一种灵芝水提物的质量控制方法
阅读：564发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种灵芝水提物的质量控制方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种药品或保健品 质量 分析方法，具体涉及一种灵芝 水 提物的质量控制方法。为了有针对性地控制产品质量，本发明采用粗多糖含量和灵芝酸A、B、C2含量之和作为灵芝水提物的质量控制指标本研究通过水提醇沉法提取灵芝粗多糖，用 铜 试剂 沉淀其中具有葡聚糖结构的多糖，采用紫外分光光度法测定其含量，排除了辅料对测定的影响，为灵芝水提物质量控制提供依据。赤芝、紫芝及松杉灵芝均含有相对含量较高的特征成分灵芝酸A、B、C2。对比目前常用的比色法测定总三萜含量的方法，特异性强，可达到 鉴别 和质量控制的目的。，下面是一种灵芝水提物的质量控制方法专利的具体信息内容。
1.一种灵芝水提物的质量控制方法，其特征在于：以灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2含量之和以及粗多糖含量作为灵芝水提物的质量控制指标。
2.根据权利要求1所述的灵芝水提物的质量控制方法，其特征在于：
所述灵芝酸A、B含量的检测方法如下：
（1）对照品溶液的制备
取减压干燥至恒重的灵芝酸A、B对照品，加入甲醇制成每1 ml含164 μg灵芝酸A和含52 μg灵芝酸B的混标溶液；
（2）供试品溶液的制备
取灵芝水提物0.5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇超声处理10 min，冷却，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过；
（3）高效液相色谱检测
以辛烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，0.1 % 醋酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为257 nm；柱温为22 ℃；流速为1.0 ml/min；理论板数按灵芝酸A计算，应不低于5000；分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
所述灵芝酸C2含量的检测方法如下：
（1）对照品溶液的制备
取减压干燥至恒重的灵芝酸C2对照品，加甲醇制成每1 ml含33 μg灵芝酸C2的对照品溶液；
（2）供试品溶液的制备
取灵芝水提物0.5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇超声处理10 min，冷却，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过；
（3）高效液相色谱检测
以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，0.1 % 醋酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为257 nm；柱温为20℃；流速为1.0 ml/min；理论板数按灵芝酸C2计算，应不低于5000；分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.根据权利要求1所述的灵芝水提物的质量控制方法，其特征在于：所述粗多糖含量的检测方法如下：
（1）标准曲线绘制
取干燥至恒重的葡聚糖对照品，加水制成每1 ml含葡聚糖1 mg的溶液，分别精密吸取上述标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml至10.0 ml量瓶中，加水稀释至刻度，分别吸取上述溶液2.0 ml至25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液1.0 ml，混匀，精密加入浓硫酸10.0 ml，混匀，置水浴中煮沸2 min，混匀，冷却至室温后用分光光度计在485 nm波长处测定吸光度，以相应的试剂为空白，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；
（2）供试品溶液的制备
取灵芝水提物0.4 g，置50 ml锥形瓶中，加水25.0 ml，超声10 min，滤过；吸取滤液
5.0 ml至50 ml离心管中，缓慢加入无水乙醇20 ml，边加边摇匀，4 ℃放置12 h，取出，
3000 r/min离心8 min，弃去上清液，沉淀加水溶解并转移至10.0 ml容量瓶中，加水定容，摇匀；吸取上述定容后的溶液2.0 ml，置于15 ml离心管中，加入100 g/L氢氧化钠溶液
