技术领域
[0001] 本
发明涉及一种坤灵丸的质量检测方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
[0002] 坤灵丸是一种中药复方制剂，其功能主治为调经养血，逐瘀生新。用于月经不调，或多或少，行经腹痛，子宫寒冷，久不受孕，习惯性流产，赤白带下，崩漏不止，病久气虚，肾亏腰痛。
[0004] 【处方】
[0005] (一)香附(制)37g 甘草7g 白薇14g 益母草14g 黄芪14g 鸡冠花14g 麦冬14g 北五味子14g 地黄14g 红花14g 木通10g 白术(炒)14g 赤石脂14g茯苓14g 厚朴
10g 肉苁蓉(制)14g 白芍(酒炒)14g
[0006] (二)香附(制)37g 荆芥10g 牡丹皮14g 阿胶14g 当归14g 藁本10g 红参14g 鹿
角胶14g 川贝母14g 没药(炒)14g 砂仁14g 延胡索14g 小茴香(盐制)14g 龟甲胶14g 川芎14g
[0007] 【制法】以上处方(一)十七味，加
水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并煎液，滤过，滤液放置24小时，取上清液加入米醋280g，浓缩成稠膏。以上处方(二)十五味，
粉碎成中粉，加入上述稠膏中，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀，用黄酒泛丸，制成1800丸，包糖衣或
薄膜衣，打光，干燥，即得。
[0008] 由于中药化学成分复杂，作用机制不明确，致使现有中药制药技术难以确保中药产品质量
稳定性，坤灵丸现行标准收载于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》第十册，标准中未涉及任何针对药味的定性定量控制项目，
发明人对坤灵丸的有效成分进行了研究。发现其中含有多种
水溶性与醇溶性成分，本发明人有针对性的对这些成分进行了研究，建立了一种坤灵丸的检测方法，对生产中的坤灵丸进行质量监督，以确保产品质量。
发明内容
[0009] 本发明目的在于提供一种坤灵丸的质量检测方法，为该制剂的质量控制提供更完善的检测方法。
[0010] 本发明所述的质量检测方法，包括
鉴别方法和含量测定方法。
[0011] 本发明首先提供一种坤灵丸的鉴别方法，该方法包括对以下中药的鉴别：
[0012] A 牡丹皮鉴别
[0013] B 当归-川芎-藁本鉴别
[0014] C 延胡索鉴别
[0015] D 白芍鉴别
[0016] E 红参鉴别
[0017] F 香附鉴别
[0018] 本发明的鉴别方法采用薄层色谱法，共有6项，可以使用其中一项作为对坤灵丸的鉴别方法，也可以多项组合使用作为对坤灵丸的鉴别方法，优选的是多项组合使用，最优选的是6项组合使用。
[0019] 其次，本发明还包括对坤灵丸中的有效成分丹皮酚进行含量测定，含量测定方法采用高效液相色谱法。
[0020] 本发明的鉴别方法，优选采用以下方法：
[0021] A牡丹皮鉴别
[0022] 供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸8g～12g、糖衣丸12～18g，采用研细方式，加稀
盐酸1～4ml，加乙醚20～50ml，加热回流15～40min，滤过，滤液回收
溶剂至干，残渣加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为供试品溶液。
[0023] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材0.8～1.2g，加稀盐酸1～4ml，加乙醚20～50ml，加热回流15～40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为对照药材溶液。
[0024] 对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每1ml含0.8～1.2mg的溶液，摇匀，即得。
[0025] 阴性样品溶液的制备：通过查询文献，白芍中也含有微量的丹皮酚，故按处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
[0026] 鉴别：照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述供试品溶液5～10μl、对照药材溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一
硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(5～3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化
铁乙醇溶液(每100ml 5％三氯化铁乙醇溶液中，加入盐酸1～5滴，混匀，即得)。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的
位置上，显相同
颜色的斑点，阴性样品无干扰。见
附图(1)。
[0027] B当归-川芎-藁本鉴别
[0028] 供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备。
[0029] 对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各0.8～1.2g，分别加乙醚20～50ml，水浴回流15～40min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶液。
[0030] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
[0031] 鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-
甲酸(95～70：5～30：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的
荧光斑点，阴性样品无干扰。见附图(2)。
[0032] C延胡索鉴别
[0033] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取1.5～2.5g，加0.1～0.3mol/L的氢
氧化钠溶液5～15ml，超声15～25min后，加入乙酸乙酯5～20ml，振摇萃取，2000～3000转/min离心3～10min，取上清液，即得。
[0034] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0.3～1.0g于20～100ml圆底烧瓶中，加
氨水0.3～0.8ml浸润，加二氯甲烷5～15ml，50℃～70℃水浴回流0.5～1h，滤过，挥干，用甲醇1～3ml溶解，即得。
[0035] 对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.15～0.25mg的溶液，作为对照品溶液。
[0036] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液。
[0037] 鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5～10μl、对照品溶液2～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨(5～8∶2～5∶0.5～1.5∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上
吸附的碘后，置紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。见附图(3)。
[0038] D白芍鉴别
