传感器平台、装有该平台的装置以及使用该平台的方法
阅读：557发布：2021-08-22
专利汇可以提供传感器平台、装有该平台的装置以及使用该平台的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种用于样品分析的 传感器 平台，包括一折射率为(n1)的 基板 (30)和一形成在该基板上的薄的、光学透明层(32)，其折射率(n2)大于折射率(n1)。该平台包括一或多个周期性沟槽(31)，(33)形式的波纹结构，限定了一或多个传感区域，每个传感区域对应一或多个俘获元件。该沟槽被赋于一定形状、尺寸和取向，使得当相干光入射在平台上时被衍射成单独的光束或衍射级，导致 透射光 束的减小和入射光的异常高的反射，从而在每个传感区域的表面处产生一增强的瞬息场。在谐振条件下该场的幅值比 现有技术 平台的场增大了大约100个量级，使得从该平台上样品所产生的发光强度也被增大了100倍。还公开了一种装有该平台的装置以及使用该平台的方法。，下面是传感器平台、装有该平台的装置以及使用该平台的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于分析一或多种样品的方法，包括使样品与一传感器平台 的传感区域相接触，所述平台包括一具有折射率n1的光学透明基板，一 形成在该基板的一个表面上的、薄的、非金属的光学透明层，所述透明 层具有比n1大的折射率n2，所述平台中引入一或多个包含周期性沟槽的 波纹结构，由其限定一或多个传感区域，每个传感区域对应一或多个俘 获元件，其特征在于所述沟槽被赋于一定的形状、尺寸和取向，使得或 者
a)入射在所述平台上的相干光被衍射成单独的光束或衍射级，其相 互干涉导致透射光束的减少和入射光的异常高的反射，从而在一或多个 传感区域的表面处产生一增强的瞬息场；或者
b)入射在所述平台上的相干的线偏振光被衍射成单独的光束或衍 射级，其相互干涉导致几乎所有透射光束消失以及入射光的异常高的反 射，从而在一或多个传感区域的表面处产生一增强的瞬息场，
用一光束照射平台，使得在该平台的传感区域中产生瞬息谐振，并 检测从该传感区域发出的辐射。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述波纹结构包括基本上平行 的单衍射或多重衍射的周期性沟槽，并且沟槽代表一或多个传感区域。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中
(a)沟槽的深度在3nm至光学透明层厚度范围内，
(b)光学透明层的厚度在30至1000nm范围内，
(c)波纹结构的周期在200至1000nm范围内，
(d)沟槽深度与光学透明层厚度之比在0.02至1范围内，并且
(e)沟槽宽度与沟槽周期之比在0.2至0.8范围内。
4.根据权利要求1所述的方法，其中该平台的基板由无机材料形成。
5.根据权利要求1所述的方法，其中该基板由有机材料形成。
6.根据权利要求4所述的方法，其中该基板由玻璃，SiO2，石英或 硅形成。
7.根据权利要求5所述的方法，其中该基板由有机聚合物形成。
8.根据权利要求7所述的方法，其中有机聚合物包括PP，PC， PMMA，PI，PS，PE，PET或PU中的一个或多个。
9.根据权利要求1所述的方法，其中该光学透明层由无机材料形成。
10.根据权利要求1所述的方法，其中该光学透明层由有机材料形 成。
11.根据权利要求9所述的方法，其中该光学透明层是金属氧化物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中金属氧化物是Ta2O5，TiO2， Nb2O5，ZrO2，ZnO或HfO2中的一个。
13.根据权利要求10所述的方法，其中该光学透明层由聚酰胺，聚 酰亚胺，PP，PS，PMMA，聚丙烯酸，聚丙烯酯，聚硫醚或聚苯硫醚和 其衍生物形成。
14.根据权利要求1或权利要求4到13中任一权利要求所述的方法， 其中该衍射沟槽的深度在3nm至光学透明层厚度范围内。
15.根据权利要求14的所述的方法，其中该衍射沟槽的深度在10nm 至光学透明层厚度范围内。
16.根据权利要求14所述的方法，其中该光学透明层的厚度在30 至1000nm范围内，衍射沟槽的周期在200至1000nm范围内，沟槽深度 与光学透明层厚度之比处于0.02至1范围内，沟槽宽度与沟槽周期之比 处于0.2至0.8范围内时将导致极短的传播距离。
17.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，其中该沟 槽为矩形截面。
18.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，其中该沟 槽具有正弦、梯形或锯齿形截面。
19.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，其中该平 台为正方形或矩形，且此沟槽沿平台线性延伸。
20.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，其中该平 台为盘形，该沟槽为环形或线形。
21.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，其中该沟 槽形成在基板的表面上。
22.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，其中该沟 槽形成在光学透明层的表面上。
23.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，其中该沟 槽同时形成在基板表面上与光学透明层表面上。
24.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，其中该一 或多个传感区域的波纹状表面被设计为在一特定激励波长和/或特定类型 的偏振下操作最优。
25.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，其中该一 或多个传感区域的波纹表面被设计为在不同的波长和/或偏振取向下操作 最优。
26.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，其中该光 学透明层的表面包括一或多个传感区域，每个传感区域携带一或多个俘 获元件。
27.根据权利要求26所述的方法，其中每个俘获元件包含能够进行 亲合反应的单个俘获分子和/或俘获分子的混合。
28.根据权利要求26所述的方法，其中该俘获元件被设置成二维阵 列。
29.根据权利要求26所述的方法，其中该平台包括一设置在光学透 明层表面处的粘合促进层，以便能够固定俘获元件。
30.根据权利要求29所述的方法，其中该粘合促进层包括一层或多 层无机和/或有机分子或其衍生物，提供附加的化学、物理、光谱和/或光 物理、光化学/生物/生化特性，以便控制所产生的粘合促进层系统的整个 功能特性。
31.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，其中该平 台由多个传感区域构成，每个传感区域具有其自身的衍射沟槽或多个重 叠的衍射沟槽，适于多色激发和样品的检测。
32.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，其中不限 制待固定在平台上的俘获元件或俘获分子的数量，并且相应于构成感兴 趣的物种或生物体的基因组的基因、DNA序列、DNA基元、DNA微卫 星、单核苷酸多态性、蛋白质或细胞碎片的数量，或者其中的选择或其 组合的数量。
33.根据权利要求26所述的方法，其中该俘获元件或多个俘获元件 或分子包括下面的一种或多种：
核苷酸，寡核苷酸和它们的化学衍生物
双链或单链DNA，包括：a)线性DNA和其化学衍生物
b)环状DNA
总RNA，信使RNA，cRNA，线粒体RNA，人工RNA，aptamers PNA
多克隆的、单克隆的、重组的、工程化的抗体，抗原，半抗原，抗 体FAB亚基
蛋白质，修饰的蛋白质，酶，酶辅因子或抑制剂，蛋白质复合物， 植物血凝素，组氨酸标记的蛋白质，用于组氨酸标记成分(HIS-tag)的 螯合剂，标记的蛋白质，人工抗体，分子印记，质体膜受体，整个细胞， 细胞碎片和细胞亚结构，突触，激动剂/抗拮剂，细胞，细胞器，
小分子，
前列腺素，
抗生素，药物，代谢物，药物代谢物
天然产品
碳水化合物和衍生物
天然和人工配体
类固醇，激素
肽
天然或人工聚合物
分子探针
天然和人工受体
及其化学衍生物
螯合反应剂，冠醚，配体，超分子集合
指示剂
组织样品，组织微阵列。
34.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，包括向被 研究样品中加入荧光诱发材料，并检测所述样品中通过增强的瞬息场激 发样品所发出的荧光。
35.根据权利要求34所述的方法，其中该荧光诱发材料包括一发光 标记。