2.0 ml、铜试剂2.0 ml，置于沸水浴中煮沸3 min，冷却至室温， 3000 r/min离心8 min，弃去上清液；沉淀用10 %硫酸溶液2.0 ml溶解并转移至10.0 ml容量瓶中，加水定容，摇匀，即得；
（3）样品测定
吸取供试品溶液2.0 ml，根据步骤（1），自“加入50 g/L苯酚溶液1.0 ml”起，依法测定吸光度，利用标准曲线计算得到葡聚糖的含量。
4.根据权利要求1所述的灵芝水提物的质量控制方法，其特征在于：测定的粗多糖含量≥30.7mg/g，以葡聚糖计；灵芝酸A、B、C2含量之和，以干燥品计，赤芝、松杉灵芝水提物≥13.3mg/g，紫芝水提物≥1.8mg/g。
一种灵芝水提物的质量控制方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种药品或保健品质量分析方法，具体涉及一种灵芝水提物的质量控制方法。
背景技术
[0002] 灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss．ex Fr．)Karst．或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang或松杉灵芝Ganoderma tsugae Murr. 的干燥子实体，具有补气安神、止咳平喘等功效。灵芝提取工艺主要有水提与醇提，而多数采用水提工艺，即采用多孔菌科真菌赤芝（Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst.）、紫芝（Ganoderma sinnese Zhao, Xu et Zhang）及松杉灵芝（Ganoderma tsugae Murr.）的干燥子实体经水提取、浓缩、干燥后制得。故本发明采用灵芝水提物命名。研究表明，灵芝中主要含有多糖、三萜、核苷、生物碱、黄酮、氨基酸及微量元素等多种化学成分。目前，对灵芝药理活性研究主要集中在灵芝多糖和灵芝三萜类成分，因此，灵芝多糖和三萜类成分作为灵芝的最主要功效成分，很有必要对其含量进行测定。
[0003] 本发明在一系列实验过程中对保健食品原料灵芝水提物标志性成分的测定方法进行了研究。灵芝多糖是灵芝中的主要活性成分之一，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等多种药理活性。目前，某些企业为了达到干燥甚至虚报灵芝多糖含量的目的，常在灵芝水提物中加入糊精、淀粉等各种辅料。若按2010年版中国药典的方法测定，将造成灵芝多糖测定结果偏高。本研究通过水提醇沉法提取灵芝粗多糖，用铜试剂沉淀其中具有葡聚糖结构的多糖，采用紫外分光光度法测定其含量，排除了辅料对测定的影响，为灵芝水提物质量控制提供依据。
[0004] 灵芝三萜类化合物是灵芝的另一主要药效成分，由于具有抗癌，抗炎，抗氧化等药理活性而备受关注。本发明人在采用高效液相色谱法对灵芝水提物三萜类成分进行研究中发现，灵芝水提物中含有含量相对较高的灵芝酸A、B、C2。对比目前常用的比色法测定总三萜含量的方法，特异性强，可达到鉴别和质量控制的目的。
发明内容
[0005] 为了有针对性地控制产品质量，本发明采用粗多糖含量和灵芝酸A、B、C2含量之和作为灵芝水提物的质量控制指标，提供了一种灵芝水提物的质量控制方法。 [0006] 本发明采取的技术方案如下：以灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2含量之和以及粗多糖含量作为灵芝水提物的质量控制指标。
[0007] 所述灵芝酸A、B含量的检测方法如下：（1）对照品溶液的制备
取减压干燥至恒重的灵芝酸A、B对照品，加入甲醇制成每1ml含164 μg灵芝酸A和含52 μg灵芝酸B的混标溶液。
取减压干燥至恒重的灵芝酸A、B对照品，加入甲醇制成每1ml含164 μg灵芝酸A和含52 μg灵芝酸B的混标溶液。
[0008] （2）供试品溶液的制备取灵芝水提物0.5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇适量超声处理10 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。
[0009] （3）高效液相色谱检测以辛烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，0.1 % 醋酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为257 nm；柱温为22 ℃；流速为1.0 ml/min；理论板数按灵芝酸A计算，应不低于5000；分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0010] 所述灵芝酸C2含量的检测方法如下：（1）对照品溶液的制备
取减压干燥至恒重的灵芝酸C2对照品，加甲醇制成每1 ml含33μg灵芝酸C2的对照品溶液。
