技术领域
[0001] 本
发明涉及中药领域的药材质量分析，具体涉及一种HPLC(高效液相色谱)指纹图谱法对各类石斛药材的质量评价方法。
背景技术
[0002] 石斛是一种常用的滋补中药，主要为石斛属
植物。石斛属植物是兰科植物中最大的一个属，包括
铁皮石斛、金钗石斛、密花石斛、鼓槌石斛等多个品种。在全球范围内，约有1100多种石斛，其中在我国发现的有76种。石斛的药用价值历史悠久。早在古代，石斛在《神农本草经》中就被列为滋补上品，长久以来，随着时代的发展，石斛一直被人们视为珍贵的中草药，具有十分重要的滋补功效。在临床上，石斛被用于
治疗多种
疾病，具有增强免疫
力、抗
氧化、降血糖和抑制癌症等药理功效。由于人为长期无节制采挖及不合理利用石斛，其野生资源日趋减少，市场上出现了一些以假乱真、以次充好的现象。此外，由于石斛产品众多，品质也参差不齐，其品种间的杂交使得其近缘的品种存在性状交叉现象，分类区别比较困难。目前对石斛药材的质量评价局限于对个别或某几类成分的评价，评价结果较片面，不能从整体上进行评价秒，不能重复，很难推广应用，因此，有必要寻找一种操作方便，高效的测定方法对石斛鲜品、干品的药材质量进行评价。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种石斛药材的质量评价方法，解决对石斛药材的质量评价主要局限于对个别或某几类成分的质量评价，其评价方式较片面，不能重复，不足以系统、完整的表明石斛药材整体质量的技术问题。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现，具体包括如下步骤：
[0005] ①对照品溶液的制备：精密称取夏佛托苷，甲醇溶解稀释即可。
[0006] ②标准样品溶液的制备：取某一类不同批次的标准石斛药材干燥样品，
粉碎，过筛，精密称取石斛粉末，加入
水或一元醇溶解，室温下超声，过滤，滤液浓缩至干，再用甲醇溶解，容量瓶中定容，摇匀，微孔滤
膜过滤，即得该类石斛药材的标准样品溶液；
[0007] ③石斛药材HPLC指纹图谱的建立：Alltima C18色谱柱；
二极管阵列检测器；流动相为乙腈/乙酸—乙酸铵溶液，梯度洗脱；检测
波长为280±10nm；柱温25-35℃；流速0.8-1.2ml/min；在此条件下分析该类标准样品溶液，得到该类石斛药材的指纹图谱；
[0008] ④标准指纹图谱的建立：以对照样品夏佛托苷色谱峰作为指纹图谱的参照峰，计算该类标准石斛样品各特征峰的相对保留时间和保留峰面积，制定得到该类石斛的标准指纹图谱；
[0009] ⑤供试样品溶液的制备：取供试石斛药材干燥样品，粉碎，过筛，精密称取石斛粉末，加入水或一元醇溶解，室温下超声，过滤，滤液浓缩至干，再用甲醇溶解，容量瓶中定容，摇匀，微孔滤膜过滤，即得供试样品溶液；
[0010] ⑥石斛药材质量评价：按照步骤③测定供试样品的指纹图谱，以供试样品指纹图谱中的特征峰的相对保留时间和保留峰面积与该类标准指纹图谱对比，相似度＞0.85的为该类质量好的石斛药材，相似度＜0.6的为该类石斛药材的劣质品或是其他种类的石斛药材。
[0011] 进一步地，步骤①中所述的对照样品溶液制备过程为：精密称取夏佛托苷作为对照品，用75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)溶解稀释，制备成浓度为16.4μg/ml夏佛托苷溶液即为对照品溶液；
[0012] 进一步地，步骤①中所述的标准样品溶液的制备过程为：分别取该类不同批次的标准石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过筛，得石斛粉末，精密称取石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，加入50mL 75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇
溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，然后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得该类不同批次的标准石斛样品溶液；
[0013] 进一步地，步骤①中所述的供试样品溶液的制备过程为：取供试干燥样品，用粉碎机粉碎，过筛，得石斛粉末，精密称取石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，加入50mL75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用
75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，然后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试样品溶液；
[0014] 进一步地，精密称取石斛粉末的称量误差≤0.2％；
[0015] 进一步地，过筛为过孔径0.335mm的筛；
[0016] 进一步地，溶解加入的一元醇为甲醇或
乙醇；
[0017] 进一步地，室温超声时间为10-40min；