36.根据权利要求35所述的方法，其中该发光标记包括为了附着在 一或多个亲合对象上，对在400nm至1200nm范围内发光的发光化合物 进行官能化或修饰，包括下列的一或多种化合物的衍生物：
聚苯和杂芳族化合物
1，2-二苯乙烯，
香豆素，
呫吨染料，
次甲基染料，
噁嗪染料，
若丹明，
荧光素，
香豆素，1，2-二苯乙烯，
芘，苝，
菁蓝，氧杂菁蓝，酞菁，紫菜碱，萘酞菁，偶氮苯衍生物，联苯乙 烯联苯，
过渡金属络合物，聚吡啶基/钌络合物，三(2，2’-联吡啶基)氯化钌， 三(1，10-菲咯啉)氯化钌，三(4，7-联苯-1，10-菲咯啉)氯化钌，和聚吡 啶基/吩嗪/钌络合物，八乙基-铂-卟啉，铕和铽络合物量子点粒子/珠或其 衍生物。
37.根据权利要求1-2、4-13中任一权利要求所述的方法，用于下面 的任意一或多个应用：
-基因表达
-基因组学
-药物基因组学
-毒理基因组学
-毒理蛋白质组学
-遗传学
-药物遗传学
-毒理遗传学
-外显子/内含子表达分布
-人类白细胞抗原定型
-剪接变体的分析
-蛋白质组学，芯片上蛋白质分析
-病人监视
-点护理，“个人化药物”
-诊断学
-用于蛋白质组学的芯片上2d凝胶
-SNP，小量测序
-高处理量筛选
-组合化学法
-蛋白质-蛋白质相互作用
-分子间相互作用
-基于芯片的蛋白质-抗体和肽相互作用
-绿色荧光蛋白
-原位杂交
-共焦显微术
-荧光相关光谱术
-传统显微术
-MALDI-TOF MS。
38.一种用于分析样品的装置，包括一平台，所述平台包括一具有折 射率n1的光学透明基板，一形成在该基板的一个表面上的薄的、非金属 的光学透明层，所述透明层具有比折射率n1大的折射率n2；所述平台中 引入一或多个包含周期性沟槽的波纹结构，由其限定一或多个传感区域， 每个传感区域对应一或多个俘获元件，其特征在于所述沟槽被赋于一定 的形状、尺寸和取向，使得或者
a)入射在所述平台上的相干光被衍射成单独的光束或衍射级，其干 涉导致透射光束的减少和入射光的异常高的反射，从而在一或多个传感 区域的表面处产生一增强的瞬息场；或者
b)入射在所述平台上的相干的线偏振光被衍射成单独的光束或衍 射级，其干涉导致几乎所有透射光束消失以及入射光的异常高的反射， 从而在一或多个传感区域的表面处产生一增强的瞬息场，
用于产生光束和用于引导光束的装置，以使光束以一定角度入射在 平台上，导致在平台中产生瞬息谐振，从而在平台的传感区域中产生增 强的谐振场，以及用于检测设置在平台的传感区域上或传感区域附近的 材料特性的装置。
39.根据权利要求38所述的装置，其中该光产生装置包括一用于发 射相干激光束的激光器。
40.根据权利要求38所述的装置，其中该光产生装置包括一放电灯 或低压灯。
41.根据权利要求40所述的装置，其中所述灯是Hg或Xe灯或发光 二极管。
42.根据权利要求39所述的装置，包括用于引导激光束以使激光束 以角度θ入射在平台上的光学元件，且角度θ由表达式θ＝n-λ/Λ限定，其 中Λ为衍射沟槽的周期，λ为光波长，n为光学透射层的有效折射率。
43.根据权利要求38到42其任一权利要求所述的装置，其中该检测 装置被设置来检测发光。
44.根据权利要求43所述的装置，其中所述的发光为荧光、磷光、 化学发光和电子发光其中之一。
45.根据权利要求38到42其任一权利要求所述的装置，其中该检测 装置被设置来另外检测折射率变化。
46.根据权利要求38到42其任一权利要求所述的装置，其中将该入 射光束被设置来照射所有或每个传感区域。
47.根据权利要求38到42其任一权利要求所述的装置，其中该光束 被设置来照射被分析的传感区域的子区域，并且该光束和平台被设置成 使得它们可以发生相对运动，以在平台的传感区域上进行有效的光束扫 描。
48.根据权利要求38到42其任一权利要求所述的装置，包括一对着 平台的传感区域定位的盒，以使样品与传感区域相接触。
49.根据权利要求38到42其任一权利要求所述的装置，包括一用于 包含多个被研究样品的微滴定型装置。
50.一种平台，包括一具有折射率n1的光学透明基板，一形成在该 基板的一个平面上的薄的、非金属光学透明层，所述透明层具有比折射 率n1大的折射率n2；所述平台在透明层中引入一基本上在整个平台上的 波纹结构，或者设置在平台上的多个分离的波纹结构，所述结构包括基 本上平行的单衍射或多重衍射的周期性沟槽，该沟槽代表一或多个传感 区域，其中：
(a)沟槽的深度在3nm至光学透明层厚度范围内，
(b)光学透明层的厚度在30至1000nm范围内，
(c)波纹结构的周期在200至1000nm范围内，
(d)沟槽深度与光学透明层厚度之比在0.02至1范围内，以及
(e)沟槽宽度与沟槽周期之比在0.2至0.8范围内。
51.一种用于样品分析的平台，包括一具有折射率n1的光学透明的 基板，一形成在该基板的一个表面上的薄的、非金属的光学透明层，所 述透明层具有比折射率n1大的折射率n2；所述平台中引入一或多个包含 周期性沟槽的波纹结构，由其限定一或多个传感区域，每个传感区域对 应一或多个俘获元件，所述沟槽被赋于一定的形状、尺寸和取向，使得 或者
a)入射在所述平台上的相干光被衍射成单独的光束或衍射级，其干 涉导致透射光束的减少和入射光的异常高的反射，从而在一或多个传感 区域的表面处产生一增强的瞬息场；或者
b)入射在所述平台上的相干的线偏振光被衍射成单独的光束或衍 射级，其干涉导致几乎所有透射光束的消失以及入射光的异常高的反射， 从而在一或多个传感区域的表面处产生一增强的瞬息场，
其中衍射沟槽的深度在3nm至光学透明层厚度范围内，光学透明层 的厚度在30至1000nm范围内，衍射沟槽的周期在200至1000nm范围 内，沟槽深度与光学透明层厚度之比在0.02至1范围内，沟槽宽度与沟 槽周期之比在0.2至0.8范围内时导致极短的传播距离。
52.根据权利要求51所述的平台，其中衍射沟槽的深度在10nm至 光学透明层厚度范围内。
技术领域
本发明通常涉及样品分析领域，尤其但并不是专用于亲合性检测领 域，例如通常被称为DNA，蛋白质，肽和抗体芯片(antibody chip)的技 术。本发明的一个方面涉及一种能够用于分析样品的传感器平台。本发 明的另一个方面涉及使用该传感器平台的装置。本发明的又一方面涉及 使用该传感器平台分析样品的方法。
背景技术
用于分析二维阵列样品的技术是已知的。其中的一种技术被称为 ELISA分析，是在抗体与抗原之间强烈的生化反应的基础上进行的。特 别的单克隆或多克隆抗体被固定在基质(substrate)上，且与附加的物质 (complimentary species)发生反应。附加荧光标记的标签，通过酶连接的 抗体激活，用光照射样品以便引起荧光。对此荧光进行检测，且此荧光 的强度表示出亲合性反应。
WO98/27430中描述了另一种已知技术。按照这种技术大量不同的物 质在基板上被按阵列固定。通过光刻手段将该物质固定在基板上。向物 质中加入荧光团标记的标签。准备样品，并且与被固定的物质起反应， 使用聚焦的激光束对整个芯片(chip)进行扫描。或者制备样品，并且使用 荧光团标记的标签对其进行改性，与被固定的物质起反应，并且使用聚 焦的激光束对整个芯片进行扫描。光电检测器检测到荧光信号，并产生2D 图案。在各个样品之间这种图案的变化提供以基因表达方面差别的指示， 从而提供关于药理学和毒理学的信息。
另一种已知技术是基于瞬息波检测器。这些检测器使用被收集在一 相当薄层中的相干激光，产生所谓的瞬逝电磁场，其在实际物理检测器 的外部扩展到一个很小的距离。该场可以与附着在检测器表面上的分子 相互作用。这种瞬息激励或相互作用被限制在一个非常接近于波导附近 的区域，对于可见光一般为距离表面0.5微米。瞬息场在空间上保持定位， 不会将它们所存储的能量转移到其它区域。激光与分子的相互作用可以 被用于许多不同的方面。包括：
1.对瞬息场产生的荧光的检测。
2.检测样品分子与俘获分子结合时所发生的折射率的变化。
3.表面等离子体谐振的检测。
一种已知的使用瞬息场的特殊传感器为平面波导传感器。该平面波 导传感器包括一平的基片，在该平的基片上形成一薄的波导层。部分波 导层中包含有光栅，激光束入射到光栅上，并且从该光栅发射出激光束， 使得激光束穿过波导层到达远离光栅的传感区域。波导传感器可以按物 质敏感方式使用(参照前面的2，3)，或者与荧光激发和检测相结合具 有高灵敏度(参照前面的1)。俘获分子被固定在传感区域上，然后在附 加具有相似亲和力(竞争)的标记分子的条件下，使被分析物(样品) 与传感区域/俘获分子相接触。或者，被分析物分子可以与固定的俘获分 子结合起来，并且通过另外一个标记物质与俘获的被分析物分子的相互 作用引入荧光标签。照射进波导层中的激光导致荧光团的瞬息激发，从 而允许对分析物进行定量分析。检测所发射的荧光，而且荧光的强度提 供已经在被分析物中存在的亲合对象与所固定的俘获分子之间发生相互 作用的指示。应该注意到在这种类型的设置中，激光辐射于波导内部传 播相当长的距离，而且耦合光栅与传感区域在几何上被分开(参见 WO95/33197和WO95/33198)。