[0039] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸12～18g(糖衣丸15～20g)，加甲醇30～70ml，加热回流0.5～1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15～25ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2～3次，每次15～25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液3～
8ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗2～3次，每次10～20ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇1～3ml溶解，作为供试品溶液。
[0040] 对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.8～1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0041] 阴性样品溶液的制备：通过文献查阅发现，处方中牡丹皮与白芍同属毛茛科
植物，其主要成分中亦含芍药苷，故按处方配比，取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰。
[0042] 鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10～20μl、对照品溶液5～15μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(30～45:3～6:5～15:0.4)为展开剂，展开，取出，喷以1％～5％香草
醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附图(4)。
[0043] E红参鉴别
[0044] 供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液。
[0045] 对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re各0.8～1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0046] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材0.8～1.2g，以下操作同供试品溶液处理方法，作为对照药材溶液。
[0047] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液。
[0048] 鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15～20μl、对照药材溶液及对照品溶液5～20μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板(烟台板)上，以三氯甲烷-甲醇-水(50～70:20～40:5～20)5～10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以5～10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见附图(5)。
[0049] F香附鉴别
[0050] 供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液。
[0051] 对照品溶液的制备：取α-香附
酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附酮0.8～1.2mg的溶液，作为对照品溶液。
[0052] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材0.8～1.2g，加入稀盐酸1～3ml，加乙醚20～40ml回流20～40min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇1～3ml复溶，即得。
[0053] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液。
[0054] 鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20μl、糖衣丸供试品溶液20-25μl、对照品溶液1-10μl和对照药材溶液10-20μl点于同一高效硅胶G薄层板(Macherey-Nagel F254高效薄层板)上，以
甲苯-乙酸乙酯-甲酸(85～95：3～8：3～8)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察。在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见附图(6)。
[0055] 本发明的含量测定方法，所述的丹皮酚含量测定方法，步骤如下：
[0056] ①供试品溶液的制备：取坤灵丸，粉碎后加入50～70％甲醇溶液中，超声处理后加50～70％甲醇溶液定容至刻度，过微孔滤膜，即得；
[0057] ②对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加50％～70％甲醇溶液制成每1ml含14～18μg丹皮酚的溶液，即得；
[0058] ③含量测定：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量，必要时可以使用阴性对照品溶液以排除干扰；
[0059] 其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂为以下填充剂的一种Shimadzu VP-ODS150×4.6mm色谱柱、Dikma Diamomsil-C185μm,250×4.6mm色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C185μm,250×4.6mm，色谱柱及Waters2695-2489、Waters 2695-PDA；以30～60∶70～40的甲醇-水为流动相；检测
波长为270～278nm；流速0.6～1.5ml/min；柱温25～35℃，进样量5～15μl。
[0060] 优选的，本发明的含量测定方法如下：
[0061] 对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％～70％甲醇水溶液制成每1ml约含14～18μg的溶液，即得。
[0062] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.4～0.6g，精密称定，置10～25ml容量瓶中，加入50～70％甲醇溶液适量，超声(功率120W，
频率40kHz)处理15～30min，放冷至室温，加50～70％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
[0063] 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、牡丹皮-白芍阴性供试品溶液各5～10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
[0064] 高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Shimadzu VP-ODS(150×4.6mm)，色谱柱、Dikma Diamomsil-C18(5μm,250×4.6mm),色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,250×4.6mm),色谱柱及Waters2695-2489、Waters 2695-PDA)；以甲醇-水(30～60∶70～40)为流动相；检测波长为270～278nm；流速0.6～1.5ml/min；柱温25～35℃，进样量5～15μl。