取减压干燥至恒重的灵芝酸C2对照品，加甲醇制成每1 ml含33μg灵芝酸C2的对照品溶液。
[0011] （2）供试品溶液的制备取灵芝水提物0.5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇适量超声处理10 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。
[0012] （3）高效液相色谱检测以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，0.1 % 醋酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为257 nm；柱温为20℃；流速为1.0 ml/min；理论板数按灵芝酸C2计算，应不低于5000；分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0013] 所述粗多糖含量的检测方法如下：（1）标准曲线绘制：
取干燥至恒重的葡聚糖对照品适量，精密称量，加水制成每1 ml含葡聚糖1 mg的溶液。分别精密吸取上述标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml至10.0 ml量瓶中，加水稀释至刻度，分别吸取上述溶液2.0 ml至25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液1.0 ml，混匀，精密加入浓硫酸10.0 ml，混匀，置水浴中煮沸2 min，混匀，冷却至室温后用分光光度计在485 nm波长处测定吸光度，以相应的试剂为空白，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
取干燥至恒重的葡聚糖对照品适量，精密称量，加水制成每1 ml含葡聚糖1 mg的溶液。分别精密吸取上述标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml至10.0 ml量瓶中，加水稀释至刻度，分别吸取上述溶液2.0 ml至25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液1.0 ml，混匀，精密加入浓硫酸10.0 ml，混匀，置水浴中煮沸2 min，混匀，冷却至室温后用分光光度计在485 nm波长处测定吸光度，以相应的试剂为空白，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
[0014] （2）供试品溶液的制备取灵芝水提物0.4 g，置50 ml锥形瓶中，加水25.0 ml，超声10 min，滤过；吸取滤液
5.0 ml至50 ml离心管中，缓慢加入无水乙醇20 ml，边加边摇匀，4 ℃放置12 h，取出，
3000 r/min离心8 min，弃去上清液，沉淀加水溶解并转移至10.0 ml容量瓶中，加水定容，摇匀；吸取上述定容后的溶液2.0 ml，置于15 ml离心管中，加入100 g/L氢氧化钠溶液
2.0 ml、铜试剂2.0 ml，置于沸水浴中煮沸3 min，冷却至室温， 3000 r/min离心8 min，弃去上清液；沉淀用10 %硫酸溶液2.0 ml溶解并转移至10.0 ml容量瓶中，加水定容，摇匀，即得。
5.0 ml至50 ml离心管中，缓慢加入无水乙醇20 ml，边加边摇匀，4 ℃放置12 h，取出，
3000 r/min离心8 min，弃去上清液，沉淀加水溶解并转移至10.0 ml容量瓶中，加水定容，摇匀；吸取上述定容后的溶液2.0 ml，置于15 ml离心管中，加入100 g/L氢氧化钠溶液
2.0 ml、铜试剂2.0 ml，置于沸水浴中煮沸3 min，冷却至室温， 3000 r/min离心8 min，弃去上清液；沉淀用10 %硫酸溶液2.0 ml溶解并转移至10.0 ml容量瓶中，加水定容，摇匀，即得。
[0015] （3）样品测定吸取供试品溶液2.0 ml，照标准曲线绘制项下，自“加入50 g/L苯酚溶液1.0 ml”起，依法测定吸光度，利用标准曲线计算得到葡聚糖的含量。
[0016] 标志性成分指标为：测定的粗多糖含量≥30.7mg/g，以葡聚糖计；灵芝酸A、B、C2含量之和，以干燥品计，赤芝、松杉灵芝水提物≥13.3mg/g，紫芝水提物≥1.8mg/g。 [0017] 本研究通过水提醇沉法提取灵芝粗多糖，用铜试剂沉淀其中具有葡聚糖结构的多糖，采用紫外分光光度法测定其含量，排除了辅料对测定的影响，为灵芝水提物质量控制提供依据。
[0019] 图1 为灵芝酸A、B混标溶液色谱图，峰1：灵芝酸B，峰2：灵芝酸A。 [0020] 图2 为供试品溶液色谱图，峰1：灵芝酸B，峰2：灵芝酸A。
[0021] 图3为灵芝酸C2对照品溶液色谱图，峰3：灵芝酸C2。