EP-0455067A2描述了一种采用折射率变化检测原理的平面波导传感 器。在整个平台上形成平台浅槽，将偏振的相干光耦合到透明波导层中， 在一段距离之后该光被耦合出去。当被分析物分子与俘获分子结合在一 起时，出射耦合光束的角度发生改变。
US-A-5738825中给出了另一个折射率型的例子。该平台包含与微滴 定度(microtiter)平板的凹槽相接触的单个光栅。
EP178083披露了表面等离子体谐振(SPR)，其中入射光子的能量 被转换为电能作为表面等离子体波。与本发明的平台不同，该传感器结 构要求一金属层，且在临界角下所反射的光量为或近似为零，与之相反 本发明中所反射的强度达到几乎100％。
所有前面的技术都具有多个缺点。其中一些速度非常慢，因为每个 样品必须被分别激发。其它的技术如平面波导，允许一次激发多于一个 样品，不过因为不同俘获元素之间的荧光串扰，由于波导损耗所导致的 激励光强度的局部变化，以及光栅耦合效率变化所导致的局部耦合力改 变，不能提供完整可靠的结果。
WO98/27430中描述了另一种已知技术。按照这种技术大量不同的物 质在基板上被按阵列固定。通过光刻手段将该物质固定在基板上。向物 质中加入荧光团标记的标签。准备样品，并且与被固定的物质起反应， 使用聚焦的激光束对整个芯片(chip)进行扫描。或者制备样品，并且使用 荧光团标记的标签对其进行改性，与被固定的物质起反应，并且使用聚 焦的激光束对整个芯片进行扫描。光电检测器检测到荧光信号，并产生2D 图案。在各个样品之间这种图案的变化提供以基因表达方面差别的指示， 从而提供关于药理学和毒理学的信息。
另一种已知技术是基于瞬息波检测器。这些检测器使用被收集在一 相当薄层中的相干激光，产生所谓的瞬逝电磁场，其在实际物理检测器 的外部扩展到一个很小的距离。该场可以与附着在检测器表面上的分子 相互作用。这种瞬息激励或相互作用被限制在一个非常接近于波导附近 的区域，对于可见光一般为距离表面0.5微米。瞬息场在空间上保持定位， 不会将它们所存储的能量转移到其它区域。激光与分子的相互作用可以 被用于许多不同的方面。包括：
1.对瞬息场产生的荧光的检测。
2.检测样品分子与俘获分子结合时所发生的折射率的变化。
3.表面等离子体谐振的检测。
一种已知的使用瞬息场的特殊传感器为平面波导传感器。该平面波 导传感器包括一平的基片，在该平的基片上形成一薄的波导层。部分波 导层中包含有光栅，激光束入射到光栅上，并且从该光栅发射出激光束， 使得激光束穿过波导层到达远离光栅的传感区域。波导传感器可以按物 质敏感方式使用(参照前面的2，3)，或者与荧光激发和检测相结合具 有高灵敏度(参照前面的1)。俘获分子被固定在传感区域上，然后在附 加具有相似亲和力(竞争)的标记分子的条件下，使被分析物(样品) 与传感区域/俘获分子相接触。或者，被分析物分子可以与固定的俘获分 子结合起来，并且通过另外一个标记物质与俘获的被分析物分子的相互 作用引入荧光标签。照射进波导层中的激光导致荧光团的瞬息激发，从 而允许对分析物进行定量分析。检测所发射的荧光，而且荧光的强度提 供已经在被分析物中存在的亲合对象与所固定的俘获分子之间发生相互 作用的指示。应该注意到在这种类型的设置中，激光辐射于波导内部传 播相当长的距离，而且耦合光栅与传感区域在几何上被分开(参见 WO95/33197和WO95/33198)。
EP-0455067A2描述了一种采用折射率变化检测原理的平面波导传感 器。在整个平台上形成平台浅槽，将偏振的相干光耦合到透明波导层中， 在一段距离之后该光被耦合出去。当被分析物分子与俘获分子结合在一 起时，出射耦合光束的角度发生改变。
US-A-5738825中给出了另一个折射率型的例子。该平台包含与微滴 定度(microtiter)平板的凹槽相接触的单个光栅。
EP178083披露了表面等离子体谐振(SPR)，其中入射光子的能量 被转换为电能作为表面等离子体波。与本发明的平台不同，该传感器结 构要求一金属层，且在临界角下所反射的光量为或近似为零，与之相反 本发明中所反射的强度达到几乎100％。
所有前面的技术都具有多个缺点。其中一些速度非常慢，因为每个 样品必须被分别激发。其它的技术如平面波导，允许一次激发多于一个 样品，不过因为不同俘获元素之间的荧光串扰，由于波导损耗所导致的 激励光强度的局部变化，以及光栅耦合效率变化所导致的局部耦合力改 变，不能提供完整可靠的结果。
发明内容
本发明涉及一种技术，允许以一种非常灵敏、可靠和定量的方式同 时对多个样品进行分析。
与平面波导传感器不同，本发明没有表现出荧光串扰，并且很好地 限定了局部光强。本发明允许真正的多路复用，即转换器(transducer) 不要求成堆的下部结构(如平面波导的情形)，并且可以将其看作一通 用的平台，其中根据要求可以在技术可行的限度内改变识别元件的尺寸 和数量，而不需要改变芯片的结构(不必象平面波导那样将波纹区域与 传感区域分开)。另外，与现有荧光技术相比，本发明所发出的荧光强 度超过大约100倍。该实验装置非常简单，仅需要对入射光束的角度进 行简单调节。本发明中所描述的转换器可以顺利地用于传统荧光显微镜， 共焦显微镜和激光扫描器中。另外，对于具有宽谐振宽度[在半最大值处 限定的全宽度，FWHM(半最大值处带宽)]和谐振位置处于或接近正入 射时，不能使用角度调节。
平台的制造过程相当简单(廉价)，并且可以通过各个装置的适当 改变来很容易地提高现有系统(即荧光扫描器，显微镜，荧光微滴度平 板读出器等)的性能。
根据本发明的第一个方面，提供一种用于样品分析的平台，包括一 具有折射率(n1)的光学透明基板，一形成在该基板的一个表面上的薄的 光学透明层，所述透明层具有一大于(n1)的折射率(n2)；所述平台中 引入一或多个包含周期性沟槽的波纹结构，由其限定一或多个传感区域， 每个传感区域对应一或多个俘获元件，所述沟槽被赋于一定的轮廓、尺 寸和取向，使得或者
a)入射到所述平台上的相干光被衍射成单独的光束或衍射级，其相互 干涉导致透射光束的减少以及入射光的异常高的反射，从而在一或多个 传感区域表面处产生一增强的瞬息场；或者
b)入射在所述平台上的相干的线性偏振光被衍射成单独的光束或衍射 级，其相互干涉导致几乎所有透射光束消失以及入射光的异常高的反射， 从而在一或多个传感区域的表面处产生一增强的瞬息场。
根据本发明的第二个方面，提供一种平台，包括一具有折射率(n1) 的光学透明基板，形成在该基板的一个表面上的一薄的光学透明层，所 述透明层具有大于(n1)的折射率(n2)；所述平台在透明层中引入一基 本上在整个平台上的波纹结构，或者在平台上设置的多个分离的波纹结 构，所述波纹结构包括基本上平行的单衍射或多重衍射的周期性沟槽， 并且沟槽表示一或多个传感区域，其中：
(a)沟槽的深度在3nm至光学透明层厚度的范围内，
(b)光学透明层的厚度在30至1000nm范围内，
(c)波纹结构的周期在200至1000nm范围内，
(d)沟槽深度与光学透明层厚度之比在0.02至1的范围内，并且
(e)沟槽宽度与沟槽周期之比在0.2至0.8范围内。在使用中该设置可 以是这样的，使沟槽具有一定的轮廓、尺寸和取向，使得或者
a)入射到平台上的相干光被衍射成单独的光束或衍射级，其相互干涉 导致透射光束的减少和入射光的异常高的反射，从而在一或多个传感区 域的表面处产生一增强的瞬息场；或者
b)入射在所述平台上的相干的线偏振光被衍射成单独的光束或衍射 级，其相互干涉导致几乎所有透射光束消失以及入射光的异常高的反射， 从而在一或多个传感区域的表面处产生一增强的瞬息场。
如此处所使用的，取向被理解为是指线性偏振光的电场矢量平行于 或垂直于沟槽。如此处所使用的，相干光被理解为是指该辐射的相干长 度，即具有规定相位关系的入射光束的空间扩展，与平台厚度相比此相 干长度更大。
在入射光束(小于1μm)的波长范围内，瞬息场按指数规律衰减。
本发明的一个重要的方面在于平台的使用，在平台中可以产生所谓 的瞬息谐振。在现有技术中已经对异常反射现象进行了理论上的描述， 如SS Wang和RMagnusson在应用光学(Vol.32，No.14，1993年5月10 日，第2606至2613页)中标题为“导模谐振滤波器的理论和应用”的 论文中，和O.Parriaux等人在Pure & Applied Optics5，(1996)(第453-469 页)中题为“作为波导功能元件的耦合光栅”中所描述的。如在这些论 文中所解释的那样，在平面介电层衍射光栅中可能发生谐振现象，其中 当衍射光栅的沟槽具有足够深度并且辐射以一特定角度入射在波纹结构 上时，光能在反射和透射波之间几乎100％地切换。在本发明中在平台的 传感区域中采用这种现象，其中该传感区域包括足够深度的衍射沟槽， 并且引起光以一定角度入射在平台的传感区域上，从而在该传感区域发 生瞬息谐振。这就在传感区域中产生一增强的瞬息场，其被用来激发被 研究样品。应该注意到100％切换指的是使用平行光束和线性偏振相干光 来产生，也可以使用非平行聚焦激光束的非偏振光来获得一增强瞬息场 的效果。
在谐振条件下，单独的光束以这样一种方式进行相互干涉，使透射 光束消失(相消干涉)，且反射光束相长干涉产生异常高的反射。