[0065] 其中优选：高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-C185μm，4.6×250mm)；以甲醇-水(30～60∶70～40)为流动相；检测波长为270～278nm；流速0.6～1.5ml/min；柱温25～35℃，进样量5～15μl。
[0066] 最优选，以50∶50甲醇-水为流动相；检测波长为274nm；流速1ml/min；柱温30℃，进样量10μl；
[0067] 对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成每1ml约含16μg的溶液，即得；
[0068] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入50％甲醇溶液适量，120W、40kHz超声处理20min，放冷至室温，加50％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
[0069] 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
[0070] 测定结果见图(7)、(8)、(9)、(10)。结果显示，阴性样品无干扰。
[0071] 本发明含量测定方法的验证：
[0072] 1仪器与试药
[0073] Waters 2695-2489高效液相色谱仪及紫外检测器；Empower2液相色谱工作站；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(5μm，250×4.6mm)；甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)；水为超纯水(公司自制，MilliQ)；对照品：丹皮酚对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110708-200506)。
[0074] 2线性关系考察
[0075] 取丹皮酚对照品适量，精密称定(实际称样量：12.73mg)，置于100ml容量瓶中，加50％甲醇溶解，稀释并定容至刻度，摇匀即得对照品母液(0.1273mg/ml)。将丹皮酚对照品母液依次稀释得到浓度为0.0636mg/ml、0.0318mg/ml、0.0159mg/ml、0.0080mg/ml、0.0040mg/ml、0.0020mg/ml的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液及对照品母液各
10μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图。以丹皮酚的对照品浓度(mg/ml)为横坐标，丹皮酚峰面积为纵坐标，求得回归方程：y＝48644921.31x+10376.05，r＝0.9999。结果表明丹皮酚在0.0020mg/ml～0.1273mg/ml浓度范围内，线性良好。
[0077] 取坤灵丸样品适量(薄膜衣丸，批号：20121101；糖衣丸，批号：20120901)，按照“
实施例7”项下方法制备供试品溶液。精密吸取上述两种供试品溶液10μl，连续进样6针，测得薄膜衣丸峰面积平均值为779400，RSD为0.47％；糖衣丸峰面积平均值为867291，RSD为0.42％。结果表明，供试品溶液在该色谱条件下进行丹皮酚含量测定时，精密度良好。
[0078] 4重复性试验
[0079] 取坤灵丸样品适量(薄膜衣丸，批号：20121101；糖衣丸，批号：20120901)，研细，取0.5g，精密称定，共6份，照“实施例7”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取上述供试品溶液及对照品溶液各10μl，进样分析。记录色谱图，并计算丹皮酚的含量。结果薄膜衣丸样品中丹皮酚平均含量为0.8220mg/g，RSD为1.10％；糖衣丸样品中丹皮酚平均含量为0.8958mg/g，RSD为0.24％。结果表明，方法的重复性良好。
[0080] 5稳定性试验
[0081] 取坤灵丸样品适量(薄膜衣丸，批号：20121101；糖衣丸，批号：20120901)，照“实施例7”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取上述供试品溶液10μl，分别于0、2、8、12、16、24h进样分析，计算峰面积的相对平均偏差RSD，薄膜衣丸、糖衣丸RSD分别为0.66％、
0.47％。结果表明供试品溶液在24h内稳定。
[0082] 6加样回收率试验
[0083] 取坤灵丸样品适量(薄膜衣丸，批号：20121101；糖衣丸，批号：20120901)，研细，取0.25g，精密称定。向已知丹皮酚含量的样品中加入该样品所含丹皮酚含量的80％、100％、120％的丹皮酚对照品，每个浓度各3份，共9份，按“实施例7”项下供试品溶液制备方法处理。分别精密吸取上述供试品溶液10μl，进样分析，记录色谱图，计算回收率，薄膜衣丸平均回收率为103.4％，RSD为0.67％；糖衣丸平均回收率为102.2％，RSD为1.19％。
见表1、表2，结果符合含量测定有关要求，说明该方法准确度良好。
[0084] 表1 薄膜衣丸加样回收率试验
[0085]
[0086]
[0087] 注：薄膜衣丸中丹皮酚含量按照重复性项下含量0.8220mg/g计算。
[0088] 表2 糖衣丸加样回收率试验
[0089]
[0090]
[0091] 注：糖衣丸中丹皮酚含量按照重复性项下含量0.8958mg/g计算。
[0092] 7样品测定
[0093] 分别选取坤灵丸样品三批(薄膜衣丸，批号：20121001、20121101、20130112；糖衣丸，批号：20120901、20120904、20130101)，按“实施例7”项下供试品溶液制备方法处理。分别精密吸取上述供试品溶液10μl，进样分析，记录色谱图，计算含量，结果见表3、4。
[0094] 表3 薄膜衣丸样品测定
[0095]
[0096] 表4 糖衣丸样品测定
[0097]
[0098] 本发明的有益效果在于：
[0099] 本发明中涉及的8味药材的薄层鉴别，除延胡索鉴别需单独处理供试品外，其中牡丹皮、当归、川芎、藁本、香附5味药材鉴别可采用同一供试品溶液，白芍、红参2味药材鉴别可采用同一供试品溶液，本方法既节省样品取样量，又节省溶剂、环保经济、污染小。
[0100] 丹皮酚含量测定方法考察中，考虑不同厂家色谱柱及不同实验室的仪器 设 施因 素，另 分别 考 察了Shimadzu VP-ODS(150×4.6mm)，色 谱 柱、Dikma Diamomsil-C18(5μm,250×4.6mm),色谱柱、Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,250×4.6mm),色谱柱及Waters2695-2489、Waters 2695-PDA高效液相色谱仪的分离情况，结果均满足要求。
[0101] 本发明所提供的坤灵丸的质量检测方法，是通过大量具体创造性试验筛选后得到的，鉴别方法中通过对样品处理方法的筛选，展开剂的选择，使得鉴别专属性好，且方法简便快捷、经济实用、结果快速。含量测定方法中通过对供试品处理方法及色谱条件的考察，证明本方法具有良好的重复性、稳定性、专属性及耐用性，该含量测定方法可有效的对产品进行质量分析，保证了该产品的质量稳定性。
附图说明
[0102] 图1、从左到右：糖衣丸样品(20120903)、牡丹皮阴性样品、丹皮酚对照品(中检院)、牡丹皮对照药材(中检院)、薄膜衣丸样品(20120809)、薄膜衣丸样品(20121002)、薄膜衣丸样品(20121102)、薄膜衣丸样品(20130103)；
[0103] 图2、从左到右：薄膜衣丸20121002、薄膜衣20120809、当归对照药材(中检院)、川芎对照药材(中检院)、藁本对照药材(中检院)、薄膜衣丸20121102、糖衣丸20120903；
[0104] 图3、从左到右：薄膜衣丸20121101、薄膜衣丸20130102、薄膜衣丸20121001、薄膜衣丸20120809、阴性样品、延胡索乙素(中检院)、延胡索对照药材(中检院)、糖衣丸20120903、薄膜衣20121102、薄膜衣丸20121002；