[0022] 图4为供试品溶液色谱图，峰3：灵芝酸C2。
具体实施方式
[0023] 以下实施例中的本品指的是灵芝水提物的供试样品。
[0024] 实施例1 粗多糖含量的测定A1.1 原理
4
试样中相对分子质量大于1×10 的高分子物质在80%乙醇溶液中沉淀，与水溶液中单糖和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性地从其他高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多糖，用苯酚-硫酸反应生成橙红色化合物，通过比色测定其含量，其显色强度与粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此计算本产品中粗多糖的含量。
4
试样中相对分子质量大于1×10 的高分子物质在80%乙醇溶液中沉淀，与水溶液中单糖和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性地从其他高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多糖，用苯酚-硫酸反应生成橙红色化合物，通过比色测定其含量，其显色强度与粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此计算本产品中粗多糖的含量。
[0025] A1.2 试剂A1.2.1试剂与材料
A1.2.1.1乙醇：分析纯。
A1.2.1.1乙醇：分析纯。
[0026] A1.2.1.2 浓硫酸：分析纯。
[0027] A1.2.1.3氢氧化钠溶液（100 g/L）：称取25 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至250 ml。加入固体无水硫酸钠至饱和，备用。
[0028] A1.2.1.4 铜试剂储备液：称取0.75 g CuS04·5H2O，7.5g柠檬酸钠，加水溶解并稀释至250 ml，混匀备用。
[0029] A1.2.1.5铜试剂溶液：取铜试剂储备液50 ml，加水50 ml，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5 g并使其溶解。临时配用。
[0031] A1.2.1.7葡聚糖标准储备液：取分子量500000、干燥至恒重的葡聚糖对照品适量，精密称量，加水制成每1 ml含葡聚糖1 mg的溶液。
[0032] A1.3 仪器A1.3.1 紫外分光光度计。
[0034] A1.3.3离心机（3000 r/min）。
[0035] A1.4 分析步骤A1.4.1标准曲线的制备
分别精密吸取葡聚糖标准储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml至10.0 ml量瓶中，加水稀释至刻度，分别吸取上述溶液2.0 ml至25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液1.0 ml，混匀，精密加入浓硫酸10.0 ml，混匀，置水浴中煮沸2 min，混匀，冷却至室温后用分光光度计在485 nm波长处测定吸光度，以相应的试剂为空白，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
分别精密吸取葡聚糖标准储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml至10.0 ml量瓶中，加水稀释至刻度，分别吸取上述溶液2.0 ml至25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液1.0 ml，混匀，精密加入浓硫酸10.0 ml，混匀，置水浴中煮沸2 min，混匀，冷却至室温后用分光光度计在485 nm波长处测定吸光度，以相应的试剂为空白，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
[0036] A1.4.2 样品溶液的制备精密称取本品0.4 g，置50 ml锥形瓶中，加水25.0 ml，超声10 min，滤过。吸取滤液
5.0 ml至50 ml离心管中，缓慢加入无水乙醇20 ml，边加边摇匀， 4 ℃放置12 h，取出，以3000 r/min离心8 min，弃去上清液，沉淀加水溶解并转移至10.0 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。吸取上述溶液2.0 ml，置于15 ml离心管中，加入100 g/L氢氧化钠溶液
2.0 ml、铜试剂2.0 ml，置于沸水浴中煮沸3 min，冷却至室温，以3000 r/min离心8 min，弃去上清液。沉淀用10 %硫酸溶液2.0 ml溶解并转移至10.0 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。同时按上述步骤做样品空白。