对于前面提到的波纹层结构，通过选择适当参数，激发能保持高度 定位。在文献中将这种结构描述为光子能带隙结构，其折射率周期性空 间变化的材料使电磁辐射不能沿任何方向传播。光子带隙结构允许出现 高度定位的模式，参见例如C.Adlard，E.R.Pike和S.Sarkar在Phisical Review Letters[第79卷第9期，第1585-87页(1997)]上发表的题为“单 光子状态的定位”的文章。这种结构表现出相当大的传播损耗，相当于 模式定位在μm范围内。
与由例如玻璃或聚合物构成的光学被动平台不同，本发明的平台可 以认为是光学主动的。此处，光学主动意味着通过能量限制增加激发光 束的电磁场。
该平台的基板可以由无机材料，如玻璃、SiO2，石英，Si形成。或 者该基板可以由有机材料，如聚合物，最好是聚碳酸酯(PC)，聚甲基 丙烯酸甲酯(PMMA)，聚酰亚胺(PI)，聚苯乙烯(PS)，聚乙烯(PE)， 聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚氨酯(PU)构成。这些有机材料对 于点护理(POC)和个人化的医疗应用来说尤其优选，因为玻璃在这种 环境中不能被接受。与玻璃相比可以更加容易地形成(压印)塑料基板。 在一个例子中该基板由玻璃构成。
光学透明层可以由无机材料构成。或者可以由有机材料构成。在一 个例子中该光学透明层是一种金属氧化物，如Ta2O5，TiO2，Nb2O5，ZrO2， ZnO或HfO2。该光学透明层为非金属物质。
或者该光学透明层可以由有机材料制成，如聚酰胺，聚酰亚胺，聚 丙烯(PP)，PS，PMMA，聚丙烯酸，聚丙烯醚，聚硫醚，聚苯硫醚和 其衍生物(参见例如S S.Hardeckcr等人，J.Of Polymer Science B： Polymer Physics，Vol.31，1951-63，1993)。
衍射沟槽的深度可以在3nm至光学透明层厚度的范围内，最好为 10nm至光学透明层厚度，例如30nm至光学透明层的厚度。光学透明层 的厚度在30至1000nm范围内，例如50至300nm，最好为50-200nm， 波纹结构的周期可以在200至1000nm范围内，例如200至500nm，最 好为250-500nm，沟槽深度与光学透明层厚度之比可以处于0.02至1范 围内，例如0.25至1，最好为0.3至0.7，而且沟槽宽度与沟槽周期之比 (“占空比”)可以处于0.2至0.8范围内，例如0.4至0.6。
沟槽截面通常可为矩形。或者，沟槽可以为正弦式或锯齿形截面。 表面结构通常可为对称的。优选的几何结构包括矩形，正弦和梯形截面。 或者，沟槽可以具有锯齿形截面(闪耀光栅)或具有其它非对称几何结 构。在另一方面，沟槽深度可以改变，例如在周期调制中沟槽深度发生 变化。
该平台可以是正方形或矩形的，而且沟槽可以沿平台线性扩展从而 覆盖表面。或者平台可以为盘状，而且沟槽可以为圆形或线形。
沟槽可以形成在基板表面上。或者沟槽可以形成在光学透明层的表 面上。作为另一种可选方案，沟槽可以同时形成在基板的表面上和光学 透明层的表面上，基板表面为界面。
可以将单个传感区域的波纹表面设计为在一个特定的激发波长和一 种特定类型的偏振下操作最优。通过适当的方法，如几个相互平行或垂 直的周期性结构的重叠，可以得到适用于平台的多波长应用的周期性表 面起伏，(“多颜色”应用)。或者，可以将一个平台上的单个传感区域 设计为针对不同波长和/或偏振方向操作进行最优。
光学透明层的表面可以包括一或多个波纹化传感区域，其中每个波 纹化传感区域可以携带一或多个俘获元件。
每个俘获元件可以包含能够进行亲合反应的单独的俘获分子和/或俘 获分子的混合。各个俘获元件的形状可以是矩形，圆形，椭圆形或任何 其它形状。单个俘获元件的面积在1μm2到10mm2之间，例如在20μm2 到1mm2，最好在100μm2到1mm2之间。可以将俘获元件设置成规则的 两维阵列。俘获元件中心到中心(ctc)的距离可以在1μm至1mm之间， 例如5μm到1mm，最好为10μm到1mm。
每个传感区域上俘获元件的数量在1到1,000,000之间，最好在1到 100,000之间。在另一方面，可以不限制待固定在平台上的俘获元件的数 量，并且可以相当于例如构成感兴趣的物种或生物体的基因组的基因、 DNA序列、DNA基元、DNA微卫星(micro satelite)、单核苷酸多态性 (SNPs)、蛋白质或细胞碎片的数量，或者它们的选择或组合的数量。 在另一个方面，本发明的平台可以包含两个或多个物种例如小老鼠和大 老鼠的基因组。
为了能够固定俘获分子，该平台可以包含一设置在光学透明层表面 处的粘合促进层。该粘合促进层还可包括一多微孔层(陶瓷，玻璃，Si)， 来进一步增加分析和检测效力，或者包括一个凝胶层，该凝胶层可以用 做实现俘获元件固定和样品分析的介质，从而进一步增加分析和检测效 力，或者在凝胶电泳的意义上允许分析混合物的分离。该平台可以形成 有多个传感区域，每个传感区域具有其自身的衍射沟槽。
本发明平台的特征在于，由于波纹平台的特性，进入光学透明层的 光能被立即衍射出该层。因而没有导波发生或者可以忽略导波。一般传 播距离为100μm或更小，最好为10μm或更小。这是一个非常惊人的短 距离。传播距离是辐射能量减小到1/e时所经过的距离。
本发明的第三个方面在于提供用于分析样品的装置，该装置包括根 据第一或第二方面的平台，用于产生光束和用于引导光束、使光束以某 一角度入射到平台上的装置，使得在平台中发生瞬息谐振，从而在平台 的传感区域中产生一增强的瞬息场，以及用于检测设置在平台传感区域 上的材料特性的装置。入射光在平台上的全反射的角度限制了适合于产 生谐振条件的角度范围。最佳角度小于45°，例如30°或更小，例如20° 至10°或更低，例如0.1°至9.9°。该角度可能等于或近似正入射。光发生 装置可以包括一个用于发射相干激光束的激光器。其它适合的光源包括 放电灯或低压灯，例如Hg或Xe，其所发射的谱线具有足够大的相干长 度，以及发光二极管(LED)。该装置还可能包括用于引导激光束的光 学元件，使得激光束以一定角度θ入射在平台上，以及用于形成相干光束 偏振平面的元件，例如适合于透过线偏振光。可以由表达式θ＝n-λ/Λ来 限定θ，其中Λ为衍射沟槽的周期，λ为入射光的波长，n为光学透明层的 有效折射率。
可以使用的激光器的例子有气体激光器，固态激光器，染料激光器， 半导体激光器。如果需要，可以通过非线性光学元件对发射波长进行倍 频。特别适合的激光器为发射275至753nm之间波长的氩离子激光器， 氪离子激光器，氩/氪离子激光器，以及氦/氖激光器。非常适合的激光器 为二极管激光器或半导体材料的倍频二极管激光器，这些激光器具有小 尺寸和低功率消耗。
另一种适合的激励类型使用VCSEL’s(垂直腔面发射激光器)，可 以分别激励平台上的识别元件。
可以将检测装置设置成用于检测发光如荧光。可以用这种方法来标 记亲合对象，以便在将分析物分子与俘获分子相结合时发生福斯特 ()荧光能量转移(FRET)。取决于层系统的折射率值和相应的 菲涅尔系数，发光强度的最大值可能相对最大异常反射位置发生轻微的 偏移。
样品可以使用未稀释的或者带有添加溶剂的。适合的溶剂包括水， 含水缓冲溶液，蛋白质溶液，天然或人工低聚物或聚合物溶液，以及有 机溶剂。适合的有机溶剂包括酒精，酮，酯，脂肪族羟，醛类，乙腈或 腈。
增溶剂或添加剂可以包括，并且可以是有机或无机化合物或生化反 应剂，如焦碳酸二乙酯，苯酚，甲酰胺，SSC(柠檬酸钠/氯化钠)，SDS (十二烷基硫酸钠)，缓冲反应剂，酶，逆转录酶，RNAase，有机或无 机聚合物。
样品还可以包括不溶于所使用的溶剂的成分，如颜料粒子，分散剂 和天然及合成低聚物或聚合物。
用做标记的荧光染料可以被化学地或物理地，例如通过静电，与一 或多个存在于分析物溶液中和/或固定在平台上的亲合结合对象(或它们 的衍生物)相结合。在亲合反应中所包含的天然产生的低聚物或聚合物 如DNA，RNA，糖类，蛋白质或缩胺酸，以及人工合成的低聚物或聚合 物的情况下，还适合于添加染料。可以通过生物相互作用如生物素/抗生 物素蛋白结合或诸如HIS-tag偶合的金属络合物形成，将发光物质附着 在分析物溶液中存在的亲合对象上。
可以将一或多个发光标记附着在分析物溶液中存在的亲合对象上， 附着在固定在平台上的俘获元件上，或者同时附着在分析物溶液中存在 的亲合对象和固定在平台上的俘获元件上，来定量地确定一或多个亲合 结合对象的存在。可以选择发光标记的光谱特性，使其符合福斯特能量 转移或光致电子转移条件。从而受体和供体的距离和与浓度相关的发光 可以被用于分析物分子的定量分析。
可以在分子间和/或分子内这种结合成亲合反应中所包含的分子的供 体与受体之间相互作用的基础上进行亲合结合对象的定量分析。发光供 体和受体的分子内组合共价地与亲合结合对象相链接，分子信标 (Molecular Beacons)[S.Tyagi等人，Nature Biotechnology(天然生物 工程技术)，1996，14，303-308]改变了亲合反应中供体与受体之间的距 离，还可以被用做用于分析物溶液的俘获分子或添加剂。另外，可以使 用pH和潜在敏感的发光物质或对酶活性敏感的发光物质，如发光衍生物 的酶媒介形成。
