ppm。在一些实施方案中，通过免疫测定测定DsbC的量。在一些实施方案中，组合物基本上不含FkpA。在一些实施方案中，组合物基本上不含DsbA。在一些实施方案中，组合物基本上不含DsbC。
[0028] 在一些实施方案中，本发明提供包含双特异性抗体的组合物，其中重组多肽通过以下方法产生，所述方法包括：a)向宿主细胞导入i)编码第一重链和第一轻链的核酸，其中所述第一重链和所述第一轻链形成第一抗原结合结构域；ii)编码第二重链和第二轻链的核酸，其中所述第二重链和所述第二轻链形成第二抗原结合结构域；iii)编码FkpA多肽的核酸；其中第一重链和第二重链形成Fc结构域；和b)纯化抗体，其中所述组合物包含少于约5ppm的FkpA。在一些实施方案中，本发明提供包含双特异性抗体的组合物，其中所述双特异性抗体通过以下方法产生，所述方法包括：a)向第一宿主细胞导入i)编码第一重链和第一轻链的核酸，其中所述第一重链和第一轻链形成第一抗原结合结构域；ii)编码FkpA多肽的核酸；b)向第二宿主细胞导入i)编码第二重链和第二轻链的核酸，其中所述第二重链和所述第二轻链形成第二抗原结合结构域；ii)编码FkpA多肽的核酸；b)分离第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域；c)在第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域组装形成双特异性抗体的条件下，将第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域组合；和b)纯化双特异性抗体，其中所述组合物包含少于约5ppm的FkpA。在一些实施方案中，组合物包含少于约
1ppm的FkpA。在一些实施方案中，宿主细胞是原核宿主细胞。在一些实施方案中，第一宿主细胞和第二宿主细胞是原核宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。在一些实施方案中，FkpA是大肠杆菌FkpA。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含结合IL13的第一结合结构域和结合IL17的第二结合结构域。在一些实施方案中，IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，IL17是人IL17。在一些实施方案中，第二结合结构域结合人IL17AA、IL17FF和IL17AF。在一些实施方案中，其中IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：
22的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，组合物包含不超过约15ppm的DsbA。在一些实施方案中，组合物包含不超过约5ppm的DsbA。在一些实施方案中，组合物包含不超过约15ppm的DsbC。在一些实施方案中，组合物包含不超过约5ppm的DsbC。在一些实施方案中，通过免疫测定法测定DsbA。在一些实施方案中，通过免疫测定法测量DsbC。
1ppm的FkpA。在一些实施方案中，宿主细胞是原核宿主细胞。在一些实施方案中，第一宿主细胞和第二宿主细胞是原核宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。在一些实施方案中，FkpA是大肠杆菌FkpA。
在一些实施方案中，双特异性抗体包含结合IL13的第一结合结构域和结合IL17的第二结合结构域。在一些实施方案中，IL13包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一结合结构域包含包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，IL17是人IL17。在一些实施方案中，第二结合结构域结合人IL17AA、IL17FF和IL17AF。在一些实施方案中，其中IL17A包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的氨基酸序列，IL17F包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：
22的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，双特异性抗体的第二结合结构域包含包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，组合物包含不超过约15ppm的DsbA。在一些实施方案中，组合物包含不超过约5ppm的DsbA。在一些实施方案中，组合物包含不超过约15ppm的DsbC。在一些实施方案中，组合物包含不超过约5ppm的DsbC。在一些实施方案中，通过免疫测定法测定DsbA。在一些实施方案中，通过免疫测定法测量DsbC。
[0029] 本发明提供了从包含多特异性抗体和一种或多种杂质的组合物纯化多肽的方法，所述方法包括以下有顺序的步骤：a)使组合物进行亲和层析法以产生亲和洗脱液，b)使亲和洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和c)使混合模式洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多肽的级分，其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。在一些实施方案中，混合模式层析法是混合模式阴离子交换层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行亲和层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行混合模式层析法。在一些实施方案中，以流经模式(flow-through mode)进行HIC。
[0030] 本发明提供了用于从包含多特异性抗体和杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，所述方法包括以下有顺序的步骤：a)使组合物进行蛋白A层析法以产生蛋白A洗脱液，b)使蛋白A洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和c)使混合模式洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多特异性抗体的级分，其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。在一些实施方案中，混合模式层析法是混合模式阴离子交换层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行亲和层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行混合模式层析法。在一些实施方案中，以流经模式进行HIC。
[0031] 在一些方面，本发明提供了用于从包含多特异性抗体和杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，其中多特异性抗体的每个臂分别产生，所述方法包括以下有顺序的步骤：a)使多特异性抗体的每个臂进行蛋白A层析法以产生多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液，b)在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液的混合物，c)使包含多特异性抗体的组合物进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和d)使混合模式洗脱液进行疏水相互作用层析法(HIC)和收集包含多特异性抗体的级分，其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。在一些实施方案中，混合模式层析法是混合模式阴离子交换层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行亲和层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行混合模式层析法。在一些实施方案中，以流经模式进行疏水相互作用层析法。在一些实施方案中，在疏水相互作用层析法之前使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行阴离子交换层析法。
[0032] 在以上方面的一些实施方案中，所述方法还包括使包含多特异性抗体的疏水相互作用层析法级分进行阳离子交换层析法和收集包含多特异性抗体的级分的步骤。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行阳离子交换层析法。
[0033] 在一些方面，本发明提供了用于从包含多肽和一种或多种杂质的组合物中纯化多肽的方法，所述方法包括以下有顺序的步骤：a)使组合物进行亲和层析法以产生亲和洗脱液，b)使亲和洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和c)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，d)使阴离子交换洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多肽的级分，其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
[0034] 在一些方面，本发明提供了用于从包含多特异性抗体和杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，所述方法包括以下有顺序的步骤：a)使组合物进行蛋白A层析法以产生蛋白A洗脱液，b)使蛋白A洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和c)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，d)使阴离子交换洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多特异性抗体的级分，其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
[0035] 在一些方面，本发明提供了用于从包含多特异性抗体和杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，其中多特异性抗体的每个臂分别产生，所述方法包括以下有顺序的步骤：a)使多特异性抗体的每个臂进行蛋白A层析法以产生多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液，b)在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液的混合物，c)使包含多特异性抗体的组合物进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和d)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，e)使阴离子交换洗脱液进行疏水相互作用层析法和收集包含多特异性抗体的级分，和收集包含多特异性抗体的级分，其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。
[0036] 在以上方面的一些实施方案中，混合模式层析法是混合模式阴离子交换层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行亲和层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行混合模式层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行阴离子交换层析法。
在一些实施方案中，以流经模式进行疏水相互作用层析法。在一些实施方案中，所述方法还包括使包含多特异性抗体的疏水相互作用层析法级分进行阳离子交换层析法的步骤。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行阳离子交换层析法。在一些实施方案中，所述方法还包括使包含多特异性抗体的疏水相互作用层析法级分进行超滤的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括使包含多特异性抗体的阳离子交换级分进行超滤的步骤。在一些实施方案中，超滤顺次包括第一超滤、渗滤和第二超滤。
在一些实施方案中，以流经模式进行疏水相互作用层析法。在一些实施方案中，所述方法还包括使包含多特异性抗体的疏水相互作用层析法级分进行阳离子交换层析法的步骤。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行阳离子交换层析法。在一些实施方案中，所述方法还包括使包含多特异性抗体的疏水相互作用层析法级分进行超滤的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括使包含多特异性抗体的阳离子交换级分进行超滤的步骤。在一些实施方案中，超滤顺次包括第一超滤、渗滤和第二超滤。
[0037] 在一些方面，本发明提供了用于从包含多肽和一种或多种杂质的组合物中纯化多肽的方法，所述方法包括：a)使组合物进行亲和层析法以产生亲和洗脱液，b)使亲和洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和c)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，d)使阴离子交换洗脱液进行羟磷灰石层析法和收集包含多肽的级分，其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。在一些实施方案中，本发明提供了用于从包含多特异性抗体和一种或多种杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，所述方法包括以下有顺序的步骤：a)使组合物进行蛋白A层析法以产生蛋白A洗脱液，b)使蛋白A洗脱液进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和c)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，d)使阴离子交换洗脱液进行羟磷灰石层析法和收集包含多特异性抗体的级分，其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。在一些实施方案中，本发明提供了用于从包含多特异性抗体和一种或多种杂质的组合物中纯化多特异性抗体的方法，其中所述多特异性抗体包含多个臂，每个臂包含VH/VL单元，其中多特异性抗体的每个臂分别产生，所述方法包括以下有顺序的步骤：a)使多特异性抗体的每个臂进行蛋白A层析法以产生多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液，b)在足以产生包含多特异性抗体的组合物的条件下形成包含多特异性抗体每个臂的蛋白A洗脱液的混合物，c)使包含多特异性抗体的组合物进行混合模式层析法以产生混合模式洗脱液，和d)使混合模式洗脱液进行阴离子交换层析法以产生阴离子交换洗脱液，e)使阴离子交换洗脱液进行羟磷灰石层析法和收集包含多特异性抗体的级分，和收集包含多特异性抗体的级分，其中所述方法从组合物中减少产物特异性杂质的量。在一些实施方案中，混合模式层析法是混合模式阴离子交换层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行亲和层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行蛋白A层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行混合模式层析法。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行阴离子交换层析法。在一些实施方案中，以流经模式进行羟磷灰石层析法。
[0038] 在上述方面和实施方案的一些实施方案中，蛋白A层析法包含与琼脂糖连接的蛋白A。在一些实施方案中，蛋白A层析法是MabSelectTM、MabSelect SuReTM和MabSelect SuReTMLX、 -vA、 Ultra Plus、Protein A Fast Flow、或AF-rProtein A层析法。在一些实施方案中，蛋白A层析法使用蛋白A平衡缓冲
液、蛋白A加载缓冲液或蛋白A洗涤缓冲液中的一种或多种，其中平衡缓冲液、加载缓冲液和/或洗涤缓冲液是约pH 7至约pH 8。在一些实施方案中，蛋白A平衡缓冲液为约pH 7.7。在一些实施方案中，蛋白A平衡缓冲液包含约25mM Tris和约25mM NaCl。在一些实施方案中，蛋白A层析法在加载后用平衡缓冲液洗涤。在一些实施方案中，通过pH梯度从蛋白A层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，通过将具有低pH的蛋白A洗脱缓冲液施加到蛋白A层析法从蛋白A洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，蛋白A洗脱缓冲液包含约150mM乙酸，约pH2.9。在一些实施方案中，当洗脱液的OD280大于约0.5时，汇集蛋白A洗脱液。
液、蛋白A加载缓冲液或蛋白A洗涤缓冲液中的一种或多种，其中平衡缓冲液、加载缓冲液和/或洗涤缓冲液是约pH 7至约pH 8。在一些实施方案中，蛋白A平衡缓冲液为约pH 7.7。在一些实施方案中，蛋白A平衡缓冲液包含约25mM Tris和约25mM NaCl。在一些实施方案中，蛋白A层析法在加载后用平衡缓冲液洗涤。在一些实施方案中，通过pH梯度从蛋白A层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，通过将具有低pH的蛋白A洗脱缓冲液施加到蛋白A层析法从蛋白A洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，蛋白A洗脱缓冲液包含约150mM乙酸，约pH2.9。在一些实施方案中，当洗脱液的OD280大于约0.5时，汇集蛋白A洗脱液。
[0039] 在以上方面和实施方案的一些实施方案中，混合模式层析法包含季胺和疏水部分。在一些实施方案中，混合模式层析法包含季胺和与高度交联的琼脂糖连接的疏水部分。在一些实施方案中，混合模式层析法包含N-苄基-n-甲基乙醇胺。在一些实施方案中，混合模式层析法是CaptoTM粘附层析法。在一些实施方案中，混合模式层析法使用混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液、混合模式加载缓冲液或混合模式洗涤缓冲液中的一种或多种，其中混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液约pH6至约pH7。在一些实施方案中，混合模式预平衡缓冲液、混合模式平衡缓冲液和/或混合模式洗涤缓冲液约pH 6.5。在一些实施方案中，混合模式预平衡缓冲液包含约500mM乙酸盐。在一些实施方案中，混合模式平衡缓冲液包含约50mM乙酸盐。在一些实施方案中，在加载后用洗涤缓冲液洗涤混合模式层析法。在一些实施方案中，通过pH梯度从混合模式层析法中洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，通过将具有低pH的混合模式洗脱缓冲液施加到混合模式阴离子交换层析法上从混合模式层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，混合模式洗脱缓冲液包含约pH 5.2的约25mM乙酸盐。在一些实施方案中，当洗脱液的OD280大于约0.5至约1.0时汇集混合模式洗脱液。
[0040] 在上述方面和实施方案的一些实施方案中，疏水相互作用层析法(HIC)包含疏水部分。在一些实施方案中，疏水相互作用层析法包含苯基部分。在一些实施方案中，疏水相互作用层析法包含与交联的琼脂糖连接的疏水部分。在一些实施方案中，疏水相互作用层析法包含与交联的琼脂糖连接的苯基部分或丁基部分。在一些实施方案中，疏水相互作用层析法是Phenyl 层析法或Butyl 层析法。在一些实施方案中，疏水相互作用交换层析法使用HIC平衡缓冲液、HIC加载缓冲液或HIC洗涤缓冲液中的一种或多种，其中HIC平衡缓冲液、HIC加载缓冲液和/或HIC洗涤缓冲液是在约pH 5至约pH6之间。在一些实施方案中，HIC平衡缓冲液、加载缓冲液和/或洗涤缓冲液为约pH 5.5。在一些实施方案中，HIC平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含约170mM乙酸盐。在一些实施方案中，HIC加载缓冲液是50mM Tris、100mM乙酸钠，pH约5.5。
[0041] 在一些实施方案中，疏水相互作用层析法包含己基部分。在一些实施方案中，疏水相互作用层析法包含与羟化甲基丙烯酸聚合物连接的疏水部分。在一些实施方案中，疏水相互作用层析法包含与羟化甲基丙烯酸聚合物连接的己基部分。在一些实施方案中，疏水相互作用层析法是 Hexyl 650C。在一些实施方案中，疏水相互作用交换层析法使用HIC平衡缓冲液、HIC加载缓冲液或HIC洗涤缓冲液中的一种或多种，其中HIC平衡缓冲液、HIC加载缓冲液和/或HIC洗涤缓冲液是在约pH6至约pH8之间。在一些实施方案中，HIC平衡缓冲液、加载缓冲液和/或洗涤缓冲液是约pH 7.0。在一些实施方案中，HIC平衡缓冲液和洗涤缓冲液包含约50mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和125mM乙酸盐。
[0042] 在一些实施方案中，在加载后用HIC洗涤缓冲液洗涤疏水相互作用层析法。在一些实施方案中，当洗脱液的OD280大于约0.5至约1.0时，汇集疏水相互作用洗脱液。
[0043] 在以上方面和实施方案的一些实施方案中，阴离子交换层析法包含季胺。在一些实施方案中，阴离子交换层析法包含与交联的琼脂糖连接的季胺。在一些实施方案中，混合模式阴离子交换层析法是Q Fast Flow(QSFF)层析法。在一些实施方案中，阴离子交换层析法使用阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液或阴离子交换加载缓冲液中的一种或多种，其中阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液和/或阴离子交换加载缓冲液是约pH8至约pH9。在一些实施方案中，阴离子交换预平衡缓冲液、阴离子交换平衡缓冲液和/或阴离子交换加载缓冲液为约pH 8.5。在一些实施方案中，阴离子交换预平衡缓冲液包含约50mM Tris、500mM乙酸钠。在一些实施方案中，阴离子交换平衡缓冲液包含约50mM Tris。在一些实施方案中，在加载后用阴离子交换平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析法。在一些实施方案中，通过盐梯度从阴离子交换层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，通过将具有增加盐浓度的阴离子交换洗脱缓冲液施加到阴离子交换层析法从阴离子交换层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，阴离子交换洗脱缓冲液包含约
50mM Tris、100mM乙酸钠，约pH 8.5。在一些实施方案中，当洗脱液的OD280大于约0.5至约
1.0时汇集阴离子交换洗脱液。
50mM Tris、100mM乙酸钠，约pH 8.5。在一些实施方案中，当洗脱液的OD280大于约0.5至约
1.0时汇集阴离子交换洗脱液。
[0044] 在以上方面和实施方案的一些实施方案中，羟磷灰石层析法是陶瓷羟磷灰石层析法。在一些实施方案中，羟磷灰石层析法是CHT I型陶瓷羟磷灰石层析法。在一些实施方案中，羟磷灰石层析法使用羟磷灰石缓冲液A或羟磷灰石缓冲液B中的一种或多种，其中与羟磷灰石缓冲液A相比，羟磷灰石缓冲液B具有更高的电导率。在一些实施方案中，羟磷灰石缓冲液A是包含约pH 6.8的约10mM磷酸钠的平衡缓冲液。在一些实施方案中，羟磷灰石缓冲液B包含约10mM磷酸钠和约1M氯化钠，约pH 6.8。在一些实施方案中，使用羟磷灰石缓冲液A中的羟磷灰石缓冲液B的梯度从羟磷灰石层析法洗脱多肽或多特异性抗体。在一些实施方案中，梯度是线性梯度。在一些实施方案中，梯度从约0％羟磷灰石缓冲液B增加至约100％羟磷灰石缓冲液B。在一些实施方案中，梯度在约20个柱体积中从0％羟磷灰石缓冲液B增加至100％羟磷灰石缓冲液B。在一些实施方案中，当洗脱液的OD280大于约0.5至约1.0时，汇集羟磷灰石洗脱液。
[0045] 在以上方面和实施方案的一些实施方案中，阳离子交换层析法包含羧酸部分或磺酸部分。在一些实施方案中，羧酸部分或磺酸部分是磺丙基、磺乙基、磺基异丁基或羧基部分。在一些实施方案中，阳离子交换层析法包含与交联的琼脂糖连接的羧酸部分或磺酸部分。在一些实施方案中，阳离子交换材料是 HS 50、 HS 20、SO3 Monolith、S Ceramic sulphopropyl- Fast Flow(SPSFF)、SP-
XL(SPXL)、CM Fast Flow、CaptoTM S、 EMD Se
Hicap、 EMD SO3-,或 EMD COO-。在一些实施方案中，阳离子交换
加载密度小于约20g/L。在一些实施方案中，阳离子交换层析法使用阳离子交换预平衡缓冲液、阳离子交换平衡缓冲液、阳离子交换加载缓冲液或阳离子交换洗涤缓冲液中的一种或多种，其中阳离子交换预平衡缓冲液、阳离子交换平衡缓冲液、阳离子交换加载缓冲液和/或阳离子交换洗涤缓冲液是约pH 5.0至约pH 6.0。在一些实施方案中，阳离子交换阳离子交换平衡缓冲液、阳离子交换加载缓冲液和/或阳离子交换洗涤缓冲液为约pH 5.5。在一些实施方案中，阳离子交换平衡缓冲液包含50mM乙酸钠。在一些实施方案中，阳离子交换洗涤缓冲液包含50mM乙酸钠。在一些实施方案中，在加载后用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析法。在一些实施方案中，通过盐梯度从阳离子交换层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，通过将具有增加盐浓度的阳离子交换洗脱缓冲液施加到阳离子交换层析法从阳离子交换层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，阳离子交换洗脱缓冲液包含500mM乙酸钠，pH5.8。在一些实施方案中，洗脱是10％至100％阳离子交换洗脱缓冲液的梯度洗脱。在一些实施方案中，当洗脱液的OD280大于约0.5至约1.0时汇集阳离子交换洗脱液。
XL(SPXL)、CM Fast Flow、CaptoTM S、 EMD Se
Hicap、 EMD SO3-,或 EMD COO-。在一些实施方案中，阳离子交换
加载密度小于约20g/L。在一些实施方案中，阳离子交换层析法使用阳离子交换预平衡缓冲液、阳离子交换平衡缓冲液、阳离子交换加载缓冲液或阳离子交换洗涤缓冲液中的一种或多种，其中阳离子交换预平衡缓冲液、阳离子交换平衡缓冲液、阳离子交换加载缓冲液和/或阳离子交换洗涤缓冲液是约pH 5.0至约pH 6.0。在一些实施方案中，阳离子交换阳离子交换平衡缓冲液、阳离子交换加载缓冲液和/或阳离子交换洗涤缓冲液为约pH 5.5。在一些实施方案中，阳离子交换平衡缓冲液包含50mM乙酸钠。在一些实施方案中，阳离子交换洗涤缓冲液包含50mM乙酸钠。在一些实施方案中，在加载后用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析法。在一些实施方案中，通过盐梯度从阳离子交换层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，通过将具有增加盐浓度的阳离子交换洗脱缓冲液施加到阳离子交换层析法从阳离子交换层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，阳离子交换洗脱缓冲液包含500mM乙酸钠，pH5.8。在一些实施方案中，洗脱是10％至100％阳离子交换洗脱缓冲液的梯度洗脱。在一些实施方案中，当洗脱液的OD280大于约0.5至约1.0时汇集阳离子交换洗脱液。
[0046] 在上述方面和实施方案的一些实施方案中，多特异性抗体的臂在细胞中产生。在一些实施方案中，细胞是原核细胞。在一些实施方案中，原核细胞在大肠杆菌细胞中。在一些实施方案中，细胞被工程化以表达一种或多种分子伴侣。在一些实施方案中，分子伴侣是FkpA、DsbA或DsbC中的一种或多种。在一些实施方案中，分子伴侣是大肠杆菌分子伴侣。在一些实施方案中，在蛋白A层析法之前裂解细胞以产生包含多特异性抗体或多特异性抗体的臂的细胞裂解物。在一些实施方案中，使用微流化器裂解细胞。在一些实施方案中，在层析法之前将聚乙二醇亚胺(polyethlyeneimine，PEI)加入到细胞裂解物中。在一些实施方案中，将PEI加入到裂解物中至约0.4％的终浓度。在一些实施方案中，通过离心澄清细胞裂解物。
[0047] 在上述方面和实施方案的一些实施方案中，产物特异性杂质是非配对抗体臂、抗体同二聚体、聚集体、高分子量物质(HMW)、低分子量物质(LMW)、酸性变体或碱性变体中的一种或多种。在一些实施方案中，所述方法减少组合物中的大肠杆菌蛋白(ECP)、FkpA、DsbA、DsbC、浸出的蛋白A、核酸、细胞培养基组分或病毒杂质中任一种的量。
[0048] 在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体的第一臂结合IL13。在一些实施方案中，IL13是人IL13。在一些实施方案中，IL13包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，多特异性抗体的第一臂包含包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，多特异性抗体的第一臂包含包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，多特异性抗体的第一臂包含包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，多特异性抗体的第一臂包含包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，多特异性抗体的第一臂包含包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，抗体的第二臂结合IL17。在一些实施方案中，IL17是人IL17。在一些实施方案中，IL17包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在一些实施方案中，多特异性抗体的第二臂包含包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，多特异性抗体的第二臂包含包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VH序列和包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VL序列。在一些实施方案中，多特异性抗体的第二臂包含包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，多特异性抗体的第二臂包含包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，多特异性抗体的第二臂包含包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的轻链。
[0049] 在一些方面，本发明提供包含通过本文所述的任何方法纯化的多特异性抗体的组合物，其中所述组合物包含不超过约5％、4％、3％、2％或1％的产物特异性杂质。在一些实施方案中，产物特异性杂质是非配对抗体臂、抗体同二聚体、聚集体、高分子量物质(HMW)、低分子量物质(LMW)、酸性变体或碱性变体中的一种或多种。在一些实施方案中，组合物包含少于约组合物包含不超过约5％、4％、3％、2％或1％的组合物中的大肠杆菌蛋白(ECP)、FkpA、DsbA、DsbC、浸出的蛋白A、核酸、细胞培养基组分或病毒杂质。附图的简要说明
[0050] 图1显示来自用于纯化FkpA的用强阳离子交换介质SP Fast Flow(GE)填充的重力流柱的级分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。泳道标记如右侧所示。
[0051] 图2显示来自SP Fast Flow(GE)层析法的层析图，其使用步骤洗脱纯化FkpA。
[0052] 图3A和3B显示来自SP Fast Flow(GE)层析法(使用步骤洗脱纯化FkpA)的级分3-13(图3A)和14-23(图3B)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。泳道标记如右侧所示。
[0053] 图4显示使用梯度洗脱纯化FkpA的SP Fast Flow(GE)层析法的层析图。
[0054] 图5显示来自用于纯化FkpA的用阴离子交换层析介质Q Fast Flow(GE)和疏水相互作用层析法(HIC)介质Phenyl Fast Flow(低取代)(GE)填充
的重力流柱的级分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。泳道标记如下所示。
的重力流柱的级分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。泳道标记如下所示。
[0055] 图6显示来自用于纯化FkpA的用疏水相互作用层析法(HIC)介质Butyl-S6 Fast Flow(GE)填充的重力流柱的级分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
泳道标记如下所示。
泳道标记如下所示。
[0056] 图7A和7B显示来自用于纯化FkpA的用疏水相互作用层析法(HIC)介质Butyl4 Fast Flow(GE)填充的重力流柱的级分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
泳道标记如右侧所示。
泳道标记如右侧所示。
[0057] 图8显示来自用于纯化FkpA的用疏水相互作用层析法(HIC)介质Butyl-S6 Fast Flow(GE)填充的重力流柱的级分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
(PAGE)。泳道标记如下所示。
(PAGE)。泳道标记如下所示。
[0058] 图9显示用于纯化FkpA的Butyl-S Fast Flow(GE)层析法的层析图。
[0059] 图10A显示来自用于纯化FkpA的用Butyl-S 材料填充的重力流柱的级分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。泳道标记如所示。图10B显示用于纯化FkpA的用Butyl-S 材料填充的重力流柱的级分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，用
SYPRO Ruby成像。泳道1-空白，泳道2-精密标准，泳道3-空白，泳道4-SP级分22-5010μL样品，泳道5-空白，泳道6-F-T/W 20 10μL样品，泳道7-空白，泳道8-PW洗脱液20μL样品，泳道
9-空白，泳道10-后池20μL样品。
SYPRO Ruby成像。泳道1-空白，泳道2-精密标准，泳道3-空白，泳道4-SP级分22-5010μL样品，泳道5-空白，泳道6-F-T/W 20 10μL样品，泳道7-空白，泳道8-PW洗脱液20μL样品，泳道
9-空白，泳道10-后池20μL样品。
[0060] 图11显示来自FkpA的Butyl-S 纯化的汇集级分的高效液相层析法(HPLC)尺寸排阻层析法(SEC)的层析图
[0061] 图12显示来自用于FkpA纯化的Superdex 200(GE)层析法的运行1的层析图。
[0062] 图13A显示来自用于FkpA纯化的Superdex 200运行1的级分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。图13B显示来自用于FkpA纯化的Superdex 200运行1的级分的用SYPRO Ruby成像的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。泳道标记如图13B底部所示。
[0063] 图14显示来自用于FkpA纯化的Superdex 200运行1的级分37的用SYPRO Ruby成像的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹。泳道标记如所示。
[0064] 图15显示用于FkpA纯化的Superdex 200的运行2的层析图。
[0065] 图16显示来自用于FkpA纯化的Superdex 200运行2的汇集级分37-44的高效液相层析法(HPLC)尺寸排阻层析法(SEC)的层析图。
[0066] 图17显示来自用于FkpA纯化的Superdex 200运行1的35-40和Superdex 200运行2-4的37-44的汇集级分的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。泳道标记如所示。
[0067] 图18显示0-3次冻融后，超纯FkpA的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。泳道标记如所示。
[0068] 图19A显示0次冻融后，超纯FkpA的高效液相层析法(HPLC)尺寸排阻层析法(SEC)的层析图。图19B显示3次冻融后，超纯FkpA的高效液相层析法(HPLC)尺寸排阻层析法(SEC)的层析图。
[0069] 图20显示使用兔A、B和C的预免疫血清和抗血清的直接结合ELISA的结果。空心圆代表来自兔A的预免疫血清，空心方块代表来自兔B的预免疫血清，空心三角代表来自兔C的预免疫血清，空心菱形代表来自兔A的抗血清，实心圆代表来自兔B的抗血清，实心方块代表来自兔C的抗血清。
[0070] 图21显示ASP抗-FkpA抗体的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。泳道标记如所示。
[0071] 图22显示使用ASP抗-FkpA抗体的直接结合ELISA的结果。
[0072] 图23显示使用ASP抗-FkpA抗体的夹心ELISA的结果。空心圆代表检测抗体稀释到1:60，空心方块代表检测抗体稀释到1:80，空心三角代表检测抗体稀释到1：100，空心菱形代表检测抗体稀释到1：110。
[0073] 图24显示来自ASP抗FkpA抗体的亲和纯化的层析图
[0074] 图25显示来自AF纯化的抗FkpA抗体的Superdex 200纯化的层析图。
[0075] 图26A显示AF纯化的抗FkpA抗体的Superdex 200纯化的级分41-63的高效液相层析法(HPLC)尺寸排阻层析法(SEC)的层析图。图26B显示AF纯化的抗FkpA抗体的Superdex 200纯化的级分64-86的高效液相层析法(HPLC)尺寸排阻层析法(SEC)的层析图。
[0076] 图27显示使用AF抗-FkpA抗体的夹心ELISA的结果。空心圆代表检测抗体稀释到1：2000，空心方块代表检测抗体稀释到1：4000，空心三角代表检测抗体稀释到1：6000，空心菱形代表检测抗体稀释到1：8000。
[0077] 图28A显示使用ASP抗-FkpA抗体的夹心ELISA的结果。图28B显示使用AF抗-FkpA抗体的夹心ELISA的结果。
[0078] 图29显示来自AF抗-FkpA抗体的高效液相层析法(HPLC)尺寸排阻层析法的层析图。
[0079] 图30显示0-3次冻融后，AF纯化的抗FkpA抗体的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。泳道标记如所示。
[0080] 图31A显示0次冻融后，AF-纯化的抗FkpA抗体的高效液相层析法(HPLC)尺寸排阻层析法(SEC)的层析图。图31B显示3次冻融后，AF纯化的抗-FkpA抗体的高效液相层析法(HPLC)尺寸排阻层析法(SEC)的层析图。
[0081] 图32显示AF抗-FkpA抗体的样品冻融稳定性的功能测试。
[0082] 图33显示使用来自随后兔A、B和C出血的ASP抗-FkpA抗体的夹心ELISA的结果。空心圆代表亲和纯化的包被抗体，空心方块代表未裂解的包被抗体，空心三角代表裂解的包被抗体。
[0083] 图34显示超纯FkpA在-70℃和2-8℃下随时间监控的稳定性控制。
[0084] 图35A显示当在0.2％鱼明胶、1mg/mL ApoMab或缓冲液C中稀释至3ng/mL时超纯FkpA随时间监控的稳定性控制。图35B显示当在0.2％鱼明胶、1mg/mL ApoMab或缓冲液C中稀释至15ng/mL时超纯FkpA随时间监控的稳定性控制。
[0085] 图36显示使用不同FkpA标准的夹心ELISA的结果。空心圆代表超纯FkpA标准，空心方块代表MyBioSource FkpA标准目录号MBS1037402，空心三角代表MyBioSource FkpA标准目录号MBS1182120。
[0086] 图37A和37B显示在混合模式阴离子交换(CaptoTM Adhere，图37B)和传统离子交换(QSFF，图37A)树脂上针对产物相关杂质分辨的高通量筛选。
[0087] 图38A和38B显示在疏水相互作用层析法树脂上乙酸钠中针对产物结合能力的高通量筛选结果。
[0088] 图39显示在乙酸钠存在下在疏水相互作用层析法树脂上针对流经的FkpA水平的高通量筛选结果。由于清除不够理想，对于WPHI-Propyl、 PPG-600M、Phenyl-650M、 Ether-650M没有进行完全测试。
[0089] 图40A、40B、40C和40D分别显示双特异性抗体生产方法1、2、3和4的流程图。发明的详细描述
[0090] 本发明提供了产生FkpA超纯组合物的方法。这样的组合物用于生产对FkpA高度特异和敏感的抗体。该抗体依次又可用于检测在细菌发酵培养物中制备的重组多肽中的FkpA，其中FkpA被表达以促进重组多肽的折叠和组装。例如，抗体可用于开发重组多肽(如包括多特异性抗体的抗体)药物制剂中的释放测定法中。
[0091] 在一些方面，本发明提供了在表达外源FkpA的宿主细胞中产生的重组多肽的组合物，其中所述组合物包含不超过约10ppm的FkpA、约9ppm、约8ppm、约7ppm、约6ppm、约5ppm、约4ppm、约3ppm、约2ppm或约1ppm。在一些实施方案中，重组多肽是多特异性抗体，如结合IL13和IL17的双特异性抗体。
[0092] 在一些方面，本发明提供了用于纯化多特异性抗体的方法，其包括使包含多特异性抗体的组合物进行a)蛋白A层析法、b)混合模式层析法和c)疏水相互作用层析法的有顺序的步骤。在一些方面，本发明提供了用于纯化多特异性抗体的方法，其中多特异性抗体的各臂在分别的培养物中产生并通过蛋白A层析法纯化。然后将纯化的抗体臂组装以产生多特异性抗体。然后使组装的多特异性抗体进行混合模式阴离子交换层析法，随后进行疏水相互作用层析法。
[0093] 在一些实施方案中，本发明提供包含基本上不含产物特异性杂质的多特异性抗体的组合物，所述产物特异性杂质如未配对的抗体臂、同二聚体、聚集体、低分子量物质、酸性和碱性变体。在一些实施方案中，组合物基本上不含方法特异性杂质，所述方法特异性杂质如大肠杆菌蛋白和DNA以及分子伴侣，包括FkpA、DsbA和DsbC。I.定义
[0094] 术语“检测”在本文中以最广泛的含义使用，包括靶分子的定性和定量测量。检测包括仅仅鉴定样品中靶分子的存在以及确定靶分子是否在样品中以可检测的水平存在。
[0095] 术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。该术语还包括已被天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。定义中还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽以及本领域已知的其他修饰。如本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”尤其包括抗体。
[0096] “纯化的”多肽(例如抗体或免疫粘附素等)意指纯度已经增加的多肽，使得该多肽以比其存在于天然环境时和/或最初合成时和/或在实验室条件下扩增时更高的纯度形式存在。纯度是一个相对的术语，并不一定意味着绝对的纯度。
[0097] 如本文所用，“超纯FkpA”是指FkpA组合物，其中组合物中至少约95％的蛋白质是期望的蛋白FkpA。在一些实例中，超纯FkpA包含至少约96％、97％、98％、99％或99.5％的FkpA。在一些实施方案中，FkpA纯度由SEC测定。
[0098] 当用于指多肽时，“FkpA”蛋白是指细菌FKBP型肽基脯氨酰基顺反异构酶。FkpA是周质蛋白二硫化物异构酶I，显示顺式/反式肽基-脯氨酰基异构酶(PPIase)和分子伴侣活性。
[0099] 如本文所用，“FkpA”也可以被称为FKBP型肽基脯氨酰基顺反异构酶(FkpA)周质蛋白二硫化物异构酶I。示例性FkpA蛋白是大肠杆菌FkpA。大肠杆菌FkpA的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。大肠杆菌FkbA基因的核酸序列由(SEQ ID NO：3)提供。在一些实施方案中，大肠杆菌FkpA是指由EcoGene登录号EG12900描述的fkpA基因编码的蛋白质。在一些实施方案中，大肠杆菌FkpA是指具有由NCBI RefSeq登录号NP_417806描述的序列的蛋白质。其他FkpA蛋白是本领域已知的。FKpA蛋白的实例可以包括但不限于S.boydii肽基-脯氨酰基异构酶(NCBI RefSeq No.WP_000838252)、C.youngae肽基-脯氨酰基异构酶(NCBI RefSeq No.WP_006687366)、产酸克雷伯菌(K.Oxytoca)肽酰-脯氨酰基异构酶(NCBI RefSeq No.WP_004125943)、肠道沙门菌(S.Enterica)肽基-脯氨酰基异构酶(NCBI RefSeq No.WP_000838233)、肺炎克雷伯氏菌(K.Pneumoniae)肽基-脯氨酰基异构酶(NCBI RefSeq No.WP_019704642)，酿酒酵母(S.cerevisiae)FPR3p(NCBI RefSeq No.NP_013637)、小家鼠(M.musculus)Fkpb1a(NCBI RefSeq No.NP_032045)、小家鼠(M.musculus)Fkpb2(NCBI RefSeq No.NP_032046)、智人(H.Sapiens)FKBP2(NCBI RefSeq No.NP_001128680)和黑腹果蝇(D.Melanogaster)CG14715(NCBI RefSeq No.NP_650101)。在一些实施方案中，本公开的FkpA蛋白与大肠杆菌FkpA具有至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的同一性。在某些实施方案中，大肠杆菌FkpA包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
[0100] 当用于指多肽时，“Dsb”蛋白是指细菌二硫化物氧化还原酶。细菌二硫化物氧化还原酶是酶的二硫键家族的成员。Dsb家族的成员包括DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和DsbG。当肽出现在细胞周质中时，DsbA形成链内二硫键，DsbC在细胞周质中氧化蛋白折叠方法中充当二硫键异构酶。
[0101] 如本文所用，“DsbA”也可以称为周质蛋白二硫化物异构酶I。示例性DsbA蛋白是大肠杆菌DsbA。大肠杆菌DsbA的氨基酸序列由NCBI登录号NP_418297提供，大肠杆菌dsbA基因的核酸序列由NCBI登录号NC_000913.3或EcoGene：EG11297提供。
[0102] 如本文所用，“DsbC”也可以称为周质蛋白二硫化物异构酶II。示例性的DsbC蛋白是大肠杆菌DsbC。大肠杆菌DsbC的氨基酸序列由NCBI登录号NP_417369.1提供，大肠杆菌dsbC基因的核酸序列由NCBI登录号NC_000913.3或EcoGene：EG11070提供。
[0103] “样品”是指大量物质的一小部分。通常，根据本文所述的方法的测试是在样品上进行的。样品典型地获自重组多肽制剂，所述重组多肽制剂例如获自培养的表达重组多肽的细胞系(在本文中也称为“产物细胞系”)、或培养的宿主细胞。如本文所用，“宿主细胞”不包含用于表达目的重组多肽或产物的基因。样品可以从例如但不限于收获的细胞培养液、从纯化方法中某个步骤的处理池或者从最终的纯化产物获得。
[0104] “捕获抗体”是指特异性结合样品中的靶分子的抗体。在某些条件下，捕获抗体与靶分子形成复合物，使得抗体-靶分子复合物可从样品的其余部分分离。在某些实施方案中，这样的分离可以包括洗掉样品中不结合捕获抗体的物质或材料。在某些实施方案中，捕获抗体可以附着于固体支持物表面，如，例如但不限于平板或珠子。
[0105] “检测抗体”是指特异性结合样品中或样品捕获抗体组合物质中的靶分子的抗体。在某些条件下，检测抗体与靶分子或与靶分子捕获抗体复合物形成复合物。检测抗体能够通过可被扩增的标记物直接检测，或者例如通过使用被标记并结合检测抗体的另一种抗体间接检测。对于直接标记，检测抗体通常缀合至通过某种方式可检测的部分，例如包括但不限于生物素或钌。
[0106] 术语“标记物”或“可检测标记物”是指可以连接至待检测或定量物质(例如抗体)的任何化学基团或部分。通常，标记物是可检测的标记物，适用于物质灵敏检测或定量。可检测标记物的实例包括但不限于发光标记物，例如荧光标记物、磷光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物和电化学发光标记物、放射性标记物、酶、颗粒、磁性物质、电活性物质等。或者，可检测标记物可通过参与特异性结合反应来表明其存在。这样的标记物的实例包括半抗原、抗体、生物素、链霉亲和素、His-标签、次氮基三乙酸，谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽等。
[0107] 术语“检测手段”是指用于通过之后在测定法中读出的信号报告检测可检测抗体存在的部分或技术。通常，检测手段使用放大固定的标记物的试剂，所述固定的标记物如捕获到微量滴定板上的标记物，例如抗生物素或链霉亲和素-HRP。
[0109] “化学发光”方法包括通过化学反应产生发光物质。“电化学发光”或“ECL”是当物质例如抗体暴露于适当的周围化学环境中的电化学能量时物质发光的方法。
[0110] “结合”感兴趣抗原(例如，宿主细胞蛋白)的抗体是以足够亲和力结合抗原的抗体，使得抗体可用作测定试剂，例如作为捕获抗体或作为检测抗体。通常，这种抗体不显著与其他多肽交叉反应。
[0111] 关于多肽与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性地结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位意指不同于非特异的相互作用的可测量的结合。例如，可以通过与对照分子的结合相比较测定靶分子的结合来测量特异性结合，通常对照分子为不具有结合活性的类似结构的分子。在一些实施方案中，本发明提供了特异性结合FkpA的多克隆抗体的制剂。例如，在多克隆抗体制剂中至少约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的抗体结合期望的多肽(例如FkpA)。
[0112] “亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)来表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的那些方法。
[0113] 用于本文的目的的“活性”或“活性”是指保留天然或天然存在的多肽的生物学和/或免疫学活性的多肽形式，其中“生物学”活性是指由天然或天然存在的多肽引起的生物功能(抑制性或刺激性)，而不是诱导产生针对天然或天然存在的多肽所具有的抗原表位的抗体的能力，“免疫学”活性是指诱导产生针对天然或天然存在的多肽所具有的抗原表位的抗体的能力。
[0114] 术语“拮抗剂”以最广泛的含义使用，包括部分或完全阻断、抑制或中和天然多肽的生物学活性的任何分子。以类似的方式，术语“激动剂”以最广泛的含义使用，包括模拟天然多肽的生物学活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子特别包括激动剂型或拮抗剂型抗体或抗体片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体等。用于鉴定多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使多肽与候选激动剂或拮抗剂分子接触和测量通常与多肽相关的一种或多种生物学活性的可检测变化。