5.0 ml至50 ml离心管中，缓慢加入无水乙醇20 ml，边加边摇匀， 4 ℃放置12 h，取出，以3000 r/min离心8 min，弃去上清液，沉淀加水溶解并转移至10.0 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。吸取上述溶液2.0 ml，置于15 ml离心管中，加入100 g/L氢氧化钠溶液
2.0 ml、铜试剂2.0 ml，置于沸水浴中煮沸3 min，冷却至室温，以3000 r/min离心8 min，弃去上清液。沉淀用10 %硫酸溶液2.0 ml溶解并转移至10.0 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。同时按上述步骤做样品空白。
[0037] A1.4.3样品测定吸取样品溶液2.0 ml置25 ml比色管中，照标准曲线制备项下，自“加入50 g/L苯酚溶液1.0 ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出葡聚糖的重量，计算，即得。
[0038] A1.4.4 结果计算X—样品中粗多糖的含量（以葡聚糖计），mg/g
m1—样品测定液中葡聚糖的质量，mg
m2—样品空白液中葡聚糖质量，mg
m3—样品质量，g
V1—样品提取液总体积，ml
V2—沉淀粗多糖所用样品提取液体积，ml
V3—粗多糖溶液体积，ml
V4—沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液体积，ml
V5—样品测定液总体积，ml
V6—测定用样品溶液体积，ml
A1.4.5 允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。
m1—样品测定液中葡聚糖的质量，mg
m2—样品空白液中葡聚糖质量，mg
m3—样品质量，g
V1—样品提取液总体积，ml
V2—沉淀粗多糖所用样品提取液体积，ml
V3—粗多糖溶液体积，ml
V4—沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液体积，ml
V5—样品测定液总体积，ml
V6—测定用样品溶液体积，ml
A1.4.5 允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。
[0039] 实施例2 灵芝酸A、B、C2鉴别及总量的测定A2.1 原理
试样以甲醇作为溶剂，超声提取，灵芝酸A、灵芝酸B经高效液相色谱柱（C8）分离；灵芝酸C2经高效液相色谱柱（C18）分离，分别用紫外检测器（UV）检测，根据色谱峰的保留时间定性，峰面积外标法定量，分别测定试样中灵芝酸A、B和灵芝酸C2的含量，并计算其总量。
试样以甲醇作为溶剂，超声提取，灵芝酸A、灵芝酸B经高效液相色谱柱（C8）分离；灵芝酸C2经高效液相色谱柱（C18）分离，分别用紫外检测器（UV）检测，根据色谱峰的保留时间定性，峰面积外标法定量，分别测定试样中灵芝酸A、B和灵芝酸C2的含量，并计算其总量。
[0040] A2.2 试剂A2.2.1 水: 纯化水。
[0041] A2.2.2 乙腈：色谱纯。
[0042] A2.2.3 冰乙酸：分析纯。
[0043] A2.2.4 甲醇：分析纯。
[0044] A2.2.5 灵芝酸A、B、C2对照品：纯度≥98 %， 由中国医学科学院药物研究所提供。
[0045] A2.3 仪器A2.3.1高效液相色谱仪（紫外检测器）。
[0046] A2.3.2 超声波清洗器。
[0047] A2.4 分析步骤A2.4.1 灵芝酸A、B测定
A2.4.1.1 色谱条件
以辛烷基键合硅胶为键合相（色谱柱：Agilent Zorbax-SB C8 150 mm × 4.6 mm,
3.5 μm或同类规格色谱柱），乙腈为流动相A，0.1 % 醋酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为257 nm；柱温为22 ℃；流速为1.0 ml/min。
A2.4.1.1 色谱条件
以辛烷基键合硅胶为键合相（色谱柱：Agilent Zorbax-SB C8 150 mm × 4.6 mm,
3.5 μm或同类规格色谱柱），乙腈为流动相A，0.1 % 醋酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为257 nm；柱温为22 ℃；流速为1.0 ml/min。
[0048] 表1 流动相梯度洗脱方式A2.4.1.2系统适用性试验
理论板数按灵芝酸A计算应不低于5000。
理论板数按灵芝酸A计算应不低于5000。