转移荧光球(Transfluorospheres)或其衍生物可以被用做荧光标记， 并且化学发光或电子发光分子可以被用做标记。
为了附着在一或多个亲合对象上，对在400nm至1200nm范围内发 光的发光化合物进行功能化或改性，如下列物质的衍生物：
聚苯和杂芳族化合物
1，2-二苯乙烯，
香豆素，
呫吨染料，
次甲基染料，
噁嗪染料，
若丹明，
荧光素，
香豆素，1，2-二苯乙烯，
芘，苝，
菁蓝，氧杂菁蓝，酞菁，紫菜碱，水杨酸菁蓝(naphthalopcyanines)， 偶氮苯衍生物，联苯联苯乙烯，过渡金属络合物例如聚吡啶基/钌络合物， 三(2，2’-联吡啶基)氯化钌，三(1，10-菲咯啉)氯化钌，三(4，7-联苯-1， 10-菲咯啉)氯化钌，和聚吡啶基(polypyridy)/吩嗪/钌络合物，如八乙 基-铂-卟啉，铕和铽络合物可以被用做发光标记。
适用于血液或血浆分析的染料为具有吸收和发射波长在400nm至 1000nm范围内的染料。另外可以使用适合于双或三光子激励的发光物 质。
适用于本发明的染料可以包括用于共价结合的官能团，例如诸如荧 光素异硫氰酸盐的荧光素衍生物。还可适用的是从Amersham生命科学 得克萨斯有限公司和Molecular Probes有限公司买到的有用的荧光染 料。
其它适合的染料包括用脱氧核苷三磷酸盐(dNTP)改性的染料，能 够被酶催化引入到RNA或DNA链中。其它适合的染料包括Quantum Dot 粒子或小珠(Quantum Dot公司，Palo Alto，CA)或其衍生物，或者过 渡金属络合物的衍生物，可以在一个和相同限定波长处被激励，衍生物 在可识别的波长下表现出荧光发射。
可以通过直接结合发光标记检测分析物，或者通过与附加发光标记 的物质进行竞争，或者通过结合到用做一个和/或多个分析物物质和/或俘 获元件的标记的发光供体与发光/电子受体的与浓度-，距离-，pH-，电位 -，或氧化还原电位相关的相互作用来间接地检测分析物。可以测量供体 的发光和/或猝灭剂的发光，来定量分析待分析物。
用相同的方式可以按这种方法来标记亲合对象，使电子转移或光致 电子转移导致对分析物分子与俘获分子相结合基础上的荧光进行抑制。
用于荧光的适当的检测器包括CCD-摄象机，光电倍增管，雪崩光电 二极管，光电二极管，混合光电倍增管。
可以将检测装置设置来另外检测折射率的变化。
可以将入射光束设置来照射传感区域或一个共同平台上的所有传感 区域。或者可以将光束设置成仅照明待分析传感区域的一个小的子区域， 并且可以对光束和/或平台进行设置使它们可以进行相对运动以便扫描平 台的传感区域。
因而，可以以适当方式设置检测装置，以在单个曝光步骤中获得整 个传感区域的发光信号强度。或者可以对检测和/或激励装置进行设置以 便逐步扫描传感区域。
该装置可以包括一贴着(against)平台的传感区域定位的盒，以使样品 与传感区域相接触。该盒可以包含其它装置以便以小规模的方式执行样 品制备、稀释、浓缩、混合、生物/化学反应、分离(参见WO97/02357)。 该装置可以包括用于包含多个待研究样品的微滴定型装置。
本发明的第四个方面提供了一种用于分析一种或多种样品的方法， 包括将样品与根据第一或第二方面的平台的传感区域相接触，用光束照 射该平台使得在平台的传感区域中发生瞬息谐振，并检测从传感区域发 出的辐射。该方法可以包括向被研究样品添加荧光诱发材料，并且检测 由增强的瞬息场激励样品在所述样品中诱发的荧光。或者该方法可以包 括向被研究样品中添加荧光诱发或抑制材料，和/或将被研究样品转变成 荧光或抑制衍生物，并且检测固定在检测平台上的所述样品由增强瞬息 场激励而产生的荧光。
可以相信，提供一种传感器平台，其中每个传感区域具有固定在其 上的不只一个类型的俘获元件或分子，是一个新颖和富于创造性的概念。 无论对于为瞬息谐振模式还是更传统的诸如波导模式而设计的平台来 说，这种概念都适用。因此，根据本发明的另一个方面，提供一种用于 样品分析的平台，所述平台具有一或多个传感区域，每个传感区域用于 接收一或多个俘获元件，当用相干光对该平台进行照射时，其相互作用 可提供亲合反应的指示，其中每个俘获元件包括两种或多种类型的俘获 分子。
现在将仅通过例子，特别是参照附图对本发明进行描述。在附图中：
图1为示意图，说明用于分析根据本发明的平台的光学参数和瞬息 谐振条件的质量控制装置；
图2为示意图，说明根据本发明的传感器平台；
图3为示意图，表示相对于平台的瞬息场分布；
图4a和4b为表示芯片盒的示意图；
图5表示本发明一个实例中的阵列布局图；
图6示意性地表示出根据本发明一个实例的用于测量荧光的配置；
图7表示现有技术和本发明所得到的结果的比较；
图8说明了平台的其它形式；
图9a到9c表示使用目前的平台在例5所描述的谐振条件下，在30pM PM分析物的培育、再生和30pM MM分析物之后得到的荧光图象；
图10表示使用目前的平台在超荧光(epifluorescence)和例6所描 述的谐振条件下得到的荧光图象和数据。
现在将根据对样品中所激发的发光的确定来描述本发明。这种确定 包含了构成本发明一个方面的传感器平台的使用，不过应该理解这种平 台的使用不必限定于所描述的特定应用。在详细描述平台之前，将对其 进行概要说明，其中该平台可以被用于确定样品的发光。
下面是说明中所使用的限定术语。
平台：包含一或多个传感区域的整个变换器/芯片，
传感区域：能够通过谐振效应产生一瞬息场，并包含一或多个俘获 元件的整个波纹区域，
俘获元件：包含一或多种俘获分子种类(species)的单个传感标记 (sensing spot)，
俘获分子：能够进行亲合反应的单个分子。
参照图1表示出根据本发明一个方面的平台(10)，可以接收来自 激光器(11)的相干光，该激光经过透镜组(12，14)被进行扩束，产 生一被扩束的平行光束(16)，并且该光束被偏振片(18)偏振。如同 下面更加详细地解释的那样，平台(10)具有一传感区域，俘获分子固 定在传感区域上。光波长通常处于UV到NIR范围内，最好在350nm至 1000nm范围内。
该装置还包括一检测器(20)用来检测透过平台(10)的光，一CCD 摄象机(21)用来检测所反射的光，以及一数据处理单元(22)。
在该装置的使用过程中，高度平行、扩束的相干线偏振激光束(16) 入射在平台(10)的传感区域上，并且透过该平台的光被检测器(20) 检测，而且所反射的光被CCD摄象机(21)记录。被扩束的激发光束的 直径大于平台(10)的尺寸。通过旋转平台来调节光束在平台上的入射 角度，直到检测器(20)实际检测到没有光透过平台。这表明在平台的 传感区域中存在发生瞬息谐振的谐振位置。在这种条件下，由摄象机(21) 所记录的反射光强度达到最大值，数据处理单元(22)从摄象机得到数 据用于进行处理。
现在参见附图2，该平台(10)的实施例包括一玻璃基板(30)，在 其顶面中蚀刻了多个沟槽(31)。在基板(30)的上表面上沉积一层光 学透明的金属氧化物(32)，且在该层(32)中也形成了沟槽(33)。 该基板(30)可以由玻璃构成，如Schott制造的AF45玻璃，并且通常 厚度为0.5mm-1.0mm。应该理解其它有机或无机材料，只要是光学透明 的均可以用做基板。
光学透明层是一介电透明金属氧化物薄膜，如在633nm波长下具有 大约2.2的高折射率即比基板折射率高很多的Ta2O5。该层的厚度通常在 50至200nm或更大的范围内，例如50至300nm。波纹结构(31)和(33) 的周期在200-1000nm范围内，例如200至500nm，一般为250-500nm。 波纹结构/衍射沟槽的深度可以在3nm至光学透明层厚度的范围内，最好 为10nm至光学透明层的厚度。金属氧化物可以是若干例子诸如Ta2O5， TiO2，Nb2O5，ZrO2，ZnO或HfO2中任意一种。
在如图2所示的平台中，当偏振激光的平行光束以特定入射角入射 其上时，在层(32)中发生称之为异常反射的效应。当发生这种效应时 基本上没有光透过平台(10)，实际上所有的光在层(32)中反射，使 此相干激光被限制在非常薄的金属氧化物层(32)中。所产生的高激光 场部分地泄露到层(32)外面，产生瞬息场，该瞬息场瞬逝激发处于层 (32)表面上或非常邻近处的荧光材料。应该注意，仅当采用具有特定 或更大深度的衍射沟槽(31，33)时能够得到这种谐振条件，还应该注 意这种波纹结构的辐射损失非常高，从而实际上在金属氧化物层(32) 内没有发生最佳波长范围内任何电磁辐射的波导。最好是沟槽的深度至 少为10nm，不过在更浅沟槽时就开始产生瞬息谐振。然而，假设被研究 样品处于谐振发生处的层(32)附近，可以使用增强的瞬息场来激励发 光，如样品中的荧光。
本平台的一个重要特征在于在谐振位置处该瞬息场的幅度比现有技 术的装置(相当于失谐条件的超荧光)大近似100个量级。