[0018] 进一步地，步骤③中采用高效液相色谱仪进行测定的色谱条件与系统适用性实验为：色谱柱：Alltima C18色谱柱(250mm×4.6mm，5um)；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：20ul；检测波长：280nm，参比波长500nm；流动相：包括流动相A和流动相B，流动相A为0.4％乙酸+20mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，并按一定的洗脱梯度进行洗脱，理论板数按夏佛托苷计算，应不低于10000。
[0019] 进一步地，步骤②中所述标准石斛为铁皮石斛、霍山石斛、兜唇石斛、齿瓣石斛、金钗石斛、叠鞘石斛、鼓槌石斛、环草石斛以及流苏石斛中的任意一种。
[0020] 进一步地，所述石斛的标准指纹图谱中含有11个特征峰，其中一个为夏佛托苷对照品的特征峰。该石斛的标准指纹图谱中的11个特征峰的保留时间分别为：10.83min、13.01min、21.22min、24.15min、27.84min、28.80min、43.32min、44.64min、52.67min、
56.37min以及66.15min，其中，保留时间为24.15min的峰为夏佛托苷对照品的特征峰；
该保留时间的误差一般在±0.3min内，即该石斛的标准指纹图谱中的11个特征峰的保留时间分别可能为10.83±0.3min、13.01±0.3min、21.22±0.3min、24.15±0.3min、
27.84±0.3min、28.80±0.3min、43.32±0.3min、44.64±0.3min、52.67±0.3min、
56.37±0.3min以及66.15±0.3min。
[0021] 进一步地，所述洗脱梯度如下所示：
[0022]
[0023] 本发明提供了一种石斛特征指纹图谱的建立方法，其主要具有的有益效果为：与过去的指纹图谱相比，本发明方法具有如下显著的优点和用途：本发明选用夏佛托苷为对照峰，对石斛中的其他特征峰进行保留时间和峰面积归一化处理，扣除不同批次之间保留时间漂移、操作误差等影响；本发明在构建指纹图谱的方法中对相对峰面积大于5％的指纹特征峰进行了定性，突破了以往指纹图谱的过于模糊性，对指纹图谱的主要成分进一步明确，将石斛指纹图谱的整体性和成分特异性统一起来，从而可以应用于药用石斛的石斛组培苗、石斛鲜品、石斛干品的质量分级及真伪
鉴别。具体地：
[0024] ①本发明所述方法的重现性良好，各共有峰相对峰面积的RSD小于5％，相对保留时间小于1％；精
密度实验中各共有峰相对峰面积的RSD小于5％，相对保留时间小于1％，样品在24小时之内
稳定性良好。说明各共有色谱峰能够客观地反映石斛的内在品质，可以作为石斛的质量控制性指标。
[0025] ②本发明建立的特征指纹图谱检测方法对各供试品的前处理方法简单，特征性成分保留完整，且供试样品溶液稳定性良好；
[0026] ③该高效液相色谱方法的精密度较高、重现性良好，分析时间较短，具有一定的专属性，所得指纹图谱中各指纹峰分离效果较好；
[0027] ④本发明选用峰面积较大的共有峰作为特征指纹峰，通过特征指纹峰相对保留时间和相对峰面积的比较，能有效地表征药用石斛的质量；
[0028] ⑤本发明所建立的特征指纹图谱以夏佛托苷对照品为参照峰，确保各特质指纹峰的相对稳定性。
[0029] 目前我国对石斛的质量评价主要局限于对个别或某几类成分的质量评价，其评价方式较片面，不足以系统、完整的表明石斛药材的整体质量，急需探索更先进、更有效的质量评价方法。而高效液相特征指纹图谱对鉴别石斛药材和含有石斛药材的复方制剂的质量具有重要意义，且建立一种能较全面的质量评价方法来对石斛检测到的化学成分进行质量控制具有重要的意义。
附图说明
[0030] 下面根据附图对本发明作进一步详细说明。
[0031] 图1是本发明
实施例所述的对照品夏佛托苷色谱峰的HPLC图；
[0032] 图2是本发明实施例一所述的对10批铁皮石斛药材的指纹图谱；
[0033] 图3是本发明实施例一所述的铁皮石斛的HPLC标准指纹图谱；
[0034] 图4为美化石斛的指纹图谱；
[0035] 图5为流苏石斛的指纹图谱；
[0036] 图6为金钗石斛的指纹图谱。
[0037] 图7是本发明实施例二所述的10批鼓槌石斛的HPLC指纹图谱；
[0038] 图8是本发明实施例二所述的鼓槌石斛的HPLC标准指纹图谱；
[0039] 图9是本发明实施例三所述的10批兜唇石斛的HPLC指纹图谱；
[0040] 图10是本发明实施例三所述的兜唇石斛的HPLC标准指纹图谱；
[0041] 图11是本发明实施例四所述的10批叠鞘石斛的HPLC指纹图谱；
[0042] 图12是本发明实施例四所述的叠鞘石斛的HPLC标准指纹图谱；
[0043] 图13是本发明实施例四所述的10批叠鞘石斛的HPLC指纹图谱；
[0044] 图14是本发明实施例四所述的叠鞘石斛的HPLC标准指纹图谱；
具体实施方式
[0045] 本发明具体实施方式如下：
[0046] 实施例1：铁皮石斛质量评价方法
[0047] 仪器和
试剂：仪器：Agilent1200 series高效液相色谱仪(包括低压二元梯度