[0049] A2.4.1.3 对照品溶液的制备取减压干燥至恒重的灵芝酸A、B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含164 μg灵芝酸A和每1 ml含52 μg灵芝酸B的混标溶液，即得。
[0050] A2.4.1.4 供试品溶液的制备取本品约0.5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇适量超声处理10 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。
[0051] A2.4.1.5 测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。用主峰保留时间定性，峰面积定量。结果如图1、图2。
[0052] A2.4.1.6 计算A2.4.1.6.1 灵芝水提物中灵芝酸A的含量按下式计算：
Y1 ——灵芝酸A的含量，单位为毫克每克（mg/g）；
Ax —— 供试品溶液色谱图中灵芝酸A的峰面积；
As —— 对照品溶液色谱图中灵芝酸A的峰面积；
C —— 对照品溶液中灵芝酸A的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ；
M —— 试样质量，单位为克(g)；
X —— 样品水分含量 (%)。
Y1 ——灵芝酸A的含量，单位为毫克每克（mg/g）；
Ax —— 供试品溶液色谱图中灵芝酸A的峰面积；
As —— 对照品溶液色谱图中灵芝酸A的峰面积；
C —— 对照品溶液中灵芝酸A的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ；
M —— 试样质量，单位为克(g)；
X —— 样品水分含量 (%)。
[0053] A2.4.1.6.2 灵芝水提物中灵芝酸B的含量按下式计算：Y2 ——灵芝酸B的含量，单位为毫克每克（mg/g）；
Ax —— 供试品溶液色谱图中灵芝酸B的峰面积；
As —— 对照品溶液色谱图中灵芝酸B的峰面积；
C —— 对照品溶液中灵芝酸B的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ；
M —— 试样质量，单位为克(g)；
X —— 样品水分含量 (%)。
Ax —— 供试品溶液色谱图中灵芝酸B的峰面积；
As —— 对照品溶液色谱图中灵芝酸B的峰面积；
C —— 对照品溶液中灵芝酸B的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ；
M —— 试样质量，单位为克(g)；
X —— 样品水分含量 (%)。
[0054] A2.4.2 灵芝酸C2测定A2.4.2.1 色谱条件及系统适用性试验
以十八烷基键合硅胶为键合相（色谱柱：Agilent Zorbax-SB C18 250 mm × 4.6 mm，5 μm或同类规格色谱柱），乙腈为流动相A，0.1 %醋酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为257 nm；柱温为20 ℃；流速为1.0 ml/min。
以十八烷基键合硅胶为键合相（色谱柱：Agilent Zorbax-SB C18 250 mm × 4.6 mm，5 μm或同类规格色谱柱），乙腈为流动相A，0.1 %醋酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为257 nm；柱温为20 ℃；流速为1.0 ml/min。
[0055] 表2 流动相梯度洗脱方式A2.4.2.2系统适用性试验
理论板数按灵芝酸C2计算应不低于5000。
理论板数按灵芝酸C2计算应不低于5000。
[0056] A2.4.2.3 对照品溶液的制备取减压干燥至恒重的灵芝酸C2对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含33μg灵芝酸C2的对照品溶液，即得。
[0057] A2.4.2.4 供试品溶液的制备取本品约0.5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇适量超声处理10 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。
[0058] A2.4.2.5 测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。用主峰保留时间定性，峰面积定量。结果如图3、图4。
[0059] A2.4.2.6 计算灵芝水提物中灵芝酸C2的含量按下式计算：
Y3 ——灵芝酸C2的含量，单位为毫克每克（mg/g）；
Ax —— 供试品溶液色谱图中灵芝酸C2的峰面积；
As —— 对照品溶液色谱图中灵芝酸C2的峰面积；