[0115] 本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、半抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要其展现出期望的生物学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)与本文中的抗体可互换使用。
[0116] 抗体是天然存在的免疫球蛋白分子，其具有不同的结构，全部基于免疫球蛋白折叠。例如，IgG抗体具有两条“重”链和两条“轻”链，其被二硫键键合形成功能性抗体。作为另一个例子，通过一个或多个二硫键连接的一条重链和一条轻链形成功能性半抗体。每条重链和轻链本身包含“恒定”(C)和“可变”(V)区域。V区决定抗体的抗原结合特异性，C区提供结构支持和在与免疫效应物的非抗原特异性相互作用中的功能。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合特定抗原的能力。
[0117] 抗体的抗原结合特异性由V区的结构特征决定。可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度上不均匀分布。反而，V区由被称为“高变区”的极端变异的较短区域(每个区域长9-12个氨基酸)分开的15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的相对不变的片段(stretch)组成。
天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，大部分采用β-片层构型，其通过形成环连接(在一些情况下形成β-片层结构的一部分)的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR保持紧密靠近在一起，并与来自另一条链的高变区促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，如抗体参与的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，大部分采用β-片层构型，其通过形成环连接(在一些情况下形成β-片层结构的一部分)的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR保持紧密靠近在一起，并与来自另一条链的高变区促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，如抗体参与的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
[0118] 每个V区通常包含三个互补决定区(“CDR”，每个CDR都含有“高变环”)和四个框架区。因此，以实质性亲和力与特定期望的抗原结合所需的最小结构单元，抗体结合位点，通常包括三个CDR和散布期间的至少三个，优选四个框架区，以适当的构象保持和呈递CDR。经典的四链抗体具有由VH和VL结构域合作限定的抗原结合位点。某些抗体，如骆驼和鲨鱼抗体缺乏轻链，仅依赖重链形成的结合位点。可以制备单个结构域工程化的免疫球蛋白，其中结合位点由重链或轻链单独形成，而不存在VH和VL之间的合作。
[0119] 术语“可变”是指可变结构域的某些部分在抗体间的序列中广泛不同的事实，这些部分用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性不均匀地分布在整个抗体的可变结构域中。它集中在轻链和重链可变结构域中三个称为高变区的区段中。可变结构域较高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，大部分采用β-片层构型，通过三个高变区连接，所述三个高变区形成环连接，在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR保持紧密靠近在一起，并与来自另一条链的高变区促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，如抗体参与的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
[0120] 当在本文中使用时，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区可以包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，在VL中围绕大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3))，在VH中围绕大约31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如VL中残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3))和VH中26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
[0121] “框架”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基以外的那些可变结构域残基。
[0122] 在抗体或半抗体的上下文中的“铰链区”通常定义为从人IgG1的Glu216至Pro230的片段(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。通过将形成重链间S-S键的第一和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置，可以将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列进行比对。
[0123] Fc区的“下铰链区”通常定义为紧邻铰链区C末端的残基片段，即Fc区的残基233-239。在本发明之前，FcγR结合通常归因于IgGFc区的下铰链区中的氨基酸残基。
[0124] 人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从IgG的约残基231延伸至约340。CH2结构域是独特的，因为它不与另一结构域紧密配对。相反，两个N-连接的分支碳水化合物链插入完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。已经推测碳水化合物可以提供结构域-结构域配对的替换，并有助于稳定CH2结构域(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。
[0125] “CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C末端的残基片段(即，从IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。
[0126] “抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；串联双体(taDb)、线性抗体(例如，美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体、单个可变结构域抗体、微抗体、单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4–Fc、di-scFv、bi-scFv或串联(di，tri)-scFv)；和双特异性T细胞参与者(BiTE)。
[0127] 抗体的木瓜蛋白酶消化产生称为“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和残留的“Fc”片段，其命名反映容易结晶的能力。Fab片段由整个L链与H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab')2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性且仍能够交联抗原的二硫化物连接的两个Fab片段。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端具有额外的少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文对这样的Fab'的命名，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离巯基。F(ab')2抗体片段最初作为Fab'片段对产生，在该Fab'片段对之间具有铰链半胱氨酸。其他抗体片段的化学偶联也是已知的。
[0128] “Fv”是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用以在VH-VL二聚体表面上限定抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含对抗原特异的三个高变区的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
[0129] Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端具有额外的少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文对这样的Fab'的命名，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带至少一个游离巯基。F(ab')2抗体片段最初作为Fab'片段对产生，在该Fab'片段对之间具有铰链半胱氨酸。其他抗体片段的化学偶联也是已知的。
[0130] 来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)“轻链”可以根据其恒定结构域的氨基酸序列归入两种明显不同的类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。
[0131] 根据其重链恒定结构域的氨基酸序列可以将抗体归入不同的类别。有五种主要类型的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别抗体的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型是众所周知的。
[0132] “单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。有关scFv的综述，参见Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
[0133] 术语“双体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含连接至相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不能使在相同链上的两个结构域之间配对的接头，使这些结构域与另一链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中更充分地描述了。
[0134] 如本文所用的术语“半抗体”或“半聚体(hemimer)”是指单价抗原结合多肽。在某些实施方案中，半抗体或半聚体包含VH/VL单元和任选地至少一部分免疫球蛋白恒定结构域。在某些实施方案中，半抗体或半聚体包含与一条免疫球蛋白轻链连接的一条免疫球蛋白重链，或其抗原结合片段。在某些实施方案中，半抗体或半聚体是单特异性的，即结合单个抗原或表位。在某些这样的实施方案中，半抗体结合IL-13并且不结合IL-17。在某些其他实施方案中，半抗体结合IL-17并且不结合IL-13。本领域技术人员将容易理解，半抗体可以具有由单个可变结构域组成的抗原结合结构域，例如源自骆驼科。
[0135] 术语“VH/VL单元”是指包含至少一个VH HVR和至少一个VL HVR的抗体的抗原结合区。在某些实施方案中，VH/VL单元包含至少一个、至少两个或全部三个VH HVR和至少一个、至少两个或全部三个VL HVR。在某些实施方案中，VH/VL单元还包含框架区(FR)的至少一部分。在一些实施方案中，VH/VL单元包含三个VH HVR和三个VLHVR。在一些这样的实施方案中，VH/VL单元包含至少一个、至少两个、至少三个或全部四个VH FR和至少一个、至少两个、至少三个或全部四个VL FR。
[0136] 术语“多特异性抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖包含具有多表位特异性的抗原结合结构域的抗体(即，能够特异性结合一种生物分子上的两个或更多个不同的表位或者能够特异性结合两种或更多种不同生物分子上的表位)。在一些实施方案中，多特异性抗体(如双特异性抗体)的抗原结合结构域包含两个VH/VL单元，其中第一VH/VL单元特异性结合第一表位，第二VH/VL单元特异性结合第二表位，其中每个VH/VL单元包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)。这样的多特异性抗体包括但不限于全长抗体、具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体、抗体片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、双体、双特异性双体和三抗体、已经共价或非共价连接的抗体片段。还包含重链恒定区的至少一部分和/或轻链恒定区的至少一部分的VH/VL单元也可以称为“半聚体”或“半抗体”。在一些实施方案中，半抗体包含单个重链可变区的至少一部分和单个轻链可变区的至少一部分。在一些这样的实施方案中，包含两个半抗体并结合两种抗原的双特异性抗体包含结合第一抗原或第一表位但不结合第二抗原或第二表位的第一半抗体和结合第二抗原或第二表位但不结合第一抗原或第一表位的第二半抗体。根据一些实施方案，多特异性抗体是以5M至0.001pM、3M至0.001pM、1M至0.001pM、0.5M至0.001pM或0.1M至0.001pM的亲和力与每种抗原或表位结合的IgG抗体。在一些实施方案中，半聚体包含重链可变区的足够部分以允许与第二半聚体形成分子内二硫键。在一些实施方案中，半聚体包含杵(knob)突变或臼(hole)突变，例如以允许与包含互补的臼突变或杵突变的第二半聚体或半抗体异源二聚化。杵突变和臼突变在下面进一步讨论。
[0137] “双特异性抗体”是包含能够特异性结合一种生物分子上的两个不同表位或能够特异性结合两种不同生物分子上的表位的抗原结合结构域的多特异性抗体。双特异性抗体在本文中也可以被称为具有“双特异性”或“双特异的”。除非另有说明，双特异性抗体名称中列出的双特异性抗体所结合的抗原的顺序是任意的。也就是说，在一些实施方案中，术语“抗IL-13/IL-17双特异性抗体”和“抗IL-17/IL-13双特异性抗体”可以互换使用。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个半抗体，其中每个半抗体包含单个重链可变区和任选重链恒定区的至少一部分，以及单个轻链可变区和任选轻链恒定区的至少一部分。在某些实施方案中，双特异性抗体包含两个半抗体，其中每个半抗体包含单个重链可变区和单个轻链可变区，并且不包含多于一个的单重链可变区和不包含多于一个的单轻链可变区。在一些实施方案中，双特异性抗体包含两个半抗体，其中每个半抗体包含单个重链可变区和单个轻链可变区，并且其中第一半抗体结合第一抗原而不结合第二抗原，第二半抗体结合第二抗原而不结合第一抗原。
[0138] 如本文所用的术语“杵入臼”技术或“KnH”技术是指通过将突起(杵)在两个多肽相互作用的界面引入一个多肽和在该界面将臼(孔)引入另一个多肽中来指导两个多肽在体外或体内配对在一起的技术。例如，已经将KnH引入抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面(参见例如US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431和Zhu等人,1997,Protein Science 6:781-788)。在一些实施方案中，KnH驱动制造多特异性抗体期间的两个不同重链的配对。例如，在其Fc区具有KnH的多特异性抗体可以进一步包含与每个Fc区连接的单个可变结构域，或者进一步包含与相似或不同的轻链可变结构域配对的不同重链可变结构域。KnH技术也可以用于将两个不同的受体细胞外结构域配对或将任何其他包含不同靶识别序列的多肽序列(例如，包括亲和体、肽体和其他Fc融合体)配对。
[0139] 如本文所用的术语“杵突变”是指将突起(杵)在多肽与另一多肽相互作用的界面引入该多肽的突变。在一些实施方案中，另一多肽具有臼突变(参见例如US 5,731,168、US 5,807,706、US 5,821,333、US 7,695,936、US 8,216,805、WO2011/133886、WO2013055958，各自以整体引用的方式并入本文)。
[0140] 如本文所用的术语“臼突变”是指将穴(臼)在界面引入多肽的突变，在该界面多肽与另一多肽相互作用。在一些实施方案中，另一多肽具有杵突变(参见例如US 5,731,168、US 5,807,706、US 5,821,333、US 7,695,936、US 8,216,805，各自以整体引用的方式并入本文中)。
[0141] 表述“单个结构域抗体”(sdAb)或“单个可变结构域(SVD)抗体”通常是指其中单个可变结构域(VH或VL)可赋予抗原结合的抗体。换句话说，单个可变结构域不需要与另一可变结构域相互作用以识别靶抗原。单个结构域抗体的实例包括来自骆驼科(camelids)(lamas和骆驼(camels))和软骨鱼类(例如护士鲨)的那些抗体和来自人和小鼠抗体重组方法的那些抗体(Nature(1989)341:544-546；Dev Comp Immunol(2006)30:43-56；Trend Biochem Sci(2001)26:230-235；Trends Biotechnol(2003):21:484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；FEBS Lett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。
[0142] 如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了在生产单克隆抗体期间可能出现的变体(这样的变体通常以少量存在)之外，群包含的各抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于其不被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从抗体基本上同质的群获得的抗体的特征，并不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可以由Kohler等人,Nature 256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如，例如美国专利号4,816,567)。还可以使用例如Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。
[0143] 本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)以及这样的抗体的片段，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自其他物种或属于其他抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，该抗体包含源自非人灵长类(例如旧大陆猴，如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。
[0144] 非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中高变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的高变环，以及FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些FR，除了如上所述的FR取代之外。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
[0145] 为了本文的目的，“完整抗体”是包含重链和轻链可变结构域和Fc区的一个抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一个或多个效应功能。
[0146] “天然抗体”通常是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数目不同。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
[0147] “裸抗体”是不缀合异源分子(如细胞毒性部分或放射性标记)的抗体(如本文所定义的)。
[0148] 如本文所用，术语“免疫粘附素”是指组合异源蛋白(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应功能的分子。在结构上，免疫粘附素包含具有期望结合特异性的氨基酸序列(该氨基酸序列不是抗体的抗原识别和结合位点(即与抗体恒定区相比是“异源的”))和免疫球蛋白恒定结构域序列(例如，IgG的CH2和/或CH3序列)的融合。示例性粘附素序列包括连续的氨基酸序列，其包含与感兴趣蛋白结合的受体或配体的一部分。粘附素序列也可以是结合感兴趣蛋白的序列，但不是受体或配体序列(例如，肽体中的粘附素序列)。可以通过各种方法选择或鉴定这样的多肽序列，包括噬菌体展示技术和高通量分选方法。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以从任何免疫球蛋白获得，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
[0149] 在一些实施方案中，抗体“效应功能”是指归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，其随着抗体同种型而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调。
[0150] “补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在下裂解靶标的能力。补体激活途径通过补体系统的第一成分(C1q)结合与相关抗原复合的分子(例如多肽(例如抗体))而启动。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)所述。
[0151] “抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页中的表3。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定法，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述。用于此类测定法的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可以在体内，例如在动物模型中评估感兴趣分子的ADCC活性，如在Clynes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型。
[0152] “人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应功能的白细胞。在一些实施方案中，细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；PBMC和NK细胞优选。
[0153] 术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体的Fc区的受体。在一些实施方案中，FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可选的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域不同。激活性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见 Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)).FcR综述于Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:
25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。在本文中术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来被鉴定的FcR。该术语还包括负责将母体IgG传递至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。
25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。在本文中术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来被鉴定的FcR。该术语还包括负责将母体IgG传递至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。
[0154] 术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指其中引入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，可能含有突变。本文包括与筛选或选择的原始转化的细胞具有相同功能或生物学活性的突变后代。
[0155] 如本文所使用的术语“杂质”是指与期望的多肽产物不同的材料或物质。在某些实施方案中，多肽产物包含抗体，包括双特异性抗体。杂质包括但不限于：宿主细胞材料，如大肠杆菌宿主细胞蛋白(ECP)；浸出的蛋白A；核酸；所期望的多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；其他多肽；内毒素；病毒；细胞培养基组分等。在一些实例中，杂质可以是来自，例如但不限于细菌细胞如大肠杆菌细胞(例如ECP)、真核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽细胞、真菌细胞的宿主细胞蛋白(HCP)。在一些实施方案中，杂质可以是剪切的FkpA和/或FkpA的聚集体。在一些实施方案中，杂质可以指用于促进多特异性抗体的表达、折叠或组装的辅助蛋白；例如分子伴侣如FkpA、DsbA和DsbC。在一些实施方案中，杂质可以指产物特异性多肽如单臂抗体和错误组装抗体、抗体变体，包括碱性变体和酸性变体以及聚集体。
[0156] “分离的”核酸是指已从其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或位于与其天然染色体位置不同的染色体位置。
[0157] 相对于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和如有必要引入间隙以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，任何保守取代不被认为是序列同一性的部分。可以以本领域技术中的各种方式实现为了确定百分比氨基酸序列同一性的比对，例如使用公众可得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在某些实施方案中，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作，并且源代码已经与用户文档在美国版权局(Washington D.C.，20559)提交，其在美国版权注册号TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech,Inc.获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应编译用于在UNIX操作系统上使用，包括数字UNIX V4.0D。所有的序列比较参数都由ALIGN-2程序设定，并且不改变。
[0158] 在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相对于、与或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以可替换地表述为相对于、与或针对给定氨基酸序列B具有或包含一定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：100乘以X/Y的分数
[0159] 其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中作为相同匹配得分的氨基酸残基的数目，其中Y是B中氨基酸残基的总数。将理解当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有特别说明，文中使用的所有％氨基酸序列同一性值使用ALIGN-2计算机程序如前面段落中所述获得。
[0160] 术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等人,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
[0161] 如本文所用，术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合到其已经导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导其可操作地连接的核酸的表达。这种载体在本文中被称为“表达载体”。
[0162] 如本文中关于层析法使用的术语“有顺序的”是指具有第一层析法步骤，随后是第二层析法步骤。在一些实施方案中，术语“有顺序的”用于其中第一层析法步骤之后是多于一个的其他步骤的上下文中。在一些实例中，如本文关于层析法使用的术语“有顺序的”是指特定顺序的层析法步骤；例如第一层析法步骤，随后是第二层析法步骤，随后是第三层析法步骤等。其他步骤(包括但不限于非层析法步骤(例如，pH和/或电导率调节、过滤、浓缩))可以包括在第一层析法步骤和其他层析法步骤之间。
[0163] 如本文关于层析法所使用的术语“连续的”是指具有第一层析材料和第二层析材料，所述第一层析材料和第二层析材料或者直接连接或者是其他机制以允许两种层析材料之间连续流动。
[0164] “加载密度”是指质量数，例如，与一定体积(例如，升)的层析材料接触的组合物的质量数，例如，克。在一些实施例中，加载密度以g/L表示。
[0165] 文中提及的“约”值或参数包括(和描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
[0166] 如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“a”、“或”和“该”包括复数指示物。应该理解，文中描述的本发明的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。II.纯化FkpA的方法
[0167] 本文提供了用于产生FkpA的超纯制剂的方法。在一些实施方案中，制剂包含多于约95.0％、96.0％、97.0％、98.0％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％中任意纯的FkpA。在一些实施方案中，99％纯的FkpA的制剂指制剂中不超过1％的物质是生产FkpA期间存在的细胞或细胞裂解物中存在的物质(例如蛋白质、核酸、脂质等)。99％纯的FkpA制剂可以含有FkpA的纯化或配制中使用的缓冲液、盐或其他赋形剂。
[0168] 在一些方面，本发明提供了用于产生超纯FkpA制剂的方法。在一些实施方案中，通过在细菌发酵培养物如大肠杆菌培养物中过表达FkpA来产生FkpA。在一些实施方案中，细菌发酵培养物如大肠杆菌培养物表达除内源FkpA外的外源FkpA。在一些实施方案中，通过在细菌发酵培养物如大肠杆菌培养物中表达外源FkpA来产生FkpA。因此，在某些实施方案中，该方法还包括在允许外源FkpA表达的条件下培养大肠杆菌培养物的步骤。发酵后，收集细菌细胞并离心。将得到的细胞糊重新悬浮于裂解缓冲液(例如25mM MES pH 6.0)并裂解(例如通过使用微流化器)。在一些实施方案中，用聚乙烯亚胺(PEI)调整细胞裂解物。在一些实施方案中，用大于约0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1.0％中的任意的终浓度PEI调整细胞裂解物。在一些实施方案中，用PEI调整细胞裂解物，持续超过约15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、16小时，20小时或24小时中的任意。在一些实施方案中，用PEI在超过约0℃、4℃或21℃中的任意下调整细胞裂解物。在一些实施方案中，用PEI在环境温度下调整细胞裂解物。在一些实施方案中，离心PEI-调整的裂解物以去除颗粒。在
一些实施方案中，在层析法之前过滤PEI-调整的裂解物。在一些实施方案中，在层析法之前通过22μm滤器过滤PEI-调整的裂解物。
一些实施方案中，在层析法之前过滤PEI-调整的裂解物。在一些实施方案中，在层析法之前通过22μm滤器过滤PEI-调整的裂解物。
[0169] 在一些实施方案中，所述方法包括用于从包含FkpA多肽和杂质的细胞裂解物中纯化FkpA多肽的方法，该方法包括b)通过离心澄清细胞裂解物，c)将包含FkpA多肽的澄清的细胞裂解物施加到阳离子交换层析材料；d)从阳离子交换层析材料洗脱FkpA多肽以产生包含FkpA多肽的阳离子交换洗脱液，e)将包含FkpA多肽的阳离子交换洗脱液施加到疏水相互作用层析(HIC)材料，f)从HIC材料洗脱FkpA多肽以产生HIC洗脱液，g)将包含FkpA多肽的HIC洗脱液施加到尺寸排阻层析法，h)从尺寸排阻层析法收集包含纯化的FkpA多肽的洗脱级分。
[0170] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换层析材料是含有带负电荷的基团(“配体”)的固相，其具有游离阳离子以与通过或经过固相的水性溶液中的阳离子交换。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换材料可以是膜、整料(monolith)或树脂。在一个实施方案中，阳离子交换材料可以是树脂。在上述的一些实施方案中，阳离子交换层析材料是阳离子交换层析柱。在上述的一些实施方案中，阳离子交换层析材料是阳离子交换层析膜。
[0171] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换材料可以使用常规层析材料或对流层析材料。常规层析材料包括例如易散发(perfusive)的材料(例如聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂)和扩散材料(例如交联的琼脂糖树脂)。在一些实施方案中，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂可以是 树脂。在一些实施方案中，交联的琼脂糖树脂可以是sulfopropyl- Fast Flow(“SPSFF”)树脂。对流层析材料可以是膜(例如聚醚
砜)或整料(monolith)材料(例如交联聚合物)。聚醚砜膜可以是Mustang。交联的聚合物整料材料可以是交联的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-乙烯二甲基丙烯酸酯)。
砜)或整料(monolith)材料(例如交联聚合物)。聚醚砜膜可以是Mustang。交联的聚合物整料材料可以是交联的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-乙烯二甲基丙烯酸酯)。
[0172] 在任何方法的一些实施方案中，阳离子交换材料包含羧酸官能团或磺酸官能团。在一些实施方案中，官能团是磺丙基、磺乙基、磺基异丁基或羧基。在一些实施方案中，阳离子交换材料是膜、整料(monolith)或树脂颗粒。在一些实施方案中，阳离子交换材料是树脂。在一些实施方案中，阳离子交换材料是Mustang S、Sartobind S、SO3 Monolith、S Ceramic HyperD、 HS50、 HS20、sulfopropyl- Fast
TM
Flow(SPSFF)、SP- XL(SPXL)、CM Fast Flow、Capto S、
Fractogel Se HiCap、Fractogel SO3或Fractogel COO。在一些实施方案中，阳离子交换材料是 HS50。阴离子交换材料的实例在本领域中是已知的，并且包括但不限于
HQ 50、 PI 50、 D、Mustang Q、Q FF(QSFF)
和DEAE 或其等同物。在一些实施方案中，阴离子交换材料是弱阴离子交换材
料；例如DEAE。在其他实施方案中，阴离子交换材料是强阴离子交换材料；例如QSFF。在一些实施方案中，用于纯化FkpA的阴离子交换材料是弱阴离子交换材料。在一些实施方案中，弱阴离子交换材料包含季胺。在一些实施方案中，季胺与交联的琼脂糖连接。在一些实施方案中，用于纯化FkpA的阴离子交换材料是DEAE
TM
Flow(SPSFF)、SP- XL(SPXL)、CM Fast Flow、Capto S、
Fractogel Se HiCap、Fractogel SO3或Fractogel COO。在一些实施方案中，阳离子交换材料是 HS50。阴离子交换材料的实例在本领域中是已知的，并且包括但不限于
HQ 50、 PI 50、 D、Mustang Q、Q FF(QSFF)
和DEAE 或其等同物。在一些实施方案中，阴离子交换材料是弱阴离子交换材
料；例如DEAE。在其他实施方案中，阴离子交换材料是强阴离子交换材料；例如QSFF。在一些实施方案中，用于纯化FkpA的阴离子交换材料是弱阴离子交换材料。在一些实施方案中，弱阴离子交换材料包含季胺。在一些实施方案中，季胺与交联的琼脂糖连接。在一些实施方案中，用于纯化FkpA的阴离子交换材料是DEAE
[0173] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，疏水相互作用层析法(HIC)是根据疏水性分离生物分子的液相层析技术。HIC材料的实例包括但不限于 hexyl 650、 butyl 650、 phenyl 650、 ether 650、
Source、Resource、 Hi-Trap、butyl Octyl
phenyl 在上述的一些实施方案中，HIC材料是HIC柱。在上述的一些实施方
案中，HIC材料是HIC膜。在一些实施方案中，HIC材料包含丁基部分。在一些实施方案中，丁基部分与交联的琼脂糖连接。在一些实施方案中，用于纯化FkpA的HIC材料是butyl[0174] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，尺寸排阻层析法是根据生物分子尺寸和形状分离生物分子的液相层析技术。尺寸排阻层析材料具有不同的孔径，以有效分离特定重量范围的分子。尺寸排阻层析材料的实例包括但不限于葡聚糖、多孔琼脂糖颗粒、交联的琼脂糖、交联的琼脂糖和葡聚糖以及交联的丙烯酰胺。尺寸排阻层析材料的实例包括但不限于Sephadex、Superdex、Sephacryl、TSKgel和Bio-Gel。在一些实施方案中，Superdex
75尺寸排阻层析法用于FkpA的纯化。
Source、Resource、 Hi-Trap、butyl Octyl
phenyl 在上述的一些实施方案中，HIC材料是HIC柱。在上述的一些实施方
案中，HIC材料是HIC膜。在一些实施方案中，HIC材料包含丁基部分。在一些实施方案中，丁基部分与交联的琼脂糖连接。在一些实施方案中，用于纯化FkpA的HIC材料是butyl[0174] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，尺寸排阻层析法是根据生物分子尺寸和形状分离生物分子的液相层析技术。尺寸排阻层析材料具有不同的孔径，以有效分离特定重量范围的分子。尺寸排阻层析材料的实例包括但不限于葡聚糖、多孔琼脂糖颗粒、交联的琼脂糖、交联的琼脂糖和葡聚糖以及交联的丙烯酰胺。尺寸排阻层析材料的实例包括但不限于Sephadex、Superdex、Sephacryl、TSKgel和Bio-Gel。在一些实施方案中，Superdex
75尺寸排阻层析法用于FkpA的纯化。
[0175] 可以优化包含FkpA的组合物在层析材料上的加载以从杂质中分离FkpA产物。在一些实施方案中，优化组合物到层析材料上的加载以使杂质与层析材料结合。例如，可在多个不同pH值的加载缓冲液(而加载缓冲液的电导率恒定)中将组合物加载到层析材料例如层析柱上。或者，可以在多个不同电导率的加载缓冲液(而加载缓冲液的pH恒定)中将组合物加载到层析材料。在完成将组合物加载到层析材料上以及随后的将产物从层析材料洗脱到池级分中后，池级分中杂质的量提供关于在给定pH或电导率下从杂质中分离产物的信息。
[0176] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，包含FkpA的组合物以小于或等于约10mg/mL、9mg/mL、8mg/mL、7mg/mL、6mg/mL、5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL或1mg/mL的多肽/阳离子交换层析材料中任意的加载密度加载到阳离子交换层析材料上。组合物可以以约1mg/mL至2mg/mL、2mg/mL至3mg/mL、3mg/mL至4mg/mL、4mg/mL至5mg/mL、5mg/mL至6mg/mL、
6mg/mL至7mg/mL、7mg/mL至8mg/mL、8mg/mL至9mg/mL或9mg/mL至10mg/mL的多肽/阳离子交换层析材料中任意的加载密度加载到阳离子层析材料上。在一些实施方案中，阳离子交换层析材料是与琼脂糖交联的磺丙基；例如SP
6mg/mL至7mg/mL、7mg/mL至8mg/mL、8mg/mL至9mg/mL或9mg/mL至10mg/mL的多肽/阳离子交换层析材料中任意的加载密度加载到阳离子层析材料上。在一些实施方案中，阳离子交换层析材料是与琼脂糖交联的磺丙基；例如SP
[0177] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，包含FkpA的组合物以小于或等于约10mg/mL、9mg/mL、8mg/mL、7mg/mL、6mg/mL、5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL或1mg/mL的多肽/HIC材料中任意的加载密度加载到HIC材料上。组合物可以以约1mg/mL至2mg/mL、2mg/mL至3mg/mL、3mg/mL至4mg/mL、4mg/mL至5mg/mL、5mg/mL至6mg/mL、6mg/mL至7mg/mL、7mg/mL至
8mg/mL、8mg/mL至9mg/mL或9mg/mL至10mg/mL的多肽/HIC材料中任意的加载密度加载到HIC材料上。在一些实施方案中，HIC材料是与交联的琼脂糖交联的丁基部分；例如Butyl[0178] 可以优化FkpA从层析材料中的洗脱以产生具有最少杂质和以最小池体积的FkpA。
例如，可将组合物在加载缓冲液中加载到层析材料例如层析柱上。加载完成后，首先洗涤层析材料，然后用多种不同pH而洗脱缓冲液的电导率恒定的缓冲液洗脱。或者，可以在多种不同电导率而洗脱缓冲液的pH恒定的洗脱缓冲液中从层析材料洗脱产物。在完成从层析材料中洗脱产物时，池级分中杂质的量提供了关于在给定pH或电导率下从杂质分离产物的信息。以大量级分(例如八个柱体积)洗脱产物表明洗脱曲线的“拖尾”。在本发明的一些实施方案中，洗脱的拖尾被最小化。
8mg/mL、8mg/mL至9mg/mL或9mg/mL至10mg/mL的多肽/HIC材料中任意的加载密度加载到HIC材料上。在一些实施方案中，HIC材料是与交联的琼脂糖交联的丁基部分；例如Butyl[0178] 可以优化FkpA从层析材料中的洗脱以产生具有最少杂质和以最小池体积的FkpA。
例如，可将组合物在加载缓冲液中加载到层析材料例如层析柱上。加载完成后，首先洗涤层析材料，然后用多种不同pH而洗脱缓冲液的电导率恒定的缓冲液洗脱。或者，可以在多种不同电导率而洗脱缓冲液的pH恒定的洗脱缓冲液中从层析材料洗脱产物。在完成从层析材料中洗脱产物时，池级分中杂质的量提供了关于在给定pH或电导率下从杂质分离产物的信息。以大量级分(例如八个柱体积)洗脱产物表明洗脱曲线的“拖尾”。在本发明的一些实施方案中，洗脱的拖尾被最小化。
[0179] 根据例如期望的缓冲液pH、期望的缓冲液电导率、感兴趣蛋白的特性和纯化方法，可以使用各种缓冲液。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述方法包括使用缓冲液。缓冲液可以是加载缓冲液、平衡缓冲液或洗涤缓冲液。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种是相同的。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液是不同的。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，缓冲液包含盐。加载缓冲液可以包含氯化钠、乙酸钠或其混合物。在一些实施方案中，加载缓冲液是氯化钠缓冲液。在一些实施方案中，加载缓冲液是乙酸钠缓冲液。
[0180] 如本文所用，负载是加载到层析材料上的组合物。加载缓冲液是用于将包含FkpA的组合物加载到层析材料上的缓冲液。在加载待纯化的组合物之前，层析材料可以用平衡缓冲液平衡。在一些实例中，在将组合物加载到层析材料上之后和在从固相洗脱感兴趣的多肽之前使用洗涤缓冲液。
[0181] 如本文所用，洗脱是从层析材料中移除产物，例如FkpA。洗脱缓冲液是用于从层析材料洗脱多肽或其他感兴趣产物的缓冲液。在许多情况下，洗脱缓冲液与加载缓冲液具有不同的物理特性。例如，洗脱缓冲液可以具有与加载缓冲液不同的电导率或与加载缓冲液不同的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液更低的电导率。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液更高的电导率。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液更低的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液更高的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有与加载缓冲液不同的电导率和不同的pH。洗脱缓冲液可以具有更高或更低的电导率以及更高或更低的pH的任何组合。
[0182] 电导率是指水性溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子传递。因此，随着水性溶液中存在的离子的量的增加，溶液将具有更高的电导率。电导率测量的基本单位是Siemen(或mho)、mho(mS/cm)，可以使用电导率仪(如各种Orion电导率仪)进行测量。由于电解质电导率是溶液中离子携带电流的能力，所以溶液的电导率可以通过改变其中的离子浓度来改变。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氯化钠、乙酸钠或氯化钾)的浓度以达到期望的电导率。优选地，修改各种缓冲液的盐浓度以达到期望的电导率。
[0183] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换加载缓冲液的电导率大于约4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm或10mS/cm中的任意。电导率可以在约4mS/cm至
17mS/cm、4mS/cm至10mS/cm、4mS/cm至7mS/cm、5mS/cm至17mS/cm、5mS/cm至10mS/cm或5mS/cm至7mS/cm中的任意。在一些实施方案中，电导率为约4mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm或
10mS/cm中的任意。一方面，电导率是加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的电导率。
在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和洗涤缓冲液中的一种或多种的电导率相同。
在一些实施方案中，加载缓冲液的电导率不同于洗涤缓冲液和/或平衡缓冲液的电导率。
17mS/cm、4mS/cm至10mS/cm、4mS/cm至7mS/cm、5mS/cm至17mS/cm、5mS/cm至10mS/cm或5mS/cm至7mS/cm中的任意。在一些实施方案中，电导率为约4mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm或
10mS/cm中的任意。一方面，电导率是加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的电导率。
在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和洗涤缓冲液中的一种或多种的电导率相同。
在一些实施方案中，加载缓冲液的电导率不同于洗涤缓冲液和/或平衡缓冲液的电导率。
[0184] 在一些实施方案中，阳离子交换洗脱缓冲液具有比加载缓冲液的电导率更大的电导率。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率大于约5mS/cm、10mS/cm、15mS/cm、20mS/cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45mS/cm、50mS/cm、55mS/cm、60mS/cm、65mS/cm、70mS/cm、75mS/cm、80mS/cm、85mS/cm、90mS/cm、95mS/cm或100mS/cm中的任意。在一些实施方案中，通过改变洗脱缓冲液的盐浓度来改变洗脱缓冲液的电导率。
[0185] 在一些实施方案中，HIC加载缓冲液的电导率大于洗脱缓冲液的电导率。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，HIC加载缓冲液的电导率大于约5mS/cm、10mS/cm、15mS/cm、20mS/cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45mS/cm、50mS/cm、55mS/cm、60mS/cm、65mS/cm、70mS/cm、75mS/cm、80mS/cm、85mS/cm、90mS/cm、95mS/cm或100mS/cm中的任意。在一些实施方案中，通过改变洗脱缓冲液的盐浓度来改变洗脱缓冲液的电导率。
[0186] 在本文所述任何方法的一些实施方案中，HIC洗脱缓冲液的电导率小于约4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm或10mS/cm中的任意。
[0187] 在任何上述实施方案的一些方面中，通过阶梯梯度或线性梯度等度地(isocratically)从加载和/或洗涤缓冲液改变洗脱缓冲液的电导率。
[0188] 在一些实施方案中，使用从约0％至约60％10mM MES和300mM NaCl的盐梯度经过9个柱体积从阳离子交换层析材料洗脱FkpA。
[0189] 在一些实施方案中，使用纯水从HIC材料中洗脱FkpA，直到FkpA从HIC材料中洗脱出来。
[0190] 基于蛋白质的氨基酸含量计算的FkpA等电点约为7.01。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换加载缓冲液具有小于约10、9、8、7、6或5中任意的pH。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，加载缓冲液具有大于约4、5、6、7、8或9中任意的pH。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种的pH是相同的。在一些实施方案中，加载缓冲液的pH不同于平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的pH。在一些实施方案中，用于阳离子交换层析法的加载缓冲液的pH值是约pH6.0。