泵G1312A，柱温箱G1316A，二极管阵列检测器G1315B，Chemstation化学工作站，美国Agilent科技有限公司)，100g手提式粉碎机(广州旭朗机械设备有限公司)Milli-Q Synthesis超纯水纯化系统(Millipore公司)，RQ-250B型
超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，PB303-N
电子天平(MEETTLER TOLEDO，0.001g)，0.45μm微孔滤头(津腾公司)。试剂：乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher scientific公司)；其它试剂为分析纯；超纯水(MilliQ超纯水，过0.45μm微孔滤膜)；乙酸(北京东方精细化工品有限公司)。
[0048] 本发明中石斛药材HPLC指纹图谱建立的色谱条件为Alltima C18色谱柱；二极管阵列检测器；流动相为乙腈/乙酸—乙酸铵溶液，梯度洗脱；检测波长为280±10nm；柱温25-35℃；流速0.8-1.2ml/min；优选的当流速为1ml/min，检测波长为280nm，柱温为30℃时，评价方法如下：
[0049] (1)对照品溶液的制备：精密称取夏佛托苷对照品0.164mg，用75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)溶解稀释，制备成浓度为16.4μg/ml夏佛托苷对照品溶液。
[0050] (2)标准样品溶液的制备：分别取不同批次的铁皮石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取铁皮石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，加入50mL75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以
0.45μm微孔滤膜过滤，即得不同批次铁皮石斛样品的标准溶液。
[0051] (3)采用高效液相色谱仪进行测定的色谱条件与系统适用性实验为：色谱分离柱填料Alltima C18色谱柱(250mm×4.6mm，5um)，流动相：包括流动相A和流动相B，流动相A为0.4％乙酸+20mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，；流速1ml/min，检测波长280nm，柱温30℃；采用梯度洗脱方式：0min→12min→35min→45min→60min→80min，乙腈2％→15％→24％→36％→75％→95％(即采用梯度洗脱方如表1所示)，后运行10min；在此条件下分析不同批次的标准样品溶液，得到铁皮石斛的指纹图谱。
[0052] 表1 流动相的梯度洗脱变化表
[0053]
[0054]
[0055] (4)标准指纹图谱的测定：分别精密吸取不同批次标准样品溶液和对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行测定，以对照品夏佛托苷色谱峰作为指纹图谱的参照峰，夏佛托苷色谱峰如图1所示，计算标准样品各特征峰的相对保留时间和保留峰面积，制定得到标准指纹图谱；
[0056] (5)供试样品溶液的制备过程为：取供试干燥样品，用粉碎机粉碎，过筛，得石斛粉末，精密称取石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，加入50mL 75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，然后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试样品溶液；
[0057] (6)供试样品质量评价：取供试样品(包括劣质铁皮石斛和其他类型的石斛)按照上述(3)所述方法及步骤，测定出指纹图谱，与标准指纹图谱对比，计算相似度。
[0058] 按照上述方法，对10批铁皮石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图2所示)，表2为10批石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定铁皮石斛的标准指纹图谱。相似度显示了各批次图谱与对照图谱的相似程度，其值越接近1.000说明与对照图谱越相似。
由表2可知，各样品相似度值大于0.85，相似度较高，样品之间的化学物质差异越小。各样品图谱相似度集中于0.85-0.96之间，说明该10批铁皮石斛品质相对比较稳定；而劣质铁皮石斛药材和其他类型的石斛药材的相似度均在0.6以下(图4-6为其他类型的石斛)，因此，根据指纹图谱的这些特征和相似度可以对各类石斛的质量做出评价。
[0059] 表2 10批铁皮石斛相似度结果
[0060]
[0061]
[0062] 实施例二：鼓槌石斛的质量评价方法
[0063] 与实施例一不同的是：