这意味着发光强度，例如可以从样品中产生的荧光，也可以被增加100 倍。可以将平台的功能看做起体光栅作用的衍射结构，它衍射光，并且 衍射光束干涉产生谐振条件，其中从第一界面所反射的光和从作为层 (32)上表面的顶面所反射的光相长干涉，产生反射最大值。在谐振条 件下，激光能量基本上被限制在薄层(32)的厚度内，从而增加了电场 强度。对于给定激光波长和波纹结构周期，此谐振具有角度依赖性。角 度依赖性谐振通常在半最大高度(FWHM)处具有的宽度＞0.1°最好是0.5° 或更大，例如1.0°或更大。这种谐振宽度取决于沟槽深度，占空度和波纹 结构的几何形状。与波导光栅的耦合行为相比，所描述谐振的FWHM比 幅值大许多量级。
应该理解，可以通过适当的传统技术在平台上形成衍射沟槽(31， 33)。一种实现该目的的方法为通过照相技术蚀刻沟槽。在这种技术中， 在基板表面上沉积深度大约为1μm的光刻胶成分，然后通过使用双光束 干涉测量术/全息或者使用相位掩模在光刻胶中写入相当于形成沟槽的周 期性结构，然后使用氩气体通过活性离子蚀刻技术对光刻胶进行刻蚀， 最后从表面剥除剩余光刻胶材料。这种技术可以用于形成沟槽(31)和 (33)。引入波纹结构的其它方法包括浮凸印花，电子束写入，激光切 割，LIGA方法。
为了制备图2所描述类型的平台，以便该平台可以用于诸如图6所 说明的测量中，应该采用下述多个步骤。
第一步是清洁平台，以从平台表面去除杂质。可以通过多种方法来 实现该清洁步骤，例如通过紫外清洁器，通过等离子体清洗，或者通过 使用诸如酸性物，碱(bases)，溶剂，气体和液体进行化学清洗。
一旦已经完成平台的清洁，下一步是向金属氧化物层的表面施加一 层粘合促进剂。由于沉积在平台上的俘获元件本身不可能稳定地附着在 金属氧化层上，因而施加该层至平台上。有多种形成该层的方法。一种 方法是形成一层硅烷分子网状结构，另一种方法是使用称之为自组装单 分子层(SAM)。这些已知技术对于本领域技术人员来说是显而易见的。 例如在Colloids and Interface Science 6(L Boksanyi，O Liardon，E Kovats，1976，95-237)中描述的可能包含液态或气态相的硅烷化。例如， Abraham Ulman(1991，Academic Press inc.)在“超薄有机薄膜”中 描述的自组装单分子层的构成。另外，还有其它适合于固定俘获元件的 方法，如
-使用反应基对芯片表面进行化学改性，以及使用适当的衔接物对俘 获分子进行化学改性(U.Maskos和E.M.Southern，Nucleic Acids Research 1992，vol.20，1679-84)，
-使用光致反应链/团对表面和俘获分子进行改性(WO98/27430和 WO91/16425)，
-通过库仑相互作用进行固定(EP 0 472 990A2)，
-在螯合反应中通过标记进行连接(如蛋白质-标记，HIS-标记)，
-以及多种其它方法，例如如Klaus Mosbacher(主编)的Method in Enzymology Academic Press，纽约，Vol.137(1988)，“固定的酶和细 胞”中所描述的，
-等离子体引发包含官能团/反应基的粘合促进层的固定/产生，能够使 俘获分子或衍生的俘获分子直接连接，或者通过化学链接或光化学链接 使俘获分子或衍生的俘获分子间接连接。
例如可以通过具有3-(丙氧基缩水甘油)三甲氧基硅烷(GOPTS) 的硅烷化来制造粘合促进层。包含亲核性基团如胺类的化合物可以与硅 烷的环氧树脂官能起反应来进行共价固定。由于抗体由氨基酸组成，所 以这种硅烷化可以被用于例如包含多个氨基的抗体的固定。另外，作为 俘获分子的DNA/RNA/PNA链(strand)也可以由氨基进行改性，以便使 这些俘获分子共价地附着在平台上，如应用例4所示(SNP识别)。在 这个例子中，具有氨基的寡核苷酸已经被共价地固定在平台的表面处。 不过，为了实现这个目的可以对其它类型的俘获分子进行固定。
另外，为了改变表面特性可以对粘合促进层进行进一步地化学改性。 例如，为了控制平台的疏水/亲水平衡，硅烷化过的GOPTS平台能够与 功能化的饱和或未饱和的有机/杂-有机/无机分子/衍生物发生反应，即改 变平台的接触角。另外，可以使用离子化合物或潜在的离子化合物在平 台的表面处产生正电荷或负电荷。可以通过共价或物理吸附或带电分子 的库仑相互作用或上述方法的混合将俘获分子与改性的表面/平台相结 合。在下面的实施例2中对此进行了说明，其中使用3-氨基-1-丙醇来改 性第二反应步骤中硅烷化GOPTS平台的表面特性，以便固定 DNA/RNA/PNA俘获分子。在这个例子中，在平台表面上引入的氮(胺 基)被质子季铵化，因而提供正电荷与DNA的负电荷反应相互作用(聚 电解质特性)。除了3-氨基-1-丙醇以外，还可以使用其它的胺类有机衍 生物，如脂肪族胺或支化脂肪族胺，或者包含芳香族或非芳香族环状结 构的胺类，或者包含杂原子的胺类，或者包含官能团的胺类，或者包含 其化合物的胺类，来固定俘获分子，例如DNA/RNA/PNA链。
可以使用功能化的有机分子来提供烃链，给平台提供更大的疏水性， 可以使用极性基为平台提供更大的亲水性，或者可以使用离子基或潜在 离子基来引入电荷。例如，可以使用聚乙二醇(PEG)或其衍生物为平台提 供更大的亲水性，防止蛋白质到平台/表面的非特殊的吸收。
可以将反应基或光活性基附在平台的表面上，可以用作进一步反应 步骤的固定基。
通过用双亲的烷基磷酸酯(例如硬脂基磷酸酯)对平台进行处理可 以获得适用于固定抗体的作为粘合促进层的SAM。磷酸酯(盐)首基与 平台表面处的羟基反应，导致形成双亲的烷基磷酸酯(盐)的有序的单 分子层。磷酸氢(Hydrophophic)烷基链为平台的表面提供了疏水性， 使抗体能够进行物理吸附，如实施例6所示(多重免疫测定)。
SAM还可以用于其它俘获分子的固定，例如用于DNA/RNA/PNA 链。在这种情形中，可以使用双亲的磷酸酯(盐)/利用例如胺基或环氧 树脂基改性的磷酸酯(盐)。俘获分子可以直接与SAM结合，例如与胺 改性的SAM结合，或者在平台与胺类的有机衍生物例如脂肪族胺或分支 脂肪族胺，或包含芳香族或非芳香族环状结构的胺类，或者包含杂原子 的胺类，或者包含官能团的胺类，或者包含其化合物的胺类，或者任何 其它有机，杂-有机和/或无机分子(例如环氧树脂改性的SAM)反应之 后进行结合。
粘合促进层可以由多层组成，以便控制表面特性，例如疏水性，接 触角，电荷密度。另外，使用上述方法中任何一种附着在平台上的层可 以提供或引入化学官能度，或者是下一个随后的层要求的，或者用于链 接俘获分子或衍生的俘获分子。也可以将化学链接分子或光化学链接分 子的附着看作一个中间层，能够使俘获分子附着在平台上。
粘合促进层包括一层或多层无机和/或有机分子或其衍生物，提供附 加的化学、物理、光谱和/或光物理、光化学/生物/生化特性，以便控制所 产生的粘合促进层系统的整个功能特性。
这种具有不同官能度的层/分子的受控结合总体上归因于超分子化学 [J-M.Lehn，超分子化学-领域和展望。分子、超分子和分子器件(Nobel Lecture，8.12.1987)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，27，89，1988.]。所得到 的超分子结构提供了一种功能，其不同于用于各个层的单个分子的功能。 对于本发明，中间层也可以将发光物质引入这种层系中，可以在俘获分 子或改性的俘获分子被附着在平台上之前，被用做福斯特能量转移 (FRET)，或者光致电子转移，或者潜在敏感发光物质意义上的能量供 体或能量受体/猝灭剂。
对于前面所描述的表面处理方法，可以使用下面的有机或无机分子 及其衍生物：
胺类，改性的胺类，杰弗胺类(jeffamines)，脂肪族胺，酒精，酸， 醛类，酮，酰胺，酐，磷酸盐(酯)，膦酸盐(酯)，硫酸盐(酯)， 磺酸盐(酯)，硫醇，包含化合物的杂原子，芳香族和脂肪族有机官能 化分子，芳香族和脂肪族杂-有机分子，天然和人工合成聚合物，硅烷， 用化学或光化学反应基改性的分子，其衍生物和功能化的例如所列出各 种的ω-功能化衍生物。
原则上，对于组成一层或多层的层结构的构成，对于所使用的具有 所有上述表面处理的分子，要求化学反应基和/或具有特殊物理或电化学 特性(例如电荷)的化学族。
可以采用化学/光化学相互作用(例如添加剂，亲核性/亲电子性置换， 自由基之间的反应，凝结，与有机/杂-有机/无机羟基衍生物的反应，或 光致反应，或热致反应，Lewis酸/碱原则)，和/或
物理/电化学相互作用(例如库仑相互作用，疏水/亲水相互作用)， 和/或
生物相互作用(例如抗原/抗体，杂化作用，Streptavidin/Avidin-Biotine 相互作用，激动剂/拮抗剂相互作用)，和/或
光化学/光物理相互作用，用于结合这种层系/粘合促进层中所采用的 分子/成分。
还可以通过在平台的表面上沉积一个多微孔层或凝胶来实现粘合促 进，该多微孔层或凝胶的表面特性/功能便于俘获元件的沉积，缩短了所 需要的培养时间，增强了后续测量的灵敏度。多微孔层可以包括有机化 合物，如聚合物，单体，分子集合和超分子集合，或者可以包括无机化 合物，如玻璃，石英，陶瓷，硅和半导体。