[0191] 在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH小于加载缓冲液的pH。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液具有小于约8、7、6、5、4、3或2中的任意的pH。洗脱缓冲液的pH可以在约4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至9、5至8、5至7、5至6、6至9、6至8、6至7中的任意。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH约为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0中的任意。在一些实施方案中，在pH 8的加载缓冲液中将包含FkpA的组合物加载到阴离子交换材料上，并在pH约7.0或7.1的洗脱缓冲液中从阴离子交换材料中洗脱。
[0192] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，HIC加载缓冲液的pH小于约6.0、7.0或8.0中的任意。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，加载缓冲液的pH大于约6.0、7.0或8.0中的任意。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种的pH相同。在一些实施方案中，加载缓冲液的pH不同于平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的pH。
[0193] 在一些实施方案中，尺寸排阻层析法以流经模式或差异分配模式使用。在一些实施方案中，用于尺寸排阻层析法的缓冲液是PBS pH 7.5±0.4。
[0194] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，流速小于约50CV/hr、40CV/hr或30CV/hr中的任意。流速可以在约5CV/hr至50CV/hr、10CV/hr至40CV/hr或18CV/hr至36CV/hr中的任意。在一些实施方案中，流速约为9CV/hr、18CV/hr、25CV/hr、30CV/hr、36CV/hr或40CV/hr中的任意。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，流速小于约200cm/hr、150cm/hr、100cm/hr、75cm/hr或50cm/hr中的任意。流速可以在约25cm/hr至200cm/hr、25cm/hr至
175cm/hr、25cm/hr至150cm/hr、25cm/hr至100cm/hr、50cm/hr至100cm/hr或65cm/hr至
85cm/hr中的任意。在一些实施方案中，流速约大于约0.1mL/分钟、0.25mL/分钟、0.5mL/分钟、0.75mL/分钟、1mL/分钟、2mL/分钟、3mL/分钟、4mL/分钟、5mL/分钟、6mL/分钟、7mL/分钟、8mL/分钟、9mL/分钟、10mL/分钟、11mL/分钟、12mL/分钟、13mL/分钟、14mL/分钟、15mL/分钟、20mL/分钟、25mL/分钟和50mL/分钟。在一些实施方案中，流速在约0.1mL/分钟至1mL/分钟、1mL/分钟至5mL/分钟、1mL/分钟至10mL/分钟、5mL/分钟至10mL/分钟、10mL/分钟至
15mL/分钟、10mL/分钟至25mL/分钟和15mL/分钟至25mL/分钟。在一些实施方案中，FkpA的阴离子交换层析法的流速为约13.3ml/分钟。在一些实施方案中，FkpA的疏水相互作用层析法的流速为约13.2ml/分钟。在一些实施方案中，FkpA的尺寸排阻层析法的流速为约1ml/分钟。
175cm/hr、25cm/hr至150cm/hr、25cm/hr至100cm/hr、50cm/hr至100cm/hr或65cm/hr至
85cm/hr中的任意。在一些实施方案中，流速约大于约0.1mL/分钟、0.25mL/分钟、0.5mL/分钟、0.75mL/分钟、1mL/分钟、2mL/分钟、3mL/分钟、4mL/分钟、5mL/分钟、6mL/分钟、7mL/分钟、8mL/分钟、9mL/分钟、10mL/分钟、11mL/分钟、12mL/分钟、13mL/分钟、14mL/分钟、15mL/分钟、20mL/分钟、25mL/分钟和50mL/分钟。在一些实施方案中，流速在约0.1mL/分钟至1mL/分钟、1mL/分钟至5mL/分钟、1mL/分钟至10mL/分钟、5mL/分钟至10mL/分钟、10mL/分钟至
15mL/分钟、10mL/分钟至25mL/分钟和15mL/分钟至25mL/分钟。在一些实施方案中，FkpA的阴离子交换层析法的流速为约13.3ml/分钟。在一些实施方案中，FkpA的疏水相互作用层析法的流速为约13.2ml/分钟。在一些实施方案中，FkpA的尺寸排阻层析法的流速为约1ml/分钟。
[0195] 床高是所用层析材料的高度。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，床高大于约3cm、10cm、15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm、50cm、60cm、70cm、80cm、90cm或100cm中的任意。床高可以在3cm至50cm、5cm至35cm、3cm至35cm或5cm至50cm中的任意。在一些实施方案中，基于加载的多肽或杂质的量来确定床高。
[0196] 在一些实施方案中，层析法在容积大于约1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、75mL、100mL或200mL的容器的柱中。
[0197] 在本发明的一些实施方案中，从层析法收集级分。在一些实施方案中，收集的级分大于约0.01CV、0.02CV、0.03CV、0.04CV、0.05CV、0.06CV、0.07CV、0.08CV、0.09CV、0.1CV、0.2CV、0.3CV、0.4CV、0.5CV、0.6CV、0.7CV、0.8CV、0.9CV、1.0CV、2.0CV、3.0CV、4.0CV、
5.0CV、6.0CV、7.0CV、8.0CV、9.0CV或10.0CV。在一些实施方案中，汇集含有产物例如多肽的级分。在一些实施方案中，汇集来自加载级分和来自洗脱级分的含有多肽的级分。本领域技术人员可以测定级分中多肽的量；例如，可以通过UV光谱法测定级分中多肽的量。在一些实施方案中，汇集含有可检测多肽片段的级分。在一些实施方案中，通过尺寸排阻层析法测定级分中FkpA的存在和纯度。
示例性实施方案
5.0CV、6.0CV、7.0CV、8.0CV、9.0CV或10.0CV。在一些实施方案中，汇集含有产物例如多肽的级分。在一些实施方案中，汇集来自加载级分和来自洗脱级分的含有多肽的级分。本领域技术人员可以测定级分中多肽的量；例如，可以通过UV光谱法测定级分中多肽的量。在一些实施方案中，汇集含有可检测多肽片段的级分。在一些实施方案中，通过尺寸排阻层析法测定级分中FkpA的存在和纯度。
示例性实施方案
[0198] 在一些实施方案中，本发明提供了以下示例性但非限制性的用于生产FkpA超纯制剂的方法。FkpA在大肠杆菌中表达。将细胞糊悬浮于10体积的25mM MES pH6.0(裂解缓冲液)中并混合直至悬浮液均匀。使用微流化器HC-8000在室内压力(6000-8000psi)下4次通过进行细胞裂解。悬浮液在RC6离心机中使用SS-34转子以15,000rpm离心30分钟。
[0199] 在其他实施方案中，将细胞糊悬浮于50mM MES pH 6.0中(50g细胞糊/1L)并混合直至悬浮液均匀。使用微流化器110F在室内压力 下3次通过进行细胞裂解。将匀浆调整至0.1％PEI(使用10％PEI储备溶液)并在环境温度 下混合30分钟。
悬浮液在SorvalRC-5B+离心机中使用“GSA”转子以8500rpm离心30分钟。收集离心分离液(centrate)并通过0.22um Durapore滤器过滤。
(a)SP Fast Flow
悬浮液在SorvalRC-5B+离心机中使用“GSA”转子以8500rpm离心30分钟。收集离心分离液(centrate)并通过0.22um Durapore滤器过滤。
(a)SP Fast Flow
[0200] 将澄清的离心分离液(用1.5M Tris碱调整至pH 8.0)加载到结合和洗脱模式的含有SP Fast Flow(GE Healthcare)的柱中。该柱具有以下特性：柱为27.0cm(高)×2.6cm(直径)，体积145mL，蛋白质容量≤50mg/mL树脂。柱用3CV 250mM MES pH6.0预平衡、并用25mM MES，pH6.0平衡。加载结束后，用3CV平衡缓冲液洗涤柱。用9CV梯度的0-
30％缓冲液B(25mM MES，300mM NaCl)洗脱FkpA。通过SDS-PAGE分析级分。
(b)Butyl-S
30％缓冲液B(25mM MES，300mM NaCl)洗脱FkpA。通过SDS-PAGE分析级分。
(b)Butyl-S
[0201] 然后将汇集的SP级分施加到结合和洗脱模式的Butyl-S 层析材料。该柱具有以下性质：柱尺寸为9.4cm(高)×2.6cm(直径)，体积为50mL，蛋白质容量≤20mg/mL树脂。该柱用300mM硫酸钠、50mM磷酸钠，pH7.0平衡。通过加入等体积的50mM磷酸盐、0.6M硫酸钠，pH 7.0调节SP池，然后加载到Butyl-S 柱上。然后用50mM磷酸盐、
300mM硫酸钠，pH 7.0洗涤柱，3CV。用纯水从柱中洗脱FkpA。收集级分并通过柱级分的SDS-PAGE分析进行分析。(c)Superdex 200
300mM硫酸钠，pH 7.0洗涤柱，3CV。用纯水从柱中洗脱FkpA。收集级分并通过柱级分的SDS-PAGE分析进行分析。(c)Superdex 200
[0202] 然后使汇集的Butyl 级分进行尺寸排阻层析法，使用Superdex 200。该步骤用于去除任何残留的高MW和低MW物质并配制FkpA。Superdex 200具有分子量10至
600kDal的分子的分级范围，适用于像FkpA这样的蛋白质。柱为Superdex 200，其具有以下性质：柱为60cm×2.6cm直径，体积320mL，加载量≤16mL。使用离心滤器将HIC池(级分7-11)浓缩至体积≤16mL(≤5％的SEC CV)。使用Eppendorf临床离心机以3000rpm离心单元20分钟间隔，直到达到目标体积。用3CV PBS(pH 7.5±0.4)平衡Superdex 200尺寸排阻柱。将Butyl 级分加载到柱上，用PBS(pH 7.5±0.4)以1mL/分钟的流速洗脱。
测定FkpA纯度的方法
600kDal的分子的分级范围，适用于像FkpA这样的蛋白质。柱为Superdex 200，其具有以下性质：柱为60cm×2.6cm直径，体积320mL，加载量≤16mL。使用离心滤器将HIC池(级分7-11)浓缩至体积≤16mL(≤5％的SEC CV)。使用Eppendorf临床离心机以3000rpm离心单元20分钟间隔，直到达到目标体积。用3CV PBS(pH 7.5±0.4)平衡Superdex 200尺寸排阻柱。将Butyl 级分加载到柱上，用PBS(pH 7.5±0.4)以1mL/分钟的流速洗脱。
测定FkpA纯度的方法
[0203] 测定FkpA制剂纯度的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，通过尺寸排阻层析法(SEC)测定制品中FkpA的纯度。在一些实施方案中，通过高效液相层析尺寸排阻层析法(HPLC SEC)测定制剂中FkpA的纯度。在一些实施方案中，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定制剂中FkpA的纯度。在一些实施方案中，使用荧光蛋白成像鉴定SDS PAGE凝胶上的蛋白质。在一些实施方案中，使用 Ruby成像SDS PAGE。在一些实施方案中，使用Heukeshoven银染色使SDS-PAGE上的蛋白质可视化。在其他实施方案中，使用表征测定法(包括但不限于N-末端序列分析、肽质量指纹(PMF)、通过CHIP TOF的完整/减少的质量和蛋白质印迹分析)来确认FkpA分子的鉴定。
[0204] 在一些实施方案中，本发明提供了FkpA的超纯制剂。在一些实施方案中，本发明提供FpkA的制剂，其中FkpA构成制剂的至少约95％、96％、97％、98％、99％或99.5％中的任意。在一些实施方案中，FkpA约为制剂的95％、96％、97％、98％、99％和/或99.5％中的任意。在一些实施方案中，制剂包含少于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或
0.01％中任意的杂质。杂质可以包括但不限于宿主细胞蛋白例如大肠杆菌宿主细胞蛋白、核酸、病毒、细胞培养组分如细胞培养基组分以及FkpA的聚集体或FkpA的片段(例如，FkpA的非功能片段)。在一些实施方案中，制剂包含少于约2％、1.5％或1％中任意的低分子量物质。在一些实施方案中，制剂包含少于约1％、0.5％或0.1％的高分子量物质。在一些实施方案中，高分子量物质是不可检测的。在一些实施方案中，通过SEC检测FkpA、低分子量物质和/或高分子量物质的存在。
0.01％中任意的杂质。杂质可以包括但不限于宿主细胞蛋白例如大肠杆菌宿主细胞蛋白、核酸、病毒、细胞培养组分如细胞培养基组分以及FkpA的聚集体或FkpA的片段(例如，FkpA的非功能片段)。在一些实施方案中，制剂包含少于约2％、1.5％或1％中任意的低分子量物质。在一些实施方案中，制剂包含少于约1％、0.5％或0.1％的高分子量物质。在一些实施方案中，高分子量物质是不可检测的。在一些实施方案中，通过SEC检测FkpA、低分子量物质和/或高分子量物质的存在。
[0205] 在一些实施方案中，本发明提供了FkpA的超纯制剂。在一些实施方案中，本发明提供了FkpA的制剂，其中FkpA构成制剂的至少约95％、96％、97％、98％、99％或99.5％中的任意。在一些实施方案中，FkpA约为制剂的95％、96％、97％、98％、99％和/或99.5％中的任意。在一些实施方案中，制剂包含少于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％，0.02％或
0.01％中任意的杂质。杂质可以包括但不限于宿主细胞蛋白如大肠杆菌宿主细胞蛋白、核酸、病毒、细胞培养组分如细胞培养基组分以及FkpA的聚集体或FkpA的片段(例如，FkpA的非功能片段)。在一些实施方案中，制剂包含少于约1％、0.5％或0.1％中任意的低分子量物质。在一些实施方案中，制剂包含少于约1％、0.5％或0.1％的高分子量物质。在一些实施方案中，通过SEC检测FkpA、低分子量物质和/或高分子量物质的存在。
0.01％中任意的杂质。杂质可以包括但不限于宿主细胞蛋白如大肠杆菌宿主细胞蛋白、核酸、病毒、细胞培养组分如细胞培养基组分以及FkpA的聚集体或FkpA的片段(例如，FkpA的非功能片段)。在一些实施方案中，制剂包含少于约1％、0.5％或0.1％中任意的低分子量物质。在一些实施方案中，制剂包含少于约1％、0.5％或0.1％的高分子量物质。在一些实施方案中，通过SEC检测FkpA、低分子量物质和/或高分子量物质的存在。
[0206] 测量DNA如宿主细胞DNA的方法是本领域已知的并在实施例部分中描述。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，DNA的量降低大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任意。DNA的量可以降低约10％至99％、30％至95％、30％至99％、
50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任意。DNA的量可以降低约10％、
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤中回收的组合物中DNA的量与纯化步骤之前组合物中DNA的量来确定降低。
50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任意。DNA的量可以降低约10％、
20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤中回收的组合物中DNA的量与纯化步骤之前组合物中DNA的量来确定降低。
[0207] 细胞培养基组分是指存在于细胞培养基中的组分。细胞培养基可以是收获细胞时的细胞培养基。在一些实施方案中，细胞培养基组分是庆大霉素。可以通过ELISA来测量庆大霉素的量。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，细胞培养基组分的量降低大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任意。细胞培养基组分的量可以降低约10％至99％、30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任意。在一些实施方案中，细胞培养基组分的量降低约10％、20％、30％、40％、
50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤中回收的组合物中细胞培养基组分的量与纯化步骤之前组合物中细胞培养基组分的量来确定降低。
III.多肽，FkpA
50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤中回收的组合物中细胞培养基组分的量与纯化步骤之前组合物中细胞培养基组分的量来确定降低。
III.多肽，FkpA
[0208] 本发明提供了产生FkpA的超纯制剂的方法。术语“FkpA”蛋白是指细菌FKBP型肽基脯氨酰基顺反异构酶。FkpA是周质蛋白二硫化物异构酶I，显示顺式/反式肽基-脯氨酰基异构酶(PPIase)和分子伴侣活性。当肽出现在细胞周质中时，FkpA可辅助多肽折叠。在一些实施方案中，FkpA源自细菌。在一些实施方案中，FkpA多肽是大肠杆菌FkpA多肽。在其他实施方案中，FkpA多肽源自肠杆菌(Enterobacteria)、固氮弧菌(Azoarcus)、沙门氏菌(Salmonella)、布氏杆菌(Buchnera)、黄单胞菌(Xanthmonas)、弯曲杆菌(Campylobacter)、志贺氏菌(Shigella)、假单胞菌(Pseudomonas)、耶尔森氏菌(Yersina)、欧文氏菌(Erwinia)和奈瑟球菌(Neisseria)的任何物种。在一些实施方案中，FkpA多肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，FkpA多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％中任意的同一性的氨基酸序列。
[0209] 通常使用重组技术生产用本文所述的方法纯化的FkpA多肽。在细菌中生产重组多肽的方法是本领域已知的。当使用重组技术时，多肽可以在细胞内、在周质空间中产生，或者直接分泌到培养基中。在一些实施方案中，将编码FkpA的核酸引入宿主细胞用于过表达多肽。在某些实施方案中，工程化的过表达FkpA的宿主细胞表达比没有遗传工程化的宿主细胞产生的水平更高水平的FkpA。在一些实施方案中，编码FkpA的核酸由表达载体表达；例如质粒。在一些实施方案中，编码FkpA多肽的核酸包含SEQ ID NO：3的核酸序列。在一些实施方案中，编码FkpA的核酸包含与SEQ ID NO：3的核酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％中任意的同一性的核酸序列。
[0210] 可以从培养基或从宿主细胞裂解物中回收多肽。用于表达多肽的细胞可以通过各种物理或化学手段如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂来破坏。如果多肽是在细胞内产生的，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的多肽的方法。简言之，在约30分钟内，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯基甲基磺酰氟(PMSF)的存在下融化细胞糊。可以通过离心去除细胞碎片。当多肽分泌到培养基中时，通常首先使用市售的多肽浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元，浓缩来自这种表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂如PMSF可包括在任何上述步骤中以抑制蛋白质水解，并可包含抗生素以防止偶然污染物的生长。
IV.在生产中可使用FkpA的多肽。
IV.在生产中可使用FkpA的多肽。
[0211] 可以在细菌(例如大肠杆菌)中生产(其中通过表达FkpA(例如外源FkpA)辅助蛋白质折叠和组装)的多肽的实例包括但不限于免疫球蛋白、免疫粘附素、抗体、半抗体、抗体片段、酶、激素、融合蛋白、含Fc的蛋白、免疫缀合物、细胞因子和白细胞介素。多肽的实例包括但不限于哺乳动物蛋白质，例如肾素；激素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；酶；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNAase；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子如NGF-b；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β
5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；细胞因子；CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；融合多肽，即包含两个或更多个异源多肽或其片段上并由重组核酸编码的多肽；含Fc的多肽，例如包含与第二多肽融合的免疫球蛋白Fc区或其片段的融合蛋白；
免疫缀合物；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10、IL13、IL17；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，如AIDS包膜的一部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如CA125(卵巢癌抗原)或HER2、HER3或HER4受体；免疫粘附素；以及任何上述蛋白的片段和/或变体以及与蛋白(包括例如任何上述蛋白质)结合的抗体(包括抗体片段)。
5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；细胞因子；CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；融合多肽，即包含两个或更多个异源多肽或其片段上并由重组核酸编码的多肽；含Fc的多肽，例如包含与第二多肽融合的免疫球蛋白Fc区或其片段的融合蛋白；
免疫缀合物；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10、IL13、IL17；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，如AIDS包膜的一部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如CA125(卵巢癌抗原)或HER2、HER3或HER4受体；免疫粘附素；以及任何上述蛋白的片段和/或变体以及与蛋白(包括例如任何上述蛋白质)结合的抗体(包括抗体片段)。
[0212] 在一些实施方案中，用于在此描述的任何测定方法中使用的多肽制剂含有感兴趣的抗体，即由宿主细胞产生的重组多肽是抗体。
[0213] 这些抗体的分子靶标包括CD蛋白及其配体，如但不限于：(i)CD3、CD4、CD13、CD8、CD19、CD11a、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79α(CD79a)和CD79β(CD79b)；(ii)ErbB受体家族成员，如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；(iii)细胞粘附分子如LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；(iv)生长因子如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C、BR3、c-met、组织因子、β7等；和(v)细胞表面和跨膜肿瘤相关抗原(TAA)，如美国专利号
7,521,541中所述。
7,521,541中所述。
[0214] 其他示例性抗体包括但不限于选自抗雌激素受体抗体、抗孕酮受体抗体、抗p53抗体、抗HER-2/neu抗体、抗EGFR抗体、抗组织蛋白酶D抗体、抗Bcl-2抗体、抗上皮钙粘蛋白抗体、抗CA125抗体、抗CA15-3抗体、抗CA19-9抗体、抗c-erbB-2抗体、抗-P-糖蛋白抗体、抗CEA抗体、抗成视网膜细胞瘤蛋白抗体、抗ras癌蛋白抗体、抗Lewis X抗体、抗Ki-67抗体、抗PCNA抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD7抗体、抗CD8抗体、抗CD9/p24抗体、抗CD10抗体、抗CD11a抗体、抗CD11c抗体、抗CD13抗体、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD23抗体、抗CD30抗体、抗CD31抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD35抗体、抗CD38抗体、抗CD41抗体、抗LCA/CD45抗体、抗CD45RO抗体、抗CD45RA抗体、抗CD39抗体、抗CD100抗体、抗CD95/Fas抗体、抗CD99抗体、抗CD106抗体、抗泛素抗体、抗CD71抗体、抗c-myc抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗-HPV蛋白抗体、抗-κ轻链抗体、抗-λ轻链抗体、抗黑素体抗体、抗前列腺特异性抗原抗体、抗S-100抗体、抗tau抗原抗体、抗纤维蛋白抗体、抗角蛋白抗体和抗Tn抗原抗体的那些抗体。单克隆抗体
[0215] 在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。单克隆抗体从基本上同质的抗体群获得，即除了在生产单克隆抗体期间可能出现的变体(这样的变体通常以少量存在)之外，群包含的各抗体是相同的和/或结合相同的表位。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特征不是离散或多克隆抗体的混合物。
[0216] 例如，可以使用由Kohler等人,Nature 256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备单克隆抗体，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制备单克隆抗体。
[0217] 在杂交瘤方法中，如本文所述免疫小鼠或其他合适的宿主动物以引发产生或能够产生特异性结合用于免疫的多肽的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。
[0218] 将如此制备的杂交瘤细胞接种并生长在合适的培养基中，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT-缺陷细胞生长。
[0219] 在一些实施方案中，骨髓瘤细胞是有效融合的那些细胞，支持所选抗体产生细胞稳定高水平产生抗体，并对如HAT培养基的培养基敏感。其中，在一些实施方案中，骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如可得自美国加州圣地亚哥的Salk研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA)的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤以及可获自美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville,Maryland USA)的SP-2或X63-Ag8-653细胞。已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
Applications第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
[0220] 测定杂交瘤细胞生长的培养基产生的针对抗原的单克隆抗体。在一些实施方案中，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定法如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定。
[0221] 单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析测定。
[0222] 在鉴定出产生期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释步骤将克隆亚克隆，并通过标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice pp.59-103(Academic Press,1986))生长。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以在动物体内作为腹水肿瘤生长。
[0224] 使用常规步骤(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)易于分离和测序编码单克隆抗体的DNA。在一些实施方案中，杂交瘤细胞充当这种DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、人胚胎肾(HEK)293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞(否则不产生免疫球蛋白多肽)，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.5:256-262(1993)and Plückthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。
[0225] 在进一步的实施方案中，可以从使用McCafferty等人,Nature 348:552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组(Marks等人,Bio/Technology 10:779-783(1992))产生高亲和力(nM范围)的人抗体，以及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等人,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方案。
[0226] 也可以修饰DNA，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA 81:6851(1984))，或通过共价连接免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽编码序列的全部或部分。
[0227] 通常，这样的非免疫球蛋白多肽取代了抗体的恒定结构域，或者其取代了抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体，所述嵌合二价抗体包含一个对抗原具有特异性的抗原结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
[0228] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些实施方案中，抗体是IgG单克隆抗体。抗体片段
[0229] 在一些实施方案中，抗体是抗体片段。已经开发了多种用于生产抗体片段的技术。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白质水解消化得到(参见例如Morimoto等人,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等人,Science 229:81(1985))。然而，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接产生。例如，可以从上面讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可以从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab')2片段。其他用于生产抗体片段的技术对于本领域技术人员将是显而易见的。在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如美国专利5,641,870中所述。这样的线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
[0230] 在一些实施方案中，提供了本文所述抗体的片段。在一些实施方案中，抗体片段是抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv、Fv和双体。多肽变体和修饰
[0231] 在某些实施方案中，考虑了本文蛋白质的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善蛋白质的结合亲和力和/或其他生物学性质。可以通过向编码蛋白质的核苷酸序列引入适当的修饰、或者通过肽合成来制备蛋白质的氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如，蛋白质氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，只要最终构建体具有期望特征。变体多肽
[0232] “多肽变体”是指多肽，例如如本文所定义的与多肽的全长天然序列、缺乏信号肽的多肽序列、具有或不具有信号肽的多肽胞外结构域具有至少约80％氨基酸序列同一性的活性多肽。这样的多肽变体包括，例如，在全长天然氨基酸序列的N或C末端加入或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，多肽变体与全长天然序列多肽序列、缺乏信号肽的多肽序列、具有或不具有信号肽的多肽胞外结构域具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任意的氨基酸序列同一性。任选地，与天然多肽序列相比，变体多肽将具有不超过一个保守氨基酸取代，或者与天然多肽序列相比不超过约2、3、4、5、6、7、8、9或10中的任意个保守氨基酸取代。
[0233] 例如，与全长天然多肽相比，变体多肽可以在N末端或C末端截短，或可以缺少内部残基。某些变体多肽可缺少对于期望的生物学活性不是必需的氨基酸残基。可以通过许多常规技术中的任意来制备这些具有截短、缺失和插入的变体多肽。期望的变体多肽可以是化学合成的。另一合适的技术包括分离和通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码期望的变体多肽的核酸片段。限定期望的核酸片段末端的寡核苷酸用于PCR中的5'和3'引物。优选地，变体多肽与本文公开的天然多肽共享至少一种生物学和/或免疫学活性。
[0234] 氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-末端与增加抗体血清半衰期的酶或多肽融合。
[0235] 例如，可能期望改善多肽的结合亲和力和/或其他生物学性质。通过将合适的核苷酸改变引入抗体核酸或通过肽合成制备多肽的氨基酸序列变体。这样的修饰包括例如多肽氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建体，只要最终构建体具有期望的特征。氨基酸改变还可改变多肽(例如抗体)的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置。
[0236] 可通过将多肽序列与同源已知多肽分子的序列相比较并最小化高同源性区中产生的氨基酸序列变化的数目，来发现确定可以插入、取代或缺失哪个氨酸残基而不会不利地影响期望的活性的指导。
[0237] 如Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085(1989)所述，用于鉴定作为诱变优选位置的多肽(例如抗体)的某些残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。文中，鉴定残基或靶残基组(例如带电残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且被中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)取代以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在取代位点上或针对取代位点引入进一步的或其他变体而完善那些证明对取代具有功能敏感性的氨基酸位置。因此，虽然预先确定引入氨基酸序列变异的位点，但突变本身的性质不需要预先确定。例如，为了分析给定位点上的突变性能，在靶密码子或区域进行ala扫描或随机诱变，并针对期望活性筛选表达的抗体变体。
[0238] 另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中具有至少一个被不同残基取代的氨基酸残基。取代诱变最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑FR的改变。如果这样的取代导致生物学活性的改变，则可以引入更实质性的改变并筛选产物，该更实质性的改变在表1中称为“示例性取代”，或者如下文参照氨基酸类别进一步描述。原始残基 示例性取代 保守取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
[0239] 通过选择在维持(a)取代区域中多肽骨架的结构(例如片层或螺旋构象)、(b)在靶位点分子的电荷或疏水性、或(c)侧链的堆叠(bulk)中效果显著不同的取代来实现多肽生物学性质的实质性修饰。可根据其侧链性质的相似性对氨基酸分组(在A.L.Lehninger,Biochemistry second ed.,第73-75页,Worth Publishers,New York(1975)中)：(1)非极性：Ala(A),Val(V),Leu(L),Ile(I),Pro(P),Phe(F),Trp(W),Met(M)
(2)不带电极性：Gly(G),Ser(S),Thr(T),Cys(C),Tyr(Y),Asn(N),Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D),Glu(E)
(4)碱性：Lys(K),Arg(R),His(H)
(2)不带电极性：Gly(G),Ser(S),Thr(T),Cys(C),Tyr(Y),Asn(N),Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D),Glu(E)
(4)碱性：Lys(K),Arg(R),His(H)
[0240] 或者，可以基于常见的侧链性质对天然存在的残基分组：(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。
(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。
[0241] 非保守取代需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。
[0242] 通常也可以用丝氨酸取代不参与维持抗体正确构象的任何半胱氨酸残基，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可将半胱氨酸键加入至多肽以改善其稳定性(特别是抗体为抗体片段如Fv片段时)。
[0243] 取代变体的一个实例包括取代亲本抗体(例如，人源化抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于其产生的亲本抗体具有改善的生物学性质。产生这样的取代变体的便利方法包括使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将几个高变区位点(例如6-7个位点)突变以在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。如此产生的抗体变体以单价方式作为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合体从丝状噬菌体颗粒展示。然后如本文所公开地针对其生物学活性(例如，结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。或者，或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与靶之间的接触点可能是有益的。这样的接触残基和相邻残基是根据本文阐述的技术进行取代的候选。一旦产生这样的变体，就如本文所述对变体组进行筛选，并且可以选择在一个或多个相关测定法中具有优异性质的抗体用于进一步的开发。
[0244] 多肽的另一种类型的氨基酸变体改变抗体的原始糖基化模式。多肽可以包含非氨基酸部分。例如，多肽可以是糖基化的。这样的糖基化可以在多肽在宿主细胞或宿主生物体中表达期间天然发生，或者可以是由人为干预产生的有意修饰。改变是指删除多肽中存在的一个或多个碳水化合物部分，和/或加入多肽中不存在的一个或多个糖基化位点。
[0245] 多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链的附着。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于将碳水化合物部分酶促附着到天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
[0246] 通过改变氨基酸序列以使其含有一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)方便地实现将糖基化位点加入至多肽。还可以通过向原始抗体的序列加入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代(对于O-连接的糖基化位点)来进行改变。
[0247] 可通过化学或酶促或通过突变取代编码作为糖基化靶标的氨基酸残基的密码子来实现存在于多肽上的碳水化合物部分的去除。可通过使用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现多肽上碳水化合物部分的酶促切割。
[0248] 其他修饰包括谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基、脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰残基或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的γ-氨基的甲基化、N-末端胺的乙酰化和任何C-末端羧基的酰胺化。嵌合多肽
[0249] 本文所述的多肽可以以形成嵌合分子的方式进行修饰，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的多肽。在一些实施方案中，嵌合分子包含多肽与标签多肽的融合体，所述标签多肽提供抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于多肽的氨基末端或羧基末端。可以使用针对标签多肽的抗体检测这种表位标签形式的多肽的存在。而且，提供表位标签使得能够使用抗标签抗体或与表位标签结合的另一类型的亲和基质通过亲和纯化容易地纯化多肽。多特异性抗体
[0250] 在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。在某些实施方案中，多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性针对一种抗原，另一种结合特异性针对任何其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合相同抗原的两个不同表位。双特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达特定抗原的细胞。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其中一个臂结合IL13和一个臂结合IL17。
[0251] 用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983),WO 93/08829,和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“杵入臼”工程化(参见例如美国专利号5,731,168)，另外交换双特异性抗体的一半的抗原结合片段Fab中的一个或多个重链和轻链结构域(CrossMab，参见WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253和WO2009/
080254)。多特异性抗体还可以通过以下制备：通过工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效应(electrostatic steering effects)(WO2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等人,Science,229:81
(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及，如，例如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)所述制备三特异性抗体。如下所述，在一些实施方案中，通过在细胞(例如，表达FkpA的大肠杆菌细胞)中产生半抗体、分离半抗体并将半抗体组装成双特异性抗体来制备多特异性抗体。
080254)。多特异性抗体还可以通过以下制备：通过工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效应(electrostatic steering effects)(WO2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等人,Science,229:81
(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及，如，例如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)所述制备三特异性抗体。如下所述，在一些实施方案中，通过在细胞(例如，表达FkpA的大肠杆菌细胞)中产生半抗体、分离半抗体并将半抗体组装成双特异性抗体来制备多特异性抗体。
[0252] 本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化的抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibodies)”(参见例如US 2006/0025576A1)。
[0253] 本文中的抗体或片段还包括包含结合一种抗原以及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(参见例如US2008/0069820)。
[0254] 制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生产基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello,Nature,305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(quadromas)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析法步骤进行的正确分子的纯化非常繁琐，产物产率低。类似的步骤描述于1993年5月13日公开的WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.,10:3655(1991)。
[0255] 根据不同的方法，将具有期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合优选使用免疫球蛋白重链恒定结构域，包含至少部分铰链区、CH2和CH3区。优选具有包含轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)，存在于至少一个融合体中。将编码免疫球蛋白重链融合体和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入到分别的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。这在构建中使用不等比率的三条多肽链提供最佳产量的实施方案中提供了调节这三个多肽片段相互比例的极大的灵活性。然而，当以相同比率表达至少两条多肽链导致高产率或者当比率没有特别的显著性时，可以将两条或全部三条多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
[0256] 在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由在一个臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称结构有助于从不想要的免疫球蛋白链组合中分离期望的双特异性化合物，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了容易的分离方式。这种方法在WO 94/04690中公开。关于产生双特异性抗体的进一步细节，参见例如Suresh等人,Methods in Enzymology,121:210(1986)。
[0257] 根据另一种方法，可以工程化一对抗体分子之间的界面以最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比。优选的界面包含抗体恒定结构域的至少一部分CH3结构域。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)(杵或突起)取代。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似尺寸的互补“穴”(孔)。这提供了相对于其他不想要的终产物(如同二聚体)增加异二聚体产率的机制。本文进一步描述了杵和臼。杵入臼
[0258] 作为产生多特异性抗体和/或单臂抗体和/或免疫粘附素的方法使用杵入臼是本领域公知的。参见1998年3月24日授予Genentech的美国专利号5,731,168。描述产生多特异性抗体的方法的其他参考文献包括2009年7月16日公布的并转让给Amgen的PCT公开号WO2009089004，2009年7月16日公布的并且转让给Novo Nordisk A/S的美国专利公开号20090182127。也参见Marvin和Zhu,Acta Pharmacologica Sincia(2005)26(6):649-658和Kontermann(2005)Acta Pharacol.Sin.,26:1-9。这里提供一个简短的讨论。
[0259] “突起”是指至少一个氨基酸侧链，其从第一多肽的界面突出并且因此可定位于相邻界面(即第二多肽的界面)中的互补穴中以稳定异多聚体，例如从而有利于异多聚体形成而不是同多聚体形成。突起可以存在于原始界面或可以合成地引入(例如通过改变编码界面的核酸)。通常，改变编码第一多肽的界面的核酸以编码突起。为此，用编码至少一个“输入(import)”氨基酸残基的核酸取代编码第一多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积。可以理解的是，可以有多于一个的原始和相应的输入残基。被取代的原始残基数的上限是第一多肽界面中残基的总数。下表中显示了各氨基酸残基的侧链体积。表2.氨基酸的性质
a分子量氨基酸减去水的分子量。值来自Handbook of Chemistry and Physics,第43版Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961。
b
值来自A.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972。
c值来自C.Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975。可及表面积在该参照的图6-20中定义。
a分子量氨基酸减去水的分子量。值来自Handbook of Chemistry and Physics,第43版Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961。