[0105] 图4、从左到右：薄膜衣丸20130103、薄膜衣丸20121105、薄膜衣丸20121103、芍药苷对照品(中检院)、双阴性样品、糖衣丸20120901、糖衣丸20120904、糖衣丸20130101；
[0106] 图5、从左到右：薄膜衣20130103、薄膜衣丸20121105、薄膜衣丸20121103、红参阴性、人参皂苷Rg1+人参皂苷Rb1+人参皂苷Re混合对照品(中检院)、红参对照药材(中检院)、糖衣丸20120901、糖衣丸20120904、糖衣丸20130101；
[0107] 图6、从左到右：香附阴性、香附对照药材(中检院)、薄膜衣丸20130101、糖衣丸20120901、α-香附酮对照品；
[0108] 图7、牡丹皮-白芍阴性供试品溶液；
[0109] 图8、丹皮酚对照品溶液；
[0110] 图9、薄膜衣丸供试品溶液；
[0111] 图10、糖衣丸供试品溶液。
具体实施方式
[0112] 下述实施例用于进一步说明但不限于本发明。
[0113] 实施例1牡丹皮鉴别
[0114] 供试品溶液的制备：取坤灵丸素丸10g，(薄膜衣丸10g：含牡丹皮、延胡索、当归、川芎、白芍约为0.5g；约含藁本0.35g；糖衣丸15g：含牡丹皮、延胡索、当归、川芎、白芍约为0.4g；约含藁本0.3g)，采用研细方式，加稀盐酸2ml，加乙醚30ml，加热回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。
[0115] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1.0g，加稀盐酸1ml，加乙醚30ml，加热回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为对照药材溶液。
[0116] 对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，摇匀，即得。
[0117] 阴性样品溶液的制备：通过查询文献，白芍中也含有微量的丹皮酚，故按处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
[0118] 鉴别：照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述供试品溶液5～10μl、对照药材溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液(每100ml 5％三氯化铁乙醇溶液中，加入盐酸3滴，混匀，即得)。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附图(1)。
[0119] 实施例2当归-川芎-藁本鉴别
[0120] 供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备。
[0121] 对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各1.0g，分别加乙醚30ml，水浴回流30min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶液。
[0122] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按制备工艺制备样品，再供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
[0123] 鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸(90：15：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。见附图(2)。
[0124] 实施例3延胡索鉴别
[0125] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取2g，加0.2mol/L的氢氧化钠溶液10ml，超声20min后，加入乙酸乙酯10ml，振摇萃取，3000转/min离心5min，取上清液，即得。
[0126] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0.5g于50ml圆底烧瓶中，加氨水0.5ml浸润，加二氯甲烷10ml，60℃水浴回流1h，滤过，挥干，用甲醇2ml溶解，即得。
[0127] 对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液
[0128] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液。
[0129] 鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5～10μl、对照品溶液2～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨(7.5∶4∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(366nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。见附图(3)。
[0130] 实施例4白芍鉴别
[0131] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸15g(糖衣丸17g)，加甲醇50ml，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用氨试液5ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗2次，每次15ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇2ml溶解，作为供试品溶液。
[0132] 对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
[0133] 阴性样品溶液的制备：通过文献查阅发现，处方中牡丹皮与白芍同属毛茛科植物，其主要成分中亦含芍药苷，故按处方配比，取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰。
[0134] 鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10～20μl、对照品溶液5～15μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.4)为展开剂，展开，取出，喷以5％香草醛硫
酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。见附图(4)。
[0135] 实施例5红参鉴别
[0136] 供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液。
[0137] 对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re各1mg的溶液，作为对照品溶液。
[0138] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材1.0g，以下操作同供试品溶液制备，作为对照药材溶液。
[0139] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液。
[0140] 鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15～20μl、对照药材溶液及对照品溶液5～20μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板(烟台板)上，以三氯甲烷-甲醇-水(60:30:10)10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见附图(5)。