C —— 对照品溶液中灵芝酸C2的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ；
M —— 试样质量，单位为克(g)；
X —— 样品水分含量 (%)。
Y3 ——灵芝酸C2的含量，单位为毫克每克（mg/g）；
Ax —— 供试品溶液色谱图中灵芝酸C2的峰面积；
As —— 对照品溶液色谱图中灵芝酸C2的峰面积；
C —— 对照品溶液中灵芝酸C2的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL) ；
M —— 试样质量，单位为克(g)；
X —— 样品水分含量 (%)。
[0060] A2.4.3 灵芝酸A、B、C2总量(Y)计算Y=Y1+Y2+Y3
Y——灵芝酸A、B、C2的总量，单位为毫克每克（mg/g）；
Y1——灵芝酸A的含量，单位为毫克每克（mg/g）；
Y2——灵芝酸B的含量，单位为毫克每克（mg/g）；
Y3——灵芝酸C2的含量，单位为毫克每克（mg/g）。
Y——灵芝酸A、B、C2的总量，单位为毫克每克（mg/g）；
Y1——灵芝酸A的含量，单位为毫克每克（mg/g）；
Y2——灵芝酸B的含量，单位为毫克每克（mg/g）；
Y3——灵芝酸C2的含量，单位为毫克每克（mg/g）。
[0061] A2.4.4 允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
[0062] 实施例3标志性成分指标应符合表3的规定。
[0063] 表3 标志性成分指标实施例4 测定灵芝水提物中粗多糖含量的方法的研究
1 方法学验证
1.1 线性实验 按照上述标准曲线制备的方法绘制标准曲线，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得线性回归方程为y=0.00514x+0.00571，相关系数γ=0.9996，线性范围为21.76μg～217.6μg。结果见表4。
1 方法学验证
1.1 线性实验 按照上述标准曲线制备的方法绘制标准曲线，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得线性回归方程为y=0.00514x+0.00571，相关系数γ=0.9996，线性范围为21.76μg～217.6μg。结果见表4。
[0064] 表4 粗多糖线性结果表1.2 准确度与精密度试验 取已知含量的灵芝（赤芝D9）水提物样品，采用加样回收试验，精密加入一定量葡聚糖对照品，分别制备3个不同浓度的供试品，每个浓度制备6份的供试品，同时做样品空白。按上述供试品溶液的制备方法和测定条件进行测定，并计算回收率，结果见表5。
[0065] 表5 粗多糖准确度与精密度试验测定结果1.3 重复性试验 取同一灵芝（赤芝D9）水提物样品6份，分别制备供试品溶液，按上述的方法进行测定，结果表明该法具有良好的重复性。结果见表6。
[0066] 表6 重复性试验测定结果1.4 方法耐用性考察 本实验使用不同仪器对同一灵芝（赤芝D9）水提物中的粗多糖含量进行了测定，结果表明，使用不同型号紫外分光光度计，粗多糖含量RSD<3%，表明该法耐用性良好。测定结果见表7。
[0067] 表7 耐用性试验结果2结论
采用紫外分光光度计测定灵芝水提物中粗多糖含量，其干扰因素为淀粉、糊精及其他碳水化合物。为了排除上述干扰，本方法在测定过程中采用铜试剂分离纯化，实验表明可获得满意结果。
采用紫外分光光度计测定灵芝水提物中粗多糖含量，其干扰因素为淀粉、糊精及其他碳水化合物。为了排除上述干扰，本方法在测定过程中采用铜试剂分离纯化，实验表明可获得满意结果。
[0068] 实施例5高效液相色谱法测定灵芝水提物中灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2含量的方法的研究1 方法学验证
1.1 线性试验 精密称取灵芝酸A、B、C2对照品适量，加甲醇分别制成不同浓度的灵芝酸A、B、C2对照品溶液。精密吸取10μl或20μl对照品溶液注入高效液相色谱仪，按上述的色谱条件测定。结果分别见表8、9、10。
1.1 线性试验 精密称取灵芝酸A、B、C2对照品适量，加甲醇分别制成不同浓度的灵芝酸A、B、C2对照品溶液。精密吸取10μl或20μl对照品溶液注入高效液相色谱仪，按上述的色谱条件测定。结果分别见表8、9、10。
[0069] 表8 灵芝酸A线性实验结果表表9 灵芝酸B线性实验结果表
表10 灵芝酸C2线性实验结果表
以浓度（μg/ml）为横坐标，相应峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线。得灵芝酸A线性回归方程为y＝8677.49x+2832.86，相关系数r＝1.0000；灵芝酸B线性回归方程为y＝8520.66x+4165.17，相关系数r＝1.0000；灵芝酸C2的线性回归方程为y =17504.5x -15909.5，相关系数r=0.9999。试验表明灵芝酸A、B、C2分别在3.504μg/ml～525.60μg/ml、3.232μg/ml～484.80μg/ml、2.036～203.600μg/ml范围内呈良好的线性关系。