b
值来自A.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972。
c值来自C.Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975。可及表面积在该参照的图6-20中定义。
[0260] 用于形成突起的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基，优选选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，用于形成突起的原始残基具有小的侧链体积，如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。CH3结构域中用于形成突起的示例性氨基酸取代包括但不限于T366W取代。
[0261] “穴”是指从第二多肽的界面凹进的至少一个氨基酸侧链，因此容纳第一多肽相邻界面上的相应的突起。穴可以存在于原始界面中或者可以合成地引入(例如通过改变编码界面的核酸)。通常，将编码第二多肽的界面的核酸改变为编码穴。为此，用编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA替换编码第二多肽界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积。可以理解的是，可以有多于一个的原始和相应的输入残基。被替换的原始残基数的上限是第二多肽界面中的残基的总数。各种氨基残基的侧链体积示于上表2中。用于形成穴的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。最优选的是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，用于形成穴的原始残基具有大的侧链体积，如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。CH3结构域中用于产生穴的示例性氨基酸取代包括但不限于T366S、L368A和Y407A取代。
[0262] “原始”氨基酸残基是被“输入”残基取代的氨基酸残基，所述“输入”残基可以具有比原始残基更小或更大的侧链体积。输入氨基酸残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基，但优选前者。“天然存在的”氨基酸残基是由遗传密码编码并列于上表2中的那些残基。“非天然存在的”氨基酸残基是指不由遗传密码编码的残基，但其能够共价结合多肽链中的相邻氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例是正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，如，例如Ellman等人,Meth.Enzym.202:301-336(1991)中描述的那些。为了产生这种非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等人Science 244:182(1989)和Ellman等人，同上中的方法。简言之，这包括化学激活具有非天然存在的氨基酸残基抑制子tRNA，然后体外转录和翻译RNA。本发明的方法包括替换至少一个原始氨基酸残基，但可以替换多于一个原始残基。通常，不超过第一或第二多肽界面中的总残基将包含被替换的原始氨基酸残基。通常，替换的原始残基是“埋入的”。“埋入”是指残基基本上是溶剂不可及的。通常，输入残基不是半胱氨酸，以防止可能的二硫键氧化或错配。
[0263] 突起“可定位”在穴中，这意味着分别在第一多肽和第二多肽界面上的突起和穴的空间位置以及突起和穴的尺寸使得突起可以定位于穴中而没有显著扰乱第一和第二多肽在界面上的正常结合。由于如Tyr、Phe和Trp的突起通常不是从界面的轴线垂直延伸并具有优选的构象，所以突起与相应的穴的对齐依赖于基于三维结构对突起/穴的建模，如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)所获得的三维结构。这可以使用本领域中广泛接受的技术来实现。
[0264] “原始或模板核酸”是指编码感兴趣的多肽的核酸，其可被“改变”(即遗传工程化或突变)以编码突起或穴。原始核酸或起始核酸可以是天然存在的核酸，或者可以包含已经进行事先改变的核酸(例如人源化抗体片段)。“改变”核酸是指原始核酸通过插入、缺失或替换至少一个编码感兴趣氨基酸残基的密码子而突变。通常，编码原始残基的密码子被编码输入残基的密码子替换。已经在Mutagenesis：a Practical Approach,M.J.McPherson,编辑,(IRL Press,Oxford,UK.(1991)中综述了以这种方式遗传修饰DNA的技术，包括例如定点诱变、盒诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。通过使原始/模板核酸突变因此相应地改变由原始/模板核酸编码的原始/模板多肽。
[0265] 可以通过合成手段将突起或穴“引入”第一或第二多肽的界面，例如通过重组技术、体外肽合成、用于引入先前描述的非天然存在的氨基酸残基的那些技术、通过肽的酶促或化学偶联或这些技术的一些组合。因此，“引入”的突起或穴是“非天然存在的”或“非天然的”，这意味着其不存在于自然界或原始多肽(例如人源化单克隆抗体)中。
[0266] 通常，用于形成突起的输入氨基酸残基具有相对少量的“旋转异构体”(例如约3-6个)。“旋转异构体”是氨基酸侧链的能量有利的构象。不同氨基酸残基旋转异构体数量的综述见于Ponders和Richards,J.Mol.Biol.193:775-791(1987)。
[0267] 在一个实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面上相遇/相互作用。在其中第一和第二Fc多肽在界面上相遇的一些实施方案中，第二Fc多肽(序列)的界面包含突起(也称为“杵”)，其可定位在第一Fc多肽(序列)界面中的穴(也称为“臼”)中。在一个实施方案中，已经从模板/原始多肽改变第一Fc多肽以编码穴，或者已经从模板/原始多肽改变第二Fc多肽以编码突起，或已经改变两者。在一个实施方案中，已经从模板/原始多肽改变第一Fc多肽以编码穴和已经从模板/原始多肽改变第二Fc多肽以编码突起。在一个实施方案中，第二Fc多肽的界面包含可定位于第一Fc多肽界面的穴中的突起，其中穴或突起或两者已经分别被引入第一和第二Fc多肽的界面。在其中第一和第二Fc多肽在界面上相遇的一些实施方案中，第一Fc多肽(序列)的界面包含可定位于第二Fc多肽(序列)界面的穴中的突起。在一个实施方案中，已经从模板/原始多肽改变第二Fc多肽以编码穴，或者已经从模板/原始多肽改变第一Fc多肽以编码突起，或改变两者。在一个实施方案中，已经从模板/原始多肽改变第二Fc多肽以编码穴和已经从模板/原始多肽改变第一Fc多肽以编码突起。在一个实施方案中，第一Fc多肽的界面包含可定位于第二Fc多肽界面中的穴中的突起，其中突起或穴或两者已经分别被引入第一和第二Fc多肽的界面中。
[0268] 在一个实施方案中，突起和穴各自包含天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，通过用具有比原始残基更大的侧链体积的输入残基替换来自模板/原始多肽的界面的原始残基产生包含突起的Fc多肽。在一个实施方案中，通过包括以下步骤的方法产生包含突起的Fc多肽，其中用编码比原始具有更大的侧链体积的输入残基的多核苷酸替换编码来自所述多肽界面的原始残基的多核苷酸。在一个实施方案中，原始残基是苏氨酸。在一个实施方案中，原始残基是T366。在一个实施方案中，输入残基是精氨酸(R)。在一个实施方案中，输入残基是苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，输入残基是酪氨酸(Y)。在一个实施方案中，输入残基是色氨酸(W)。在一个实施方案中，输入残基是R、F、Y或W。在一个实施方案中，通过替换模板/原始多肽中的两个或更多个残基产生突起。在一个实施方案中，包含突起的Fc多肽包含用色氨酸替换位置366的苏氨酸，根据Kabat等人的EU编号方案进行氨基酸编号(第688-696页，Sequences of proteins of immunological interest，第5版，第1卷(1991；NIH，Bethesda，MD))。
[0269] 在一些实施方案中，通过用具有比原始残基更小的侧链体积的输入残基替换模板/原始多肽界面中的原始残基来产生包含穴的Fc多肽。例如，可以通过包括以下步骤的方法产生包含穴的Fc多肽，其中用编码比原始具有更小的侧链体积的输入残基的多核苷酸替换编码来自所述多肽界面的原始残基的多核苷酸。在一个实施方案中，原始残基是苏氨酸。在一个实施方案中，原始残基是亮氨酸。在一个实施方案中，原始残基是酪氨酸。在一个实施方案中，输入残基不是半胱氨酸(C)。在一个实施方案中，输入残基是丙氨酸(A)。在一个实施方案中，输入残基是丝氨酸(S)。在一个实施方案中，输入残基是苏氨酸(T)。在一个实施方案中，输入残基是缬氨酸(V)。可以通过替换模板/原始多肽的一个或多个原始残基产生穴。例如，在一个实施方案中，包含穴的Fc多肽包含两个或更多个选自苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸的原始氨基酸的替换。在一个实施方案中，包含穴的Fc多肽包含选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸的两个或更多个输入残基。在一些实施方案中，包含穴的Fc多肽包含选自苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸的两个或更多个原始氨基酸的替换，并且其中所述原始氨基酸被选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸的输入残基替换。在一些实施方案中，被替换的原始氨基酸是T366、L368和/或Y407。在一个实施方案中，包含穴的Fc多肽包含用丝氨酸替换位置366的苏氨酸，根据Kabat等人同上的EU编号方案进行氨基酸编号。在一个实施方案中，包含穴的Fc多肽包含用丙氨酸替换位置368的亮氨酸，根据Kabat等人同上的EU编号方案进行氨基酸编号。在一个实施方案中，包含穴的Fc多肽包含用缬氨酸替换位置407的酪氨酸，根据Kabat等人同上的EU编号方案进行氨基酸编号。在一个实施方案中，包含穴的Fc多肽包含选自T366S、L368A和Y407V的两个或更多个氨基酸替换，根据Kabat等人同上的EU编号方案进行氨基酸编号。在这些抗体片段的一些实施方案中，包含突起的Fc多肽包含用色氨酸替换位置366的苏氨酸，根据Kabat等人同上的EU编号方案进行氨基酸编号。
[0270] 在一个实施方案中，抗体包含构成“杵”和“臼”的Fc突变，如WO2005/063816中所述。例如，臼突变可以是Fc多肽中的T366S、L368A和/或Y407V中的一个或多个，杵突变可以是T366W。
[0271] 在本发明的一个方面中，纯化多特异性抗体，其中所述抗体包含第一半抗体和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含结合IL-17的第一VH/VL单元和第二半抗体包含结合IL-13的第二VH/VL单元。在一些实施方案中，第一半抗体不结合IL-13，并且其中第二半抗体不结合IL-17。
[0272] IL-17家族中有六个成员，IL-17A、B、C、D、E和F。IL-17家族成员形成同二聚体，IL-17A和IL-17F进一步形成异二聚体。参见例如，Gaffen,S.L.,2009,Nature Review 9:556-
567；Hymowitz等人,2001,EMBO J.20:5332-41和WO2005/010044。本领域有时使用IL-17来指代IL-17家族成员的原型，IL-17A。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗体结合并抑制IL-13和IL-17AA的活性。
567；Hymowitz等人,2001,EMBO J.20:5332-41和WO2005/010044。本领域有时使用IL-17来指代IL-17家族成员的原型，IL-17A。在某些实施方案中，本文提供的多特异性抗体结合并抑制IL-13和IL-17AA的活性。
[0273] 在某些特定实施方案中，本文提供的多特异性抗体结合IL-17AA、IL-17AF和IL-17FF，抑制IL-17AA-、IL-17AF-和IL-17FF诱导的活性，并抑制IL-13诱导的活性。在某些实施方案中，抗IL-13/IL-17双特异性抗体是指抗IL-13/IL-17AA、FF和AF抗体。在某些这样的实施方案中，与由IL-17A或IL-17F单独诱导的活性相反，抗IL-13/IL-17AA、AF和FF双特异性抗体有利地阻断由全部IL-17A和F细胞因子诱导的活性。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体结合IL-17AA、IL-17AF和IL-17FF。在一些实施方案中，IL-17AA诱导的活性是体内或体外IL-17AA诱导的基因表达和/或细胞的增殖。在一些实施方案中，IL-17AF诱导的活性是在体内或体外IL-17AF诱导的基因表达和/或细胞增殖。在一些这样的实施方案中，IL-17FF诱导的活性是在体内或体外IL-17FF诱导的基因表达和/或细胞增殖。在一些实施方案中，IL-13诱导的活性是在体内或体外IL-13诱导的基因表达和/或细胞增殖。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体不抑制IL-13与IL-13Rα1的结合。
[0274] 在一些实施方案中，抗IL13/IL17AA AF FF双特异性抗体包含第一半抗体和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含结合IL-17AA、AF和FF的第一VH/VL单元并且所述第二半抗体包含结合IL-13的第二VH/VL单元，其中第一VH/VL单元包含含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-L3，并且其中第二VH/VL单元包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，第一半抗体不结合IL-13，第二半抗体不结合IL-17。
[0275] 在一些实施方案中，第一VH/VL单元包含与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL序列，并且其中第二VH/VL单元包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL序列。在一些实施方案中，提供了多特异性抗体，其中第一VH/VL单元包含具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VH序列和具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VL序列，并且其中第二VH/VL单元包含具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH序列和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VL序列。
[0276] 在某些实施方案中，第一半抗体结合IL17AA AF和FF，其包含含有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的轻链，第二半抗体结合IL13，其包含含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，第一半抗体结合IL17AA AF和FF，其包含含有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的轻链，第二半抗体结合IL13，其包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链。与抗IL13/抗IL17抗体相关的序列显示于表3。参见PCT/US2015/01716(WO2015/127405)，其通过引用整体并入本文。表3
V.载体、宿主细胞和重组方法
V.载体、宿主细胞和重组方法
[0277] 为了使用FkpA重组产生异源多肽(例如多特异性抗体)，分离编码多肽(例如多特异性抗体)的核酸并将其插入到可复制载体中用于进一步克隆(扩增DNA)或表达。使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离编码多肽(例如多特异性抗体)的DNA并对其进行测序。许多载体都可用。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞或者是原核来源的。应该理解的是，任何同种型的恒定区可以用于该目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且这样的恒定区可以从任何人或动物物种获得。A使用原核宿主细胞产生抗体
i载体构建
i载体构建
[0278] 可使用标准重组技术获得编码本发明多特异性抗体的多肽组分的多核苷酸序列。可以从抗体生产细胞如杂交瘤细胞中分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，将编码多肽的序列插入到能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域可用的和已知的许多载体可用于本发明的目的。选择合适的载体将主要取决于待插入载体的核酸的大小以及用载体转化的特定宿主细胞。根据其功能(异源多核苷酸的扩增或表达，或两者)及其与其所在的特定宿主细胞的相容性，每个载体含有各种组分。载体组分通常包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入和转录终止序列。
[0279] 通常，含有源自与宿主细胞相容的物种的复制和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，通常使用源自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322含有编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，因此提供了用于鉴定转化细胞的简单手段。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体也可以含有或被修饰成含有可被微生物体用于表达内源蛋白的启动子。在Carter等人的美国专利号5,648,237中详细描述了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。
[0280] 此外，含有与宿主微生物相容的复制和控制序列的噬菌体载体可用作与这些宿主TM-11有关的转化载体。例如，如GEM 的噬菌体可用于制备重组载体，所述重组载体可用于转化易感宿主细胞如大肠杆菌LE392。
[0281] 本发明的表达载体可以包含编码每种多肽组分的两个或更多个启动子-顺反子对。启动子是位于调控其表达的顺反子上游(5')的非翻译调控序列。原核启动子通常分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子是一种启动子，启动响应培养条件变化(例如存在或不存在营养物质或温度变化)在其控制下的顺反子转录水平的增加。
[0282] 各种潜在的宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。通过限制性酶消化从源DNA去除启动子并将分离的启动子序列插入到本发明的载体中，可以将所选启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作地连接。可以使用天然启动子序列和许多异源启动子来指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常允许更高的转录和表达的靶基因的更高的产量。
[0283] 适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、内酰胺酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子，如tac或trc启动子。然而，在细菌中起作用的其他启动子(例如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经公开，从而使得技术工作者使用提供任何所需的限制性位点的接头或适体将其可操作地连接至编码靶轻链和重链的顺反子(Siebenlist等人,(1980)Cell 20:269)。
[0284] 翻译起始区(TIR)是蛋白质总体翻译水平的主要决定因素。TIR包括编码信号序列的多核苷酸，并且从Shine-Delgarno序列的紧邻上游延伸至起始密码子下游约二十个核苷酸。通常，载体将包含TIR，TIR和变体TIR是本领域已知的，用于产生TIR的方法在本领域中是已知的。可以产生一系列具有一定范围翻译强度的核酸序列变体，由此提供方便的手段以针对许多不同多肽的最佳分泌来调节该因子。与这些变体融合的报告基因如PhoA的使用提供了定量不同翻译起始区的相对翻译强度的方法。可以在质粒载体背景中提供变体或突变TIR，从而提供一组质粒，可以将感兴趣基因插入这些质粒并测量其表达，从而建立最佳范围的翻译强度用于最大程度表达成熟多肽。美国专利8,241,901中公开了变体TIR。
[0285] 在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子包含指导所表达的多肽穿过膜易位的分泌信号序列组分。通常，信号序列可以是载体的组分，或者其可以是插入到载体中的靶多肽DNA的一部分。为了本发明的目的选择的信号序列应该是被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工异源多肽天然信号序列的原核宿主细胞，信号序列被选自例如本发明信号多肽的原核信号序列取代。另外，载体可以包含选自碱性磷酸酶、青霉素酶、Lpp或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP的信号序列。
[0286] 一方面，一个或多个多核苷酸(例如表达载体)共同编码抗体。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码抗体的轻链和分开的多核苷酸编码抗体的重链。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码抗体的轻链和重链。在一些实施方案中，一个或多个多核苷酸(例如表达载体)共同编码单臂抗体。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码(a)单臂抗体的轻链和重链，和(b)Fc多肽。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码单臂抗体的轻链和重链，并且单独的多核苷酸编码Fc多肽。在一个实施方案中，分开的多核苷酸分别编码单臂抗体的轻链组分、单臂抗体的重链组分和Fc多肽。例如在WO2005063816中描述了单臂抗体的产生。
[0287] 适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用的细菌的实例包括埃希氏杆菌(例如大肠杆菌)、芽孢杆菌(例如枯草芽孢杆菌(B.Subtilis))、肠杆菌、假单胞菌(例如铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯菌、变形杆菌、志贺氏菌、根瘤菌、透明颤菌或副球菌。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，大肠杆菌细胞被用作本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,vol.2(Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987)第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)和菌株63C1和64B4。在一些实施方案中，大肠杆菌菌株是命名为62A7(ΔfhuA(ΔtonA)ptr3,lacIq,lacL8,ompTΔ(nmpc-fepE)ΔdegP ilvG修复)的W3110衍生物。其他菌株及其衍生物，如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ
1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)的也是合适的。这些例子是说明性的而非限制性的。用于构建具有确定基因型的任何上述细菌的衍生物的方法是本领域已知的，并且在例如Bass等人，Proteins，8：309-314(1990)中描述。通常需要考虑复制子在细菌细胞中的复制性来选择合适的细菌。例如，当使用众所周知的质粒如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌种可以适合用作宿主。典型地，宿主细胞应该分泌最小量的蛋白质水解酶，并且理想地可以将另外的蛋白酶抑制剂掺入细胞培养物中。
1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)的也是合适的。这些例子是说明性的而非限制性的。用于构建具有确定基因型的任何上述细菌的衍生物的方法是本领域已知的，并且在例如Bass等人，Proteins，8：309-314(1990)中描述。通常需要考虑复制子在细菌细胞中的复制性来选择合适的细菌。例如，当使用众所周知的质粒如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌种可以适合用作宿主。典型地，宿主细胞应该分泌最小量的蛋白质水解酶，并且理想地可以将另外的蛋白酶抑制剂掺入细胞培养物中。
[0288] 为了改善细菌培养物中多肽的生产产率和质量，可以对细菌细胞进行修饰。例如，为了改善分泌的抗体多肽的正确组装和折叠，细菌宿主细胞可以包含表达伴侣蛋白的另外的载体，如FkpA和Dsb蛋白(DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)可用于共转化宿主原核细胞。已证明伴侣蛋白有助于在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白的正确折叠和溶解性。ii.抗体生产[0289] 用上述表达载体转化宿主细胞，并在常规营养培养基中培养，适当修饰所述培养基以诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因。
[0290] 转化是指将DNA导入原核宿主中，使得DNA可作为染色体外元件复制或通过染色体整合复制。根据使用的宿主细胞，使用适合于这种细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于含有大量细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。另一种使用的技术是电穿孔。
[0291] 用于产生本发明多肽的原核细胞在本领域已知的并适于培养所选宿主细胞的培养基中生长。合适的培养基的实例包括Luria肉汤(LB)加上必需的营养补充剂。在一些实施方案中，培养基还含有基于表达载体的构建选择的选择剂，以选择性地允许含有表达载体的原核细胞生长。例如，氨苄青霉素加入到培养基中用于表达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。
[0292] 也可以以适当的浓度包括除碳、氮和无机磷酸盐源之外的任何必需的补充剂，单独引入或作为与另一种补充剂或培养基的混合物(如复合氮源)引入。任选地，培养基可以含有一种或多种选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇的还原剂。
[0293] 在合适的温度下培养原核宿主细胞。对于大肠杆菌的生长，例如，优选的温度范围为约20℃至约39℃、更优选约25℃至约37℃、甚至更优选约30℃。培养基的pH可以是约5至约9的任何pH，主要取决于宿主生物体。对于大肠杆菌，pH优选为约6.8至约7.4，更优选约7.0。
[0294] 如果在本发明的表达载体中使用诱导型启动子，则在适合激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，转化的宿主细胞在磷酸盐限制性培养基中培养以诱导。优选地，磷酸盐限制性培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等人,J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)或WO2002/061090中描述的培养基。如本领域已知的，根据采用的载体构建体可以使用各种其他诱导剂。
[0295] 在一个实施方案中，本发明表达的多肽分泌到宿主细胞周质中并从其中回收。蛋白质回收通常包括破坏微生物，一般通过如渗透压休克、超声处理或裂解的手段。一旦细胞被破坏，可以通过离心或过滤去除细胞碎片或全细胞。可以进一步纯化蛋白质，例如通过亲和树脂层析法。或者，可以将蛋白质运输到培养基中并在其中分离。可以从培养物中去除细胞、过滤并浓缩培养物上清液，以进一步纯化产生的蛋白质。可以使用通常已知的方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹测定法进一步分离和鉴定表达的多肽。
[0296] 在本发明的一个方面中，通过发酵过程大量进行抗体生产。各种大规模补料分批发酵方法可用于生产重组多肽。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1000到100000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧气和营养物质，尤其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升、和范围在约1升至约100升的发酵罐中发酵。
[0297] 在发酵过程中，通常在合适的条件下使细胞生长至期望的密度(例如约180-220的OD 550)之后启动蛋白质表达的诱导，在该阶段细胞处于早期的稳定期。根据所采用的载体构建体可以使用各种诱导剂，如本领域已知和上文所述。诱导前细胞可以生长较短的时间。通常诱导细胞约12-50小时，尽管可以使用更长或更短的诱导时间。
[0298] 为了改善本发明多肽的生产产率和质量，可以对各种发酵条件进行修饰。例如，为了改善分泌的抗体多肽的正确组装和折叠，表达伴侣蛋白如FkpA、DsbA和/或DsbC的另外的载体可用于共转化宿主原核细胞。已证明伴侣蛋白有助于在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白的正确折叠和溶解性。在一些实施方案中，FkpA、DsbA和/或DsbC在细菌宿主细胞中表达。
[0299] 为了使表达的异源蛋白(尤其是蛋白质水解敏感的蛋白质)的蛋白质水解最小化，蛋白质水解酶缺陷的某些宿主菌株可以用于本发明。例如，可以修饰宿主细胞菌株以在编码已知细菌蛋白酶如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合的基因中产生基因突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株是可用的并描述于例如Joly等人,(1998),同上；Georgiou等人,美国专利号：5,264,365；Georgiou等人,美国专利号：5,508,192；Hara等人,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)。
[0300] 在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷和用表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。B.抗体纯化
[0301] 可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下方法是合适的纯化方法的示例：在免疫亲和或离子交换柱上分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅或阳离子交换树脂如SP或阴离子交换如DEAE上的层析法、层析法聚焦、SDS–PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
[0302] 在一个方面，固定在固相上的蛋白A用于免疫亲和纯化本发明的抗体产物。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD的细胞壁蛋白，其以高亲和力结合抗体的Fc区。Lindmark等人,(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。固定蛋白A的固相优选包含玻璃或二氧化硅表面的柱，更优选可控孔度玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，柱已经包被有如甘油的试剂，试图防止杂质的非特异性附着。
[0303] 作为纯化的第一个步骤，将如上所述来自细胞培养物的制剂施加到蛋白A固定的固相上，以允许感兴趣的抗体特异性结合蛋白A。然后洗涤固相以去除非特异性结合到固相上的杂质。最后通过洗脱从固相回收感兴趣的抗体。
[0304] 在本发明的一些实施方案中，针对FkpA的去除分析源自一个或多个纯化步骤的级分。在一些实施方案中，通过免疫测定法测定FkpA的去除；例如通过本文所述的免疫测定法。
[0305] 本发明还提供了免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，其包含例如与细胞毒性剂(如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶联物))缀合的本文所述的任何抗体。
[0306] 以下描述本发明的双特异性抗体的纯化方案。VI.FkpA的组成
[0307] 在一些方面，本发明提供了包含超纯FkpA的组合物。在一些实施方案中，组合物包含FkpA，其中FkpA是大于约95.0％、96.0％、97.0％、98.0％、99.0％或99.5％中任意的FkpA。在一些实施方案中，包含95％FkpA的组合物是这样一种组合物，其中制剂中少于5％的物质是在FkpA生产期间存在于细胞或细胞裂解物中的其他物质(例如蛋白质、核酸、脂质等)。在一些实施方案中，通过尺寸排阻层析法(例如HPLC-SEC)测量FkpA多肽的百分比。在一些实施方案中，包含超纯FkpA的组合物包含少于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％中任意的低分子量物质(例如，如通过SEC或SDS-PAGE所测量，分子量小于FkpA的物质)。在一些实施方案中，包含超纯FkpA的组合物包含少于约2％的低分子量物质。在一些实施方案中，包含超纯FkpA的组合物包含少于约5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％中任意的高分子量物质(例如，如通过SEC或SDS-PAGE所测量，分子量大于FkpA的物质)。在一些实施方案中，包含超纯FkpA的组合物包含少于约1％的高分子量物质。
[0308] 在一些实施方案中，将包含高纯度FkpA的组合物配制使用。在一些实施方案中，将包含超纯FkpA的组合物配制用于免疫动物以产生针对FkpA的抗体；例如通过加入佐剂以促进免疫应答的产生。在其他实施方案中，将包含超纯FkpA的组合物配制用于免疫测定法；例如，作为阳性对照或作为标准曲线。VII.产生针对FkpA的抗体
[0309] 在某些方面，本发明提供超纯FkpA作为免疫原以产生用于免疫测定法的抗体(例如多克隆抗体和/或单克隆抗体)，所述免疫测定法用于分析重组多肽样品中FkpA的存在。例如，抗体可用于免疫测定法中以检测和/或定量重组多肽样品中的FkpA，其中重组多肽(例如多特异性抗体)在表达外源FkpA的细菌细胞中产生。在一些实施方案中，本发明提供了特异性结合超纯FkpA的多克隆抗体。在一些方面，多克隆抗体特异性结合FkpA的不同表位，因此提供检测FkpA片段、变体、错误折叠的蛋白等的用途。为了最小化针对宿主细胞蛋白杂质的兔抗体的产生(该宿主细胞蛋白杂质可能导致对免疫测定法测量的样品中的FkpA水平的过度定量或过度评估)，用超纯FkpA免疫动物(例如兔)。
[0310] 本发明提供了特异性结合FkpA的抗体。在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体。多克隆抗体优选在动物中通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂而产生。使用双功能剂或衍生剂将相关抗原缀合到在待免疫物种中具有免疫原性的多肽(例如钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)可能是有用的，所述双功能剂或衍生剂例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酰酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基。
[0311] 通过组合例如100μg或5μg的多肽或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂，并将溶液多个位点皮内注射给动物，来针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。一个月后，用1/5至1/10原始量的弗氏完全佐剂中的肽或缀合物通过多个位点皮下注射加强免疫动物。7至14天后，将动物取血并测定血清的抗体滴度。加强免疫动物直到滴度平台。在一些实施方案中，用相同抗原的缀合物加强免疫动物，但该抗原缀合至不同的多肽和/或通过不同的交联剂缀合。缀合物也可以作为多肽融合体在重组细胞培养物中制备。而且，聚集剂如明矾适合用于增强免疫应答。
[0312] 在一些实施方案中，用FkpA免疫的动物是山羊、绵羊、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、大鼠、驴或鸡。
[0313] 在一些实施方案中，特异性结合FkpA的抗体是单克隆抗体。单克隆抗体从基本上同质的抗体群获得，即除了在生产单克隆抗体期间可能出现的变体(这样的变体通常以少量存在)之外，群包含的各抗体是相同的和/或结合相同的表位。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特征不是离散或多克隆抗体的混合物。如上所述，可以使用Kohler等人,Nature 256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备单克隆抗体，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制备单克隆抗体。
[0314] 在一些方面，本发明提供纯化特异性结合FkpA的抗体的方法，包括使包含抗-FkpA抗体的组合物与包含附着于支持材料的超纯FkpA的层析材料接触，洗涤层析材料以去除未结合的化合物，以及洗脱抗FkpA抗体。在一些实施方案中，附着于支持材料的超纯FkpA包含少于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％中任意的杂质。在一些实施方案中，通过本文所述的方法制备超纯FkpA。在一些实施方案中，本发明提供了纯化特异性结合FkpA的多克隆抗体的方法。在一些实施方案中，少于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％中任意的多克隆抗体特异性结合非FkpA化合物。
[0315] 在一些实施方案中，通过使抗体与固定在层析材料上的超纯FkpA(例如，固定于激活的甘油可控孔度玻璃的超纯FkpA)接触来纯化抗-FkpA抗体。在一些实施方案中，例如，在与固定的FkpA接触之前，通过硫酸铵沉淀来浓缩抗体。在一些实施方案中，抗体与固定的FkpA结合，然后洗涤固定的FkpA-抗体复合物以去除未结合的杂质。在进一步的实施方案中，通过用与加载缓冲液不同pH的缓冲液洗脱从固定的FkpA洗脱抗体；例如，抗体在中性pH(例如pH 7.2)下与固定的FkpA结合，并在酸性pH(例如pH 2.0)下洗脱。在一些进一步的实施方案中，使抗-FkpA抗体进行进一步的层析法；例如尺寸排阻层析法。在一些实施方案中，分别测定纯化的抗-FkpA抗体(例如多克隆抗体)与超纯FkpA的结合。VIII.使用针对FkpA的抗体的免疫测定法
[0316] 在一些实施方案中，本发明提供了用于分析重组多肽(例如多特异性抗体)样品中FkpA的存在和/或量的方法，包括使用免疫测定法检测样品中的FkpA，并比较样品中检测到的FkpA的量与超纯FkpA参照标准的一个或多个浓度的检测。在一些实施方案中，制剂包含少于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％中任意的杂质。在一些实施方案中，通过本文所述的方法制备超纯FkpA参照标准。在一些实施方案中，免疫测定法包含特异性结合超纯FkpA的抗体。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体结合少于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、
0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％中任意的非FkpA化合物。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体是多克隆抗体。在其他实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体用作免疫测定法中的捕获抗体。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体用作检测抗体。在一些实施方案中，检测抗体与检测试剂(例如辣根过氧化物酶)缀合。在一些实施方案中，FkpA是大肠杆菌FkpA。在一些实施方案中，重组多肽在宿主细胞(例如大肠杆菌宿主细胞)中制备。
在一些实施方案中，宿主细胞过表达FkpA(例如，过表达FkpA的大肠杆菌宿主细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞表达外源FkpA(例如，表达外源FkpA的大肠杆菌宿主细胞)。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物或从重组多肽制剂获得，并且其中重组多肽制剂已经进行一个或多个层析法纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制剂是最终纯化的产物。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体能够在免疫测定法中检测少于约和/或约50ng/mL、
25ng/mL、15ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL和/或1.5ng/mL中任意的FkpA。
0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％中任意的非FkpA化合物。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体是多克隆抗体。在其他实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体用作免疫测定法中的捕获抗体。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体用作检测抗体。在一些实施方案中，检测抗体与检测试剂(例如辣根过氧化物酶)缀合。在一些实施方案中，FkpA是大肠杆菌FkpA。在一些实施方案中，重组多肽在宿主细胞(例如大肠杆菌宿主细胞)中制备。
在一些实施方案中，宿主细胞过表达FkpA(例如，过表达FkpA的大肠杆菌宿主细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞表达外源FkpA(例如，表达外源FkpA的大肠杆菌宿主细胞)。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物或从重组多肽制剂获得，并且其中重组多肽制剂已经进行一个或多个层析法纯化步骤。在一些实施方案中，重组多肽制剂是最终纯化的产物。在一些实施方案中，特异性结合超纯FkpA的抗体能够在免疫测定法中检测少于约和/或约50ng/mL、
25ng/mL、15ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL和/或1.5ng/mL中任意的FkpA。
[0317] 在一些方面，本发明提供了用于检测和定量FkpA的免疫测定方法。这样的方法可以用于检测和定量在宿主细胞(例如大肠杆菌)中产生的重组多肽制品中的FkpA，在所述宿主细胞中FkpA被表达以促进多肽的折叠和组装。在一些实施方案中，免疫测定方法使用本文所述的捕获和检测抗-FkpA抗体。在一些实施方案中，抗体用于本领域已知的任何免疫测定方法，包括但不限于夹心测定法、酶联免疫吸附测定(ELISA)测定法、电化学测定(ECL)测定法、磁性免疫测定法。在某些实施方案中，方法包括使重组多肽制剂的样品与本文所述的抗-FkpA抗体在允许抗-FkpA抗体与FkpA结合的条件下接触，并检测所述抗-FkpA抗体与FkpA之间是否形成复合物。
[0318] 在某些实施方案中，提供了标记的抗FkpA抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或部分(如荧光、发色团、电子密度、化学发光和放射性标记)以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分(如酶或配体)。示例性的标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与使用过氧化氢的酶偶联以氧化染料前体如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基，等等。
[0319] 在某些实施方案中，捕获抗-FkpA抗体固定在固相上。在一些实施方案中，用于固定的固相是任何惰性支持物或载体，其基本上不溶于水，且可用于免疫测定法，包括例如表面、颗粒、多孔基质、珠子等形式的支持物。常用的支持物的实例包括小片、凝胶、聚氯乙烯、塑料珠子、以及由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制成的测定平板或试管，包括96孔微量滴定板，以及颗粒材料如滤纸、琼脂糖、交联的葡聚糖和其他多糖。或者，反应性水不溶性基质如溴化氰激活的碳水化合物和美国专利号3,969,287；3,691,016；4,195,
128；4,247,642；4,229,537和4,330,440中描述的反应性底物适合用于捕获剂固定。在一些实施方案中，将固定的捕获剂包被在可用于一次分析几个样品的微量滴定板上。示例性的微量滴定板包括但不限于 NUNC
和 用如上定义的捕获剂包被固相，其可以根据需要通过非共价或共价相
互作用或物理连接连接。用于附着的技术包括在美国专利号4,376,110和其中引用的参考文献中描述的技术。如果是共价相互作用，则在本领域熟知的条件下(例如在室温下持续1小时)将平板或其他固相与交联剂和捕获剂一起孵育。在一些实施方案中，在测定法本身之前堆积(stack)平板并包被很长时间，然后以手动、半自动或自动方式(如通过使用机器人)在几个样品上同时进行测定法。
128；4,247,642；4,229,537和4,330,440中描述的反应性底物适合用于捕获剂固定。在一些实施方案中，将固定的捕获剂包被在可用于一次分析几个样品的微量滴定板上。示例性的微量滴定板包括但不限于 NUNC
和 用如上定义的捕获剂包被固相，其可以根据需要通过非共价或共价相
互作用或物理连接连接。用于附着的技术包括在美国专利号4,376,110和其中引用的参考文献中描述的技术。如果是共价相互作用，则在本领域熟知的条件下(例如在室温下持续1小时)将平板或其他固相与交联剂和捕获剂一起孵育。在一些实施方案中，在测定法本身之前堆积(stack)平板并包被很长时间，然后以手动、半自动或自动方式(如通过使用机器人)在几个样品上同时进行测定法。
[0320] 在一些实施方案中，用非特异性结合并饱和结合位点的阻断剂处理包被的平板，以防止游离配体与平板孔上过量位点的不想要的结合。用于此目的合适的阻断剂的实例包括但不限于例如明胶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白和脱脂奶。阻断处理通常在环境温度的条件下进行一段时间，通常约1-4小时。
[0321] 在一些实施方案中，在包被和阻断之后将适当稀释的待分析样品加入到固定相中。可以用于此目的稀释的示例性缓冲液包括但不限于(a)含有0.5％BSA、0.05％TWEEN洗涤剂(P20)、0.05％ 300抗生素、5％EDTA、0.25％3-((3-胆酰胺丙基)二甲基铵)-1-丙磺酸盐(CHAPS)表面活性剂、0.2％β-γ球蛋白和0.35M NaCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)；(b)含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)、0.05％P20和0.05％ 300,pH
7的PBS；(c)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％ 300、5mM EDTA和0.35M NaCl，
pH 6.35的PBS；(d)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％ 300、5mM EDTA、0.2％
β-γ球蛋白和0.35M NaCl的PBS；和(e)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％
300、5mM EDTA、0.25％CHAPS和0.35M NaCl的PBS。
7的PBS；(c)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％ 300、5mM EDTA和0.35M NaCl，
pH 6.35的PBS；(d)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％ 300、5mM EDTA、0.2％
β-γ球蛋白和0.35M NaCl的PBS；和(e)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％
300、5mM EDTA、0.25％CHAPS和0.35M NaCl的PBS。
[0322] 选择孵育样品和固定的捕获剂的条件以最大化测定法的灵敏度并最小化解离，并确保样品中存在的任何感兴趣的分析物(如FkpA)与固定的捕获剂结合。任选地，从固定的捕获剂分离(例如通过洗涤)样品以去除未捕获的物质。用于洗涤的溶液通常是缓冲液(例如“洗涤缓冲液”)。如果有任何担心所捕获的感兴趣物质可能在随后的步骤中在一定程度上解离，则可以在这个阶段加入交联剂或其他合适的试剂，以允许现在结合的感兴趣物质(例如FkpA)与捕获剂共价附着。
[0323] 具有任何结合的本发明感兴趣物质的固定的捕获剂与检测抗-FkpA抗体接触。在一些实施方案中，检测抗体是生物素化的。在一些实施方案中，对于生物素化的标记物的检测手段是抗生物素或链霉亲和素-HRP。在一些实施方案中，检测手段的读取是荧光或比色。
[0324] 使用检测抗体的检测手段测量或定量现在与捕获剂结合的来自样品的任何游离的感兴趣物质(例如FkpA)的水平。在一些实施方案中，测量或定量包括比较作为上述步骤的结果发生的反应与标准曲线以确定与已知量相比较的感兴趣物质(例如FkpA)的水平。
[0325] 加入到固定的捕获剂中的抗体被直接标记，或者通过在洗去过量的第一抗体之后加入摩尔过量的第二标记抗体(所述抗体针对第一抗体动物物种的IgG)间接检测。在后者的间接测定法中，将标记的针对第一抗体的抗血清加入到样品中以便原位产生标记的抗体。
[0326] 用于第一或第二抗体的标记物是不干扰游离的感兴趣物质(例如FkpA)与第一或第二抗体结合的任何可检测的官能团。合适的标记物的实例包括已知用于免疫测定法的那些标记物，如上面列举的那些。
[0327] 常规方法可用于将这些标记物与蛋白或多肽共价结合。例如，可以使用偶联剂如二醛、碳化二亚胺、二马来酰亚胺、双亚胺酸酯、双重氮化的联苯胺等使抗体标记上述荧光、化学发光和酶标记物。参见，例如，美国专利号3,940,475(荧光测定法)和美国专利号3,645,090(酶)；Hunter等人,Nature 144:945(1962)；David等人,Biochemistry,13:1014-