[0141] 实施例6香附鉴别
[0142] 供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液。
[0143] 对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附酮1mg的溶液，作为对照品溶液。
[0144] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材1g，加入稀盐酸1ml，加乙醚30ml回流30min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇2ml复溶，即得。
[0145] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液。
[0146] 鉴别：照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录ⅥB)试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20μl、糖衣丸供试品溶液20-25μl、对照品溶液1-10μl和对照药材溶液10-20μl点于同一高效硅胶G薄层板(Macherey-Nagel F254高效薄层板)上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(92：5：5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察。在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见附图(6)。
[0147] 实施例7丹皮酚含量测定
[0148] 高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-C185μm，4.6×250mm)；以甲醇-水(50∶50)为流动相；检测波长为274nm；流速1ml/min；柱温30℃，进样量10μl。
[0149] 对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成每1ml约含16μg的溶液，即得。
[0150] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入50％甲醇溶液适量，超声(功率120W，频率40kHz)处理20min，放冷至室温，加50％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
[0151] 测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。见附图(7)～(10)。
[0152] 实施例8
[0153] 坤灵丸的质量检测方法
[0154] 牡丹皮的鉴别
[0155] 供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸8g或糖衣丸12g，采用研细方式，加稀盐酸1ml，加乙醚20ml，加热回流15min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；
[0156] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材0.8g，加稀盐酸1ml，加乙醚20ml，加热回流15min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0157] 对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每1ml含0.8mg的溶液，摇匀，即得；
[0158] 阴性样品溶液的制备：按坤灵丸处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
[0159] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5μl、对照药材溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性样品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60℃，5∶1石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[0160] 当归、川芎、藁本薄层鉴别，步骤如下：
[0161] 供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备方法；
[0162] 对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各0.8g，分别加乙醚20ml，水浴回流15min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶；
[0163] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
[0164] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以95：5：1的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰；
[0165] 延胡索薄层鉴别，步骤如下：
[0166] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取1.5g，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液5ml，超声15min后，加入乙酸乙酯5ml，振摇萃取，2000转/min离心3min，取上清液，即得；
[0167] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0.3g于20ml圆底烧瓶中，加氨水0.3ml浸润，加二氯甲烷5ml，50℃水浴回流0.5h，滤过，挥干，用甲醇1ml溶解，即得；
[0168] 对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，作为对照品溶液；
[0169] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
[0170] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5∶2∶0.5∶0.1的正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置366nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰，
[0171] 白芍薄层鉴别，步骤如下：
[0172] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸12g或糖衣丸15g，加甲醇30ml，加热回流0.5h，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液3ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗2次，每次10ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇1ml溶解，作为供试品溶液；
[0173] 对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液；
[0174] 阴性样品溶液的制备：取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰；