可以通过使用例如3-(丙氧基缩水甘油)三甲氧基硅烷(GOPTS) 的硅烷化来制造粘合促进层。为了改变表面特性可以对粘合促进层进行 进一步化学改性。例如，硅烷化的GOPTS平台可以与功能化的饱和的 或未饱和的有机分子发生反应，以便控制平台的疏水/亲水平衡，从而改 变平台的接触角。
一旦已经在平台上形成该粘合促进层，必须采用另外的一或多个清 洁步骤来去除该层的制备过程中所使用的过量的化学材料。在清洁之后， 平台准备好接收俘获元件。
在沉积在平台上之前，在粘合促进层的3-D表面上形成俘获或识别 元件的二维阵列。可以使用多种方法来沉积该俘获元件阵列。用于沉积 俘获元件的技术包括喷墨式打印机，其具有压电致动器，电磁致动器， 压力阀/电磁阀致动器或其它测力传感器；使用热电致动器的喷气泡 (bubble jet)打印机；或激光致动器；环形销打印机；销测位仪装置； 如WO90/03382或WO92/10092中所描述的芯片内合成；非常大规模的 固定聚合物合成(VLSIPS)如WO98/27430中所描述的；固定在粘合促 进层表面处的特殊设计光反应基的光催化/光去保护；微接触打印机；微 接触书写笔；画笔或俘获元件的转移/冲压垫片；通过从诸如PMMA原 版例如使用PDMS(聚二甲氧基硅烷)或通过微机械或机械装置，或者 通过用于俘获元件本地输送的蚀刻技术通过铸造得到微流体通道和流体 单元；通过光切割形成俘获元件结构；或者使用其中一种前面提到的技 术或者任何其它光固定技术将俘获元件沉积在凝胶垫片上。
可沉积在平台上的俘获或识别元件可以有许多，并且可以是各种各 样的。通常来说，所使用的俘获分子应该能够发生亲合反应。可以用在 本平台中的识别或俘获分子的例子如下：
核苷酸，寡核苷酸(和其化学衍生物)
DNA(双链或单链)a)线性(和其化学衍生物)
b)环状(例如质粒，粘粒，BACs，ACs)
总RNA，信使(messenger)RNA，cRNA，线粒体RNA，人工RNA， aptamers PNA(肽核酸)
多克隆，单克隆，重组，工程化抗体，抗原，半抗原，抗体FAB亚 基(如果需要则进行改性)
蛋白质，修饰的蛋白质，酶，酶辅因子或抑制剂，蛋白质复合物， 植物血凝素，组氨酸标记的蛋白质，用于组氨酸标记成分(HIS-tag)的 螯合剂，标记的蛋白质，人工抗体，分子印记，质体膜受体，整个细胞， 细胞碎片和细胞亚结构，突触，激动剂/拮抗剂，细胞，细胞器如微粒体
小分子如苯二氮杂类(benzodiazapines)，
前列腺素，
抗生素，药物，代谢物，药物代谢物
天然产品
碳水化合物和衍生物
天然和人工配体
类固醇，激素
肽
天然或人工聚合物
分子探针
天然和人工受体
及其化学衍生物
螯合反应剂，冠醚，配体，超分子集合
指示剂(pH，电位，膜电位，氧化还原电位)
组织样品(组织微阵列)。
可以使用多种方法使俘获分子的活性或密度最优化。可以将其上沉 积有俘获元件的平台在饱和水蒸汽环境下培养一规定时间，以便使印刷 的轨迹回湿。这可使俘获分子的密度最优化，即增加每单位面积可能的 结合位置。随后可以对所培养的芯片烘烤一定时间，例如对于cDNA俘 获分子在80℃下烘烤一分钟。可以用少量纯净水或任何其它适当液体或 溶液将平台喷湿，以避免过量未结合材料所造成的俘获元件的交叉污染。 在这些过程之后，可以将所制备的平台保存在干燥器中以备使用。在使 用芯片之前，可能要求使用0.1至10ml杂化缓冲液或其它适当的溶液/液 体对其进行另外的冲洗步骤，复活/复水干燥的俘获元件，并且进一步去 除过量的未结合俘获元件/缓冲剂残余物。在DNA俘获分子的情形中， 发现当在50至85℃之间的温度处执行冲洗时，冲洗过程最有效。
可以使用杂化站所，如Genomic Solutions Inc.，Michigan，US的Gene TAC杂交站自动进行芯片操作的处理步骤。
所描述的特殊测量技术为涉及特定荧光的发光。在进行测量时，将 被研究样品放在平台的传感区域上，在平台上设置有俘获元件。为了得 到荧光，在测量开始之前将荧光物质加入系统。可以将荧光物质加入样 品，例如作为被标记的亲合对象，不过还可以将荧光物质附着在平台上 的俘获元件上。测量是基于这个事实，即通过与被分析物或待研究样品 发生相互作用而改变从包含被标记俘获分子的俘获元件和/或从被标记的 亲合对象发出荧光。可以使用不同激励和发射波长的标签，存在一种或 几种不同的标签，标签1用于对照实验，标签2用于实验。
图3示意性地表示出在谐振位置处瞬息场的能量分布，以及它是如 何扩展到金属氧化层(32)表面之外，使得能够激发处于传感区域的表 面邻近处的荧光物质，例如附着于俘获分子的荧光物质或者附着于与俘 获分子(38)结合的分子的荧光物质。在大约一微米范围内，瞬息场呈 指数减小至零。
应该理解到在执行分析时进行一或多个测量。一种可能是样品与俘 获元件接触之前的背景测量。在样品已经与俘获元件相接触或者在样品 与俘获元件接触之后可以进行第二个测量。为了比较多个样品，例如基 因表达实验中“control(控制)”和“treated(处理)”样品，在实施 例2所描述的“control”实验之后芯片可以被再生，可以进行另外的背 景测量和将“treated”样品施加给芯片之后/过程中的测量。为了得到有 关亲合对象的反应动力信息，可以将完整的一组测量作为培养时间和/或 后冲洗时间函数进行记录。图6表示用于这种测量的典型装置。将图2 中所示的平台调节到获得瞬息谐振的角度，并且使用CCD摄象机(66) 测量从平台表面发出的荧光。这就表示从沉积在平台上的俘获元件阵列 上每个位置发出荧光。可以对其进行分析，推论在俘获元件与被研究样 品之间发生的反应的亲合性。
图6中所示的装置在一次曝光中收集了全部发光，例如荧光，一次 曝光中整个平台的图象，在测量过程中不必要运动任何部分。这种非扫 描装置可能会非常简单和廉价，尤其适合于点护理应用或便携系统。另 一种典型的装置利用光学元件将相干激光限制在微米范围内，从而提高 焦点中的电场，并对传感区域进行扫描。
应该理解，可以使用本技术对多种样品进行分析。通常样品被完全 溶解以便分析，这可能包括一种或多种被检测物质。样品可以是净化和 被处理的组织的溶液，或者从活体解剖和实验研发中得到的其它材料， 包括用于诊断目的的样品。样品还可以是生物媒质，如蛋黄，体液或其 组成部分，如血液，血清和尿。还可以为地表水，溶液或从天然或合成 媒质中的提取物，如土壤或植物的一部分，来自生物方法的液体或合成 液体。
为了进行测量，可以将样品放入图4a和4b所示类型的样品盒中。 该盒包括一由诸如PMMA的聚合物制成的外壳(41)。已经将这种聚合 物加工成限定一个中心隔室(44)，中心隔室的尺寸相当于平台的尺寸。 在隔室(44)中形成另一个凹陷来限定一小室(46)，通过O-形环(47) 对小室(46)的边缘进行密封。小室(46)在其顶部和底部是敞开的。 可以通过流送线(45)将被分析溶液引入到O-形环(47)中的小室(46) 内。可以通过阀门(43)控制流送线(45)中的流量。该盒包括一个盖 子(49)，盖子设置在外壳上面并固定于外壳(41)上，以封闭盒的顶 部。盖子(49)包括一位于隔室(46)上的窗(50)，从而允许辐射穿 过盖子进入盒(46)。
在使用该盒时，外壳(41)邻接平台的表面设置，在平台上形成有 俘获元件，使得盖子(49)远离该表面。这使得隔室(46)与平台的传 感区域相通。然后通过流送线(45)将被研究样品加到隔室(46)中， 使得与平台表面上的俘获元件相接触。然后如前所述在多个俘获点处对 所产生的荧光进行测量。
图8说明平台可选择的形状。
可以用多种方法设置传感元件，例如矩形，圆形，正六边形同心， 椭圆形，线形或错综复杂的形状。传感区域可以是矩形，圆形或任何其 它形状。沟槽可以被设置成等间距直线，或者等间距圆形，或者可以相 当于这种结构的一部分。
平台可以是矩形或盘形或者为任何其它几何结构。该平台包括一或 多个传感区域，每个传感区域包括一或多个俘获元件，并且每个俘获元 件可以包括一或多个被标记的或没有被标记的俘获分子。
该平台还适合于微滴定型平板/装置以在单个微滴定穴(well)中执行一 或多个分析。对于所有平板类型：96，384，1536，或者更高数量的微滴 定穴都可以实现，与各个微滴定平板的尺寸无关。
下面是平台的特例：
1.3-D平台的物理性能：异常反射
1a.平台1
基因芯片变换器平台包括一0.7mm厚的平面透明基板(Schott制造 的玻璃AF45)。在该基板中使用光刻方法(沉积光刻胶，＜1μm；通过 双光束干涉/全息在光刻胶中写入周期性结构；使用氩气体用活性离子刻 蚀来蚀刻光刻胶；剥离残余光刻胶)蚀刻一周期性表面结构。
该表面结构的形状接近于正弦形。单个结构的宽度(周期)为360nm。 沟槽的深度为大约38nm。
在均匀结构的玻璃表面上面沉积一绝缘的透明金属氧化物薄膜 (Ta2O5)，该金属氧化物薄膜在633nm波长下具有大约2.2的高折射率。 通过离子电镀法来沉积金属氧化物薄膜。层厚为130nm。由于高能量和 各向异性沉积过程，玻璃表面的主要结构被转移到金属氧化物层的顶面。
当高度平行、扩束的相干激光束以特殊的角度θ(对应于所谓的谐振 位置)照射到变换器上时，几乎所有的光被变换器平台反射，0级透射强 度被减小到小于1％(与任意角度处的90-95％相比)。