[0064] 标准样品溶液的制备：取不同批次的鼓槌石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，加入50mL 75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得不同批次的标准样品溶液。
[0065] 表3 10批鼓槌石斛指纹图谱相似度评价结果
[0066]
[0067] 按照上述方法，对10批鼓槌石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图7)，表3为10批鼓槌石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定鼓槌石斛的标准指纹图谱(如图8)。
[0068] 由表3可知，各样品相似度值大于0.85，相似度较高，样品之间的化学物质差异越小。说明该10批鼓槌石斛品质相对比较稳定；而劣质鼓槌石斛药材和其他类型的石斛药材的相似度均在0.6以下(图4-6为其他类型的石斛)，因此，根据指纹图谱的这些特征和相似度可以对各类石斛的质量做出评价。
[0069] 实施例三：兜唇石斛的质量评价方法
[0070] 与实施例一不同的是：
[0071] 标准样品溶液的制备：取不同批次的兜唇石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，加入50mL 75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得不同批次的标准样品溶液。
[0072] 表4 10批兜唇石斛指纹图谱相似度评价结果
[0073]
[0074] 按照上述方法，对10批兜唇石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图9)，表3为10批兜唇石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定兜唇石斛的标准指纹图谱(如图10)。
[0075] 由表4可知，各样品相似度值大于0.85，相似度较高，样品之间的化学物质差异越小。说明该10批鼓槌石斛品质相对比较稳定；而劣质兜唇石斛药材和其他类型的石斛药材的相似度均在0.6以下(图4-6为其他类型的石斛)，因此，根据指纹图谱的这些特征和相似度可以对各类石斛的质量做出评价。
[0076] 实施例四：叠鞘石斛的质量评价方法
[0077] 与实施例一不同的是：
[0078] 标准样品溶液的制备：取标准叠鞘石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，加入50mL 75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得不同批次的标准样品溶液。
[0079] 表5 10批叠鞘石斛指纹图谱相似度评价结果
[0080]
[0081] 按照上述方法，对10批叠鞘石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图11)，表3为10批叠鞘石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定叠鞘石斛的标准指纹图谱(如图12)。
[0082] 由表5可知，各样品相似度值大于0.85，相似度较高，样品之间的化学物质差异越小。说明该10批叠鞘石斛品质相对比较稳定；而劣质叠鞘石斛药材和其他类型的石斛药材的相似度均在0.6以下(图4-6为其他类型的石斛)，因此，根据指纹图谱的这些特征和相似度可以对各类石斛的质量做出评价。
[0083] 实施例五：霍山石斛的质量评价方法
[0084] 与实施例一不同的是：
[0085] 标准样品溶液的制备：取标准霍山石斛干燥样品，用粉碎机粉碎，过药典筛(孔径0.335mm)，精密称取石斛粉末1.000g，置于100ml锥形瓶中，加入50mL 75％甲醇(V水：V甲醇＝25:75)，室温下超声30min后取出，过滤，滤液旋蒸浓缩至干，用75％甲醇溶剂(V水：V甲醇＝25:75)溶解，最后转移至5ml容量瓶中定容，摇匀，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得不同批次的标准样品溶液。
[0086] 表6 10批霍山石斛指纹图谱相似度评价结果
[0087]
[0088] 按照上述方法，对10批霍山石斛药材建立了HPLC指纹图谱(如图13)，表3为10批霍山石斛相似度结果，根据10批次样品的指纹图谱，制定霍山石斛的标准指纹图谱(如图14)。
[0089] 由表5可知，各样品相似度值大于0.85，相似度较高，样品之间的化学物质差异越小。说明该10批霍山石斛品质相对比较稳定；而劣质霍山石斛药材和其他类型的石斛药材的相似度均在0.6以下(图4-6为其他类型的石斛)，因此，根据指纹图谱的这些特征和相似度可以对各类石斛的质量做出评价。
[0090] 本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下所作的有关本发明的任何修饰或变更，凡是具有与本
申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