1021(1974)；Pain等人,J.Immunol.Methods 40:219-230(1981)；和Nygren,
J.Histochem.and Cytochem.,30:407-412(1982)。
IX.获得用于制剂和方法中的多特异性抗体
1021(1974)；Pain等人,J.Immunol.Methods 40:219-230(1981)；和Nygren,
J.Histochem.and Cytochem.,30:407-412(1982)。
IX.获得用于制剂和方法中的多特异性抗体
[0328] 本文所述的纯化方法中使用的多特异性抗体可以使用本领域众所周知的方法获得，包括重组方法。以下部分提供有关这些方法的指导。(A)多核苷酸
[0329] 编码多肽的多核苷酸可以从任何来源获得，包括但不限于cDNA文库，所述cDNA文库从被认为具有多肽mRNA并以可检测水平表达该多肽mRNA的组织制备。因此，编码多肽的多核苷酸可以方便地从人组织制备的cDNA文库获得。编码多肽的基因也可以从基因组文库获得或通过已知的合成步骤(例如自动核酸合成)获得。
[0330] 例如，多核苷酸可以编码完整的免疫球蛋白分子链，如轻链或重链。完整的重链不仅包含重链可变区(VH)，而且还包含重链恒定区(CH)，(通常包含三个恒定结构域：CH1、CH2和CH3)和“铰链”区。在某些情况下，恒定区的存在是需要的。
[0331] 可以由多核苷酸编码的其他多肽包括抗原结合抗体片段，如单结构域抗体(“dAb”)、Fv、scFv、Fab'和F(ab')2和“微抗体”。微抗体(通常)是已经切除了CH1和CK或CL结构域的二价抗体片段。由于微抗体小于常规抗体，在临床/诊断应用其应该获得更好的组织渗透性，但是作为二价，其应该比单价抗体片段如dAbs保留更高的结合亲和力。因此，除非上下文另外指出，否则本文使用的术语“抗体”不仅涵盖完整抗体分子，还涵盖上述类型的抗原结合抗体片段。优选地，编码多肽中存在的每个框架区相对于相应的人受体框架将包含至少一个氨基酸取代。因此，例如，相对于受体框架区，框架区可以总共包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代。
[0332] 合适地，本文所述的多核苷酸可以是分离的和/或纯化的。在一些实施方案中，多核苷酸是分离的多核苷酸。
[0333] 术语“分离的多核苷酸”旨在表示该分子从其正常或天然环境中移出或分离，或以不存在于其正常或天然环境中的方式产生。在一些实施方案中，多核苷酸是纯化的多核苷酸。术语“纯化”旨在表示至少一些污染分子或物质已经被去除。
[0334] 合适地，多核苷酸是基本上纯化的，使得相关多核苷酸构成组合物中存在的显性(即最丰富的)多核苷酸。(B)多核苷酸的表达
[0335] 以下描述主要涉及通过培养用含有编码多肽的多核苷酸的载体转化或转染的细胞来产生多肽。当然，可以考虑使用本领域熟知的替换方法来制备多肽。例如，可以通过使用固相技术的直接肽合成来产生适当的氨基酸序列或其部分(参见例如Stewart等人,Solid-Phase Peptide Synthesis W.H.Freeman Co.,San Francisco,Calif.(1969)；Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。可以使用手动技术或通过自动化进行体外蛋白合成。例如，可以使用Applied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City，CA)使用制造商的说明书来完成自动合成。可以化学分别合成多肽的各个部分并使用化学或酶促方法组合以产生期望的多肽。
[0336] 将如本文所述的多核苷酸插入表达载体以产生多肽。术语“控制序列”是指在特定的宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。控制序列包括但不限于启动子(例如天然相关或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。
[0337] 当多核苷酸置于与另一多核苷酸序列的功能关系中时，其是“可操作地连接”的。例如，前序列或分泌前导序列的核酸如果作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则其与多肽的核酸可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；
或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则其与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指被连接的核酸序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并处于阅读框架中。但是，增强子并不需要是连续的。连接是通过在方便的限制性位点进行连接来完成的。如果这样的位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适体或接头。
或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则其与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指被连接的核酸序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并处于阅读框架中。但是，增强子并不需要是连续的。连接是通过在方便的限制性位点进行连接来完成的。如果这样的位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适体或接头。
[0338] 对于抗体，可以在相同或不同的表达载体中克隆轻链和重链。编码免疫球蛋白链的核酸区段与表达载体中的控制序列可操作地连接以确保免疫球蛋白多肽的表达。
[0339] 可以通过众所周知的方法将含有多核苷酸序列(例如，可变重链和/或可变轻链编码序列和任选的表达控制序列)的载体转移到宿主细胞中，所述方法取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质体、基因枪或基于病毒的转染可用于其他细胞宿主。(通常参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,2nd ed.,1989)。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射到受精的卵母细胞中，或者可以将其掺入胚胎干细胞的基因组中，并将这些细胞的细胞核转移到去核卵母细胞中。
载体
载体
[0340] 术语“载体”包括表达载体和转化载体和穿梭载体。
[0341] 术语“表达载体”是指能够在体内或体外表达的构建体。
[0342] 术语“转化载体”是指能够从一个实体转移到另一个实体(可以是该物种的或可以是不同物种的实体)的构建体。如果构建体能够从一个物种转移到另一个物种，如从大肠杆菌质粒转移到细菌如芽孢杆菌属，那么转化载体有时被称为“穿梭载体”。它甚至可以是能够从大肠杆菌质粒转移到农杆菌到植物的构建体。
[0343] 如下所述，可将载体转化到合适的宿主细胞中以提供多肽的表达。各种载体是公众可获得的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种步骤将适当的核酸序列插入载体中。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入合适的限制性内切核酸酶位点。采用本领域技术人员已知的标准连接技术构建含有一种或多种这些组分的合适载体。
[0344] 载体可以是例如提供有复制起点的质粒、病毒或噬菌体载体，任选地提供有用于表达所述多核苷酸的启动子和任选地启动子的调节子。载体可以含有一种或多种本领域公知的选择性标记物基因。
[0345] 这些表达载体通常可作为附加体在宿主生物体中复制或作为宿主染色体DNA的整合部分在宿主生物体中复制。宿主细胞
[0346] 宿主细胞可以是例如细菌、酵母或其他真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
[0347] 可以使用已经被遗传操作的转基因多细胞宿主生物体来生产多肽。生物体可以是例如转基因哺乳动物生物体(例如，转基因山羊或小鼠系)。
[0348] 合适的原核生物包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如大肠杆菌。各种大肠杆菌菌株是公众可获得的，如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5 772(ATCC 53,635)。其他合适的原核宿主细胞包括肠杆菌科如埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属)，沙门氏菌属(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))，沙雷氏菌属(Serratia)(例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志贺菌属，以及芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)(例如地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属如铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。这些例子是说明性的而非限制性的。菌株W3110是特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用于重组多核苷酸产物发酵的常见宿主菌株。优选地，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，可以修饰菌株W3110以在编码宿主内源多肽的基因中产生遗传突变，这种宿主的实例包括具有完整基因型tonA的大肠杆菌W3110菌株1A2；具有完整基因型tonA ptr3的大肠杆菌W3110菌株9E4；具有完整基因型tonA ptr3phoA E15(argF-lac)169degP ompT kan'的大肠杆菌W3110菌株
27C7(ATCC 55,244)；具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169degP ompT rbs7 ilvG kan'的大肠杆菌W3110菌株37D6；大肠杆菌W3110菌株40B4(其是具有非卡那霉素抗性degP缺失突变的菌株37D6)；和具有突变的周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法如PCR或其他核酸聚合酶反应是合适的。在一些实施方案中，原核宿主细胞(例如大肠杆菌宿主细胞)表达一种或多种分子伴侣以促进抗体的折叠和组装。在一些实施方案中，分子伴侣是FkpA、DsbA或DsbC中的一种或多种。在一些实施方案中，分子伴侣由内源分子伴侣基因表达。在一些实施方案中，分子伴侣由外源分子伴侣基因表达。在一些实施方案中，分子伴侣基因是大肠杆菌分子伴侣基因(例如，大肠杆菌FkpA基因、大肠杆菌DsbA基因和/或大肠杆菌DsbC基因)。
27C7(ATCC 55,244)；具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169degP ompT rbs7 ilvG kan'的大肠杆菌W3110菌株37D6；大肠杆菌W3110菌株40B4(其是具有非卡那霉素抗性degP缺失突变的菌株37D6)；和具有突变的周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法如PCR或其他核酸聚合酶反应是合适的。在一些实施方案中，原核宿主细胞(例如大肠杆菌宿主细胞)表达一种或多种分子伴侣以促进抗体的折叠和组装。在一些实施方案中，分子伴侣是FkpA、DsbA或DsbC中的一种或多种。在一些实施方案中，分子伴侣由内源分子伴侣基因表达。在一些实施方案中，分子伴侣由外源分子伴侣基因表达。在一些实施方案中，分子伴侣基因是大肠杆菌分子伴侣基因(例如，大肠杆菌FkpA基因、大肠杆菌DsbA基因和/或大肠杆菌DsbC基因)。
[0349] 在这些原核宿主中，可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，存在许多各种已知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达，任选地与操纵子序列一起，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。
[0350] 真核微生物可以用于表达。真核微生物如丝状真菌或酵母是用于编码多肽的载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574)、脆弱克鲁维酵母K.fragilis(ATCC12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16045)、K.wickeramii(ATCC24178)、K.waltii(ATCC56500)、K.drosophilarum(ATCC 36906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；念珠菌；里氏木霉(Trichoderma reesia)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺氏酵母(Schwanniomyces)如Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Tolypocladium，以及曲霉属宿主如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。甲烷同化(Methylotropic)酵母适用于本文，包括但不限于能够在甲醇上生长的酵母,选自汉逊酵母(Hansenula)、念珠菌(Candida)、克乐克酵母(Kloeckera)、毕赫酵母(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母(Torulopsis)和红酵母(Rhodotorula)。酵母属(Saccharomyces)是优选的酵母宿主，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子尤其包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
[0351] 除微生物外，哺乳动物组织细胞培养物也可用于表达和产生本文所述的多肽，并且在一些情况下是优选的(参见Winnacker,From Genes to Clones VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。对于一些实施方案，真核细胞可能是优选的，因为本领域已经开发了许多能够分泌异源多肽(例如，完整的免疫球蛋白)的合适的宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞，优选骨髓瘤细胞系或转化的B细胞或杂交瘤。在一些实施方案中，哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。
[0352] 在一些实施方案中，宿主细胞是脊椎动物宿主细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO或CHO-DP-12细胞系)；小鼠支持细胞；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞；MRC
5细胞；FS4细胞和人肝癌细胞系(Hep G2)。
X.产生半抗体组装的多特异性抗体
5细胞；FS4细胞和人肝癌细胞系(Hep G2)。
X.产生半抗体组装的多特异性抗体
[0353] 在一些实施方案中，本发明提供了用于产生多特异性抗体的方法和试剂。在一些实施方案中，通过分别产生半抗体来产生多特异性抗体，每个半抗体包含结合特定表位的VH/VL单元。在一些实施方案中，在宿主细胞中分别产生每个半抗体。在一些实施方案中，在相同的宿主细胞中一起产生每个半抗体。将半抗体混合并使其组装成多特异性抗体。在一些实施方案中，在相同的宿主细胞中一起产生每个半抗体。在一些实施方案中，宿主细胞表达分子伴侣，如FkpA、DsbA和/或DsbC，以促进半抗体的折叠。在一些实施方案中，多特异性抗体由结合IL13的半抗体和结合IL17的半抗体组装而成。
[0354] 如美国专利号7,642,228所述，每个半抗体可具有工程化到重链中的杵(突起)或臼(穴)。简言之，可以首先生成CH3杵突变体。然后可以通过随机化配偶体CH3结构域上与杵邻近的残基366、368和407来创建CH3臼突变体的文库。在某些实施方案中，杵突变包含T366W，并且臼具有在IgG1或IgG4骨架中包含T366S、L368A和Y407V的突变。其他免疫球蛋白同种型的等同突变可由本领域技术人员制备。此外，本领域技术人员将容易理解，优选用于双特异性的两个半抗体是相同的同种型。
[0355] 在一些实施方案中，通过在细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达重链和轻链构建体，在分别的培养物中产生含有杵突变或臼突变的半抗体。可以通过蛋白A亲和层析法分别纯化每个半抗体。可以通过 MaBSelectTM SuReTM柱从杵和臼半抗体澄清的细胞提取物纯化。在还原剂的存在下，蛋白A纯化的具有不同特异性的半抗体可以在体外在氧化还原反应中组装形成双特异性抗体。
[0356] 在一些实施方案中，通过在相同的细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达重链和轻链构建体，在相同的培养物中产生含有杵突变或臼突变的半抗体。可以通过蛋白A亲和层析法纯化半抗体。可以通过 MaBSelectTM SuReTM柱从杵和臼半抗体澄清的细胞提取物纯化。在还原剂的存在下，蛋白A纯化的具有不同特异性的半抗体可以在体外在氧化还原反应中组装形成双特异性抗体。
[0357] 可以使用任何合适的方法制备期望的还原条件。例如，可以通过向反应(如本发明的组装混合物)中加入还原剂/还原剂制备期望的还原条件。合适的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、巯基乙酸、抗坏血酸、硫羟乙酸(thiol acetic acid)、谷胱甘肽(GSH)、β-巯基乙基胺、半胱氨酸/胱氨酸、GSH/谷胱甘肽二硫化物(GSSG)、半胱胺/胱胺、甘氨酰半胱氨酸(glycylcysteine)和β-巯基乙醇，优选GSH。在某些具体的实施方案中，还原剂是弱还原剂，包括但不限于GSH、β-巯基乙基胺、半胱氨酸/胱氨酸、GSH/GSSG、半胱胺/胱胺、甘氨酰半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选GSH。在某些优选的实施方案中，还原剂是GSH。在某些实施方案中，还原剂不是DTT。选择合适浓度和合适实验条件下的合适的还原剂以在反应中达到所需的还原条件在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，在20℃双特异性抗体蛋白浓度为10g/L的溶液中，10mM L-还原型谷胱甘肽将导致约-400mV的起始氧化还原电位。例如，加入到组装混合物中的谷胱甘肽产生弱还原条件，这对于杵入臼双特异性组装是有利的。其他相似类型的还原剂，如BMEA(β-巯基乙胺)也可能有类似的效果。参见WO2013/055958，其通过引用整体并入本文。可以使用本领域已知的任何合适的方法来估计和测量反应的还原条件。例如，可以使用刃天青指示剂(在还原条件下从蓝色变为无色)测量还原条件。为了更精确的测量，可以使用氧化还原电位计(如由BROADLEY
制造的ORP电极)。
制造的ORP电极)。
[0358] 在某些特定的实施方案中，还原条件是弱还原条件。文中使用的术语“弱还原剂”或“弱还原条件”是指由在25℃下具有负氧化电位的还原剂制备的还原剂或还原条件。当pH为7至9、温度在15℃至39℃时，还原剂的氧化电位优选在-50至-600mV、-100至-600mV、-200至-600mV、-100至-500mV、-150至-300mV，更优选在约-300至-500mV，最优选约-400mV。本领域技术人员将能够选择合适的还原剂来制备期望的还原条件。熟练的研究人员将认识到可以以较低浓度使用强还原剂，所述强还原剂，即，对于相同浓度、pH和温度，具有比上述还原剂更负的氧化电位的还原剂。在一个优选的实施方案中，当在上述条件下孵育时，蛋白质能够在还原剂存在下形成二硫键。弱还原剂的实例包括但不限于谷胱甘肽、β-巯基乙基胺、胱氨酸/半胱氨酸、GSH/GSSG、半胱胺/胱胺、甘氨酰半胱氨酸和β-巯基乙醇。在某些实施方案中，可以使用与200X摩尔比的GSH：抗体相似的氧化电位作为弱还原条件的参照点，在该弱还原条件下能预期使用其他还原剂的有效组装。
[0359] 谷胱甘肽浓度可以摩尔浓度表示，或者以摩尔比或相对于组装混合物中存在的半抗体的量的摩尔过量表示。使用针对组装混合物中蛋白质浓度的还原剂对照的靶摩尔比；这防止了由于蛋白质浓度变化而导致的过度还原或还原不足。在某些其他实施方案中，以
2-600X、2-200X、2-300X、2-400X、2-500X、2-20X、2-8X、20-50X、50-600X、50-200X、或100-
300X摩尔过量，优选50-400X，更优选100-300X，最优选200X摩尔过量(相对于半抗体的总量)加入还原剂。在某些实施方案中，组装混合物具有7至9的pH，优选pH 8.5。
XI.包括多特异性抗体的多肽的纯化
2-600X、2-200X、2-300X、2-400X、2-500X、2-20X、2-8X、20-50X、50-600X、50-200X、或100-
300X摩尔过量，优选50-400X，更优选100-300X，最优选200X摩尔过量(相对于半抗体的总量)加入还原剂。在某些实施方案中，组装混合物具有7至9的pH，优选pH 8.5。
XI.包括多特异性抗体的多肽的纯化
[0360] 本文提供了纯化使用分子伴侣(例如FkpA、Dsba和/或DsbC)在大肠杆菌中产生的多肽(例如，多特异性抗体)的方法。在一些方面，多特异性抗体的纯化包括以下有顺序的步骤：亲和层析法、混合模式层析法和疏水相互作用层析法。在一些实施方案中，在亲和层析法之前组装多特异性抗体。在其他方面，在亲和层析法之后组装多特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其中抗体的一个臂(即，一个VH/VL单元)结合IL13，并且抗体的另一臂结合IL17。
[0361] 在一些实施方案中，多特异性抗体由两条或更多条抗体臂组成，其中不同的抗体臂结合不同的表位。在一些实施方案中，抗体臂包含VH/VL单元。在一些实施方案中，抗体臂包含半聚体，也称为半抗体。为了便于组装，在一些实施方案中修饰一个抗体臂的重链以包含“杵”，并且另一个抗体臂的重链包含“臼”，使得第一重链的杵拟合到第二重链的臼中。
[0362] 在一些实施方案中，多特异性抗体的每个臂在分别的细胞培养物中产生。在宿主细胞中表达抗体臂后，收集全细胞肉汤并均浆，提取抗体臂。在一些实施方案中，在层析法之前将聚乙烯亚胺(PEI)加入到细胞裂解物中。在一些实施方案中，在层析法之前将细胞裂解物离心。然后通过亲和层析法纯化多特异性抗体的每个臂。在一些实施方案中，亲和层析法是蛋白A层析法。此时，可以分析纯化的抗体臂；例如通过SDS-PAGE SEC层析法、质谱等。然后将纯化的多特异性抗体的臂组合并通过本文所述的方法使其组装。
[0363] 在其他实施方案中，多特异性抗体的每个臂在分别的细胞培养物中产生。在宿主细胞中表达抗体臂后，收集全细胞肉汤并均浆。然后将来自每种培养物的细胞匀浆混合，并提取组合的抗体臂。在一些实施方案中，在层析法之前将聚乙烯亚胺(PEI)加入到细胞裂解物中。在一些实施方案中，在层析法之前将细胞裂解物离心。然后通过亲和层析法纯化组合的多特异性抗体的臂。在一些实施方案中，亲和层析法是蛋白A层析法。此时，可以分析纯化的抗体臂；例如通过SDS-PAGE SEC层析法、质谱等。然后将纯化的多特异性抗体的臂组合并通过本文所述的方法使其组装。
[0364] 在其他实施方案中，多特异性抗体的每个臂在相同的细胞培养物中产生。在宿主细胞中表达抗体臂之后，收集全细胞肉汤、均浆并提取抗体臂。在一些实施方案中，在层析法之前将聚乙烯亚胺(PEI)加入到细胞裂解物中。在一些实施方案中，在层析法之前将细胞裂解物离心。然后通过亲和层析法纯化多特异性抗体的臂。在一些实施方案中，亲和层析法是蛋白A层析法。此时，可以分析纯化的抗体臂；例如通过SDS-PAGE SEC层析法、质谱等。然后通过本文所述的方法使纯化的多特异性抗体的臂组装。
[0365] 在一些实施方案中，细胞裂解物中PEI的终浓度为至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％或5.0中的任意。在一些实施方案中，细胞裂解物中PEI的终浓度在约0.1％至5％、0.1％至1％、0.1％至0.5％、
0.5％至5％、0.5％至1％或1％至5％中任一。在一些实施方案中，包含PEI的细胞裂解物保持超过约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、
14小时、16小时、18小时、20小时或24小时中的任意。在一些实施方案中，包含PEI的细胞裂解物保持约1小时至24小时、1小时至6小时、6小时至12小时、12小时至18小时、18小时至24小时中的任一。在一些实施方案中，包含PEI的细胞裂解物保持约10小时至14小时中的任一。在一些实施方案中，包含PEI的细胞裂解物保持在约4℃至37℃。在一些实施方案中，包含PEI的细胞裂解物保持在约环境温度。
0.5％至5％、0.5％至1％或1％至5％中任一。在一些实施方案中，包含PEI的细胞裂解物保持超过约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、
14小时、16小时、18小时、20小时或24小时中的任意。在一些实施方案中，包含PEI的细胞裂解物保持约1小时至24小时、1小时至6小时、6小时至12小时、12小时至18小时、18小时至24小时中的任一。在一些实施方案中，包含PEI的细胞裂解物保持约10小时至14小时中的任一。在一些实施方案中，包含PEI的细胞裂解物保持在约4℃至37℃。在一些实施方案中，包含PEI的细胞裂解物保持在约环境温度。
[0366] 在一些实施方案中，在层析法之前通过离心澄清细胞裂解物。在一些实施方案中，在层析法之前过滤细胞裂解物。在一些实施方案中，在层析法之前通过0.22μm滤器过滤细胞裂解物。
[0367] 亲和层析法的实例包括但不限于使用蛋白A或蛋白G衍生的层析法。亲和层析材料的实例包括但不限于 -vA、 Ultra Plus、Protein A Fast Flow、 AF-rProtein A、MabSelectTM、MabSelect SuReTM和MabSelect
SuReTMLX。在上述的一些实施方案中，亲和层析材料在柱中。在上述的一些实施方案中，亲和层析材料是膜。在一些实施方案中，亲和层析法是蛋白A层析法。在一些实施方案中，蛋白A层析法是MabSelect SuReTM层析法。
SuReTMLX。在上述的一些实施方案中，亲和层析材料在柱中。在上述的一些实施方案中，亲和层析材料是膜。在一些实施方案中，亲和层析法是蛋白A层析法。在一些实施方案中，蛋白A层析法是MabSelect SuReTM层析法。
[0368] 在一些实施方案中，随后将来自亲和层析法步骤的洗脱液施加到混合模式层析法。在一些实施方案中，混合模式材料包含能够进行以下功能中的一种或多种的官能团：阴离子交换、阳离子交换、氢键键合和疏水相互作用。在一些实施方案中，混合模式材料包含能够进行阴离子交换和疏水相互作用的官能团。在一些实施方案中，混合模式材料包含能够进行阳离子交换和疏水相互作用的官能团。混合模式材料可以含有N-苄基-N-甲基乙醇胺、4-巯基-乙基-吡啶、己胺或苯丙胺作为配体或含有交联的聚烯丙胺。混合模式材料的实例包括CaptoTM粘附树脂、AccellTMPlus Quaternary Methyl Amine(QMA)树脂、CaptoTM MMC树脂、MEP HyperCelTM树脂、HEA HyperCelTM树脂、PPA HyperCelTM树脂、或ChromaSorbTM膜或Sartobind 在一些实施方案中，混合模式材料是CaptoTM粘附树脂。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行混合模式层析法，其中多特异性抗体结合混合模式层析材料，然后从混合模式层析材料洗脱。在上述的一些实施方案中，混合模式材料在柱中。在上述的一些实施方案中，混合模式材料在膜中。
[0369] 在一些实施方案中，随后将来自混合模式层析法步骤的洗脱液施加到疏水相互作用层析法(HIC)的层析法。在一些实施方案中，在疏水相互作用层析法之前将来自混合模式层析法步骤的洗脱液施加到阴离子交换层析法。疏水相互作用层析法是根据疏水性分离生物分子的液相层析技术。HIC层析材料的实例包括但不限于 Hexyl-650、Hexyl-650C、 Butyl-650、 Phenyl-650、
Ether-650、 Sepharose、Octyl Phenyl
或Butyl 在一些实施方案中，HIC层析材料包含Phenyl
在其他实施方案中，HIC层析材料包含Butyl 在一些实施
方案中，以流经模式进行HIC层析法，其中多特异性抗体流经HIC层析法。在上述的一些实施方案中，HIC层析材料在柱中。在上述的一些实施方案中，HIC层析材料在膜中。
Ether-650、 Sepharose、Octyl Phenyl
或Butyl 在一些实施方案中，HIC层析材料包含Phenyl
在其他实施方案中，HIC层析材料包含Butyl 在一些实施
方案中，以流经模式进行HIC层析法，其中多特异性抗体流经HIC层析法。在上述的一些实施方案中，HIC层析材料在柱中。在上述的一些实施方案中，HIC层析材料在膜中。
[0370] 在本发明的一些实施方案中，在HIC层析法之前将混合模式层析法洗脱液施加到阴离子交换层析法。在一些实施方案中，阴离子交换层析材料是带正电的固相，其具有游离的阴离子用于与通过或经过固相的水性溶液中的阴离子交换。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阴离子交换材料可以是膜、整料或树脂。在一个实施方案中，阴离子交换材料可以是树脂。在一些实施方案中，阴离子交换材料可包含伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团、多胺官能团或二乙基氨基乙基官能团。阴离子交换材料的实例是本领域已知的，包括但不 HQ 50、 PI 50、 D、 Q、QFast Flow(QSFF)和DEAE- 在一些实施方案中，阴离子交换层析材料是QSFF
层析材料。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行阴离子交换层析法。在上述的一些实施方案中，阴离子交换层析材料在柱中。在上述的一些实施方案中，阴离子交换层析材料在膜中。
层析材料。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行阴离子交换层析法。在上述的一些实施方案中，阴离子交换层析材料在柱中。在上述的一些实施方案中，阴离子交换层析材料在膜中。
[0371] 在本发明的一些实施方案中，将来自HIC层析法的包含多特异性抗体的级分施加到阳离子交换层析法。在一些实施方案中，阳离子交换层析材料是带正电荷的固相，其具有游离的阳离子用于与通过或经过固相的水性溶液中的阳离子交换。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，阳离子交换材料可以是膜、整料或树脂。在一些实施方案中，阳离子交换材料可以是树脂。阳离子交换材料可以包含羧酸官能团或磺酸官能团，如但不限于磺酸盐、羧酸、羧甲基磺酸、磺基异丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺酰基、磺氧乙基(sulphoxyethyl)或正磷酸盐。在上述的一些实施方案中，阳离子交换层析材料是阳离子交换层析柱。在上述的一些实施方案中，阳离子交换层析材料是阳离子交换层析膜。本领域已知的阳离子交换材料的实例包括但不限于 S、 S、SO3 monolith、和 SO3、S Ceramic XS、
HS 50、 HS 20、sulphopropyl- Fast Flow(SPSFF)、SP
XL(SPXL)、CM Fast Flow、CaptoTM S、 EMD Se
Hicap、 EMD SO3-、或 EMD COO-。在本文所述的任何方法的一些实
施方案中，阳离子交换材料是 HS 50。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进
行阳离子交换层析法。在上述的一些实施方案中，阳离子交换层析材料在柱中。在上述的一些实施方案中，阳离子交换层析材料在膜中。
HS 50、 HS 20、sulphopropyl- Fast Flow(SPSFF)、SP
XL(SPXL)、CM Fast Flow、CaptoTM S、 EMD Se
Hicap、 EMD SO3-、或 EMD COO-。在本文所述的任何方法的一些实
施方案中，阳离子交换材料是 HS 50。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进
行阳离子交换层析法。在上述的一些实施方案中，阳离子交换层析材料在柱中。在上述的一些实施方案中，阳离子交换层析材料在膜中。
[0372] 在本发明的一些实施方案中，将来自阴离子交换层析法的包含多肽(例如多特异性抗体)的级分施加到羟磷灰石层析法。在一些实施方案中，羟磷灰石包含(Ca5(PO4)3OH)2。在一些实施方案中，羟磷灰石层析材料是固相层析法。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，羟磷灰石材料可以是膜、整料或树脂。在一些实施方案中，阳离子交换材料可以是树脂。在一些实施方案中，树脂是陶瓷的。在一些实施方案中，羟磷灰石层析法是陶瓷羟磷灰石层析法。在一些实施方案中，羟磷灰石层析法是CHT陶瓷羟磷灰石层析法。本领域已知的羟磷灰石材料的实例包括但不限于CHT陶瓷羟磷灰石I型和II型。在一些实施方案中，以结合和洗脱模式进行羟磷灰石层析法。在上述的一些实施方案中，羟磷灰石层析材料在柱中。在上述的一些实施方案中，羟磷灰石层析材料在膜中。
[0373] 可以优化包含多特异性抗体的溶液在本文所述的任何层析材料上的加载，以从杂质中分离多特异性抗体。在一些实施方案中，当用于结合和洗脱模式(例如，亲和层析法、混合模式层析法和离子交换层析法)中时，优化包含多特异性抗体的溶液到层析材料上的加载，以使多特异性抗体与层析材料结合。例如，可以在多个不同pH值、而加载缓冲液的电导率是恒定的加载缓冲液中将包含多特异性抗体的溶液加载到层析材料(例如，层析柱)上。或者，可以在多个不同电导率、而加载缓冲液的pH是恒定的加载缓冲液中将包含多特异性抗体的溶液加载到层析材料上。在完成将包含多特异性抗体的溶液加载到层析材料上并且从层析材料将多特异性抗体洗脱到池级分中时，池级分中污染物的量提供对于给定pH或电导率从污染物中分离产物方面的信息。同样，对于其中多特异性抗体流经层析材料(例如HIC)的层析法，优化加载缓冲液的pH和电导率，使得多特异性抗体流经层析法，而杂质被层析材料保留或以不同于多特异性抗体的速率流经层析材料。
[0374] 在一些实施方案中，包含多特异性抗体或抗体臂的溶液的加载密度大于约10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、
140g/L或150g/L的亲和层析材料(例如蛋白A层析材料)中的任意。在一些实施方案中，包含多特异性抗体或抗体臂的溶液的加载密度为约10g/L至20g/L、20g/L至30g/L、30g/L至40g/L、40g/L至50g/L、50g/L至60g/L、60g/L至70g/L、70g/L至80g/L、80g/L至90g/L、90g/L至
100g/L的亲和层析材料(例如，蛋白A层析材料)中的任意。
140g/L或150g/L的亲和层析材料(例如蛋白A层析材料)中的任意。在一些实施方案中，包含多特异性抗体或抗体臂的溶液的加载密度为约10g/L至20g/L、20g/L至30g/L、30g/L至40g/L、40g/L至50g/L、50g/L至60g/L、60g/L至70g/L、70g/L至80g/L、80g/L至90g/L、90g/L至
100g/L的亲和层析材料(例如，蛋白A层析材料)中的任意。
[0375] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，亲和层析法的洗脱液以大于约30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L或150g/L的混合模式层析材料(例如，CaptoTM粘附层析材料)中的任意的多肽加载密度加载到混合模式层析材料上。在一些实施方案中，亲和层析法洗脱液的加载密度为约10g/L至20g/L、
20g/L至30g/L、30g/L至40g/L、40g/L至50g/L、50g/L至60g/L、60g/L至70g/L、70g/L至80g/L、80g/L至90g/L、90g/L至100g/L的混合模式层析材料(例如CaptoTM粘附层析材料)中的任意。
20g/L至30g/L、30g/L至40g/L、40g/L至50g/L、50g/L至60g/L、60g/L至70g/L、70g/L至80g/L、80g/L至90g/L、90g/L至100g/L的混合模式层析材料(例如CaptoTM粘附层析材料)中的任意。
[0376] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，混合模式层析法或阴离子交换层析法的洗脱液以大于约30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L或150g/L的HIC层析材料(例如Phenyl 或Butyl层析材料)中的任意的多肽加载密度加载到HIC层析材料上。在一些实施方案
中，混合模式层析法或阴离子交换层析法的洗脱液的加载密度为约10g/L至20g/L、20g/L至
30g/L、30g/L至40g/L、40g/L至50g/L、50g/L至60g/L、60g/L至70g/L、70g/L至80g/L、80g/L至90g/L、90g/L至100g/L的混合模式层析材料(例如Phenyl 或Butyl
层析材料)中的任意。
中，混合模式层析法或阴离子交换层析法的洗脱液的加载密度为约10g/L至20g/L、20g/L至
30g/L、30g/L至40g/L、40g/L至50g/L、50g/L至60g/L、60g/L至70g/L、70g/L至80g/L、80g/L至90g/L、90g/L至100g/L的混合模式层析材料(例如Phenyl 或Butyl
层析材料)中的任意。
[0377] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，混合模式层析法的洗脱液以大于约30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L或150g/L的阴离子交换层析材料(例如QSFF层析材料)中的任意的多肽加载密度加载到阴离子交换层析材料上。在一些实施方案中，混合模式层析法的洗脱液的加载密度为约10g/L至20g/L、20g/L至30g/L、30g/L至40g/L、40g/L至50g/L、50g/L至60g/L、60g/L至70g/L、70g/L至80g/L、80g/L至90g/L、90g/L至100g/L的阴离子交换层析材料(例如QSFF层析材料)中的任意。
[0378] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，来自HIC层析法的包含多特异性抗体的级分以大于约30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L或150g/L的阳离子交换层析材料(例如， HS 50层析材料)中的任
意的多肽加载密度加载到阳离子交换层析材料上。在一些实施方案中，来自HIC层析法的包含多特异性抗体的级分的加载密度为约10g/L至20g/L、20g/L至30g/L、30g/L至40g/L、40g/L至50g/L、50g/L至60g/L、60g/L至70g/L、70g/L至80g/L、80g/L至90g/L、90g/L至100g/L的阳离子交换层析材料(例如， HS 50层析材料)中的任意。
意的多肽加载密度加载到阳离子交换层析材料上。在一些实施方案中，来自HIC层析法的包含多特异性抗体的级分的加载密度为约10g/L至20g/L、20g/L至30g/L、30g/L至40g/L、40g/L至50g/L、50g/L至60g/L、60g/L至70g/L、70g/L至80g/L、80g/L至90g/L、90g/L至100g/L的阳离子交换层析材料(例如， HS 50层析材料)中的任意。
[0379] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，来自阴离子交换层析法的包含多特异性抗体的级分以小于约5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L或150g/L的羟磷灰石层析材料(例如CHT I型陶瓷羟磷灰石层析材料)的多肽的加载密度加载到羟磷灰石层析材料上。在一些实施方案中，来自HIC层析法的包含多特异性抗体的级分的加载密度为约5g/L至10g/L、10g/L至15g/L、15g/L至20g/L、20g/L至25g/L、25g/L至30g/L、30g/L至50g/L、50g/L至100g/L和100g/L至150g/L的羟磷灰石层析材料(例如，CHT I型陶瓷羟磷灰石层析材料)中的任意。
[0380] 可优化从层析材料对多特异性抗体的洗脱，以产生具有最少污染物和最小池体积的产物。例如，可将含有多特异性抗体或抗体臂的溶液在加载缓冲液中加载到层析材料例如层析柱上。加载完成后，用多种不同pH而洗脱缓冲液的电导率恒定的缓冲液洗脱多特异性抗体或抗体臂。或者，可以在多种不同电导率而洗脱缓冲液的pH恒定的洗脱缓冲液中从层析材料洗脱多特异性抗体或抗体臂。在完成从层析材料中洗脱多特异性抗体或抗体臂后，池级分中杂质的量提供了关于在给定pH或电导率下从杂质分离多特异性抗体或抗体臂的信息。以大量级分(例如八个柱体积)洗脱多特异性抗体或抗体臂表明洗脱曲线的“拖尾”。在本发明的一些实施方案中，洗脱的拖尾被最小化。
[0381] 根据例如期望的缓冲液pH、期望的缓冲液电导率、感兴趣蛋白质的特性和纯化方法，可以使用各种缓冲液。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述方法包括使用缓冲液。缓冲液可以是加载缓冲液、平衡缓冲液或洗涤缓冲液。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种是相同的。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液是不同的。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，缓冲液包含盐。加载缓冲液可以包含氯化钠、乙酸钠或其混合物。在一些实施方案中，加载缓冲液是氯化钠缓冲液。在一些实施方案中，加载缓冲液是乙酸钠缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液包含Tris。在一些实施方案中，缓冲液包含精氨酸。
[0382] 如本文所用，负载是加载到层析材料上的组合物。加载缓冲液是用于将包含多特异性抗体或抗体臂的溶液加载到层析材料上的缓冲液。在加载待纯化的溶液之前，层析材料可以用平衡缓冲液平衡。在一些实例中，在将溶液加载到层析材料上之后和在从固相洗脱多特异性抗体或抗体臂之前使用洗涤缓冲液。然而，一些感兴趣的产物，例如多特异性抗体可以通过洗涤缓冲液从层析材料中去除(例如在HIC情况下的流经模式)。
[0383] 如本文所用，洗脱是从层析材料中移除产物，例如多特异性抗体或抗体臂。洗脱缓冲液是用于从层析材料洗脱多特异性抗体或其他感兴趣产物的缓冲液。在许多情况下，洗脱缓冲液可以与加载缓冲液具有不同的物理特性。例如，洗脱缓冲液可以具有与加载缓冲液不同的电导率或与加载缓冲液不同的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液更低的电导率。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液更高的电导率。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液更低的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液更高的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有与加载缓冲液不同的电导率和不同的pH。洗脱缓冲液可以具有更高或更低的电导率以及更高或更低的pH的任何组合。
[0384] 电导率是指水性溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子传递。因此，随着水性溶液中存在的离子的量的增加，溶液将具有更高的电导率。电导率测量的基本单位是Siemen(或mho)、mho(mS/cm)，可以使用电导率仪(如各种模式的Orion电导率仪)进行测量。由于电解质电导率是溶液中离子携带电流的能力，所以溶液的电导率可以通过改变其中的离子浓度来改变。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氯化钠、乙酸钠或氯化钾)的浓度以达到期望的电导率。优选地，修改各种缓冲液的盐浓度以达到期望的电导率。
[0385] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，加载缓冲液具有大于约1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、
5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm,
9.5mS/cm、10mS/cm或20mS/cm中任意的电导率。电导率可以为约1mS/cm至20mS/cm、4mS/cm至10mS/cm、4mS/cm至7mS/cm、5mS/cm至17mS/cm、5mS/cm至10mS/cm、或者5mS/cm至7mS/cm中的任意。在一些实施方案中，电导率为1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、
3.5mS/cm、4mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm或20mS/cm中的任意。一方面，电导率是加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的电导率。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和洗涤缓冲液中的一种或多种的电导率相同。在一些实施方案中，加载缓冲液的电导率不同于洗涤缓冲液和/或平衡缓冲液的电导率。
5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm,
9.5mS/cm、10mS/cm或20mS/cm中任意的电导率。电导率可以为约1mS/cm至20mS/cm、4mS/cm至10mS/cm、4mS/cm至7mS/cm、5mS/cm至17mS/cm、5mS/cm至10mS/cm、或者5mS/cm至7mS/cm中的任意。在一些实施方案中，电导率为1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、
3.5mS/cm、4mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm或20mS/cm中的任意。一方面，电导率是加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的电导率。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和洗涤缓冲液中的一种或多种的电导率相同。在一些实施方案中，加载缓冲液的电导率不同于洗涤缓冲液和/或平衡缓冲液的电导率。
[0386] 在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有的电导率小于加载缓冲液的电导率。在本文所述任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液具有小于约0.0mS/cm、0.5mS/cm、1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4.0mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、
5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm或7.0mS/cm中任意的电导率。电导率可以为约0mS/cm至7mS/cm、1mS/cm至7mS/cm、2mS/cm至7mS/cm、3mS/cm至7mS/cm或4mS/cm至7mS/cm、0mS/cm至
5.0mS/cm、1mS/cm至5mS/cm、2mS/cm至5mS/cm、3mS/cm至5mS/cm或4mS/cm至5mS/cm中的任意。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为约0.0mS/cm、0.5mS/cm、1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、
6.0mS/cm、6.5mS/cm或7.0mS/cm中的任意。
5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm或7.0mS/cm中任意的电导率。电导率可以为约0mS/cm至7mS/cm、1mS/cm至7mS/cm、2mS/cm至7mS/cm、3mS/cm至7mS/cm或4mS/cm至7mS/cm、0mS/cm至
5.0mS/cm、1mS/cm至5mS/cm、2mS/cm至5mS/cm、3mS/cm至5mS/cm或4mS/cm至5mS/cm中的任意。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为约0.0mS/cm、0.5mS/cm、1.0mS/cm、1.5mS/cm、2.0mS/cm、2.5mS/cm、3.0mS/cm、3.5mS/cm、4mS/cm、4.5mS/cm、5.0mS/cm、5.5mS/cm、
6.0mS/cm、6.5mS/cm或7.0mS/cm中的任意。
[0387] 在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有的电导率大于加载缓冲液的电导率。在本文所述任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液具有大于约5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17.0mS/cm、18.0mS/cm、19.0mS/cm、20.0mS/cm、
21.0mS/cm、22.0mS/cm、23.0mS/cm、24.0mS/cm、25.0mS/cm、26.0mS/cm、27.0mS/cm、28.0mS/cm、29.0mS/cm或30.0mS/cm中任意的电导率。电导率可以为约5.5mS/cm至30mS/cm、6.0mS/cm至30mS/cm、7mS/cm至30mS/cm、8mS/cm至30mS/cm、9mS/cm至30mS/cm或10mS/cm至30mS/cm中的任意。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率约为5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、
7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17.0mS/cm、18.0mS/cm、19.0mS/cm、20.0mS/cm、
21.0mS/cm、22.0mS/cm、23.0mS/cm、24.0mS/cm、25.0mS/cm、26.0mS/cm、27.0mS/cm、28.0mS/cm、29.0mS/cm或30.0mS/cm中的任意。在任何上述实施方案的一些方面中，通过阶梯梯度或线性梯度从加载和/或洗涤缓冲液改变洗脱缓冲液的电导率。
21.0mS/cm、22.0mS/cm、23.0mS/cm、24.0mS/cm、25.0mS/cm、26.0mS/cm、27.0mS/cm、28.0mS/cm、29.0mS/cm或30.0mS/cm中任意的电导率。电导率可以为约5.5mS/cm至30mS/cm、6.0mS/cm至30mS/cm、7mS/cm至30mS/cm、8mS/cm至30mS/cm、9mS/cm至30mS/cm或10mS/cm至30mS/cm中的任意。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的电导率约为5.5mS/cm、6.0mS/cm、6.5mS/cm、