[0175] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以30:3:5:0.4三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷以1％～5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，[0176] 红参薄层鉴别，步骤如下：
[0177] 供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液
[0178] 对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re各0.8mg的溶液，作为对照品溶液；
[0179] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材0.8g，以下操作同供试品溶液处理方法，作为对照药材溶液；
[0180] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
[0181] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15μl、对照药材溶液及对照品溶液5μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以50:20:5三氯甲烷-甲醇-水5℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以5％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[0182] 香附薄层鉴别，步骤如下：
[0183] 供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液；
[0184] 对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附酮0.8mg的溶液，作为对照品溶液；
[0185] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材0.8g，加入稀盐酸1ml，加乙醚20ml回流20min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇1ml复溶，即得；
[0186] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
[0187] 鉴别：照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10μl、糖衣丸供试品溶液20μl、对照品溶液1μl和对照药材溶液10μl点于同一高效硅胶G薄层板上，以85：3：3的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。
[0188] 实施例9
[0189] 坤灵丸的质量检测方法
[0190] 牡丹皮的鉴别
[0191] 供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸12g或糖衣丸18g，采用研细方式，加稀盐酸4ml，加乙醚50ml，加热回流40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯3ml使溶解，作为供试品溶液；
[0192] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1.2g，加稀盐酸4ml，加乙醚50ml，加热回流40min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯3ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0193] 对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每1ml含1.2mg的溶液，摇匀，即得；
[0194] 阴性样品溶液的制备：按坤灵丸处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
[0195] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液10μl、对照药材溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性样品溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以90℃，3∶1石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液；供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[0196] 当归、川芎、藁本薄层鉴别，步骤如下：
[0197] 供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备方法；
[0198] 对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各1.2g，分别加乙醚50ml，水浴回流40min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯3ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶；
[0199] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
[0200] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以70：30：1的正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰；
[0201] 延胡索薄层鉴别，步骤如下：
[0202] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取2.5g，加0.3mol/L的氢氧化钠溶液15ml，超声25min后，加入乙酸乙酯20ml，振摇萃取，3000转/min离心10min，取上清液，即得；
[0203] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材1.0g于100ml圆底烧瓶中，加氨水0.8ml浸润，加二氯甲烷15ml，70℃水浴回流1h，滤过，挥干，用甲醇3ml溶解，即得；
[0204] 对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；
[0205] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
[0206] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各10μl、对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8∶5∶1.5∶0.1的正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置366nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰，
[0207] 白芍薄层鉴别，步骤如下：
[0208] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸18g或糖衣丸20g，加甲醇70ml，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨试液8ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗3次，每次20ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇3ml溶解，作为供试品溶液；