表10 灵芝酸C2线性实验结果表
以浓度（μg/ml）为横坐标，相应峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线。得灵芝酸A线性回归方程为y＝8677.49x+2832.86，相关系数r＝1.0000；灵芝酸B线性回归方程为y＝8520.66x+4165.17，相关系数r＝1.0000；灵芝酸C2的线性回归方程为y =17504.5x -15909.5，相关系数r=0.9999。试验表明灵芝酸A、B、C2分别在3.504μg/ml～525.60μg/ml、3.232μg/ml～484.80μg/ml、2.036～203.600μg/ml范围内呈良好的线性关系。
[0070] 1.2 准确度与精密度试验 取已知含量的灵芝（赤芝D9）水提物样品，采用加样回收试验，精密加入一定量灵芝酸A、B、C2对照品，分别制备3个不同浓度的供试品，每个浓度制备6份的供试品，按上述供试品溶液的制备方法和色谱条件测定，并计算回收率，结果见表11、12、13。
[0071] 表11 灵芝酸A准确度与精密度试验测定结果表12 灵芝酸B准确度与精密度试验测定结果
表13 灵芝酸C2准确度与精密度试验测定结果
1.3 重复性试验 取同一灵芝（赤芝D9）水提物样品6份，分别制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果表明，该法具有良好的重复性。结果见表14、15、16。
表13 灵芝酸C2准确度与精密度试验测定结果
1.3 重复性试验 取同一灵芝（赤芝D9）水提物样品6份，分别制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果表明，该法具有良好的重复性。结果见表14、15、16。
[0072] 表14 灵芝酸A重复性试验测定结果表15 灵芝酸B重复性试验测定结果
表16 灵芝酸C2重复性试验测定结果
1.4 方法耐用性
1.4.1 方法稳定性试验 取同一灵芝（赤芝D9）水提物样品X分别于0、2、4、8、16、24h进样，按上述色谱条件测定灵芝酸A、B、C2含量。结果表明，供试品溶液在24小时内稳定。
表16 灵芝酸C2重复性试验测定结果
1.4 方法耐用性
1.4.1 方法稳定性试验 取同一灵芝（赤芝D9）水提物样品X分别于0、2、4、8、16、24h进样，按上述色谱条件测定灵芝酸A、B、C2含量。结果表明，供试品溶液在24小时内稳定。
[0073] 1.4.2 不同色谱柱考察 本实验采用不同色谱柱对灵芝（赤芝D9）水提物中灵芝酸A、B、C2的含量进行测定。结果使用不同型号色谱柱，灵芝酸A、B、C2含量RSD<2%，表明该法耐用性良好，测定结果见表18、19。
[0074] 表18 耐用性试验结果1表19 耐用性试验结果2
1.4.3 不同流动相考察 本实验采用不同比例流动相对灵芝（赤芝D9）水提物中灵芝酸A、B、C2的含量进行了测定。结果使用不同比例流动相，灵芝酸A、B、C2含量RSD<2%，表明该法耐用性良好，测定结果见表20、21。
1.4.3 不同流动相考察 本实验采用不同比例流动相对灵芝（赤芝D9）水提物中灵芝酸A、B、C2的含量进行了测定。结果使用不同比例流动相，灵芝酸A、B、C2含量RSD<2%，表明该法耐用性良好，测定结果见表20、21。
[0075] 表20 耐用性试验结果3表21 耐用性试验结果4
1.4.4不同仪器考察 本实验采用不同仪器对灵芝（赤芝D9）水提物中灵芝酸A、B、C2的含量进行了测定。结果使用不同型号高效液相色谱仪，灵芝酸A、B、C2含量RSD<2%，表明该法耐用性良好，测定结果见表22。
1.4.4不同仪器考察 本实验采用不同仪器对灵芝（赤芝D9）水提物中灵芝酸A、B、C2的含量进行了测定。结果使用不同型号高效液相色谱仪，灵芝酸A、B、C2含量RSD<2%，表明该法耐用性良好，测定结果见表22。
[0076] 表22 耐用性试验结果52 结论
紫芝水提物其灵芝酸A、B、C2的含量与赤芝水提物相比，含量较低，松杉灵芝水提物的灵芝酸A、B、C2含量与赤芝水提物的含量相当，因此紫芝水提物与赤芝、松杉灵芝水提物其灵芝酸A、B、C2总量的限度应分开制定。
紫芝水提物其灵芝酸A、B、C2的含量与赤芝水提物相比，含量较低，松杉灵芝水提物的灵芝酸A、B、C2含量与赤芝水提物的含量相当，因此紫芝水提物与赤芝、松杉灵芝水提物其灵芝酸A、B、C2总量的限度应分开制定。
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