7.0mS/cm、7.5mS/cm、8.0mS/cm、8.5mS/cm、9.0mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17.0mS/cm、18.0mS/cm、19.0mS/cm、20.0mS/cm、
21.0mS/cm、22.0mS/cm、23.0mS/cm、24.0mS/cm、25.0mS/cm、26.0mS/cm、27.0mS/cm、28.0mS/cm、29.0mS/cm或30.0mS/cm中的任意。在任何上述实施方案的一些方面中，通过阶梯梯度或线性梯度从加载和/或洗涤缓冲液改变洗脱缓冲液的电导率。
[0388] 在本发明的一些实施方案中，将包含多特异性抗体的溶液在具有约<6.5mS/cm的电导率的缓冲液中加载到混合模式层析材料上，并从层析材料洗脱多肽到具有约1.5mS/cm的电导率的洗脱缓冲液中。在一些实施方案中，加载缓冲液具有约6.5mS/cm的电导率，洗脱缓冲液具有约3mS/cm的电导率。在一些实施方案中，加载缓冲液具有约5.5mS/cm的电导率，洗脱缓冲液具有约2mS/cm的电导率。在一些实施方案中，加载缓冲液具有约5.5mS/cm的电导率，洗脱缓冲液具有约1mS/cm的电导率。在上述实施方案的进一步实施方案中，层析材料是CaptoTM粘附树脂。
[0389] 在任何上述实施方案的一些方面中，通过阶梯梯度或线性梯度从加载和/或洗涤缓冲液改变洗脱缓冲液的电导率。在一些实施方案中，将包含多特异性抗体的组合物以<6.5mS/cm加载到混合模式层析法(例如CaptoTM ahere层析法)上，并通过至约1.5mS/cm的阶梯电导率梯度从混合模式层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，将包含多特异性抗体的组合物以<2.5mS/cm加载到阴离子交换层析法(例如QSFF层析法)上，并通过至约
8.6mS/cm的阶梯电导率梯度从阴离子交换层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，将包含多特异性抗体的组合物以约5.0mS/cm加载到阳离子交换层析法(例如 HS
50层析法)上，并通过至约27.5mS/cm的阶梯电导率梯度从阳离子交换层析法洗脱多特异性抗体。
8.6mS/cm的阶梯电导率梯度从阴离子交换层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，将包含多特异性抗体的组合物以约5.0mS/cm加载到阳离子交换层析法(例如 HS
50层析法)上，并通过至约27.5mS/cm的阶梯电导率梯度从阳离子交换层析法洗脱多特异性抗体。
[0390] 在一些实施方案中，将包含多特异性抗体的组合物加载到羟磷灰石层析法(例如，CHT I型陶瓷羟磷灰石层析法)上，并通过线性电导率梯度从羟磷灰石层析法洗脱多特异性抗体。在一些实施方案中，将多特异性抗体在包含约10mM磷酸钠的羟磷灰石缓冲液A中加载到羟磷灰石层析法上。在一些实施方案中，通过逐步加入包含约10mM磷酸钠、约1M氯化钠的羟磷灰石缓冲液B来形成线性梯度。在一些实施方案中，羟磷灰石缓冲液A和/或B约为pH 6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3中的任意。在一些实施方案中，羟磷灰石缓冲液A和/或B约为pH 6.8。在一些实施方案中，随梯度增加洗脱缓冲液的羟磷灰石缓冲液B的含量。在一些实施方案中，线性梯度以约0％羟磷灰石缓冲液B开始，以约100％羟磷灰石缓冲液B结束。在一些实施方案中，线性梯度以约0％羟磷灰石缓冲液B开始，经过约10、15、
20、25或30中的任意个柱体积(CV)以约100％羟磷灰石缓冲液B结束。在一些实施方案中，线性梯度以约0％羟磷灰石缓冲液B开始，经过约20个柱体积(CV)以约100％羟磷灰石缓冲液B结束。
20、25或30中的任意个柱体积(CV)以约100％羟磷灰石缓冲液B结束。在一些实施方案中，线性梯度以约0％羟磷灰石缓冲液B开始，经过约20个柱体积(CV)以约100％羟磷灰石缓冲液B结束。
[0391] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，加载缓冲液具有小于约10、9、8、7、6或5中任意的pH。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，加载缓冲液具有大于约4、5、6、7、
8或9中任意的pH。加载缓冲液可具有约4至9、4至8、4至7、5至9、5至8、5至7、5至6中任意的pH。在一些实施方案中，加载缓冲液的pH为约4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8中的任意。pH可以是加载缓冲液、平衡缓冲液或洗涤缓冲液的pH。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种的pH相同。在一些实施方案中，加载缓冲液的pH不同于平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的pH。
8或9中任意的pH。加载缓冲液可具有约4至9、4至8、4至7、5至9、5至8、5至7、5至6中任意的pH。在一些实施方案中，加载缓冲液的pH为约4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8中的任意。pH可以是加载缓冲液、平衡缓冲液或洗涤缓冲液的pH。在一些实施方案中，加载缓冲液、平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液中的一种或多种的pH相同。在一些实施方案中，加载缓冲液的pH不同于平衡缓冲液和/或洗涤缓冲液的pH。
[0392] 在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有的pH小于加载缓冲液的pH。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液具有小于约8、7、6、5、4、3或2中任意的pH。洗脱缓冲液的pH可以为约4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至9、5至8、5至7、5至6、6至9、6至8、6至7中的任意。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0中的任意。
[0393] 在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有的pH大于加载缓冲液的pH。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液具有大于约5、6、7、8或9中任意的pH。洗脱缓冲液的pH可以为约4至9、5至9、6至9、7至9、8至9、4至8、5至8、6至8、7至8、4至7、5至7和6至7中的任意。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7/0、7.5、8.0、8.5或9.0中的任意。
[0394] 在一些实施方案中，包含多特异性抗体或抗体臂的溶液在约pH7.7下被加载到亲和层析法(例如蛋白A层析法)上，通过至约pH2.9的阶梯梯度从亲和层析法洗脱多特异性抗体或抗体臂。
[0395] 在任何上述实施方案的一些方面，通过阶梯梯度或线性梯度从加载和/或洗涤缓冲液改变洗脱缓冲液的pH。
[0396] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，流速小于约50CV/hr、40CV/hr或30CV/hr中的任意。流速可以为约5CV/hr至50CV/hr、10CV/hr至40CV/hr或者18CV/hr至36CV/hr中的任意。在一些实施方案中，流速为约9CV/hr、18CV/hr、25CV/hr、30CV/hr、36CV/hr或40CV/hr中的任意。在本文所述的任何方法的一些实施例中，流速小于约100cm/hr、75cm/hr或50cm/hr中的任意。流速可以为约25cm/hr至150cm/hr、25cm/hr至100cm/hr、50cm/hr至
100cm/hr或65cm/hr至85cm/hr中的任意。
100cm/hr或65cm/hr至85cm/hr中的任意。
[0397] 床高是所用层析材料的高度。在本文所述的任何方法的一些实施例中，床高大于约5cm、10cm、15cm、20cm、25cm、30cm、35cm、40cm、45cm或50cm中的任意。在一些实施方案中，床高为约5cm至50cm。在一些实施方案中，基于加载中多肽或污染物的量确定床高。
[0398] 在一些实施方案中，层析法在体积大于约1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、75mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、
600mL、700mL、800mL、900mL、1L、2L、3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L、10L、25L、50L、100L、200L、
300L、400L、500L、600L、700L、800L、900L或100L的容器柱中。
600mL、700mL、800mL、900mL、1L、2L、3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L、10L、25L、50L、100L、200L、
300L、400L、500L、600L、700L、800L、900L或100L的容器柱中。
[0399] 在本发明的一些实施方案中，从层析法收集级分。在一些实施方案中，收集的级分大于约0.01CV、0.02CV、0.03CV、0.04CV、0.05CV、0.06CV、0.07CV、0.08CV、0.09CV、0.1CV、0.2CV、0.3CV、0.4CV、0.5CV、0.6CV、0.7CV、0.8CV、0.9CV、1.0CV、2.0CV、3.0CV、4.0CV、
5.0CV、6.0CV、7.0CV、8.0CV、9.0CV或10.0CV。在一些实施方案中，汇集含有产物例如多特异性抗体或抗体臂的级分。本领域技术人员可以测定级分中多肽的量；例如，可以通过UV光谱法测定级分中多肽的量。在一些实施方案中，当OD280大于约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0中的任意时，收集级分。在一些实施方案中，当OD280为约0.5至1.0、0.6至1.0、0.7至1.0、0.8至
1.0或0.9和1.0中的任意时，收集级分。在一些实施方案中，汇集含有可检测的多特异性抗体或抗体臂的级分。
5.0CV、6.0CV、7.0CV、8.0CV、9.0CV或10.0CV。在一些实施方案中，汇集含有产物例如多特异性抗体或抗体臂的级分。本领域技术人员可以测定级分中多肽的量；例如，可以通过UV光谱法测定级分中多肽的量。在一些实施方案中，当OD280大于约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0中的任意时，收集级分。在一些实施方案中，当OD280为约0.5至1.0、0.6至1.0、0.7至1.0、0.8至
1.0或0.9和1.0中的任意时，收集级分。在一些实施方案中，汇集含有可检测的多特异性抗体或抗体臂的级分。
[0400] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，杂质是产物特异性杂质。产物特异性杂质的实例包括但不限于未配对的半抗体、未配对的抗体链、抗体片段、同二聚体、聚集体、高分子量物质、极高分子量物质、低分子量物质和电荷变体如抗体的酸性变体和碱性变体。
[0401] 在一些实施方案中，方法提供减少或去除未配对的半抗体和/或同二聚体(例如，包含相同结合结构域的配对半二聚体)。测量未配对半抗体和同二聚体存在的方法是本领域已知的；例如通过疏水相互作用层析法，包括疏水相互作用层析高效液相层析法(HIC-HPLC)。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，半抗体和/或同二聚体的量减少大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意。半抗体和/或同二聚体的量可以减少约10％至99％、30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、
75％至99％或85％至99％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中半抗体和/或同二聚体的量与纯化步骤之前组合物中半抗体和/或同二聚体的量，确定减少。
75％至99％或85％至99％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中半抗体和/或同二聚体的量与纯化步骤之前组合物中半抗体和/或同二聚体的量，确定减少。
[0402] 聚集的多肽(例如聚集的多特异性抗体或聚集的抗体臂)可以是高分子量(HMW)蛋白质。在一些实施方案中，聚集的多肽是感兴趣多肽的多聚体。HMW蛋白质可以是二聚体、高达8x的单体、或更大的感兴趣多肽。测量聚集蛋白质(例如，HMW蛋白)的方法是本领域已知的，并在实施例部分中描述。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，聚集蛋白质的量减少大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意。聚集蛋白质的量可以减少约10％至99％、30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％和99％中的任意。聚集蛋白质的量可以减少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中聚集蛋白质(例如HMW蛋白)的量与纯化步骤之前组合物中聚集蛋白质(例如HMW蛋白)的量，确定减少。
[0403] 片段多肽可以是低分子量(LMW)蛋白质。在一些实施方案中，片段化多肽是感兴趣的多特异性抗体或抗体臂的片段。LMW蛋白的实例包括但不限于Fab(抗原结合片段)、Fc(可结晶片段)区或两者的组合或感兴趣抗体的任何随机片段化部分。测量片段化蛋白质(例如LMW蛋白)的方法是本领域已知的，并在实施例部分中描述。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，LMW蛋白的量减少大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意。LMW蛋白的量可以减少约10％至99％、30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任意。LMW蛋白的量可以减少约5％、
10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中片段化蛋白质(例如LMW蛋白)的量与纯化步骤之前组合物中片段化蛋白质(例如LMW蛋白)的量，确定减少。
10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中片段化蛋白质(例如LMW蛋白)的量与纯化步骤之前组合物中片段化蛋白质(例如LMW蛋白)的量，确定减少。
[0404] 抗体的酸性变体是其中抗体的pI小于天然完整抗体的pI的变体。抗体的碱性变体是其中抗体的pI大于天然完整抗体的pI的变体。电荷变体(例如，酸性和碱性变体)可以是天然过程的结果，例如氧化、脱酰胺、赖氨酸残基的C-末端加工、N-末端焦谷氨酸盐形成和抗体的糖化。测量电荷变体的方法是本领域已知的；例如成像毛细管等电位聚焦(cIEF)。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，电荷变体(酸性和/或碱性变体)的量减少大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意。电荷变体(酸性和/或碱性变体)的量可以减少约10％至99％、30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％、或85％至99％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中电荷变体(酸性和/或碱性变体)的量与纯化步骤之前组合物中电荷变体的量，确定减少。
[0405] 在本文所述的任何方法的一些实施方案中，杂质是方法特异性杂质。例如，杂质可以是以下的任何一种或多种：宿主细胞材料；分子伴侣如FkpA、DsbA和DspC；浸出的蛋白A；核酸；其他多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分、羧肽酶B、庆大霉素等。在一些实例中，污染物可以是宿主细胞蛋白(HCP)，其来自例如但不限于细菌细胞如大肠杆菌细胞、昆虫细胞、原核细胞、真核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽细胞、真菌细胞。
[0406] 宿主细胞蛋白(HCP)是来自其中产生多肽的细胞的蛋白质。例如，ECP是来自宿主细胞的蛋白质，即大肠杆菌蛋白质。可以通过酶联免疫吸附测定法(“ELISA”)来测量CHOP的量。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，HCP(例如ECP)的量减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意。HCP的量可以减少约10％至99％、
30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任意。在一些实施方案中，HCP的量减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、
90％、95％或98％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中HCP的量与纯化步骤之前组合物中HCP的量，确定减少。
30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任意。在一些实施方案中，HCP的量减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、
90％、95％或98％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中HCP的量与纯化步骤之前组合物中HCP的量，确定减少。
[0407] 伴侣蛋白，例如FkpA、DsbA和/或DsbC常常用于在细胞中产生抗体以促进抗体的折叠和组装。分子伴侣可以通过使用特异性结合FkpA、DsbA或DsbC的抗体的ELISA来检测。例如，可以针对FkpA、DsbA或DsbC的超纯组合物产生抗体。在一些实施方案中，通过质谱法测定FkpA、DsbA和/或DsbC。
[0408] 浸出的蛋白A是从其所结合的固相分离或洗涤出的蛋白A。例如，浸出的蛋白A可以从蛋白A层析柱中浸出的。蛋白A的量可以通过例如ELISA来测量。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，浸出的蛋白A的量减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任意。浸出的蛋白A的量可以减少约10％至99％、30％至95％、30％至99％、
50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任意。在一些实施方案中，浸出的蛋白A的量减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中浸出的蛋白A的量与纯化步骤之前组合物中浸出的蛋白A的量，确定减少。
50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任意。在一些实施方案中，浸出的蛋白A的量减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中浸出的蛋白A的量与纯化步骤之前组合物中浸出的蛋白A的量，确定减少。
[0409] 测量DNA如宿主细胞DNA的方法是本领域已知的，并在实施例部分中描述。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，DNA的量减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任意。DNA的量可以减少约10％至99％、30％至95％、30％至
99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任意。DNA的量可以减少约
10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中DNA的量与纯化步骤之前组合物中的DNA的量，确定减少。
99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任意。DNA的量可以减少约
10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中DNA的量与纯化步骤之前组合物中的DNA的量，确定减少。
[0410] 细胞培养基组分是指存在于细胞培养基中的组分。细胞培养基可以是收获细胞时的细胞培养基。在一些实施方案中，细胞培养基组分是庆大霉素。庆大霉素的量可以通过ELISA来测量。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，细胞培养基组分的量减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任意。细胞培养基组分的量可以减少约10％至99％、30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％和99％中的任意。在一些实施方案中，细胞培养基组分的量减少约10％、20％、30％、40％、
50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中细胞培养基组分的量与纯化步骤之前组合物中细胞培养基组分的量，确定减少。
50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％中的任意。在一些实施方案中，通过比较从纯化步骤回收的组合物中细胞培养基组分的量与纯化步骤之前组合物中细胞培养基组分的量，确定减少。
[0411] 在一些实施方案中，通过病毒过滤进一步纯化多特异性抗体。病毒过滤是去除多肽纯化进料流中的病毒污染物。病毒过滤的例子包括超滤和微滤。在一些实施方案中，使用细小病毒滤器来纯化多肽。
[0412] 在一些实施方案中，在层析法之后(例如，HIC层析法之后或阳离子交换层析法之后)浓缩多特异性抗体。浓缩方法的例子是本领域已知的，包括但不限于超滤和渗滤。在一些实施方案中，通过第一超滤、渗滤和第二超滤浓缩多特异性抗体。在一些实施方案中，超滤和/或渗滤使用具有小于约5kDal、10kDal、15kDal、20kDal或25kDal中任意的截留值的滤器。在一些实施方案中，将第一超滤的保留物渗滤成药物制剂。
[0413] 在本文所述任何方法的一些实施方案中，方法还包括将纯化方法的纯化多肽与药学上可接受的运载体组合。在一些实施方案中，通过超滤/渗滤将多特异性抗体配制成药物制剂。
[0414] 在一些实施方案中，多肽(例如多特异性抗体)的浓度大于约10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、110mg/mL、
120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL、
200mg/mL或300mg/mL中的任意。在一些实施方案中，多特异性抗体的浓度为约10mg/mL至
20mg/mL、20mg/mL至30mg/mL、30mg/mL至40mg/mL、40mg/mL至50mg/mL、50mg/mL至60mg/mL、
60mg/mL至70mg/mL、70mg/mL至80mg/mL、80mg/mL至90mg/mL、90mg/mL至100mg/mL、100mg/mL至110mg/mL、110mg/mL至120mg/mL、120mg/mL至130mg/mL、130mg/mL至140mg/mL、140mg/mL至150mg/mL、150mg/mL至160mg/mL、160mg/mL至170mg/mL、170mg/mL至180mg/mL、180mg/mL至190mg/mL、190mg/mL至200mg/mL、200mg/mL至300mg/mL中的任意。
XII.制剂和制备制剂的方法
120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL、
200mg/mL或300mg/mL中的任意。在一些实施方案中，多特异性抗体的浓度为约10mg/mL至
20mg/mL、20mg/mL至30mg/mL、30mg/mL至40mg/mL、40mg/mL至50mg/mL、50mg/mL至60mg/mL、
60mg/mL至70mg/mL、70mg/mL至80mg/mL、80mg/mL至90mg/mL、90mg/mL至100mg/mL、100mg/mL至110mg/mL、110mg/mL至120mg/mL、120mg/mL至130mg/mL、130mg/mL至140mg/mL、140mg/mL至150mg/mL、150mg/mL至160mg/mL、160mg/mL至170mg/mL、170mg/mL至180mg/mL、180mg/mL至190mg/mL、190mg/mL至200mg/mL、200mg/mL至300mg/mL中的任意。
XII.制剂和制备制剂的方法
[0415] 本文还提供了制剂和制备制剂的方法，所述制剂包含通过本文所述方法纯化的多特异性抗体。例如，纯化的多肽可以与药学上可接受的载体组合。
[0416] 在一些实施方案中，可以通过将具有期望纯度的多肽与任选的药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))混合，制备以冻干制剂或水性溶液的形式用于储存的多肽制剂。
[0417] 如本文所用，“运载体”包括药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂，其在使用剂量和浓度对暴露与其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理上可接受的运载体是水性pH缓冲溶液。
[0418] 可接受的运载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚醇、丁醇或苄基醇；烷基防腐剂(alkyl parabens)如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如Zn-TM TM
蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。
蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。
[0419] 在一些实施方案中，多肽制剂中的多肽保持功能活性。
[0420] 用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过无菌过滤膜过滤很容易完成。
[0421] 本文的制剂还可以包含治疗的特定适应症所需的超过一种的活性化合物，优选具有互补活性而不会相互不利地影响的那些活性化合物。例如，除多肽之外，可能需要在一种制剂中包含另外的多肽(例如抗体)。可选地或另外地，组合物可进一步包含化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。这样的分子适合以对于预期目的有效的量组合存在。XIII.在表达FkpA的细胞中产生的多肽组合物
[0422] 在一些方面，本发明提供了包含在表达FkpA的宿主细胞中产生的重组多肽的组合物。在一些实施方案中，组合物中的重组多肽已经从包括FkpA的宿主细胞蛋白质中纯化。在一些实施方案中，组合物包含在表达FkpA的宿主细胞中产生的重组多肽和药学上可接受的赋形剂。
[0423] 在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含小于约或不多于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、
0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.2ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、
15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、
200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中任意的重组多肽。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中任意的重组多肽；以及小于约
50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、
0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1中任意的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.2ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，组合物包含浓度约5mg/ml至约
100mg/ml、约50mg/ml至约150mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、约150mg/ml至约250mg/ml、约200mg/ml至约300mg/ml的重组多肽；以及小于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、
9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、
0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.2ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.1ppm的FkpA。
0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.2ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、
15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、
200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中任意的重组多肽。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中任意的重组多肽；以及小于约
50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、
0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1中任意的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.2ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，组合物包含浓度约5mg/ml至约
100mg/ml、约50mg/ml至约150mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、约150mg/ml至约250mg/ml、约200mg/ml至约300mg/ml的重组多肽；以及小于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、
9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、
0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.2ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.1ppm的FkpA。
[0424] 在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含小于约或不多于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、
0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的DsbA和/或DsbC。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中任意的重组多肽。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、
20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、
250mg/ml或300mg/ml中任意的重组多肽；以及小于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、
9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、
0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的DsbA和/或DsbC。在一些实施方案中，组合物包含浓度约5mg/ml至约100mg/ml、约50mg/ml至约150mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、约150mg/ml至约250mg/ml、约200mg/ml至约300mg/ml的重组多肽；以及小于约50ppm、
40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、
0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的DsbA和/或DsbC。美国临时申请号62/129,701提供了检测DsbA和DsbC的试剂和方法，其全部内容通过引用并入本文。
0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的DsbA和/或DsbC。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中任意的重组多肽。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、
20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、
250mg/ml或300mg/ml中任意的重组多肽；以及小于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、
9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、
0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的DsbA和/或DsbC。在一些实施方案中，组合物包含浓度约5mg/ml至约100mg/ml、约50mg/ml至约150mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、约150mg/ml至约250mg/ml、约200mg/ml至约300mg/ml的重组多肽；以及小于约50ppm、
40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、
0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的DsbA和/或DsbC。美国临时申请号62/129,701提供了检测DsbA和DsbC的试剂和方法，其全部内容通过引用并入本文。
[0425] 在一些实施方案中，重组多肽是抗体。在一些实施方案中，重组多肽是多特异性抗体。在一些实施方案中，重组多肽是双特异性抗体。在一些实施方案中，组合物包含在表达FkpA(例如表达外源FkpA)的细胞中产生的多特异性抗体。在一些实施方案中，组合物包含在表达FkpA的细胞中产生的多特异性抗体，其中所述组合物基本上不含FkpA。在一些实施方案中，组合物包含在表达FkpA的细胞中产生的多特异性抗体，其中所述组合物包含小于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.2ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、
10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、
175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中任意的多特异性抗体。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、
100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中任意的多特异性抗体；以及小于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、
3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或
0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.2ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约5mg/ml至约100mg/ml、约50mg/ml至约150mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、约
150mg/ml至约250mg/ml、约200mg/ml至约300mg/ml的多特异性抗体；以及小于约50ppm、
40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、
0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.2ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.1ppm的FkpA。
10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、
175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中任意的多特异性抗体。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、
100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中任意的多特异性抗体；以及小于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、
3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或
0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.2ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.1ppm的FkpA。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约5mg/ml至约100mg/ml、约50mg/ml至约150mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、约
150mg/ml至约250mg/ml、约200mg/ml至约300mg/ml的多特异性抗体；以及小于约50ppm、
40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、
0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.2ppm的FkpA。在一些实施方案中，包含重组多肽的组合物包含约0.1ppm的FkpA。
[0426] 在一些实施方案中，组合物包含在表达FkpA(例如表达外源FkpA、DsbA和/或DsbC)的细胞中产生的多特异性抗体。在一些实施方案中，组合物包含在表达FkpA的细胞中产生的多特异性抗体，其中所述组合物基本上不含FkpA。在一些实施方案中，组合物包含在表达FkpA的细胞中产生的多特异性抗体，其中所述组合物包含少于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、
0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm的DsbA和/或DsbC。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、
75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中任意的多特异性抗体。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、
20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、
250mg/ml或300mg/ml中任意的多特异性抗体；以及少于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、
10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、
0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的DsbA和/或DsbC。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约5mg/ml至约100mg/ml、约50mg/ml至约150mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、约150mg/ml至约250mg/ml、约200mg/ml至约300mg/ml的多特异性抗体；以及少于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、
1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的DsbA和/或DsbC。
0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm的DsbA和/或DsbC。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、
75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml中任意的多特异性抗体。在一些实施方案中，组合物包含浓度为至少约5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、
20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、
250mg/ml或300mg/ml中任意的多特异性抗体；以及少于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、
10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、
0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的DsbA和/或DsbC。在一些实施方案中，组合物包含浓度为约5mg/ml至约100mg/ml、约50mg/ml至约150mg/ml、约100mg/ml至约200mg/ml、约150mg/ml至约250mg/ml、约200mg/ml至约300mg/ml的多特异性抗体；以及少于约50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、
1ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm或0.1ppm中任一的DsbA和/或DsbC。
[0427] 在一些实施方案中，组合物包含在表达FkpA的细胞中产生的双特异性抗体，其中所述组合物基本上不含FkpA。在一些实施方案中，双特异性抗体包含第一半抗体和第二半抗体，其中第一半抗体包含结合IL-17的第一VH/VL单元，第二半抗体包含结合IL-13的第二VH/VL单元。在一些实施方案中，第一半抗体不结合IL-13，并且其中第二半抗体不结合IL-17。在某些特定实施方案中，本文提供的多特异性抗体结合IL-17AA、IL-17AF和IL-17FF，抑制IL-17AA、IL-17AF和IL-17FF诱导的活性，并抑制IL-13诱导的活性。在某些这样的实施方案中，抗IL-13/IL-17AA、AF和FF双特异性抗体有利地阻断由全部IL-17A和F细胞因子诱导的活性，而不是仅由IL-17A或IL-17F单独诱导的活性。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体结合IL-17AA、IL-17AF和IL-17FF。在一些实施方案中，IL-17AA诱导的活性是IL-
17AA诱导的体内或体外基因表达和/或细胞的增殖。在一些实施方案中，IL-17AF诱导的活性是IL-17AF诱导的体内或体外基因表达和/或细胞的增殖。在一些这样的实施方案中，IL-
17FF诱导的活性是IL-17FF诱导的体内或体外基因表达和/或细胞的增殖。在一些实施方案中，IL-13诱导的活性是IL-13诱导的体内或体外基因表达和/或细胞的增殖。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体不抑制IL-13与IL-13Rα1的结合。
17AA诱导的体内或体外基因表达和/或细胞的增殖。在一些实施方案中，IL-17AF诱导的活性是IL-17AF诱导的体内或体外基因表达和/或细胞的增殖。在一些这样的实施方案中，IL-
17FF诱导的活性是IL-17FF诱导的体内或体外基因表达和/或细胞的增殖。在一些实施方案中，IL-13诱导的活性是IL-13诱导的体内或体外基因表达和/或细胞的增殖。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体不抑制IL-13与IL-13Rα1的结合。
[0428] 在一些实施方案中，组合物中的抗IL13/IL17AA AF FF双特异性抗体包含第一半抗体和第二半抗体，其中第一半抗体包含结合IL-17AA、AF和FF的第一VH/VL单元，第二半抗体包含结合IL-13的第二VH/VL单元，其中第一VH/VL单元包含含有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3，并且其中第二VH/VL单元包含含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-H1、包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-H2、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-H3、包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1、包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方案中，第一半抗体不结合IL-13，并且第二半抗体不结合IL-17。
[0429] 在一些实施方案中，第一VH/VL单元包含与SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL序列，并且其中第二VH/VL单元包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的VL序列。在一些实施方案中，提供了多特异性抗体，其中第一VH/VL单元包含具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH序列和具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VL序列，并且其中第二VH/VL单元包含具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH序列和具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL序列。
[0430] 在某些实施方案中，第一半抗体结合IL17AA AF和FF，包含含有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链，第二半抗体结合IL13，包含含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。在某些实施方案中，第一半抗体结合IL17AA AF和FF，包含含有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的轻链，第二半抗体结合IL13，包含含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的轻链。
[0431] 在一些实施方案中，通过组装如本文所述的半抗体来制备多特异性抗体。通过培养宿主细胞以表达半抗体的两条链、由此当表达后两条链折叠并组装以在宿主细胞中形成生物半抗体，从而在原核宿主细胞中产生半抗体。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包含一个或多个多核苷酸，其编码编码多肽第一链的第一翻译单元、编码多肽第二链的第二翻译单元；和编码选自以下的至少一种伴侣蛋白的翻译单元：肽基-脯氨酰基异构酶(例如FkpA)、蛋白质二硫化物氧化还原酶(例如DsbA和DsbC)。翻译单元可以在相同的多肽分子或不同的多肽分子上，或者任何组合。例如，第一和第二翻译单元可以在第一多肽分子上，编码一种或多种伴侣蛋白的翻译单元可以在第二多肽分子上。宿主细胞在包括以下的条件下在培养基中培养：包括生长温度和生长搅拌速率的生长相和包括生产温度和生产搅拌速率的生产相。在一些实施方案中，生长温度比生产温度高2至10℃，生长搅拌速率比生产搅拌速率高50至250rpm。如上所述从细胞中回收半抗体并组装。在一些实施方案中，在组装之前通过蛋白A层析法纯化半抗体。参见美国临时申请号62/075,792，通过引用将其全部内容并入本文。
[0432] 进一步纯化组装的多特异性抗体以去除杂质，包括例如FkpA。在一些实施方案中，组装的多特异性抗体通过混合模式层析法(例如阴离子交换混合模式层析法)然后通过疏水相互作用层析法来纯化。在一些实施方案中，组装的多特异性抗体通过混合模式层析法(例如阴离子交换混合模式层析法)然后通过阴离子交换层析法然后通过疏水相互作用层析法来纯化。在一些实施方案中，组装的多特异性抗体通过混合模式层析法(例如阴离子交换混合模式层析法)然后通过阴离子交换层析法然后通过疏水相互作用层析法然后通过阳离子交换层析法来纯化。在一些实施方案中，使用本文所述的测定法分析纯化的多特异性抗体中FkpA的去除。XIV.制品和试剂盒
[0433] 通过本文所述的方法纯化的多肽(例如多特异性抗体)和/或包含通过本文所述的方法纯化的多肽的制剂可以包含在制品中。在一些实施方案中，制品包含使用本文所述的超纯FkpA多肽产生的抗体。制品可以包含容器，该容器包含多肽和/或多肽制剂。优选地，制品包含：(a)容器，在容器内包含组合物，该组合物包含本文所述的多肽和/或多肽制剂；和(b)包装说明书，其具有用于将所述制剂施用于受试者的说明。
[0434] 制品包含容器以及在容器上或与容器关联的标签或包装说明书。合适的容器包括如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料制成，例如玻璃或塑料。容器容纳或包含制剂并且可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是多肽。标签或包装说明书指示组合物在受试者中的使用，具有关于所提供的多肽和任何其他药物的给药量和间隔的具体指导。制品还可以包括从商业和用户观点所期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、滤器、针头和注射器。在一些实施方案中，容器是注射器。在一些实施方案中，注射器进一步包含在注射装置内。在一些实施方案中，注射装置是自动注射器。