[0209] 对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1.2mg的溶液，作为对照品溶液；
[0210] 阴性样品溶液的制备：取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液，结果阴性无干扰；
[0211] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各20μl、对照品溶液15μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以45:6:15:0.4三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷以1％～5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，[0212] 红参薄层鉴别，步骤如下：
[0213] 供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液
[0214] 对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re各1.2mg的溶液，作为对照品溶液；
[0215] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材1.2g，以下操作同供试品溶液处理方法，作为对照药材溶液；
[0216] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
[0217] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各20μl、对照药材溶液及对照品溶液20μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以70:40:20三氯甲烷-甲醇-水10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[0218] 香附薄层鉴别，步骤如下：
[0219] 供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液；
[0220] 对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附酮1.2mg的溶液，作为对照品溶液；
[0221] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材1.2g，加入稀盐酸3ml，加乙醚40ml回流40min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇3ml复溶，即得；
[0222] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
[0223] 鉴别：照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液20μl、糖衣丸供试品溶液25μl、对照品溶液10μl和对照药材溶液20μl点于同一高效硅胶G薄层板上，以95：8：8的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。
[0224] 实施例10
[0225] 坤灵丸的质量检测方法
[0226] 牡丹皮鉴别方法为：
[0227] 供试品溶液的制备：取坤灵丸薄膜衣丸10g或糖衣丸15g，采用研细方式，加稀盐酸2ml，加乙醚30ml，加热回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；
[0228] 对照药材溶液的制备：取牡丹皮对照药材1.0g，加稀盐酸1ml，加乙醚30ml，加热回流30min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0229] 对照品溶液的制备：取丹皮酚对照品适量，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，摇匀，即得；
[0230] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除牡丹皮、白芍外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液；
[0231] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5～10μl、对照药材溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以60～90℃的3∶1石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性5％三氯化铁乙醇溶液；
供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[0232] 当归、川芎、藁本鉴别
[0233] 供试品溶液的制备：同牡丹皮供试品溶液的制备；
[0234] 对照药材溶液的制备：分别取当归对照药材、川芎对照药材、藁本对照药材各1.0g，分别加乙醚30ml，水浴回流30min，取出，放冷，滤过，滤液回收乙醚至干，残渣分别加乙酸乙酯1ml使溶解，作为当归对照药材溶液，川芎对照药材溶液，藁本对照药材溶液；
[0235] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除当归、川芎、藁本外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液，
[0236] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及上述对照药材与阴性样品溶液各5～15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以90：15：1正己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。
[0237] 延胡索鉴别
[0238] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研成细粉，称取2g，加0.2mol/L的氢氧化钠溶液10ml，超声20min后，加入乙酸乙酯10ml，振摇萃取，3000转/min离心5min，取上清液，即得；
[0239] 对照药材溶液的制备：取延胡索对照药材0.5g于50ml圆底烧瓶中，加氨水0.5ml浸润，加二氯甲烷10ml，60℃水浴回流1h，滤过，挥干，用甲醇2ml溶解，即得；
[0240] 对照品溶液的制备：取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液；
[0241] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除延胡索外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法，制成缺延胡索的阴性样品溶液；
[0242] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液与阴性样品溶液各5～10μl、对照品溶液2～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以7.5∶4∶1∶0.1的正己烷-二氯甲烷-甲醇-浓氨为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点显色清晰后取出，挥尽板上吸附的碘后，置366nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰；
[0243] 白芍鉴别