[0435] “包装说明书”用于指通常包含在治疗产物的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、与包装产物组合的其他治疗产物的信息，和/或关于使用此类治疗产物的警告。
[0436] 在一些实施方案中，本发明提供了用于检测包含由细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的FkpA的试剂盒，其中所述试剂盒包含如本文所述的抗FkpA抗体。在其他实施方案中，本发明提供了用于检测包含由细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的FkpA的试剂盒，其中所述试剂盒包含如本文所述的抗FkpA抗体。在一些实施方案中，本发明提供用于检测包含由细菌细胞制备的重组多肽的药物组合物中的FkpA的试剂盒，其中所述细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)表达FkpA。在一些实施方案中，试剂盒包括使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括超纯FkpA，其用作产生用于定量样品中FkpA的标准曲线的参照标准。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括超纯FkpA，其用作检测样品中FkpA的测定法中的阳性对照。
[0437] 本说明书中公开的所有特征可以以任何组合组合。在本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等同或相似目的的替换特征替换。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是一系列等同或相似特征的一个例子。
[0438] 通过以下非限制性实施例来说明本发明的进一步细节。说明书中所有参考文献的公开内容通过引用明确地并入本文。实施例
[0439] 以下实施例纯粹旨在是本发明的示例，因此不应认为以任何方式限制本发明。以说明而不是限制的方式提供以下实施例和详细描述。实施例1.针对大肠杆菌蛋白的测定法不足以测量FkpA。
[0440] FkpA是大肠杆菌中的伴侣蛋白，其通常不以高水平表达，但过表达FkpA的大肠杆菌已被用于改善异多聚体真核蛋白(包括抗体)的正确组装和折叠(Zhang等人,2003,BioTechniques,35:1032-1042)。
[0441] 为了确定针对大肠杆菌蛋白(ECP)的测定法是否足以检测和定量FkpA的存在，将超纯FkpA样品(参见实施例2)以不同浓度加入测定稀释液(0.15M NaCl/0.1M NaPO4/0.1％鱼明胶/0.05％聚山梨醇酯20/0.05％Proclin 300)，并在ECP测定法(Zhu-Shimoni,J.等人,2014,Biotech and Bioeng.111:2367-2379)中测试。使用牛血清白蛋白作为阴性对照，因为针对大肠杆菌蛋白的测定法不应该检测到这种哺乳动物蛋白质。结果如表4所示。表4.ECP测定法检测。
LTR＝小于范围，ND＝未检测到
LTR＝小于范围，ND＝未检测到
[0442] 结果显示ECP测定法不足以检测和定量FkpA。此外，作为针对在大肠杆菌中制备的治疗性蛋白质的释放测定法的一部分，检测大肠杆菌残留物(例如，大肠杆菌蛋白和核酸)的商业测定法不特异性鉴定FkpA。因此，需要产生对FkpA高度特异性的多克隆抗体，其对可能干扰FkpA检测测定法的其他大肠杆菌蛋白和/或核酸具有最小的反应性。另外，FkpA的超纯制剂可用于产生精确检测治疗性多肽制剂中FkpA的FkpA标准，以及产生确保研究和商业多肽生产的测定法质量的FkpA阳性对照。实施例2.超纯FkpA的制备
材料和方法
提取步骤
材料和方法
提取步骤
[0443] FkpA在大肠杆菌(命名为66F8的W3110衍生物：ΔfhuA ΔphoA ilvG2096(Valr)Δprc spr43H1 ΔdegP ΔmanA lacIQ ΔompT ΔmenE)中表达。为此，如EP1356052(参见例如实施例9-10，特别是在段落[0207]中)所述，构建含有FkpA的ORF的相容质粒(pACYC,Novagen,Madison,WI)。将0.5mL冷冻的储备培养物(含有10-15％DMSO)融解并用于接种2L摇瓶，该摇瓶含有补充有2mL卡那霉素溶液(5mg/mL)和2.5mL 1M磷酸钠溶液的500mL大豆LB培养基。将培养扩大到大规模培养。在大约200的OD下向发酵物中推注50mL的200mM IPTG。使用IPTG诱导用于控制FkpA开放阅读框(ORF)表达的tacII启动子。发酵运行期间为50小时。
[0444] 除非另有说明，所有细胞裂解和离心步骤均在2-8℃下进行。
[0445] 将从10L大肠杆菌发酵中回收的304g细胞糊的等份试样过夜融解。将细胞糊悬浮于10体积的25mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，pH6.0(裂解缓冲液)中并混合60分钟以产生均匀的悬浮液。将装备有温度控制单元(初始设定点≤5℃)的微流化器HC-8000均浆器(Microfluidics Corporation)用于细胞裂解。在引入细胞悬浮液之前，用1L冷的裂解缓冲液冲洗微流化器。将细胞悬浮液转移到微流化器中，在室内压力(6-8Kps)下进行总共四次通过。使用冷的裂解缓冲液从微流化器驱动(chase)残留悬浮液。取200mL裂解的细胞悬浮液等份试样用于离心和随后的纯化。将剩余的约3.2L的匀浆储存在≤-60℃。
[0446] 将200mL等分试样分成六个等体积并转移到50mL离心管中。使用装备有SS-34转子(Thermo Corporation)的RC6Plus离心机以15,000rpm的速度在20℃温度下将管离心30分钟。在2-8℃的温度下储存含有FkpA的上清液，弃去沉淀物。SP Flow阳离子交换层析法的分析评估
[0447] (基于成熟蛋白质的氨基酸序列)计算的FkpA的等电点(pI)为7.01。在pH6.0下进行的阳离子交换层析法应导致靶蛋白的良好结合，而大多数大肠杆菌蛋白(ECP)杂质(具有3-6的pI值)应流过柱。
[0448] 使用用强阳离子交换介质SP Fast Flow(GE Healthcare)填充的1mL重力流柱进行该潜在的第一层析法步骤的分析评估。
[0449] 柱用3个柱体积(CV)的50mM MES、1.0M NaCl，pH6.0(洗脱缓冲液)预平衡，然后用3CV的50mM MES，pH6.0(平衡缓冲液)平衡。将1.0mL裂解物上清液的等份试样加载到柱上，然后用平衡缓冲液进行5CV洗涤。使用从100mM到1000mM递增的NaCl浓度(通过混合平衡和洗脱缓冲液制备)步骤洗脱柱。
[0450] 无二硫键还原的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用于测定柱级分中FkpA的相对纯度。结果显示FkpA在这些条件下完全结合阳离子交换介质(如通过流经和洗涤级分中缺乏FkpA所证实)(图1，泳道2和3)。通过100mM NaCl步骤从柱中完全洗脱FkpA，表明FkpA与阳离子交换介质弱结合，证实了大部分ECP流经柱的假设。得到的含有FkpA的池非常干净，只有少量的残留ECP(图1，泳道4)。SP Flow阳离子交换层析法的步骤洗脱评估
[0451] 使用SP Fast Flow阳离子交换层析法的FkpA纯化的制备评估在Explorer 100(GE Healthcare)上完成。该操作使用2.6cm(宽)×27.3cm(长)的柱
(1CV＝145mL)。所有步骤均以8.85mL/分钟(100cm/hr)的流速进行。柱用3CV的洗脱缓冲液(25mM MES、1.0M NaCl，pH 6.0)预平衡，然后用3CV的平衡缓冲液(25mM MES，pH 6.0)平衡。
将裂解物上清液加载到柱上并用20mL平衡缓冲液驱动(chase)。柱用5CV平衡缓冲液洗涤，然后用50mM MES、100mM NaCl，pH6.0步骤洗脱。在步骤洗脱之后，用3CV的洗脱缓冲液将柱剥离。
(1CV＝145mL)。所有步骤均以8.85mL/分钟(100cm/hr)的流速进行。柱用3CV的洗脱缓冲液(25mM MES、1.0M NaCl，pH 6.0)预平衡，然后用3CV的平衡缓冲液(25mM MES，pH 6.0)平衡。
将裂解物上清液加载到柱上并用20mL平衡缓冲液驱动(chase)。柱用5CV平衡缓冲液洗涤，然后用50mM MES、100mM NaCl，pH6.0步骤洗脱。在步骤洗脱之后，用3CV的洗脱缓冲液将柱剥离。
[0452] 层析图显示于图2中。柱级分的SDS-PAGE分析(图3A和3B)显示FkpA与主要的洗脱峰相关，并且主要见于级分11-17。在级分18-23中也有少量的FkpA。SP Flow阳离子交换层析法的梯度洗脱评估
[0453] 为了进一步评估SP Fast Flow去除残留ECP的潜力，从第一制备评估的级分11-18进行再层析法。
[0454] 汇集级分11-18并缓冲液交换回使用 G-25的SP Fast Flow平衡缓冲液。
[0455] 在相同的加载和洗涤参数下，将缓冲液交换的级分在早期制备运行中使用的相同SP Fast Flow柱上进行再层析法。考虑到FkpA的原始步骤洗脱所需的相对盐量，使用0至30％梯度(0-300mM NaCl)经过9CV进行洗脱。
[0456] 层析图(图4)在相对低的(5-11mS/cm)离子强度条件下显示洗脱的大主峰。梯度曲线显示与步骤洗脱曲线的强相似性(图2)，没有更小的前峰(这些级分不包括在选择用于再层析法的那些级分中)。
[0457] 洗脱曲线的SDS-PAGE分析。ECP条带相对于FkpA的检测表明，通过使用线性梯度仅实现了这些杂质中的一些的部分分辨(数据未显示)。这可能表明这些ECP可具有与FkpA相当的pI值，或者一些其他的相互作用模式可能负责它们的共纯化。潜在二次纯化步骤的分析评估：比较Q Fast Flow和Phenyl
Fast Flow
Fast Flow
[0458] 使用用强阴离子交换介质Q Fast Flow(QSFF)(GE Healthcare)填充的1mL重力流柱进行该潜在的第二层析法步骤的分析评估。
[0459] 柱用5mL 50mM Tris、1.0M NaCl，pH8.0(QSFF洗脱缓冲液)预平衡，然后用5mL 50mM Tris，pH8.0(QSFF平衡缓冲液)平衡。使用PD-10柱(GE Healthcare)，将来自上述SP梯度评估的级分22-50的2.5mL小型池等份试样缓冲液交换到3.5mL的QSFF
平衡缓冲液中，并加载到柱。柱用3.5mL QSFF平衡缓冲液洗涤，随后用3.0mL QSFF洗脱缓冲液洗脱。
平衡缓冲液中，并加载到柱。柱用3.5mL QSFF平衡缓冲液洗涤，随后用3.0mL QSFF洗脱缓冲液洗脱。
[0460] 通过SDS-PAGE分析来自QSFF和Phenyl (以下描述)评估的柱级分(图5)。Q 柱不结合FkpA，但能够去除结合在柱上的较高分子量(MW)物质中的三
种。然而，在～35kDa、～40kDa和～26kDa处的条带仍然可以在柱流经液中与FkpA一起被检测到。回收率数据总结在表5和表6中。Q Fast Flow凝胶具有良好的总体回收
率(95％)。
表5.来自QSFF和Phenyl 柱级分的分光光度数据
样品 稀释因子 FkpA(mg/mL) Abs<280nm> Abs<320nm>
PW空白 1.0 1.1656E-3 -8.3447E-5 -7.1287E-4
SP池 1.0 1.51360 0.82628 8.9335E-3
Q F-T/洗涤 1.0 0.46137 0.24948 3.4523E-4
Q剥离(strip) 1.0 0.12278 6.5184E-2 -1.1196E-3
Ph F-T/W 1.0 6.8952E-2 3.2589E-2 -4.6453E-3
Ph 0.5M W 1.0 1.8189E-2 7.5068E-3 -2.3150E-3
Ph 0.4M W 1.0 2.3830E-2 1.1497E-2 -1.3714E-3
Ph 0.3M W 1.0 2.0948E-2 8.4639E-3 -2.8481E-3
Ph 0.2M W 1.0 1.8924E-2 9.6922E-3 -5.2691E-4
Ph 0.1M W 1.0 3.4419E-2 2.0305E-2 1.7190E-3
Ph 0M W 1.0 0.14326 8.2129E-2 4.7674E-3
Ph PW剥离 1.0 0.20207 0.11301 3.8896E-3
FkpA(mg/mL)＝(Abs(280nm)-Abs(320nm))/0.54
表6.Q Fast Flow回收率数据
级分 Vol.(mL) Conc.(mg/mL) mg ％回收
SP小型池级分22-50 2.5 1.51 3.8 100％
F-T/洗涤 7.0 0.46 3.2 85％
1M NaCl剥离 3.0 0.12 0.4 10％
质量平衡 3.6 95％
Phenyl
种。然而，在～35kDa、～40kDa和～26kDa处的条带仍然可以在柱流经液中与FkpA一起被检测到。回收率数据总结在表5和表6中。Q Fast Flow凝胶具有良好的总体回收
率(95％)。
表5.来自QSFF和Phenyl 柱级分的分光光度数据
样品 稀释因子 FkpA(mg/mL) Abs<280nm> Abs<320nm>
PW空白 1.0 1.1656E-3 -8.3447E-5 -7.1287E-4
SP池 1.0 1.51360 0.82628 8.9335E-3
Q F-T/洗涤 1.0 0.46137 0.24948 3.4523E-4
Q剥离(strip) 1.0 0.12278 6.5184E-2 -1.1196E-3
Ph F-T/W 1.0 6.8952E-2 3.2589E-2 -4.6453E-3
Ph 0.5M W 1.0 1.8189E-2 7.5068E-3 -2.3150E-3
Ph 0.4M W 1.0 2.3830E-2 1.1497E-2 -1.3714E-3
Ph 0.3M W 1.0 2.0948E-2 8.4639E-3 -2.8481E-3
Ph 0.2M W 1.0 1.8924E-2 9.6922E-3 -5.2691E-4
Ph 0.1M W 1.0 3.4419E-2 2.0305E-2 1.7190E-3
Ph 0M W 1.0 0.14326 8.2129E-2 4.7674E-3
Ph PW剥离 1.0 0.20207 0.11301 3.8896E-3
FkpA(mg/mL)＝(Abs(280nm)-Abs(320nm))/0.54
表6.Q Fast Flow回收率数据
级分 Vol.(mL) Conc.(mg/mL) mg ％回收
SP小型池级分22-50 2.5 1.51 3.8 100％
F-T/洗涤 7.0 0.46 3.2 85％
1M NaCl剥离 3.0 0.12 0.4 10％
质量平衡 3.6 95％
Phenyl
[0461] 使用用疏水性相互作用介质Phenyl Fast Flow(低取代度)(GE Healthcare)填充的1mL重力流柱进行该潜在的第二层析法步骤的分析评估。
[0462] 柱用5mL 50mM磷酸盐，pH 7.0(苯基洗脱缓冲液)预平衡，然后用5mL 0.6M硫酸钠、50mM磷酸盐，pH7.0(苯基平衡缓冲液)平衡。将2.5mL 1.2M硫酸钠加入到来自上述SP梯度评估的级分22-50小型池的2.5mL等份试样中。轻轻混合小型池并在室
温下静置30分钟，然后加载到柱中。柱用3.0mL苯基平衡缓冲液洗涤，随后用3.0mL体积的苯基洗脱缓冲液中的递减硫酸钠(0.5M、0.4M、0.3M、0.2M、0.1M和0M)进行步骤洗脱。最后，使用3.0mL纯化水(PW)将柱剥离。
温下静置30分钟，然后加载到柱中。柱用3.0mL苯基平衡缓冲液洗涤，随后用3.0mL体积的苯基洗脱缓冲液中的递减硫酸钠(0.5M、0.4M、0.3M、0.2M、0.1M和0M)进行步骤洗脱。最后，使用3.0mL纯化水(PW)将柱剥离。
[0463] Phenyl (低取代)凝胶显示与Q Fast Flow相反的行为：与QSFF结合的杂质能够流经Phenyl (低取代)柱。在QSFF上与FkpA共纯化
的～35kDa的条带也流经Phenyl 柱。在递减的盐曲线中FkpA非常晚地被洗脱，
在0M硫酸钠以及PW剥离中，表明其非常疏水。含有FkpA的级分似乎缺乏存在于SP
Fast Flow池中的ECP杂质。回收率数据总结在表5和6中。Phenyl
Fast Flow(低取代)凝胶仅能够回收51％。剩余的蛋白质很可能与柱结合，表明Phenyl(低取代)凝胶与FkpA结合得太紧。Phenyl Fast Flow(低取代)
能够成功地去除残留的ECP，但是代价是较低的回收率。
表6.Pheny (低取代)回收率数据
级分 体积(mL) 浓度(mg/mL) mg ％回收率
SP小型池级分22-50 2.5 1.51 3.8 100％
F-T/洗涤 8.0 0.07 0.6 15％
0.5M洗涤 3.0 0.02 0.1 1％
0.4M洗涤 3.0 0.02 0.1 2％
0.3M洗涤 3.0 0.02 0.1 2％
0.2M洗涤 3.0 0.02 0.1 2％
0.1M洗涤 3.0 0.03 0.1 3％
0M洗涤 3.0 0.14 0.4 11％
PW剥离 3.0 0.20 0.6 16％
质量平衡 1.9 51％
潜在第二纯化步骤的分析评估：比较Phenyl Butyl 和
Octyl
的～35kDa的条带也流经Phenyl 柱。在递减的盐曲线中FkpA非常晚地被洗脱，
在0M硫酸钠以及PW剥离中，表明其非常疏水。含有FkpA的级分似乎缺乏存在于SP
Fast Flow池中的ECP杂质。回收率数据总结在表5和6中。Phenyl
Fast Flow(低取代)凝胶仅能够回收51％。剩余的蛋白质很可能与柱结合，表明Phenyl(低取代)凝胶与FkpA结合得太紧。Phenyl Fast Flow(低取代)
能够成功地去除残留的ECP，但是代价是较低的回收率。
表6.Pheny (低取代)回收率数据
级分 体积(mL) 浓度(mg/mL) mg ％回收率
SP小型池级分22-50 2.5 1.51 3.8 100％
F-T/洗涤 8.0 0.07 0.6 15％
0.5M洗涤 3.0 0.02 0.1 1％
0.4M洗涤 3.0 0.02 0.1 2％
0.3M洗涤 3.0 0.02 0.1 2％
0.2M洗涤 3.0 0.02 0.1 2％
0.1M洗涤 3.0 0.03 0.1 3％
0M洗涤 3.0 0.14 0.4 11％
PW剥离 3.0 0.20 0.6 16％
质量平衡 1.9 51％
潜在第二纯化步骤的分析评估：比较Phenyl Butyl 和
Octyl
[0464] 已经证明了用于第二步纯化的疏水相互作用层析法(HIC)的潜力；第二评估比较了具有不同疏水性的三种HIC介质：Phenyl e(低取代)、OctylFast Flow和Butyl 4Fast Flow(GE Healthcare)。
[0465] 如上所述针对每个柱针对具有额外步骤的Phenyl 进行层析法，其中在使用3.0mL纯化水(PW)对柱进行剥离之后，使用3mL的2％氢氧化钠再生每个柱。
[0466] 比较来自每个柱的柱再生级分(表7和8)。表7和表8按照相对于FkpA增加的疏水性顺序列出了不同的柱。Butyl 4 Fast Flow凝胶具有三者中最低的再生值(15％)，而Octyl Fast Flow和Phenyl Fast Flow(低取代)分别
显示45和56％的回收率。因此，Octyl Fast Flow和Phenyl Fast
Flow(低取代)凝胶太疏水，不能用作第二层析法步骤。
表7.来自柱再生级分的分光光度数据
样品 稀释因子 FkpA(mg/mL) Abs<280nm> Abs<320nm>
PW空白 1.0 -5.6867E-4 6.1989E-5 3.6907E-4
Butyl再生 1.0 0.18870 0.10798 6.0782E-3
Octyl再生 1.0 0.56642 0.31557 9.7098E-3
Phenyl再生 1.0 0.70106 0.38781 9.2392E-3
FkpA(mg/mL)＝(Abs(280nm)-Abs(320nm))/0.54
表8.HIC凝胶再生
级分 体积(mL) 浓度(mg/mL) mg ％回收率
SP小型22-50 2.5 1.51 3.8 100％
Butyl再生 3.0 0.19 0.6 15％
Octyl再生 3.0 0.57 1.7 45％
Phenyl再生 3.0 0.70 2.1 56％
潜在第二纯化步骤的分析评估：Butyl-S 6 Fast Flow
显示45和56％的回收率。因此，Octyl Fast Flow和Phenyl Fast
Flow(低取代)凝胶太疏水，不能用作第二层析法步骤。
表7.来自柱再生级分的分光光度数据
样品 稀释因子 FkpA(mg/mL) Abs<280nm> Abs<320nm>
PW空白 1.0 -5.6867E-4 6.1989E-5 3.6907E-4
Butyl再生 1.0 0.18870 0.10798 6.0782E-3
Octyl再生 1.0 0.56642 0.31557 9.7098E-3
Phenyl再生 1.0 0.70106 0.38781 9.2392E-3
FkpA(mg/mL)＝(Abs(280nm)-Abs(320nm))/0.54
表8.HIC凝胶再生
级分 体积(mL) 浓度(mg/mL) mg ％回收率
SP小型22-50 2.5 1.51 3.8 100％
Butyl再生 3.0 0.19 0.6 15％
Octyl再生 3.0 0.57 1.7 45％
Phenyl再生 3.0 0.70 2.1 56％
潜在第二纯化步骤的分析评估：Butyl-S 6 Fast Flow
[0467] 在比较具有不同疏水性的三种HIC介质之后，评估另外的HIC凝胶：Butyl-S6Fast Flow(GE Healthcare)。该凝胶在所评估的HIC凝胶的层析介质中具有
最弱的HIC配体。
最弱的HIC配体。
[0468] 用Butyl-S 6Fast Flow(GE Healthcare)填充1mL重力流柱。柱用5mL 50mM磷酸盐，pH7.0(丁基-S洗脱缓冲液)预平衡，然后用5mL 0.6M硫酸钠、50mM磷酸盐，pH7.0(丁基-S平衡缓冲液)平衡。将2.5mL的1.2M硫酸钠加入到来自上述SP
梯度评估的级分22-50小型池的2.5mL等份试样中。轻轻混合小型池并在室温下静置30分钟，然后加载到柱中。柱用3.0mL丁基-S平衡缓冲液洗涤，随后用3.0mL体积的丁基-S洗脱缓冲液中递减的硫酸钠(0.5M、0.4M、0.3M、0.2M、0.1M和0M)进行步骤洗脱。使用3.0mL纯化水(PW)将柱剥离两次，然后使用3mL的2％氢氧化钠再生。
梯度评估的级分22-50小型池的2.5mL等份试样中。轻轻混合小型池并在室温下静置30分钟，然后加载到柱中。柱用3.0mL丁基-S平衡缓冲液洗涤，随后用3.0mL体积的丁基-S洗脱缓冲液中递减的硫酸钠(0.5M、0.4M、0.3M、0.2M、0.1M和0M)进行步骤洗脱。使用3.0mL纯化水(PW)将柱剥离两次，然后使用3mL的2％氢氧化钠再生。
[0469] 通过SDS-PAGE分析来自丁基-S评估的柱级分(图6)。在平衡条件下(0.6M硫酸钠)，来自SP Fast Flow小型池的ECP不被柱捕获。另外，在NaOH再生级分中似乎只有非常少的FkpA，表明这种层析介质可能能够从SP Fast Flow池中去除残留
的ECP，而不会维持大的回收损失。
潜在的第二纯化步骤的分析评估：比较Butyl 4 Fast Flow和Butyl-S
6 Fast Flow
的ECP，而不会维持大的回收损失。
潜在的第二纯化步骤的分析评估：比较Butyl 4 Fast Flow和Butyl-S
6 Fast Flow
[0470] 直接比较含有Butyl-S 6 Fast Flow或Butyl 4 Fast Flow的1mL重力流柱。对于Butyl-S 6 Fast Flow的步骤如上所述，除了使用
6.0mL PW将柱剥离一次而不是使用2×3mL的PW。
6.0mL PW将柱剥离一次而不是使用2×3mL的PW。
[0471] 来自Butyl 4Fast Flow和Butyl-S 6 Fast Flow的柱级分的SDS-PAGE分析分别显示在图7A和7B中。对于Butyl 4Fast Flow样品，
FkpA非常晚地洗脱(50mM磷酸盐，随后是PW)。在再生级分中存在显著量的FkpA和更低MW的杂质。对于Butyl-S 6 Fast Flow样品，FkpA在几个洗涤浓度的过程中洗脱，其
中在PW剥离步骤之前洗脱最多。再生级分仍含有一些更低MW的杂质和少量FkpA。Butyl-S
6 Fast Flow实验组的回收率数据显示在表9和10中。质量平衡是定量的，在
再生级分中仅发现总蛋白质的6％。Butyl-S 6 Fast Flow凝胶提供了很好地
从SP Fast Flow池中清除残留的ECP，以及非常高的回收率。
表9.分光光度测定数据：Butyl-S 6 Fast Flow
样品 稀释因子 FkpA(mg/mL) Abs<280nm> Abs<320nm>
PW空白 1.0 -1.0596E-4 -1.0586E-4 -4.8637E-5
F-T/洗涤 1.0 9.4522E-2 4.9919E-2 -1.1234E-3
0.5M洗涤 1.0 2.1272E-2 7.1135E-3 -4.3736E-3
0.4M洗涤 1.0 1.9341E-2 9.2669E-3 -1.1773E-3
0.3M洗涤 1.0 4.0865E-2 2.0347E-2 -1.7200E-3
0.2M洗涤 1.0 0.17278 9.4492E-2 1.1907E-3
0.1M洗涤 1.0 0.31258 0.17033 1.5364E-3
0M洗涤 1.0 0.27013 0.14822 2.3418E-3
PW洗脱 1.0 6.1637E-2 3.2298E-2 -9.8085E-4
2％NaOH再生 1.0 7.7314E-2 4.6334E-2 4.5843E-3
kpA(mg/mL)＝(Abs(280nm)-Abs(320nm))/0.54
表10.Butyl-S 回收率数据
级分 体积(mL) 浓度(mg/mL) mg ％回收率
SP小型22-50 2.5 1.51 3.8 100％
Butyl-S F-T/洗涤 8.0 0.09 0.8 20％
0.5M洗涤 3.0 0.02 0.1 2％
0.4M洗涤 3.0 0.02 0.1 2％
0.3M洗涤 3.0 0.04 0.1 3％
0.2M洗涤 3.0 0.17 0.5 14％
0.1M洗涤 3.0 0.31 0.9 25％
0M洗涤 3.0 0.27 0.8 21％
PW剥离 6.0 0.06 0.4 10％
2％NaOH再生 3.0 0.08 0.2 6％
质量平衡 3.9 102％
Butyl-S 6 Fast Flow优化
FkpA非常晚地洗脱(50mM磷酸盐，随后是PW)。在再生级分中存在显著量的FkpA和更低MW的杂质。对于Butyl-S 6 Fast Flow样品，FkpA在几个洗涤浓度的过程中洗脱，其
中在PW剥离步骤之前洗脱最多。再生级分仍含有一些更低MW的杂质和少量FkpA。Butyl-S
6 Fast Flow实验组的回收率数据显示在表9和10中。质量平衡是定量的，在
再生级分中仅发现总蛋白质的6％。Butyl-S 6 Fast Flow凝胶提供了很好地
从SP Fast Flow池中清除残留的ECP，以及非常高的回收率。
表9.分光光度测定数据：Butyl-S 6 Fast Flow
样品 稀释因子 FkpA(mg/mL) Abs<280nm> Abs<320nm>
PW空白 1.0 -1.0596E-4 -1.0586E-4 -4.8637E-5
F-T/洗涤 1.0 9.4522E-2 4.9919E-2 -1.1234E-3
0.5M洗涤 1.0 2.1272E-2 7.1135E-3 -4.3736E-3
0.4M洗涤 1.0 1.9341E-2 9.2669E-3 -1.1773E-3
0.3M洗涤 1.0 4.0865E-2 2.0347E-2 -1.7200E-3
0.2M洗涤 1.0 0.17278 9.4492E-2 1.1907E-3
0.1M洗涤 1.0 0.31258 0.17033 1.5364E-3
0M洗涤 1.0 0.27013 0.14822 2.3418E-3
PW洗脱 1.0 6.1637E-2 3.2298E-2 -9.8085E-4
2％NaOH再生 1.0 7.7314E-2 4.6334E-2 4.5843E-3
kpA(mg/mL)＝(Abs(280nm)-Abs(320nm))/0.54
表10.Butyl-S 回收率数据
级分 体积(mL) 浓度(mg/mL) mg ％回收率
SP小型22-50 2.5 1.51 3.8 100％
Butyl-S F-T/洗涤 8.0 0.09 0.8 20％
0.5M洗涤 3.0 0.02 0.1 2％
0.4M洗涤 3.0 0.02 0.1 2％
0.3M洗涤 3.0 0.04 0.1 3％
0.2M洗涤 3.0 0.17 0.5 14％
0.1M洗涤 3.0 0.31 0.9 25％
0M洗涤 3.0 0.27 0.8 21％
PW剥离 6.0 0.06 0.4 10％
2％NaOH再生 3.0 0.08 0.2 6％
质量平衡 3.9 102％
Butyl-S 6 Fast Flow优化
[0472] 该实验的目的是评估柱的中间0.3M硫酸钠洗涤是否将提供与潜在的递减硫酸钠梯度相当的纯化(回收率和纯度)。
[0473] 用Butyl-S 6 Fast Flow(GE Healthcare)填充1mL重力流柱。柱用5mL 50mM磷酸盐，pH7.0(丁基-S洗脱缓冲液)预平衡，然后用5mL 0.6M硫酸钠、50mM磷酸盐，pH7.0(丁基-S平衡缓冲液)平衡。将2.5mL的0.6M硫酸钠加入到来自上述SP
梯度评估的级分22-50的小型池的2.5mL等份试样中。轻轻混合小型池并在室温下静置30分钟，然后加载到柱中。用5.0mL 0.3M硫酸钠、50nM磷酸盐，pH7.0洗涤柱，随后用5.0mL纯化水(PW)洗脱，然后用3mL 2％氢氧化钠再生。
梯度评估的级分22-50的小型池的2.5mL等份试样中。轻轻混合小型池并在室温下静置30分钟，然后加载到柱中。用5.0mL 0.3M硫酸钠、50nM磷酸盐，pH7.0洗涤柱，随后用5.0mL纯化水(PW)洗脱，然后用3mL 2％氢氧化钠再生。
[0474] 通过SDS-PAGE对柱级分的分析(图8)显示在减少的硫酸钠条件下SPFast Flow池中更高MW的杂质流经Butyl-S 柱，使洗脱池清澈。加载泳道中少
数更低MW的条带结合柱，其通过再生去除(如在较早的凝胶中所见；图3)。
数更低MW的条带结合柱，其通过再生去除(如在较早的凝胶中所见；图3)。
[0475] 回收率数据显示在表11和12中。F-T/洗涤池中的回收率比来自先前实验的回收率值高约5％。PW洗脱回收率稍低。额外的PW洗脱可增加产率。再生步骤也略高于步骤洗脱，与再生前可能需要较长的洗脱步骤一致。表11.Butyl-S Fast Flow回收率数据
样品 稀释因子 FkpA(mg/mL) Abs<280nm> Abs<320nm>
PW空白 1.0 -1.8632E-4 -2.6512E-4 -1.6451E-4
F-T/洗涤 1.0 0.11878 6.3139E-2 -1.0047E-3
PW洗脱 1.0 0.45328 0.24602 1.2512E-3
2％NaOH再生 1.0 0.12895 7.2400E-2 2.7652E-3
FkpA(mg/mL)＝(Abs(280nm)-Abs(320nm))/0.54
表12.Butyl-S Fast Flow回收率数据
级分 体积(mL) 浓度(mg/mL) mg ％回收率
SP小型22-50 2.5 1.51 3.8 100％
Butyl-S F-T/洗涤 10.0 0.12 1.2 31％
PW洗脱 5.0 0.45 2.3 60％
2％NaOH再生 3.0 0.13 0.4 10％
质量平衡 3.8 102％
样品 稀释因子 FkpA(mg/mL) Abs<280nm> Abs<320nm>
PW空白 1.0 -1.8632E-4 -2.6512E-4 -1.6451E-4
F-T/洗涤 1.0 0.11878 6.3139E-2 -1.0047E-3
PW洗脱 1.0 0.45328 0.24602 1.2512E-3
2％NaOH再生 1.0 0.12895 7.2400E-2 2.7652E-3
FkpA(mg/mL)＝(Abs(280nm)-Abs(320nm))/0.54
表12.Butyl-S Fast Flow回收率数据
级分 体积(mL) 浓度(mg/mL) mg ％回收率
SP小型22-50 2.5 1.51 3.8 100％
Butyl-S F-T/洗涤 10.0 0.12 1.2 31％
PW洗脱 5.0 0.45 2.3 60％
2％NaOH再生 3.0 0.13 0.4 10％
质量平衡 3.8 102％
[0476] Butyl-S HIC介质显示从SP Fast Flow池很好地分离ECP，并具有非常好的FkpA回收率。基于来自这些分析评估的数据，将其规模放大并用作FkpA纯化方法中的第二回收步骤。
Butyl-S Fast Flow步骤的放大规模
Butyl-S Fast Flow步骤的放大规模
[0477] 将Butyl-S 层析法步骤放大规模，以将回收率和纯度与分析Butyl-S层析法步骤进行比较。进行了一系列的开发运行以优化步骤。分析HIC运行显
示FkpA与Butyl-S 凝胶相对紧密地结合。评估延长的洗脱步骤以查看是否可
以获得FkpA回收率的增加。
缓冲液和溶液
调节缓冲液：0.6M硫酸钠、50mM磷酸盐，pH7.0
平衡缓冲液：0.3M硫酸钠、50mM磷酸盐，pH7.0(A11)
洗脱溶液：纯化水(PW，A12)
再生溶液：2％NaOH
柱准备
准备2.6cm×9.4cm(50mL)的柱用于该评估。该柱用3CV平衡缓冲液平衡。
加载调节
示FkpA与Butyl-S 凝胶相对紧密地结合。评估延长的洗脱步骤以查看是否可
以获得FkpA回收率的增加。
缓冲液和溶液
调节缓冲液：0.6M硫酸钠、50mM磷酸盐，pH7.0
平衡缓冲液：0.3M硫酸钠、50mM磷酸盐，pH7.0(A11)
洗脱溶液：纯化水(PW，A12)
再生溶液：2％NaOH
柱准备
准备2.6cm×9.4cm(50mL)的柱用于该评估。该柱用3CV平衡缓冲液平衡。
加载调节
[0478] 将140mL的调节缓冲液逐步加入到140mL的SP FF池中，在整个加入方法中轻轻混合。在加入全部调节缓冲液后，在室温下继续混合30分钟。
层析法
层析法
[0479] 层析图如图9所示。观察到少量的突破性OD，这是基于分析评估所预期的。洗脱峰具有明显的拖尾，在约6CV的洗脱后达到10mAUFS。后池被收集作为单独的级分。使用2％(0.5M)氢氧化钠作为再生溶液进行柱再生。表13显示了UV-Vis分光光度法分析柱级分。质量平衡高于分析运行，但是数据与之前的分析运行产生的数据相似。规模放大运行显示了在FkpA纯度和回收率方面相似的柱性能。第二柱运行显示了可比较的柱曲线。表13.Butyl-S 回收
级分 体积(mL) 浓度(mg/mL) mg ％回收率
SP FF级分22-50 140 1.48 207 100％
F-T/洗涤 450 0.12 53 26％
预-池 54 0.03 1 1％
池 232 0.60 140 67％
后-池 232 0.03 8 4％
2％NaOH再生 150 0.16 23 11％
质量平衡 225 109％
SDS-PAGE
级分 体积(mL) 浓度(mg/mL) mg ％回收率
SP FF级分22-50 140 1.48 207 100％
F-T/洗涤 450 0.12 53 26％
预-池 54 0.03 1 1％
池 232 0.60 140 67％
后-池 232 0.03 8 4％
2％NaOH再生 150 0.16 23 11％
质量平衡 225 109％
SDS-PAGE
[0480] 通过SDS-PAGE的柱级分分析(图10A)显示纯化步骤与分析评估是可比较的，表明该HIC步骤的规模放大能够重复去除存在于SP Fast Flow池中的宿主细胞蛋白质杂质。更高MW的杂质流经层析柱，更低MW的杂质与柱紧密结合(如早期的凝胶所证明)。
洗脱池非常清澈，在后池中观察到非常少量的FkpA。在染色溶液中过夜孵育后，使用SYPRO Ruby试剂(Bio-Rad Laboratories)使相同的凝胶成像。SYPRO Ruby成像是一种更灵敏的分析含蛋白质样品的检测方法。SYPRO Ruby成像(图10B)显示纯化的FkpA级分仍具有许多可能是宿主细胞蛋白质杂质和/或FkpA剪切形式的更低MW的条带。
结论
洗脱池非常清澈，在后池中观察到非常少量的FkpA。在染色溶液中过夜孵育后，使用SYPRO Ruby试剂(Bio-Rad Laboratories)使相同的凝胶成像。SYPRO Ruby成像是一种更灵敏的分析含蛋白质样品的检测方法。SYPRO Ruby成像(图10B)显示纯化的FkpA级分仍具有许多可能是宿主细胞蛋白质杂质和/或FkpA剪切形式的更低MW的条带。
结论
[0481] Butyl-S 层析法步骤的规模放大是线性化自选自不同HIC介质的分析评估的参数。Butyl-S 提供了最好的FkpA回收率，因为它具有针对该第二
纯化步骤被评估的HIC培养基的最弱的配体。基于SDS-PAGE分析，通过该单元操作大大增强了分子纯度，其中主要杂质条带或存在于流经液中或被更高地保留。
HPLC-SEC分析评估
纯化步骤被评估的HIC培养基的最弱的配体。基于SDS-PAGE分析，通过该单元操作大大增强了分子纯度，其中主要杂质条带或存在于流经液中或被更高地保留。
HPLC-SEC分析评估
[0482] 基于其一级序列，FkpA具有～26kDa的摩尔质量。先前公布的关于FkpA的信息表明分子通过非共价结合以更高的MW运行。使用蛋白质参照物以及含有FkpA的Butyl-S池进行分析评估，以确定FkpA在尺寸排阻层析柱上的迁移位置。材料和方法
[0483] 使用TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC柱(7.8mm×30cm；Tosoh Bioscience)进行评估。流动相为0.25M KCl、0.2M磷酸钾，pH 6.2。柱流速为0.5mL/分钟。将FkpA与蛋白质标准进行比较：抗体(～150kDa)、牛血清白蛋白(～66.5kDa)和 (～22kDa)。层析法
[0484] HPLC-SEC结果显示在图11中。FkpA具有抗体与BSA之间的保留时间，证实了较早的参考文献，即FkpA具有比从其一级序列预测的更大的溶液摩尔质量(表14)。表14.FkpA和标准的HPLC-SEC
Superdex 200尺寸排阻层析法
Superdex 200尺寸排阻层析法
[0485] 选择Superdex 200尺寸排阻层析法(SEC)以从FkpA中分离残留的更高MW的物质和更低MW的物质，以及配制蛋白质。运行1：使用1.6cm×60cm Superdex 200柱的试验方法
[0486] 最初的Superdex 200运行在120mL柱上进行。在将Superdex 200 SEC规模放大以产生最终配制的体积之前，表征柱级分纯度。材料和方法
[0487] 该试验运行使用1.6cm×60cm(1CV＝120mL)Superdex 200柱(GE Healthcare)。柱用1CV的0.1M NaOH清洗，然后用3CV磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.5(平衡缓冲液)平衡。样品制备
[0488] 使用一对Amicon Ultra 10kDa单位(Millipore Corporation)浓缩30mL Butyl-S池。使用20分钟的循环将Amicon单元在Eppendorf 5810R离心机中以3000rpm离心，直到保留物体积≤6mL(≤1CV的5％)。
层析法
层析法
[0489] Superdex 200层析法步骤的层析图显示在图12中。该曲线与使用TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC柱的HPLC-SEC曲线没有显著不同，除了TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC柱产生更高MW物质的更好的分辨率外。SDS-PAGE
[0490] 通过SDS-PAGE分析柱级分32-42。通过与SDS样品缓冲液在室温下孵育1小时(不加热)制备用于电泳的样品。对通常的样品制备进行这种修改是为了确定是否加热样品导致低MW物质的存在。
[0491] 相同凝胶的无染色图像(图13A)和SYPRO Ruby成像(图13B)显示与完整蛋白共迁移的更低MW条带的存在。可以得出结论，在85℃下加热5分钟的常规样品制备并不是更低MW条带存在的原因，因为其存在于未加热的样品中。蛋白质印迹分析
[0492] 进行蛋白质印迹分析以确定物质是否足够纯以用于免疫兔或是否需要进行额外的纯化工作。对于该分析，使用来自Superdex 200柱的级分37(峰级分；图12)。
[0493] 凝胶和蛋白质印迹结果显示在图14中。蛋白质印迹的抗体是抗ECP。将蛋白质转移到PVDF纸上，每个PVDF纸与山羊抗ECP孵育。用缀合辣根过氧化物酶的兔抗山羊抗体进行第二孵育。然后将PVDF纸与通过与辣根过氧化物酶反应而发光的增强的化学发光底物孵育。分子量标记物也用StrepTactin和辣根过氧化物酶缀合物系统发光。与抗ECP孵育的免疫印迹揭示了样品中的ECP。凝胶结果证实先前产生的SYPRO Ruby成像结果(图13B)。蛋白质印迹显示了在37kDa和50kDa之间的微弱条带，用Sypro Ruby成像看不到。
质谱分析
质谱分析
[0494] 用胰蛋白酶消化蛋白质并通过UPLC-MS/MS分析以确定1)存在于物质中的FkpA肽序列，和2)样品中不存在其他蛋白杂质。该分析包括45分钟从0-40％乙腈的UPLC梯度，将其直接喷雾到高分辨率四极-飞行时间质谱仪，该质谱仪收集MS调查扫描，然后从层析法分离方法中的每个连续的MS扫描收集前20个最丰富的前体离子的MS/MS。针对Uniprot大肠杆菌规范和同种型数据库检索LC-MS/MS原始数据文件，鉴定了356个FkpA肽(由于高MS/MS取样率，许多是相同肽的多个实例)。还发现了2个β-半乳糖苷酶肽，其来源于用于质谱仪校准的内部标准，因此不包含在FkpA样品中。使用质谱法进一步表征FkpA并且使用β-半乳糖苷酶作为内部对照。
[0495] 结果显示在表15中。如所预期地，质谱分析显示FkpA序列覆盖～91％，信号序列代表FkpA肽覆盖中缺失的9％。没有观察到来自其他蛋白质的其他肽，得出如下结论：通过SDS-PAGE和蛋白质印记分析观察到的更低MW的条带是FkpA相关的。如果存在其他杂质，则其水平低于质谱仪的检测极限，和/或其组成不存在于结果与之比较的数据库中。表15.质谱分析的结果
Superdex 200运行2-4
Superdex 200运行2-4
[0496] 在初始试验运行之后，在320mL柱上进行随后的运行2-4以产生最终配制的体积。柱准备
[0497] 用1CV的0.1M NaOH清洗2.6cm×60cm柱(320mL床体积)，然后用3CV的PBS，pH7.5(平衡缓冲液)平衡。样品制备
[0498] 运行2-4中使用60mg-95mg的等分试样。使用与运行1相同的步骤来制备用于SEC的等分试样。目标终体积≤16.0mL(≤床体积的5％)。图15显示了运行2期间获得的层析图。汇集级分37-44并使用TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC柱再分析。图16显示运行2级分37-44的TSKgel G3000SWxl HPLC-SEC层析图。可以看到约2％的聚集体。该聚集量是期望的，以便针对聚集体产生抗体。运行3和4的结果相似。SDS-PAGE
[0499] 通过SDS-PAGE分析来自运行1的柱级分35-40和来自运行2-4的柱级分37-44。参见图17(分别是泳道2-5)。来自运行1的物质似乎已经降解，不用于随后的实验。超滤和过滤
[0500] 使用Amicon Ultra 10kDa单位将Superdex 200池浓缩至2.0mg/mL的靶蛋白浓度。由于运行1物质未预见的和未知原因的降解，只有来自运行2-4的物质包括在终体积中。
[0501] 使用两个Amicon Ultra 10kDa单位。将13mL来自运行2-4的组合级分(来自每个运行的级分37-44)转移到每个单元中。如前所述离心样品。倒出滤液并将UF保留物与来自组合级分的其他物质混合(以最小化单元中较高的蛋白质浓度)。重复该方法直至蛋白质浓度略高于2.0mg/mL的目标。将浓缩的样品通过0.2μ滤器过滤并用5mL UF滤液驱动。目标蛋白浓度FkpA的回收率实际上是定量的，如表16所示。表16.从超滤和过滤步骤中回收
级分 体积(mL) 浓度(mg/mL) mg ％回收率
Superdex池 154 1.49 228 100％
UF滤液 44 0.00 0 0％
Form.池 110 2.02 223 98％
超纯FkpA的冻融稳定性
级分 体积(mL) 浓度(mg/mL) mg ％回收率
Superdex池 154 1.49 228 100％
UF滤液 44 0.00 0 0％
Form.池 110 2.02 223 98％
超纯FkpA的冻融稳定性
[0502] 冻融稳定性测试背后的目的是确保试剂对多达三次冻融是稳定的，而不损失活性或改变电泳或SEC曲线。材料和方法
[0503] 使用75μL Ultrapure FkpA等分试样进行研究。将一个等分试样放置在冷藏室中，其余三个放入≤-80℃的冷冻室中。1小时后，将三个冷冻的等分试样融解并轻轻混合。将一个等分试样(“一次冻融”)放入冷藏室，另外两个放回冷冻室。对剩余的两个样品重复该方法，将第二个冻融样品转移到冷藏室，并将第三个冻融样品过夜放置在≤-80℃的冷冻室中。在之后的一天融解第三个样品。SDS-PAGE
[0504] 通过SDS-PAGE分析每个冻融样品的10μg等分试样。凝胶结果(图18)显示四个样品中的每一个之间的可比性。HPLC-SEC
[0505] 通过HPLC-SEC分析每个冻融样品的100μg等分试样。分级结果(图19A和19B以及表17)显示了四个样品之间的可比性。在更高MW的物质和单体中非常小的差异可能是由于峰的手动整合。来自Superdex 200运行2-4的超纯FkpA体积物(bulk)对三次冻融是稳定的，蛋白质没有明显变化。试剂被认为适合用作免疫原在兔中产生抗体，以及可用作ELISA测定法的参照，也可用作配体构建亲和柱，以从兔抗血清中纯化抗FkpA。
表17.FkpA冻融测定法的HPLC-SEC分析
表17.FkpA冻融测定法的HPLC-SEC分析
[0506] 通过SDS-PAGE(图14)、HPLC-SEC(表17)、N-末端序列分析和肽质量指纹(表15)表征最终产物。如使用FkpA的消光系数的分光光度法测定的，浓度为2.02mg/mL，稀释至100μg/mL。将稀释的溶液命名为标准储备液I并在-70℃或更低的温度下储存。实施例3.抗-FkpA抗体的产生和纯化
[0507] 产生针对超纯FkpA的多克隆抗体，用于测定法中来测量治疗性多肽制剂中FkpA的去除。以下实施例描述了用于产生多克隆FkpA抗体的纯化方法。这些试剂与FkpA免疫原一起是开发特异性FkpAELISA所必需的。
[0508] 用超纯FkpA免疫三只兔。在第42天，从各个兔抽取血液，并使用FkpA抗血清纯化抗-FkpA抗体。通过直接结合ELISA测定来自兔A、B和C的抗血清和预免疫血清。将超纯FkpA在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中稀释至4μg/mL，并直接包被在Costar 96孔板(目录号#9018)上，并在2-8℃孵育12至72小时。用洗板机用大约400μL的洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)和0.05％聚山梨醇酯20)洗涤每个孔并吸掉，3次，充分印迹(blotted)。通过在废液池上方反转平板，溶液未从孔中去除。将大约200μL测定稀释液加入到每个孔中，并在环境温度下在搅拌下孵育1至2小时。重复洗涤步骤。将样品在测定稀释液(0.15M NaCl、0.1M NaPO4，pH
7.2,0.05％聚山梨醇酯20、0.1％鱼明胶；0.05％proclin 300)中以1:500稀释，然后系列稀释4倍至多达12倍，并加入到相应的孔。在室温下将平板在搅拌下孵育2小时。用ELISA洗涤缓冲液洗涤平板，将稀释于测定稀释液中的山羊抗兔-HRP加入到各孔中，并在室温下搅拌孵育2小时。将平板用ELISA洗涤缓冲液洗涤，并将SureBlue ReserveTM TMB微孔过氧化物酶底物(Kirkegaard&Perry Labs[KPL]，目录号#53-00-00)(底物溶液)加入到平板中，在室温下持续约20分钟使颜色显色。用0.6N硫酸终止反应。在450nm的波长处读取OD，并使用Softmax Pro数据还原软件(data reduction software)分析数据。来自兔A、B和C的抗血清针对FkpA的免疫反应性是可比较的(图20)，因此汇集样品。
FkpA抗体的纯化
7.2,0.05％聚山梨醇酯20、0.1％鱼明胶；0.05％proclin 300)中以1:500稀释，然后系列稀释4倍至多达12倍，并加入到相应的孔。在室温下将平板在搅拌下孵育2小时。用ELISA洗涤缓冲液洗涤平板，将稀释于测定稀释液中的山羊抗兔-HRP加入到各孔中，并在室温下搅拌孵育2小时。将平板用ELISA洗涤缓冲液洗涤，并将SureBlue ReserveTM TMB微孔过氧化物酶底物(Kirkegaard&Perry Labs[KPL]，目录号#53-00-00)(底物溶液)加入到平板中，在室温下持续约20分钟使颜色显色。用0.6N硫酸终止反应。在450nm的波长处读取OD，并使用Softmax Pro数据还原软件(data reduction software)分析数据。来自兔A、B和C的抗血清针对FkpA的免疫反应性是可比较的(图20)，因此汇集样品。
FkpA抗体的纯化
[0509] 在汇集的抗血清上进行60％硫酸铵沉淀(ASP)步骤。将52.7mL硫酸铵溶液(3.8M硫酸铵、50mM磷酸盐，pH7.0)缓慢加入到73.0mL抗-FkpA兔抗血清中，在整个加入方法中轻轻搅拌。一旦加入完成，将溶液转移至冷藏室并轻轻混合过夜。
[0510] 然后使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来测定ASP抗-FkpA抗体的相对纯度以及确定蛋白质的摩尔质量。将2×10μL AS悬浮液的等分试样转移到单独的Eppendorf管中。向每个样品加入90μL的PBS，pH7.2，轻轻混合以溶解悬浮液。将100μL样品转移到Eppendorf管中。将样品以最高速度微离心5分钟。取出上清液并转移到单独的Eppendorf管中。剩余的沉淀物在100μL PBS，pH7.2中重构。将2×10μL上清液的等份试样转移到单独的Eppendorf管中。向每个上清液样品中加入90μL的PBS，pH7.2，并轻轻混合。
[0511] 通过SDS-PAGE分析来自每个条件的10μL样品。进行有和没有二硫键还原的电泳以评估抗体的共价聚集。使用Bio-Rad CriterionTM4-20％TGX(Tris-Glycine eXtended)Stain-FreeTM凝胶进行SDS-PAGE，并用Bio-Rad Criterion Stain FreeTM成像仪(Bio-Rad Laboratories)成像。凝胶结果显示在图21中。如箭头所标示的，在上清液中不存在抗体证明了60％分级步骤成功耗尽了所有兔抗体的抗血清。
[0512] 在通过SDS-PAGE分析之后，将剩余的硫酸铵悬浮液在Sorvall RC 6Plus离心机中在2-8℃的温度下以11,000rpm离心30分钟。去除上清液并将沉淀物储存在-80℃。
[0513] 然后将沉淀物溶解在磷酸盐缓冲液中。通过UV分光光度法测定ASP抗-FkpA抗体的浓度为6.69mg/mL。
[0514] 如上所述通过直接结合ELISA测定ASP抗FkpA抗体。将超纯FkpA在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中稀释至4μg/mL，并直接包被在Costar 96孔板(目录号#9018)上。样品在测定稀释液中以1:500稀释，然后系列稀释2倍至多达12倍。使用山羊抗兔-HRP检测结合。ASP抗-FkpA抗体显示对以1:256,000稀释度起始的超纯FkpA的线性剂量反应(图22)。这些结果促使进行ELISA夹心测定法。用ASP抗-FkpA抗体开发ELISA夹心测定法
[0515] 按照制造商的说明书，使用Pierce Kit EZ-Link Peroxidase(目录号#31489)将1mg ASP抗-FkpA抗体缀合至HRP。在测定稀释液中进一步以1/20稀释HRP缀合的ASP抗-FkpA抗体，并命名为ASP HRP缀合物储备液I。将ASP抗-FkpA抗体等分，并命名为ASP包被源。然后将ASP包被源在PBS中稀释至1mg/mL，并命名为ASP包被储备液I。
[0516] 在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中将ASP包被储备液I稀释至4μg/mL，并直接包被在Costar 96孔板(目录号#9018)上。将FkpA稀释至0.78-100ng/mL范围内的各种浓度，并加入到每个相应的孔中。将ASPHRP缀合物储备液I稀释至1:60、1:80、1:100和1:110，并加入到每个相应的孔中。将100μL稀释的ASP包被储备液I移液至微量滴定板的每个孔中并在2-8℃孵育12至72小时。用洗板机用约400μL洗涤缓冲液洗涤每个孔并吸掉，3次，充分印迹(blotted)。通过在废液池上方反转平板，溶液未从孔中去除。将大约200μL测定稀释液加入到每个孔中，并在环境温度下在搅拌下孵育1至2小时。重复洗涤步骤。将每孔100μL稀释的标准(一式两份)、对照(一式两份)和样品移液到适当的孔中。在环境温度下将平板在搅拌下孵育2小时±10分钟。如上洗涤孔、旋转平板、并重复洗涤步骤。用测定稀释液稀释ASP HRP-缀合物储备液I以产生最高和最低标准之间显著的OD范围，靶向最大OD值1.5-2.0OD。将100μL稀释的HRP-缀合物储备液I移液至每个孔并在环境温度下在搅拌下孵育2小时±10分钟。如上洗涤孔、旋转平板、并重复洗涤步骤。将每孔100μL底物溶液移液到孔中并在环境温度下在黑暗中孵育足够的时间，以允许最佳的标准曲线颜色显色。将100μL的0.6N硫酸移液到每孔中。使用酶标仪使用两个滤光片：450nm用于检测吸光度和620-630nm用于参照吸光度(参比波长是可选的)读取OD。使用具有最小4参数逻辑曲线拟合程序的数据处理软件确定样品浓度。结果显示在图23中。标准曲线似乎在～25ng/mL时显示平稳。测定的工作范围为～0.156-20ng/mL，最佳ASP HRP缀合物储备液I稀释度为1:90，如由预期的最大OD值～
1.7所确定。
使用ASP抗-FkpA抗体的ELISA夹心测定法的用途
1.7所确定。
使用ASP抗-FkpA抗体的ELISA夹心测定法的用途
[0517] 进行ELISA夹心测定法以测定如实施例6中所述产生的抗IL13/IL17双特异性抗体样品中FkpA的量。将ASP HRP缀合物储备液I以1:90稀释。结果显示非线性(表18)；因此表明额外的抗体纯化可能是优选的。表18.ASP ELISA夹心测定法
*＝计算中未包括的数据，N/A＝不适用，GTR＝大于范围，LTR＝小于范围
FkpA抗体的亲和纯化
*＝计算中未包括的数据，N/A＝不适用，GTR＝大于范围，LTR＝小于范围
FkpA抗体的亲和纯化
[0518] 为了改善ELISA夹心测定法的线性，通过亲和(AF)纯化和尺寸排阻层析法(SEC)进一步纯化ASP抗-FkpA抗体的等分试样。使用与激活的甘油基CPG共价偶联的超纯FkpA构建亲和柱以从非FkpA抗体分离靶抗FkpA抗体。用于偶联甘油可控孔度玻璃的超纯FkpA的制备
[0519] 将20×1mL小瓶的2.02mg/mL超纯FkpA在2-8℃过夜融解，并汇集内容物。使用125mL Sephadex G-25柱(GE Healthcare)缓冲液交换FkpA至偶联缓冲液(0.1M碳酸氢钠、
0.5M氯化钠，pH8.3)中。用1CV的0.1M NaOH清洗柱，然后用3CV偶联缓冲液平衡。
偶联步骤
0.5M氯化钠，pH8.3)中。用1CV的0.1M NaOH清洗柱，然后用3CV偶联缓冲液平衡。
偶联步骤
[0520] 由于其高流速特征以及在洗脱相期间耐受低pH条件的能力，选择甘油基-CPG(Millipore Corporation)作为构建亲和柱的支持物。支持物的甘油基部分具有醇官能团，其在氨基化学偶联之前被氧化成醛。所有的偶联步骤均在室温下进行。
[0521] 在通风柜下将干燥的甘油基-CPG加入到适量的纯化水中(1克甘油基-CPG将产生约3mL水合凝胶)。将甘油基-CPG与水轻轻混合以使凝胶充分水合。使水合凝胶沉降15-30分钟。针对水合凝胶的沉降体积为10-12mL体积。
[0522] 去除液体层(含有细粒(fines))，并将纯化水加入到沉降的凝胶中。轻轻混合凝胶，然后沉降15-30分钟。去除液体层并根据需要重复该步骤直到在液体层中没有观察到细粒。
[0523] 选择偏高碘酸钠(NaIO4)以将甘油基-CPG凝胶上的羟基氧化为醛。将等体积新鲜制备的1％(m/v)偏高碘酸钠加入到水合甘油基-CPG中，然后转移到适当大小的容器中。将容器固定在轨道旋转器上并轻轻混合30分钟。在氧化步骤结束时，从旋转器中取出容器，使凝胶沉降。
[0524] 去除液体，将3-4体积pH7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)加入到凝胶中。轻轻地将凝胶悬浮，然后使其沉降15分钟。去除液体，重复PBS另外3次以去除残留的偏高碘酸钠，然后加入待偶联的蛋白质。最后，将3-4体积0.1M碳酸氢钠、0.5M NaCl，pH8.3(偶联缓冲液)加入到沉降的凝胶中，轻轻混合，使其沉降15分钟。在偶联步骤之前去除液体。
[0525] 将经缓冲液交换的FkpA(来自Sephadex G-25步骤)加入到氧化的甘油基-CPG中。使用氰基硼氢化钠(NaBH3CN)还原中间席夫碱，并在FkpA和支持物之间形成稳定的共价键。
以～1mg氰基硼氢化钠/mL沉降的甘油基-CPG将NaBH3CN加入到反应混合物中。将反应混合物转移到密封容器中，固定在轨道旋转器上，并在室温下轻轻混合过夜。
以～1mg氰基硼氢化钠/mL沉降的甘油基-CPG将NaBH3CN加入到反应混合物中。将反应混合物转移到密封容器中，固定在轨道旋转器上，并在室温下轻轻混合过夜。
[0526] 从旋转器中取出偶联的凝胶并使其沉降15-30分钟。沉降后，取出2mL上清液的等份试样并转移到一对1mL的Eppendorf管中。将管以最高速度微离心2分钟以去除任何残留固体。测量上清液中的残留蛋白质以确定偶联效率。FkpA与氧化的甘油基-CPG的结合应该是定量的，耗尽蛋白质的上清液。上清液中的蛋白质浓度显示没有残留FkpA的迹象，表明偶联效率为100％(数据未显示)。
[0527] 如上所述用于去除NaIO 4的洗涤FkpA-CPG凝胶以去除残留的NaBH3CN。
[0528] 将等体积的1.0M Tris，pH8.0加入到FkpA-CPG凝胶中。在使用凝胶作为亲和支持物之前，使用FkpA的偶联来引入另外的胺基团以阻断任何剩余的反应位点。
[0529] 如上所述再次洗涤FkpA-CGP。亲和柱制备
[0530] 将亲和凝胶包装在1.6cm XK柱(GE Healthcare)中。最终尺寸为1.6cm×6.3cm(CV＝12.6mL)。柱用5CV的PBS、0.02％叠氮化钠，pH7.2洗涤，然后储存在冷藏室中直到使用。FkpA-CPG亲和层析法
运行1：FkpA-CPG亲和凝胶的初始评估
运行1：FkpA-CPG亲和凝胶的初始评估
[0531] 使用25％的60％硫酸铵沉淀物进行亲和柱性能的初始评估。将沉淀物从≤-60℃的储存融解并升温至室温。向沉淀物中加入120mL3.8M硫酸铵、50mM磷酸钠，pH7.0，并轻轻混合沉淀物使其悬浮。将悬浮液分别在四个SS-34离心管中，并在Sorvall RC 6Plus离心机中以15K rpm离心30分钟。丢弃上清液，将四个离心管中的三个转移回≤-60℃的冷冻室中用于后期的纯化。
[0532] 将30mL的50mM磷酸钠，pH 7.0加入剩余的离心管中。将管固定在实验室旋转器上，在室温下轻轻混合1小时以完全溶解沉淀物中的蛋白质。
[0533] 将样品以15K rpm离心15分钟，然后通过0.2μ滤器过滤。用30mL PBS、0.02％叠氮化钠，pH7.5(亲和柱的平衡缓冲液)驱动过滤后的样品以产生待加载至亲和柱的进料。
[0534] 将样品加载到柱并用20mL平衡缓冲液驱动。洗涤后，将洗脱池收集到含有17mL的1.0M Tris，pH8.0的烧杯中，在整个收集池的期间轻轻混合。层析图如图24所示。
[0535] 使用0.2μ滤器过滤pH调节的池并用5.0mL平衡缓冲液驱动，然后测量池中的蛋白质浓度并回收。通过UV-VIS分光光度法测定浓度为0.058mg/mL。将pH调节的池储存在2-8℃。Superdex 200层析法
[0536] 使用Superdex 200柱(GE)进行SEC以去除聚集体并配制pH调节的亲和池。
[0537] 用1CV的0.1M NaOH清洗1.6cm×60cm(1CV＝120mL)的Superdex 200柱(GE Healthcare)，然后用3CV的PBS，pH7.5(平衡缓冲液)平衡。
运行1：FkpA-CPG运行1的层析法
运行1：FkpA-CPG运行1的层析法
[0538] 使用两个Amicon Ultra 10kDa单位将来自FkpA-CPG运行1的83mL pH调节的池浓缩至体积≤6.0mL(≤1CV的5％)。将13mL pH调节的池转移到每个单元中。浓缩器在Eppendorf离心机中以3K rpm旋转30分钟。移出滤液，并重新装满pH调节的池。重复该方法直至达到UF保留物的靶体积(UF保留物体积＝3.8mL)。
[0539] 将UF保留物加载到柱上并用pH7.5的PBS驱动。层析图(图25)显示从靶单体物质中分离出许多更高MW的物质。
[0540] 通过HPLC-SEC分析含有更高MW物质的级分(fr.41-63)和包含主峰的那些级分(fr.64-86)。测定结果(图26A和26B)显示主峰包含～96％的单体物质，其通过使用尺寸排阻层析法步骤而大大增强。
[0541] 汇集Superdex 200级分并使用Amicon Ultra浓缩单元(Millipore)浓缩。通过UV分光光度法测定浓度为3.1mg/mL。
[0542] 按照制造商的说明，使用Pierce Kit EZ-Link Peroxidase(目录号#31489)将1mg亲和纯化的抗FkpA抗体缀合至HRP。HRP缀合的亲和纯化的抗-FkpA抗体进一步在测定稀释液中以1/20稀释，并命名为AF HRP缀合物储备液I。将亲和纯化的抗-FkpA抗体等分并命名为AF包被源。将AF包被源在PBS中稀释至1mg/mL，并命名为AF包被储备液I。
[0543] AF包被储备液I在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中稀释至4μg/mL，并直接包被在Costar 96孔板(目录号#9018)上。将FkpA稀释至0.78-100ng/mL范围内的各种浓度，并加入到每个相应的孔中。将AFHRP缀合物储备液I稀释至1：2000、1：4000、1：6000和1：8000，并加入到每个相应的孔中。如上所述进行测定。结果显示在图27中。工作范围测定为0.78-100ng/mL，最佳AF HRP缀合物储备液I稀释度为1：6000，最大OD值为～1.7。
比较ASP和亲和纯化的抗FkpA抗体
比较ASP和亲和纯化的抗FkpA抗体
[0544] 进行ELISA夹心测定法以比较ASP和亲和纯化的抗-FkpA抗体测定如实施例6中所述制备的抗-IL13/IL17双特异性抗体样品中FkpA的量的能力，所述样品含有5.31mg/mL抗-IL13/IL17。测定参数显示在表19中。所得到的ASP和AF抗-FkpA抗体的标准曲线显示在图28A和28B中。如图28A、28B和表19和20所示，亲和纯化的抗体具有0.78ng/mL-100ng/mL的动态范围，具有改善的线性，并且需要更少的HRP检测抗体。
表19.用于比较ASP和AF抗-FkpA抗体的参数
参数 ASP-FkpA AF-FkpA
包被 4ug/mL 4ug/mL
缀合物稀释度 1/90 1/6000
空白OD 0.092 0.054
在0.156或0.78ng/mL的OD 0.137 0.087
标准曲线范围 0.156-20ng/mL 0.78-100ng/mL
最大OD 1.537 1.753
表20.ASP和AF抗-FkpA抗体结果
剩余ASP抗体的亲和纯化
表19.用于比较ASP和AF抗-FkpA抗体的参数
参数 ASP-FkpA AF-FkpA
包被 4ug/mL 4ug/mL
缀合物稀释度 1/90 1/6000
空白OD 0.092 0.054
在0.156或0.78ng/mL的OD 0.137 0.087
标准曲线范围 0.156-20ng/mL 0.78-100ng/mL
最大OD 1.537 1.753
表20.ASP和AF抗-FkpA抗体结果
剩余ASP抗体的亲和纯化
[0545] 基于上述的并行比较，使用亲和层析法、随后的进行尺寸排阻层析法纯化剩余的ASP抗体。级分33-46含有～98％的单体(图29)。通过UV分光光度法测定浓度为0.386mg/mL。组合Superdex 200运行2的级分33-46并使用单个Amicon Ultra 10kDa单位浓缩，如前所述。通过UV分光光度法测定浓度为1.2mg/mL，并将样品命名为AF包被储备液II。
AF抗体的冻融稳定性
AF抗体的冻融稳定性
[0546] 冻融稳定性测试背后的目的是确保试剂对多达三次冻融是稳定的，而不损失活性或改变电泳或SEC曲线。使用100μL AF包被储备液II的等分试样用于该实验。将一个等分试样放置在冷藏室中，剩余三个放入≤-60℃的冷冻室中。1小时后，将三个冷冻的等分试样融解并轻轻混合。将一个等分试样(“一次冻融”)放入冷藏室，另外两个放回冷冻室。对剩余的两个样品重复该方法，将第二个冻融样品转移到冷藏室，并将第三个冻融样品过夜放置在≤-60℃的冷冻室中。在之后的一天融解第三个样品。
[0547] 通过SDS-PAGE分析每个冻融样品的10μg等分试样。凝胶结果显示在图30中。冻融样品在凝胶两侧的冻融之间似乎是可比较的。还原侧在每个样品中显示一些非常高的MW条带。这些条带可能是与还原步骤相关的凝胶伪影。
[0548] 通过HPLC-SEC分析四个冻融样品。每个样品使用50μg等分试样。测定结果在图31A和31B和表21中。曲线非常相似，但是显示轻微的随冻融增加而增加的更高MW物质的倾向。这些样品的功能测试显示更高MW物质的增加对试剂的使用几乎没有影响(图32)。基于SDS-PAGE和HPLC-SEC分析，对于多达3次冻融，在蛋白质纯度和/或组成中没有显著差异。
表21.AF纯化抗体的冻融测定法的HPLC-SEC分析
表21.AF纯化抗体的冻融测定法的HPLC-SEC分析
[0549] 等分AF包被储备液II，并在多次冻/融事件中评估AF抗-FkpA抗体的稳定性。AF包被储备液I和II的夹心ELISA比较
[0550] AF包被储备液I和II在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中稀释至3μg/mL，并直接包被在Costar 96孔板(目录号#9018)上并在2-8℃过夜孵育。用ELISA洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)/0.05％聚山梨醇酯20)洗涤平板，用测定稀释液(0.15M氯化钠[NaCl]/0.1M磷酸钠[NaPO4]/0.1％鱼明胶/0.05％聚山梨醇酯20/0.05％Proclin 300)在室温搅拌下阻断1-2小时，然后再次用ELISA洗涤缓冲液洗涤。将标准曲线(100-1.56ng/mL)和空白加入平板并在室温搅拌下孵育2小时。用ELISA洗涤缓冲液洗涤平板并将AF HRP缀合物储备液I用测定稀释液以1：6000稀释，加入到平板，在室温搅拌下孵育2小时。用ELISA洗涤缓冲液洗涤平板并向平板加入SureBlue ReserveTM TMB微孔过氧化物酶底物(Kirkegaard&Perry Labs[KPL]，目录号#53-00-00)，在室温下约20分钟使其显色。用0.6N硫酸终止反应。在450nm波长处读取OD，用Softmax Pro数据还原软件分析数据。AF包被储备液I和II产生的标准曲线几乎是重叠的。筛选和优化了包被浓度、检测抗体稀释度和孵育时间。3ug/mL的包被浓度和1/6000的AF HRP缀合物稀释液被确定为准确和稳健的。包被孵育时间稳健地长达3天。
纯化和分析来自随后放血的抗体
纯化和分析来自随后放血的抗体
[0551] 根据是否发生红细胞溶血，汇集兔A、B和C随后的放血，分别纯化裂解和未裂解的物质。如前所述，两个池均通过60％ASP以及随后的亲和层析法和SEC纯化。根据SEC-HPLC数据，裂解池(命名为批次B)和未裂解池(命名为批次C)之间没有显著差异。级分35-38与AF包被储备液II(命名为批次A)物质最为相似，所以批次B级分35-38汇集在一起(表22)。表22.批次A和B的HPLC-SEC比较
[0552] 比较作为夹心ELISA中包被抗体的批次A、B和C。包被抗体稀释到3μg/mL。AF HRP缀合物储备液I以1:6000的稀释度用作检测抗体。三种抗体的结果是可比较的(图33)。通过UV分光光度法测定批次B的浓度为2.13mg/mL。
[0553] 按照制造商的说明，使用Pierce Kit EZ-Link Peroxidase(目录号#31489)将1mg批次B抗体缀合至HRP。进一步以1/10稀释批次BHRP缀合的抗体，并命名为批次B HRP缀合物储备液I。批次B被细等分，并命名为批次B储备液I。测定法稳健性
[0554] 进行实验设计以筛选测定条件并证明稳健性。测定参数，如包被浓度、缀合稀释度和TMB底物孵育时间是不同的。这些参数的微小变化不影响测定结果。最佳条件如表23所示。表23
Y154参数
标准曲线范围 1.56-100ng/mL
AF包被储备液II 3ug/mL
缀合物储备液I 1/20,000
底物孵育时间 20分钟
实施例4.超纯FkpA的稳定性
超纯FkpA在-70℃储存的稳定性
Y154参数
标准曲线范围 1.56-100ng/mL
AF包被储备液II 3ug/mL
缀合物储备液I 1/20,000
底物孵育时间 20分钟
实施例4.超纯FkpA的稳定性
超纯FkpA在-70℃储存的稳定性
[0555] 为了测试超纯FkpA作为测定对照的稳定性，将实施例2中描述的标准储备液I在测定稀释液中稀释至3(低)、15(中)、75(高)ng/mL，等分并储存在-70℃。在冷冻之前，使用标准曲线通过ELISA测量一个低、中和高等分试样的浓度。通过融解等分试样并测定FkpA的浓度，监测低、中和高超纯度FkpA对照的稳定性总共18天。当储存在-70℃时，低的对照是不稳定的。中的对照表现出相似的不稳定性，然而，当储存在-70℃时，高的对照似乎是稳定的。与-70℃相比在2-8℃储存的超纯FkpA的稳定性
[0556] 对一组新的低和中对照进行第二次测试，一半保存在-70℃，另一半保存在2-8℃共8天。在冷冻之前不测量浓度。与之前的实验一样，冷冻对照的浓度从第1天的计算靶浓度开始下降30％。在2-8℃储存的对照浓度比在-70℃储存的对照下降的速率慢，但是仍然认为该下降在可接受的范围之外(图34)。在不同量的聚山梨醇酯中制备的超纯FkpA的稳定性
[0557] 标准储备液I在测定稀释液中在不同量的聚山梨醇酯中稀释至3(低)、15(中)或75(高)ng/mL，用于测定对照。测定稀释液含有0.05％聚山梨醇酯，因此测试聚山梨醇酯浓度0.1、0.25、0.5和1％，以观察其是否改善在-70℃冷冻的对照的稳定性。在冷冻(T＝0)之前测试FkpA的各种溶液，并如上所述监测总共15天。对于所有稀释到3ng/mL的样品，与T＝0相比，似乎只有含有0.5％聚山梨醇酯的样品在整个15天内的浓度下降小于20％。其他3ng/mL条件观察到更大的变异(表24)。对于15ng/mL溶液，没有条件具有比靶浓度低30％以上的浓度。含有0.5％或0.25％聚山梨醇酯的浓度在所有15天内都保持在靶浓度的20％以内(表
24)。0.5％聚山梨醇酯产生所有测试对照的最佳回收率。来自靶浓度和第0天的百分比差异(％Diff)在1-13％之间，％CV为1-10％。在0.10％聚山梨醇酯中稀释的对照确实具有小于
20％的％Diff，但是对于低对照存在更大的变异，％CV为20％。总体而言，不认为增加量的聚山梨醇酯足以防止超纯FkpA的不稳定性。
表24.不同浓度的聚山梨醇酯的比较
在鱼明胶、ApoMab和缓冲液C中制备的超纯FkpA的稳定性
24)。0.5％聚山梨醇酯产生所有测试对照的最佳回收率。来自靶浓度和第0天的百分比差异(％Diff)在1-13％之间，％CV为1-10％。在0.10％聚山梨醇酯中稀释的对照确实具有小于
20％的％Diff，但是对于低对照存在更大的变异，％CV为20％。总体而言，不认为增加量的聚山梨醇酯足以防止超纯FkpA的不稳定性。
表24.不同浓度的聚山梨醇酯的比较
在鱼明胶、ApoMab和缓冲液C中制备的超纯FkpA的稳定性
[0558] 当在0.2％鱼明胶、1mg/mL ApoMab(Ashkenazi,A,2008,Nature Reviews Drug Discovery,7:1001-1012)或缓冲液C(20mM乙酸组氨酸、240mM蔗糖、0.02％聚山梨醇酯20，pH 5.5)中稀释至3(低)、15(中)或75(高)ng/mL时，测定超纯FkpA在-70℃时的稳定性(图35A和35B)。结果显示FkpA在几种不同组合物中的稳定性，在所有情况中在缓冲液C中储存时对照在-70℃保持稳定。作为一个例子，通过重复该测定法16次来证明在缓冲液C中对照回收的稳健性(表25)。变异在可接受的范围内。
表25.用于检测FkpA的ELISA
实施例5.比较超纯FkpA与商业FkpA试剂
表25.用于检测FkpA的ELISA
实施例5.比较超纯FkpA与商业FkpA试剂
[0559] 测定实施例3中描述的夹心ELISA测定法检测不同FkpA标准的能力。各种标准包括标准储备液I(实施例2中描述)、BioSource FkpA标准目录号MBS1037402和BioSource FkpA标准目录号MBS1182120。使用的标准是1.56到100ng/mL。BioSource FkpA标准目录号MBS1037402和MBS1182120产生标准曲线，其信号比标准储备液I的低(图36)。实施例6.产生抗-IL13/抗-IL17IgG4双特异性抗体
[0560] 在大肠杆菌中产生具有两条不同轻链的人IgG1双特异性抗体的技术(Yu等人，2011，Sci Transl Med 3,84ra44)。该方法利用杵入臼技术(Ridgway等人,1996,Protein Eng.9,617–621；Atwell等人,1997,J Mol Biol 270,26–35)促进免疫球蛋白重链的异二聚化。为了能够使用两条不同的轻链而不具有轻链错配，在单独的大肠杆菌细胞中将每条臂作为半聚体或半抗体进行培养。该方法用于通过将抗IL17和抗IL13亲本抗体亚克隆到载体中来产生抗IL13/抗IL17双特异性抗体，所述载体允许表达作为人IgG4臼的抗IL17臂，和作为人IgG4杵的抗IL13臂。IgG4杵重链恒定区的序列示于SEQ ID NO：15或16，IgG4臼重链恒定区的序列示于SEQ ID NO：26或27。
[0561] 对于初始抗体表达，使用仅表达内源FkpA的大肠杆菌菌株64B4。在最初的评估中，我们发现在pH高于7时，抗-IL-17半抗体形成沉淀。捕获半抗体，然后在低pH下从蛋白A柱洗脱，并将洗脱液调节至pH8.5以在氧化还原反应中进行双特异性抗体的组装。在pH调节后，约20％的抗-IL-17半抗体洗脱液由于沉淀而失去。可用于与抗-IL-13半抗体配对的抗-IL-17半抗体的减少导致两个半抗体比率之间的不平衡并降低了抗-IL-13/IL-17双特异性的产率。随后，在过表达外源FkpA、DsbA和DsbC的不同大肠杆菌菌株中产生半抗体。用编码抗-IL13或抗IL17半抗体的LC和HC和分子伴侣FkpA、DsbA和DsbC的TIR(翻译起始区)2,2单个质粒转化大肠杆菌菌株67A6Δ(基因型：W3110 ΔfhuA ΔphoA ilvG2096(IlvG+；Valr)Δprc spr43H1 ΔmanA lacIQ ΔompT ΔmenE742 degPS210A)。在两种质粒上，FkpA的表达在phoA启动子的控制之下，DsbA和DsbC的表达以多顺反子方式在tacII启动子的控制下。LC和HC都在独立的phoA启动子的控制之下。质粒用于转化67A6。表达的FkpA含有其天然信号肽。
[0562] 半抗体抗IL13.杵和抗IL17.臼，其各自在以上所述的67A6大肠杆菌细胞的培养物中生长。用于抗IL13.杵的大规模培养物保持在pH6.7±0.2，抗IL17.臼的大规模培养物保持在pH7.0±0.2。使培养物在34℃以220rpm生长直至培养物的OD达到150。然后将培养物转换为25℃，160rpm。总发酵72小时。
[0563] 每个半抗体的全部肉汤分别通过微流器均浆。然后将每个匀浆池用水稀释并用PEI调整并在室温下孵育。随后将调整的匀浆池离心以分离固体，然后通过一系列滤器过滤含有半抗体的离心分离液(centrate)。
[0564] 每个半抗体的滴度比用不含外源表达FkpA、DsbA和DsbC的大肠杆菌菌株64B4产生的滴度高约10至20倍(数据未显示)。因此，采用外源表达FkpA、DsbA和DsbC来制备抗IL13/IL17抗体。
[0565] 然后将各半抗体分别在使用MabSelect SuReTM树脂(GE Healthcare Life Sciences)的亲和层析柱上捕获。柱平衡后，将离心分离液加载到柱上，用平衡缓冲液和第二次洗涤缓冲液洗涤。在酸性条件(pH 2.8)下从柱洗脱半抗体。抗IL13/抗IL17抗体的组装
[0566] 将亲和纯化的抗IL13和抗IL17半抗体以1:1的质量比组合，然后滴定至pH8.5。相对于从组装方法中预期的双特异性抗体的理论最大量，将100x过量摩尔比的还原L-谷胱甘肽(GSH)加入到混合物中，并将温度从室温调节至35℃。两个半抗体在体外氧化还原反应中组装形成抗IL13/抗IL17双特异性抗体。氧化还原反应在35℃持续12-24小时。通过将pH调节至6.5来淬灭组装反应，并且在进行下述纯化方法之前用水稀释该混合物。
[0567] 在初始的MabSelect SuReTM纯化和组装之后，进行双特异性抗体纯化的几个有顺TM序的步骤。首先在使用CAPTO ADHERE树脂(GE Healthcare Life Sciences)以结合-洗脱模式操作的混合模式阴离子交换层析法步骤中纯化组装的抗体。柱平衡(50mM醋酸盐，pH6.5)后，将调节的组装池加载到柱上，用平衡缓冲液洗涤，然后用第二次洗涤缓冲液(200mM乙酸盐，pH6.5)洗涤。通过降低缓冲液(25mM乙酸盐，pH5.2)的pH来洗脱双特异性抗体。
[0568] 在CAPTOTMADHERE层析法之后，将双特异性抗体产物的浓度从约80-85％增加至≥92％，并且高分子量物质浓度从约12-15％降低至约≤4％，如通过SEC-HPLC测量的。此外，制剂中的ECP减少约2个对数，DsbA减少约1个对数，FkpA减少0.75个对数。
[0569] 通过使用Q Fast Flow树脂(GE Healthcare Life Sciences)以结合-和-洗脱模式操作的阴离子交换层析法步骤进一步纯化池。将调整至pH 8.5的CaptoTM粘附洗脱液池加载到平衡的Q Fast Flow柱上并用平衡缓冲液(50mM Tris，
pH8.5)洗涤。通过增加缓冲液(50mM Tris、100mM乙酸钠，pH8.5)的电导率从柱中洗脱双特异性抗体。
pH8.5)洗涤。通过增加缓冲液(50mM Tris、100mM乙酸钠，pH8.5)的电导率从柱中洗脱双特异性抗体。
[0570] 在QSFF层析法之后，双特异性抗体产物的浓度从约≥92％增加至≥94％，并且高分子量物质浓度从≤4％降低至约≤2.5％，并且如通过SEC-HPLC所测量的，不能检测到极高分子量物质的量。此外制剂中的DsbC降低约4倍，FkpA降低4-5倍。
[0571] 将QSFF洗脱液池调节至pH 5.5，并在使用PHENYL 6Fast Flow(high sub)树脂(GE Healthcare Life Sciences)和以流经模式操作的疏水相互作用层析柱上进一步纯化。平衡柱(170mM乙酸盐，pH 5.5)，并将调整的QSFF池加载到柱上。抗IL13/抗IL17双特异性抗体流经，然后用平衡缓冲液洗涤柱。基于OD280开始和终止产物池收集，其中汇集发生在0.5至1的OD之间或最大10CV的柱洗涤体积。然后浓缩池并使用超滤/渗滤(UF/DF)进行缓冲液交换。
[0572] 以类似的结果进行第二次运行。实施例7.检测抗IL13/抗IL17抗体制剂中的杂质
[0573] 分析两个批次的抗IL13/抗IL17双特异性抗体存在的杂质，包括非配对半抗体、同二聚体、低分子量物质(LMWS)、高分子量物质(HMWS)、极高分子量物质(vHMWS)、酸性变体、碱性变体、FkpA、DsbA、DsbC、ECP、浸出的蛋白A、大肠杆菌DNA和内毒素。产物质量列于表26。表26.产物质量
检测纯化的抗IL13/抗IL17双特异性抗体中的FkpA
检测纯化的抗IL13/抗IL17双特异性抗体中的FkpA
[0574] 使用针对超纯FkpA的抗体以及针对标准和对照的超纯FkpA、通过ELISA测定FkpA的浓度。在抗-IL13/抗-IL17双特异性抗体的每个生产阶段之后，还通过LC-MS/MS(液相层析法-串联质谱法)分析样品存在的FkpA。
[0575] 下面描述通过ELISA和LC-MS/MS检测FkpA。结果显示在表27中。表27抗-IL13/抗-IL17样品中的FkpA浓度
通过ELISA检测FkpA
通过ELISA检测FkpA
[0576] 针对超纯FkpA的多克隆血清在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中稀释至3μg/mL，直接包被在Costar 96孔板(目录号#9018)上并在2-8℃过夜孵育。用ELISA洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)/0.05％聚山梨醇酯20)洗涤平板，用测定稀释液(0.15M氯化钠/0.1M磷酸钠/0.1％鱼明胶/0.05％聚山梨醇酯20/0.05％Proclin300)在室温搅拌下阻断1-2小时，然后再用ELISA洗涤缓冲液洗涤。将超纯FkpA的标准曲线(100-1.56ng/mL)和空白加入到平板中，并在室温搅拌下孵育2小时。用ELISA洗涤缓冲液洗涤平板，将亲和纯化的抗-FkpA HRP缀合物储备液用测定稀释液以1:6000稀释，加入平板中，并在室温搅拌下孵育2小时。用ELISA洗涤缓冲液洗涤平板，将SureBlue ReserveTM TMB微孔过氧化物酶底物(Kirkegaard&Perry Labs，目录号#53-00-00)加入平板，并在室温下约20分钟使颜色显色。用0.6N硫酸终止反应。在450nm的波长处读取OD，并使用Softmax Pro数据还原软件分析数据。
通过LC-MS/MS检测FkpA
通过LC-MS/MS检测FkpA
[0577] 用纯化水稀释在0.5mg Apomab中的1、5、10、25和50ppm FkpA的FkpA标准、0.5mg各抗体样品和标准至终浓度5mg/mL。将400μL变性缓冲液(7.2M盐酸胍、0.3M乙酸钠，pH 5.0)和10μL 0.5M Bond-Breaker Tris(2-羧乙基)膦(TCEP)，中性pH(Pierce)加入到100μL稀释的样品中，孵育样品15分钟，37℃。
[0578] 用～10mL脱盐缓冲液(1mM乙酸钠、0.5mM TCEP，pH 5.0)平衡NAP-5脱盐柱。加载样品并用800μL脱盐缓冲液洗脱。将100μL的0.5M MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸、4-吗啉丙磺酸)加入到各样品中。
[0579] 将20μL 0.5mg/mL胰蛋白酶加入到各样品，并将样品在37℃孵育60分钟。通过加入30μL 10％三氟乙酸(TFA)使胰蛋白酶失活。
[0580] 注射100μL各消化的样品用于通过多重反应监测(MRM)的LC-MS/MS分析。LC在具有2.1mm×150mm、1.7μmWaters CSH C18 UPLC柱的Waters Acquity H-Class Bio UPLC上进行。柱温为60℃，流速为0.3mL/分钟，使用缓冲液A(具有0.1％甲酸的水)和缓冲液B(具有
0.1％甲酸的乙腈)作为0-40％B的梯度，45分钟。
0.1％甲酸的乙腈)作为0-40％B的梯度，45分钟。
[0581] 用Sciex 6500Qtrap质谱仪进行MS/MS。MRM监测FkpA肽SAYALGASLGR(SEQ ID NO：45)的+2前体离子向y6片段离子的转变。碰撞能为28.1V，去簇(declustering)电位＝70V，停留时间为100ms。Q1质量＝533.3(对于前体)，Q3质量＝560.3(对于y6片段离子)。使用FkpA标准曲线来确定抗-IL13/抗-IL17样品中的FkpA浓度。
实施例8.抗IL13/抗IL17双特异性抗体的5-柱纯化
实施例8.抗IL13/抗IL17双特异性抗体的5-柱纯化
[0582] 为了进一步降低抗-IL13/抗-IL17抗体中FkpA的浓度，将另外的纯化步骤加入到上述的4-柱步骤中。评估 50HS阳离子交换层析法。将pH调至5.0的PHENYL6 Fast Flow(high sub)洗脱液池的样品施加到 HS 50
(Applied BiosystemsTM)阳离子交换柱上，并以结合-洗脱模式纯化。使用线性盐梯度(0至
500mM乙酸，pH5.8，经过22CV)洗脱双特异性抗体。然后分析样品的杂质去除。结果列于表
28。
表28.初步的 HS 50第五层析法步骤的结果
n.t.:未测试
BsAb＝双特异性抗体
(Applied BiosystemsTM)阳离子交换柱上，并以结合-洗脱模式纯化。使用线性盐梯度(0至
500mM乙酸，pH5.8，经过22CV)洗脱双特异性抗体。然后分析样品的杂质去除。结果列于表
28。
表28.初步的 HS 50第五层析法步骤的结果
n.t.:未测试
BsAb＝双特异性抗体
[0583] 基于这些结果，将 HS 50柱并入到抗IL13/抗IL17的纯化方案中。在MabSelect SuReTM柱上通过蛋白A亲和层析法纯化半抗体，并如实施例6中所述进行组装。组TM
装的抗IL13/抗IL17抗体通过CAPTO ADHERE、Q Fast Flow和PHENYL
6 Fast Flow(high sub)层析法步骤进一步纯化，如实施例6所述。
装的抗IL13/抗IL17抗体通过CAPTO ADHERE、Q Fast Flow和PHENYL
6 Fast Flow(high sub)层析法步骤进一步纯化，如实施例6所述。
[0584] 在UF/DF步骤之前，将来自PHENYL 6 Fast Flow柱的抗-IL13/抗IL17双特异性抗体池在以结合-和-洗脱模式操作的 HS 50柱上纯化。将柱平
衡(50mM乙酸盐，pH 5.5)，并将稀释的PHENYL 6 Fast Flow(high sub)
流经液池加载到柱上。用平衡缓冲液以及随后的第二次洗涤缓冲液(50mM乙酸盐，pH5.8)洗涤柱。使用从10-100％B的线性盐梯度经过22CV(A：水，B：500mM乙酸盐，pH5.8)从柱洗脱双特异性抗体。基于OD280开始和终止洗脱液收集，其中汇集发生在0.5至1之间。
衡(50mM乙酸盐，pH 5.5)，并将稀释的PHENYL 6 Fast Flow(high sub)
流经液池加载到柱上。用平衡缓冲液以及随后的第二次洗涤缓冲液(50mM乙酸盐，pH5.8)洗涤柱。使用从10-100％B的线性盐梯度经过22CV(A：水，B：500mM乙酸盐，pH5.8)从柱洗脱双特异性抗体。基于OD280开始和终止洗脱液收集，其中汇集发生在0.5至1之间。
[0585] 随后，使用超滤/渗滤(UF/DF)进行 HS 50池的浓缩和缓冲液交换。
[0586] 用四种不同的αIL13和αIL17发酵重复该方法。
[0587] 分析终产物的样品以及纯化方法的不同步骤后的样品的产物特异性杂质。表29中给出了样品中高分子量物质(HMWS)的分析结果。简言之，组装的双特异性抗体起始物质含有约91-94％的产物和约6.0-7.5％的HMWS。在CaptoTM粘附混合模式层析法之后，样品含有约95-98％的产物和约2.2％的HMWS，表明样品中HMWS杂质的量减少。阴离子交换、HIC和阳离子交换之后样品含有98-99.6％的产物和0.2-1.5％的HMWS。表29.分析SEC-HPLC结果
[0588] 使用针对超纯FkpA的抗体、通过使用实施例4中提供的ELISA分析5-柱方法池的样品存在的FkpA。如表30和31所示，5-柱方法有效地从双特异性抗体制剂中去除FkpA。
[0589] 因此，如通过ELISA测定法在示例性双特异性抗体(即，抗IL13/抗IL17双特异性抗体)的样品中所分析的，本文所述的纯化方法基本上去除或减少FkpA水平至不超过6ppm，所述双特异性抗体由过表达外源FkpA的大肠杆菌细胞产生的半抗体组装。作为比较，如通过相同的ELISA测定法在由仅表达内源FkpA的大肠杆菌细胞(如不具有表达外源FkpA或其他伴侣蛋白的质粒的菌株64B4)产生并由ProPacTMHIC-10柱纯化的抗-IL13/抗-IL17双特异性抗体的样品中所测定的，FkpA水平保持在7ppm(数据未显示)。表30.通过ELISA测定的抗-IL13/抗-IL17样品中FkpA的浓度
表31抗-IL13/抗-IL17样品中的蛋白质浓度(mg/mL)
实施例9.评估用于纯化表达外源FkpA的大肠杆菌中产生的多肽的混合模式阴离子交换层析法
表31抗-IL13/抗-IL17样品中的蛋白质浓度(mg/mL)
实施例9.评估用于纯化表达外源FkpA的大肠杆菌中产生的多肽的混合模式阴离子交换层析法
[0590] 高通量筛选表明，与传统阴离子交换层析法(例如QSFF层析法)相比，混合模式阴离子交换层析法提高了产物相关杂质的分辨率(图37)。通过QSFF层析法很少或没有抗IL17单体被分离，但使用混合模式层析法观察到改善的抗IL13单体和抗IL17二聚体物质的分离。
[0591] 评估混合模式层析法在纯化双特异性抗体中的用途。在评估的一个环节中，结合IL13或IL17的半抗体分别在细菌培养物中制备。然后使结合IL13或IL17的半抗体进行使用蛋白A层析法(MabSelect SuReTM层析法)的亲和层析法。然后组装部分纯化的抗体以形成如上所述结合IL13和IL17的双特异性抗体。使组装的双特异性抗体进行QSFF阴离子交换层析TM TM法，然后进行Capto Adhere混合模式阴离子交换层析法(训练1)或进行Capto Adhere混合模式阴离子交换层析法，然后进行QSFF阴离子交换层析法(训练2)。结果列于表32。
表32.产物质量
表32.产物质量
[0592] 在阴离子交换层析法之前使组装的双特异性抗体进行混合模式阴离子层析法通常导致改善的产物变体去除。
[0593] 方法相关杂质的清除如表33所示。表33.方法相关的杂质
[0594] 当混合模式先于阴离子交换层析法时，观察到改善的杂质清除，如使用训练2纯化的物质中杂质含量较低所示。
[0595] 结合和洗脱QSFF阴离子交换条件如下：用50mM Tris，pH8.5平衡柱。将调节至pH 8.5且≤1.8mS/cm的组装池(训练1)或CaptoTMAdhere洗脱池(训练2)加载到柱上，使加载密度为每L填充树脂中≤20g蛋白质，用平衡缓冲液洗涤，然后用第二次洗涤缓冲液(含有5mM乙酸钠的50mM Tris，pH8.5)洗涤。通过增加缓冲液(含有139mM乙酸钠的50mM Tris，pH8.5)的电导率洗脱双特异性抗体。基于280nm处的吸光度开始和终止汇集。
[0596] 结合和洗脱CaptoTM Adhere混合模式阴离子交换条件如下：用50mM乙酸盐，pH6.5平衡柱。将调节至pH 6.5且≤7.0mS/cm的QSFF洗脱池(训练1)或组装池(训练2)加载到柱上，使加载密度为每L填充树脂中≤24g蛋白质，用平衡缓冲液洗涤，然后用第二次洗涤缓冲液(200mM乙酸盐，pH6.5)洗涤。通过降低缓冲液(25mM乙酸盐，pH 5.2)的pH来洗脱双特异性抗体。基于280nm处的吸光度开始和终止汇集。实施例10.筛选用于降低FkpA的HIC树脂
[0597] 筛选许多用于降低多肽产物如双特异性抗体产物中FkpA的HIC树脂。树脂包括BakerbondTMWP Hi-Propyl、CaptoTMOctyl、CaptoTMButyl、 Hexyl-650C、PPG-600M、 Phenyl-650M、 Butyl-650M和
Ether-650M。Hexyl 650C在流经模式下产生最低的FkpA水平，其次是
Butyl(图38和39)。进行机器人高通量筛选以评估在不同盐类型和浓度以及pH条
件下产物和FkpA与这些树脂的批次结合。检查了三种不同的kosmotropic盐以确定盐类型对选择性的影响。测试的盐和浓度范围如下：100-800mM乙酸钠、100-400mM硫酸钠、500-
2000mM氯化钠。另外，评估5.0-7.0的pH范围。用约50μL树脂填充96孔膜底板的每孔，并对每个实验在适当的结合条件(盐类型、盐浓度、pH)下平衡。将含有调节至相应结合条件的FkpA的部分纯化的产物池(即起始加载物质/进料)施加至每个孔，以达到每1μL树脂50μg产物的加载密度。在混合和孵育以达到平衡之后，收集上清液并分析相对的产物和FkpA含量以评估相对于起始加载物质/进料所获得的产物的富集。Hexyl 650C在流经模式下产生最低的TM
FkpA水平，其次是Capto Butyl。
实施例11.方法版本
Ether-650M。Hexyl 650C在流经模式下产生最低的FkpA水平，其次是
Butyl(图38和39)。进行机器人高通量筛选以评估在不同盐类型和浓度以及pH条
件下产物和FkpA与这些树脂的批次结合。检查了三种不同的kosmotropic盐以确定盐类型对选择性的影响。测试的盐和浓度范围如下：100-800mM乙酸钠、100-400mM硫酸钠、500-
2000mM氯化钠。另外，评估5.0-7.0的pH范围。用约50μL树脂填充96孔膜底板的每孔，并对每个实验在适当的结合条件(盐类型、盐浓度、pH)下平衡。将含有调节至相应结合条件的FkpA的部分纯化的产物池(即起始加载物质/进料)施加至每个孔，以达到每1μL树脂50μg产物的加载密度。在混合和孵育以达到平衡之后，收集上清液并分析相对的产物和FkpA含量以评估相对于起始加载物质/进料所获得的产物的富集。Hexyl 650C在流经模式下产生最低的TM
FkpA水平，其次是Capto Butyl。
实施例11.方法版本
[0598] 评估了多个方法版本。在方法的第一个例子中，在大肠杆菌中产生半抗体。参见图40A。通过微流器匀浆每个半抗体的大肠杆菌全部细胞肉汤。用水稀释每个匀浆池并用PEI调整并在室温下孵育。随后离心调整的匀浆池以分离固体，随后通过一系列滤器过滤含有半抗体的离心分离液。然后使半抗体进行使用蛋白A层析柱(MabSelect SuReTM)的亲和纯化。然后如上所述通过组合亲和纯化的半抗体组装双特异性抗体。对于第一方法(方法1)，使组装的双特异性抗体进行结合和洗脱模式的混合模式阴离子交换层析法(CaptoTM Adhere)，然后进行结合和洗脱模式的阴离子交换层析法(Q Fast Flow)。然后
使回收的级分进行流经模式的HIC(Phenyl 6 Fast Flow，high sub)。最后，
使双特异性抗体进行超滤和渗滤以配制双特异性抗体。在方法的另一个实例中(方法2)(图
40B)，如上所述制备组装的双特异性抗体，使其进行混合模式阴离子交换层析法(CaptoTM Adhere)，然后进行结合和洗脱模式的阴离子交换层析法(Q Fast Flow)。然后
使回收的级分进行流经模式的HIC(Phenyl 6 Fast Flow，high sub)和结合
和洗脱模式的阳离子交换层析法( 50 HS)。最后，使双特异性抗体进行超滤和渗
滤以配制双特异性抗体。
使回收的级分进行流经模式的HIC(Phenyl 6 Fast Flow，high sub)。最后，
使双特异性抗体进行超滤和渗滤以配制双特异性抗体。在方法的另一个实例中(方法2)(图
40B)，如上所述制备组装的双特异性抗体，使其进行混合模式阴离子交换层析法(CaptoTM Adhere)，然后进行结合和洗脱模式的阴离子交换层析法(Q Fast Flow)。然后
使回收的级分进行流经模式的HIC(Phenyl 6 Fast Flow，high sub)和结合
和洗脱模式的阳离子交换层析法( 50 HS)。最后，使双特异性抗体进行超滤和渗
滤以配制双特异性抗体。
[0599] 在第三方法(方法3，图40C)中，如上所述组装双特异性抗体，然后使其进行混合模式阴离子交换层析法(CaptoTM Adhere)，然后进行结合和洗脱模式的阴离子交换层析法(QFast Flow)，和流经模式的HIC(Hexyl 650C)。最后，使双特异性抗体进行超滤和渗滤以配制双特异性抗体。
[0600] 在第四方法(方法4，图40D)中，如上所述组装双特异性抗体，然后使其进行结合和洗脱模式的混合模式阴离子交换层析法(CaptoTM Adhere)，然后进行结合和洗脱模式的阴离子交换层析法(Q Fast Flow)和结合和洗脱模式的陶瓷羟磷灰石层析法(CHT I型，80μm)。
[0601] 最后，对于方法1-3，使双特异性抗体进行超滤和渗滤以配制双特异性抗体。
[0602] 然后使用MabSelect SuReTM树脂(GE Healthcare Life Sciences)在亲和层析柱上分别捕获各半抗体。柱平衡后，将离心分离液加载到柱上，用平衡缓冲液和第二次洗涤缓冲液洗涤。在酸性条件下(pH 2.8)从柱上洗脱半抗体。CaptoTMAdhere方法：
[0603] 结合和洗脱CaptoTM Adhere混合模式阴离子交换条件如下：用50mM乙酸盐，pH6.5平衡柱。将调节至pH6.5和6.5mS/cm的组装池加载到柱上，使加载密度为每L填充树脂中≤20g蛋白质，用平衡缓冲液洗涤，然后用第二次洗涤缓冲液(200mM乙酸盐，pH 6.5)洗涤。通过降低缓冲液(25mM乙酸盐，pH 5.2)的pH来洗脱双特异性抗体。基于280nm处的吸光度开始和终止汇集。
Q FF方法：
Q FF方法：
[0604] 结合和洗脱QSFF阴离子交换条件如下：用50mM Tris，pH8.5平衡柱。将调节至pH8.5的CaptoTM Adhere洗脱池加载到柱上，使加载密度为每L填充树脂中≤50g蛋白质，并用平衡缓冲液洗涤。通过增加缓冲液(含有100mM乙酸钠的50mM Tris，pH8.5)的电导率来洗脱双特异性抗体。基于280nm处的吸光度开始和终止汇集。Phenyl 方法：
[0605] 流经Phenyl 6Fast Flow(high sub)HIC条件如下：用170mM乙酸盐，pH5.5平衡柱。将调整的pH 5.5的QSFF洗脱池加载到柱上。抗IL13/抗IL17双特异性抗体流经，然后用平衡缓冲液洗涤柱。基于280nm处的吸光度开始和终止产物池收集。
HS 50方法：
HS 50方法：
[0606] 结合和洗脱 HS 50阳离子交换条件如下：柱用50mM乙酸盐，pH 5.5平衡。将调节至5.0mS/cm的Phenyl 流经池加载到柱上，使加载密度为每L填充
树脂中≤20g蛋白质，用平衡缓冲液洗涤，然后用第二次洗涤缓冲液(50mM醋酸盐，pH 5.8)洗涤。通过增加22个柱体积(CV)中从10-100％B的线性梯度(A：WFI，B：500mM乙酸盐，pH
5.8)中的电导率来洗脱双特异性抗体。基于280nm处的吸光度开始和终止汇集。
Hexyl-650C方法：
树脂中≤20g蛋白质，用平衡缓冲液洗涤，然后用第二次洗涤缓冲液(50mM醋酸盐，pH 5.8)洗涤。通过增加22个柱体积(CV)中从10-100％B的线性梯度(A：WFI，B：500mM乙酸盐，pH
5.8)中的电导率来洗脱双特异性抗体。基于280nm处的吸光度开始和终止汇集。
Hexyl-650C方法：
[0607] 流经Hexyl-650C HIC条件如下：用具有125mM乙酸钠，pH7.0的50mM MOPS平衡柱。将调整的pH7.0的QSFF洗脱池加载到柱上。抗IL13/抗IL17双特异性抗体流经，然后用平衡缓冲液洗涤柱。基于280nm处的吸光度开始和终止产物池收集。
CHT I型方法：
CHT I型方法：
[0608] 结合和洗脱CHT I型陶瓷羟磷灰石层析法条件如下：用10mM磷酸钠，pH6.8平衡柱。将调整为含有10mM磷酸钠，pH6.8的QSFF洗脱池加载到柱上，使加载密度为每L填充树脂中≤25g蛋白质，并用平衡缓冲液洗涤。通过增加20个柱体积(CV)中从0-100％B的线性梯度(A：平衡缓冲液，B：含有1M氯化钠，pH6.8的10mM磷酸钠)中的电导率来洗脱双特异性抗体。
基于280nm处的吸光度开始和终止汇集。
基于280nm处的吸光度开始和终止汇集。
[0609] 以下表34中示出了这些示例性方法(方法1-4)中的每个的最终柱池中的总收率和产物质量数据：表34.产物质量
*：N＝1运行分析
n.a.:数据不可用
实施例12.纯化αA/αB
*：N＝1运行分析
n.a.:数据不可用
实施例12.纯化αA/αB
[0610] 组装和纯化结合两种抗原(A和B)的双特异性抗体。如上针对抗IL13/抗IL17双特异性抗体(参见实施例6)所述，在过表达FkpA、DsbA和DsbC的大肠杆菌中产生抗A和抗B半抗体。抗A半抗体包含Fc区中的“杵”氨基酸取代，抗B半抗体包含“臼”氨基酸取代。
[0611] 通过微流器分别匀浆每个半抗体的全部肉汤。然后用水稀释每个匀浆池并用PEI调整并在室温下孵育。随后离心该调整的匀浆池以分离固体，然后通过一系列滤器过滤含有半抗体的离心分离液。
[0612] 然后使用MabSelect SuReTM树脂(GE Healthcare Life Sciences)将各半抗体分别捕获在亲和层析柱上。柱平衡后，将离心分离液加载到柱上，用平衡缓冲液和第二次洗涤缓冲液洗涤。在酸性条件下(pH 2.8<3)从柱中洗脱半抗体。
[0613] 通过组合等质量的每个半抗体而组装双特异性抗体。将样品滴定至pH8.4。相对于从组装方法预期的双特异性抗体的理论最大量，将100x过量摩尔比的还原L-谷胱甘肽(GSH)加入到混合物中，并将温度从室温调节至35℃。两个半抗体在体外氧化还原反应中组装形成双特异性抗体。氧化还原反应在35℃持续20小时。通过将pH调节至6.5来淬灭组装反应，并且在进行下述纯化方法之前用水稀释池。
[0614] 然后使组装的双特异性抗体进行CaptoTM Adhere混合模式阴离子交换层析法。结合和洗脱CaptoTM Adhere混合模式阴离子交换条件如下：用含有50mM乙酸钠，pH6.5的2mM MES平衡柱。将调节至pH6.5和6.5mS/cm的组装池加载到柱上，使加载密度为每L填充树脂中≤20g蛋白质，用平衡缓冲液洗涤，然后用第二次洗涤缓冲液(6mM MES，含150mM醋酸盐，pH6.5)洗涤。通过降低缓冲液(25mM乙酸盐，pH5.0)的pH来洗脱双特异性抗体。基于280nm处的吸光度开始和终止汇集。
[0615] 将汇集的CaptoTM Adhere洗脱液调节至pH 8.5，并以结合和洗脱模式经过QSFF阴离子交换层析柱纯化。结合和洗脱QSFF阴离子交换条件如下：用50mM Tris，pH8.5平衡柱。将调整的CaptoTM Adhere洗脱池加载到柱上，使加载密度为每L填充树脂中41g蛋白质，并用平衡缓冲液洗涤。通过增加缓冲液(具有100mM乙酸钠的50mM Tris，pH8.5)的电导率来洗脱双特异性抗体。基于280nm处的吸光度开始和终止汇集。
[0616] 然后使调节至pH 5.5的QSFF洗脱液进行流经模式的phenyl HS层析法。流经Phenyl 6 Fast Flow(high sub)HIC条件如下：用170mM乙酸盐，pH
5.5平衡柱。将调整的QSFF洗脱池加载到柱上。双特异性抗体流经，然后用平衡缓冲液洗涤柱。基于280nm处的吸光度开始和终止产物池收集。然后浓缩Phenyl 池并使用
超滤/渗滤(UF/DF)进行缓冲液交换。分析抗A/抗B双特异性抗体存在的杂质，包括非配对的半抗体、同二聚体、低分子量物质(LMWS)、高分子量物质(HMWS)、极高分子量物质(vHMWS)、酸性变体、碱性变体、FkpA、DsbA、DsbC、ECP、浸出的蛋白A、大肠杆菌DNA和内毒素。产物质量和方法性能(如％产率所示)详见表35。
表35.抗A/抗B产物质量和方法性能
序列
除非另有说明，否则氨基酸序列以N末端至C末端表示，核酸序列以5'至3'表示。
大肠杆菌FkpA
氨基酸序列–无前导序列
氨基酸序列–全长序列
核酸序列
5.5平衡柱。将调整的QSFF洗脱池加载到柱上。双特异性抗体流经，然后用平衡缓冲液洗涤柱。基于280nm处的吸光度开始和终止产物池收集。然后浓缩Phenyl 池并使用
超滤/渗滤(UF/DF)进行缓冲液交换。分析抗A/抗B双特异性抗体存在的杂质，包括非配对的半抗体、同二聚体、低分子量物质(LMWS)、高分子量物质(HMWS)、极高分子量物质(vHMWS)、酸性变体、碱性变体、FkpA、DsbA、DsbC、ECP、浸出的蛋白A、大肠杆菌DNA和内毒素。产物质量和方法性能(如％产率所示)详见表35。
表35.抗A/抗B产物质量和方法性能
序列
除非另有说明，否则氨基酸序列以N末端至C末端表示，核酸序列以5'至3'表示。
大肠杆菌FkpA
氨基酸序列–无前导序列
氨基酸序列–全长序列
核酸序列
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 电光显示器 | 2020-05-14 | 946 |
| 电子纸装置 | 2020-05-15 | 51 |
| 介电电泳装置及方法 | 2020-05-15 | 220 |
| 电光显示器 | 2020-05-15 | 140 |
| 电泳显示面板 | 2020-05-14 | 152 |
| 光诱导介电泳辅助单细胞介电谱自动测试装置及测试方法 | 2020-05-12 | 653 |
| 电泳显示装置及其制作方法 | 2020-05-13 | 466 |
| 一种柔性彩色电泳显示器及其制备方法 | 2020-05-15 | 321 |
| 一种基于介电泳力驱动的纳米颗粒分类装置 | 2020-05-12 | 975 |
| 基于复合介电泳的单细胞介电谱自动测试装置 | 2020-05-11 | 368 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