[0244] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，研细，称取薄膜衣丸15g或糖衣丸17g，加甲醇50ml，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用氨试液5ml洗涤，用正丁醇饱和的水洗2次，每次15ml，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加无水乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；
[0245] 对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
[0246] 阴性样品溶液的制备：取除白芍、牡丹皮外的其他药材，按制备坤灵丸的工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成白芍、牡丹皮双阴性样品溶液；
[0247] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各10～20μl、对照品溶液5～15μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以40:5:10:0.4的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色，供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰；
[0248] 红参鉴别
[0249] 供试品溶液的制备：用白芍供试品溶液；
[0250] 对照品溶液的制备：取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品适量，加甲醇制成每1ml分别含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re各1mg的溶液，作为对照品溶液；
[0251] 对照药材溶液的制备：取红参对照药材1.0g，以下操作同供试品溶液制备，作为对照药材溶液；
[0252] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除红参外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成红参阴性样品溶液；
[0253] 鉴别：照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及阴性样品溶液各15～20μl、对照药材溶液及对照品溶液5～20μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以60:30:10的三氯甲烷-甲醇-水在10℃以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色，供试品色谱图中，在与对照品及对照药材色谱图相应的位置上，显示相同颜色的斑点，阴性样品无干扰
[0254] 香附鉴别
[0255] 供试品溶液的制备：用牡丹皮供试品溶液；
[0256] 对照品溶液的制备：取α-香附酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含有α-香附酮1mg的溶液，作为对照品溶液；
[0257] 对照药材溶液的制备：取香附对照药材1g，加入稀盐酸1ml，加乙醚30ml回流30min，放至室温，滤过，回收溶剂至近干，以乙醇2ml复溶，即得；
[0258] 阴性样品溶液的制备：按处方配比，取除香附外的其他药材，按坤灵丸的制备工艺制备样品，再按供试品溶液制备方法制成香附阴性样品溶液；
[0259] 鉴别：照薄层色谱法试验，取上述薄膜衣丸供试品溶液10-20μl、糖衣丸供试品溶液20-25μl、对照品溶液1-10μl和对照药材溶液10-20μl点于同一高效硅胶G薄层板上，以92：5：5的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以二硝基苯肼试液，放置片刻，在日光下观察，在供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。
[0260] 实施例11
[0261] 丹皮酚含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
[0262] 高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂为Shimadzu VP-ODS150×4.6mm，色谱柱；以30∶70的甲醇-水为流动相；检测波长为270nm；流速0.6ml/min；柱温25℃，进样量5μl；
[0263] 对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成每1ml约含14μg的溶液，即得；
[0264] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.4g，精密称定，置10ml容量瓶中，加入50％甲醇溶液适量，超声功率120W，频率40kHz处理15min，放冷至室温，加50％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
[0265] 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
[0266] 实施例12
[0267] 丹皮酚含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
[0268] 高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂为，Dikma Diamomsil-C185μm,250×4.6mm 3色谱柱；以60∶40的甲醇-水为流动相；检测波长为278nm；流速1.5ml/min；柱温35℃，进样量15μl；
[0269] 对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加70％甲醇水溶液制成每1ml约含18μg的溶液，即得；
[0270] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.6g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入70％甲醇溶液适量，超声功率120W，频率40kHz处理30min，放冷至室温，加70％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
[0271] 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
[0272] 实施例13
[0273] 丹皮酚含量测定方法为高效液相色谱法，步骤如下：
[0274] 高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，具体为Agilent ZORBAX SB-C185μm，4.6×250mm；
[0275] 以50∶50甲醇-水为流动相；检测波长为274nm；流速1ml/min；柱温30℃，进样量10μl；
[0276] 对照品溶液的制备取丹皮酚对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成每1ml约含16μg的溶液，即得；
[0277] 供试品溶液的制备：取坤灵丸适量，糖衣丸去掉糖衣，研细，取0.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入50％甲醇溶液适量，120W、40kHz超声处理20min，放冷至室温，加50％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；
[0278] 测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，经计算得到坤灵丸中丹皮酚的含量。