几乎所有的光均被反射的谐振条件的宽度Δθ，与波长λ(633nm，固 定的)和辐射损失系数α成正比。辐射损失系数受光栅沟槽深度、波纹结 构的几何结构和占空度的影响，且随着沟槽深度的增加几乎呈二次方增 加。对于我们的情形(激光波长633nm，130nm金属氧化物层，38nm 沟槽深度)，辐射损失系数大约为2000/cm，即在这种层系中所引导的激 光束的传播距离，在由该周期结构衍射出平台之前，为1/2000cm＝5μm。 这是一个相当短的距离。从而在这些条件下没有波导发生。通过改进平 台主要参数，可以进一步减小传播距离。
作为谐振效应的特征，对于4mm直径区域将平行光束(TE偏振) 的强度调节为100μW(Newport NRC1835功率计)。平台法线与入射光 束之间的角度被旋转为偏离异常反射的中心位置(谐振条件)1至2度。 中心位置处于2.5°。然后以5/1000°步进速度(Newport NRC控制器 PM500)对平台进行旋转，并改变监测到的透射光束的功率。在谐振角 下，少于1％(＜1μW)的初始透射光束到达检测器。入射激光束的功率 被完全反射(镜面反射光束：接近100％)。
在我们的情形中，对于异常反射的半最大值处的全宽度(FWHM) 为0.9°。在整个传感器表面上(18mm×18mm)反射的均匀性优于90％。
1b.平台2
表面结构的形状接近于矩形。单个结构的宽度(周期)为360nm。 沟槽的深度为大约52nm。在均匀结构的玻璃表面上沉积一层介电透明金 属氧化物薄膜(Ta2O5)，该金属氧化物薄膜在633nm波长处具有大约2.15 的高折射率。通过溅射来形成金属氧化物薄膜。层厚为150nm。由于高 能量和各向异性沉积过程，玻璃的主要结构被转移到金属氧化物层的顶 面。
当高度平行、扩束的相干激光束以相当于谐振位置的特殊角θ照射到 传感器上时，几乎所有的光都被传感器平台反射，0级透射光强度被减小 到小于1％(与任意角度处的90-95％相比)。
几乎所有的光均被反射的谐振条件的宽度Δθ，与辐射损失系数α成正 比。对于我们的情形(激光波长633nm，150nm金属氧化物层，52nm 沟槽深度)，辐射损失系数大约为2000/cm，即在这种层系统中所引导的 激光束的传播距离，在由周期结构衍射出平台之前，1/2000cm＝5μm。 从而在这些条件下，没有波导发生。
作为谐振效应的特征，对于4mm直径区域将平行光束(TE偏振) 的强度调节为600μW(Newport NRC1835功率计)。平台法线与入射光 束之间的角度被旋转为偏离异常反射位置(谐振条件)4度。然后以5/1000° 步进速度(Newport NRC控制器PM500)对平台进行旋转，改变监测到 的透射光束的功率。在谐振角，少于0.5％(＜3μW)的初始透射光束到 达检测器。入射激光束的功率被完全反射(镜面反射光束：接近100％)。
由于根据与平台1相比更深的沟槽，扩展了平台2的谐振宽度，+1 和-1衍射级的谐振曲线相互重叠，在法线入射处产生单一极宽的谐振。 对于异常反射半最大谐振值的全宽度(FWHM)在我们的情形中为4.2°。 在整个传感器表面(18mm×18mm)上反射的均匀性优于95％。
2.用于基因表达分析的例子
a)制备
参照图2所描述的类型的传感器平台(尺寸18mm×18mm2)首先被 在三氯甲烷(FLUKA，“purriss.”)中超声处理两次，然后在异丙醇(Merch， “Uvasol”)中处理两次，每次15分钟。然后将该平台在真空中干燥， 并且用UV清洁剂(Boeckel industries Inc，model 135500)清洁30分钟。 将邻二甲苯加热到75℃(搅拌)，并且将2％v/v 3-环氧丙氧基丙基-三甲 氧基硅烷(Fluka，“purum”)以及0.2％v/v N-乙基二异丙基胺 (Fluka，“purum”)加入到加热的溶剂中(搅拌)。将该平台安装在框 架中，然后在75℃下在溶液中培养7小时(搅拌)。随后，将该平台放 入新鲜的乙腈(Fluka，“HPLC等级”)中超声处理三次，每次15分钟。 然后将该平台在2％v/v 3-氨基-1-丙醇(Fluka，“purum”)溶液中在乙 腈中超声处理15分钟，然后在室温下在相同溶液中培养一整夜(搅拌)。 第二天，首先在新鲜的异丙醇(Fluka，“HPLC等级”)中将该平台超 声处理三次15分钟，随后在新鲜的甲醇(Merck，“Uvasol”)中处理三 次15分钟。最后，干燥该平台，并将其保存在真空干燥器中。
b)识别元件的固定
使用喷墨打印机(Microdrop GmbH，Norderstedt，德国)将包括10 个不同cDNA的阵列(每个cDNA10重复为：CYP 450 1A1，CYP450 2B1 EST.，CYP 450 2B1，CYP 450 2B2，CYP 450 3A1 humen，CYP 450 3A2， CYP 450 4A1，β-肌动蛋白，GAPDH，外标物)印在平台上。cDNA溶液 的浓度为50ng/μL。直径(10个喷墨液滴/位置)为大约250μm，斑点之 间的间距大约为500μm。从而，10×10阵列的整个尺寸大约为5×5mm2。 图5示意性地表示出所固定的cDNA斑点的排列和说明。阵列被印制在 尺寸为(18×18mm2)的平台的中心。随后，在饱和水蒸汽氛围中在密封 容器内将该平台培养一整夜。第二天，将所培养的芯片烘烤一预定时间， 比如说在80℃下烘烤一分钟。然后用去离子水冲洗该平台，并使用氮气 进行干燥。
c)检测设备
图6中示意性地表示出所使用的检测设备。激励激光器(61)(HeNe 激光器，633nm，1.3mW)和20×扩束器(64)共同(62)固定在角度计 (63)上。二向色反射镜(68)将扩束的激光光束朝向平台(67)引导。 激光束的旋转中心处于平台(67)的金属氧化物层的平面内。从平台表 面发射的荧光经过二向色反射镜(68)被收集。另外使用荧光滤色片(65) 将荧光(69)从激励光中分离出来。使用装配有Nikon Noct镜头(数值 孔径1.2)的冷却的CCD摄象机(Astrocam EEV 30/11)测量从平台表 面发出的荧光图象。角度计允许调节入射的扩束的激光束相对平台的表 面法线的角度。在瞬息谐振条件(即调节入射的扩束激光束的角度，使 透过平台的光表现为最小)下拍摄荧光图象。
d)芯片盒
图4示意性地表示出将该平台安装在由PMMA/聚合物制造的特别设 计的盒(41)中。凹陷(44)区域的尺寸为(18×18×0.7mm3)，培养室 (46)为0.2mm深。培养室中的溶液通过0.5mm直径的流通道(45) 进行交换，流通道穿入PMMA中。通过进口/出口(42)交换盒的内含 物。将平台设置在该盒的相应的凹陷区中，使传感区域朝向培养室。固 定盖子(49)，按压平台使之密封。盖子中铣出的/微切削加工出的窗口 (50)允许激励光的照射和获取平台表面的荧光图象。盒子的阀门到阀 门之间的体积为大约14μL。
e)变性单元
使用热电元件控制流体盒中平台的变性(79℃)，培养(42℃)， 再生(79℃)和清洗(42℃)温度。
f)样品制备
使用2组老鼠(每组3只)用于当前研究。使用80mg苯巴比妥，钠 盐，在每千克活体重量(0.9％w/v NaCl)溶液中处理一组老鼠(treated)， 并且仅使用0.9％NaCl处理第二组老鼠(control)。连续进行4天处理。 在4天末，动物被杀死，使用液氮迅速冻结肝脏样品，并保存在-80℃下。
随后，分离总RNA/mRNA并通过反向翻译标记成第一链cDNA(采 用标记的脱氧核苷酸，与用于控制和处理的荧光标签相同或不同)，净 化并溶解于20μL杂化缓冲剂中。
g)分析过程
使用Cavro步进喷水器将缓冲剂和溶液抽取/吸出到盒中。执行下面 的步骤测量老鼠中的CYP450电感应：
1)在79℃下使用1ml杂化缓冲剂(HB)预冲洗30分钟，对与HB 接触的平台的背景1进行测量。
2)将“control”样品注入盒中，在79℃下变性30分钟，然后在42℃ 下培养一整夜。
3)在42℃下使用1mL HB后冲洗10分钟，测量与HB接触的平台 的“control”强度。
4)再生：在79℃下使用1mL杂化缓冲剂(HB)冲洗30分钟，测 量与HB接触的平台的背景2。
5)将“treated”样品注入盒中，在79℃下变性30分钟，然后在42℃ 下培养一整夜。
6)在42℃下使用1mL HB后冲洗10分钟，测量与HB接触的平台 的“treated”强度。
在瞬息谐振条件下对所有荧光图象进行测量。
h)数据处理
计算所有斑点的净强度(control-背景1和treated-背景2)，并且 在外标物强度的帮助下对treated数据组的所有强度进行归一化。通过除 法计算出各个基因之间的表达比率(重叠改变)
重叠改变＝归一化的treated/controll
计算出每10个重复实验的平均值。
i)结果
在瞬息谐振条件下测量的ER-芯片通常表示大约100倍的增强强度 和改进的信号/背景比值。
下表中概括了重叠改变的平均值：
基因 重叠改变 CYP 4501A1(老鼠) 1.6 CYP 4502B1EST.(老鼠) 16 CYP 4502B1(老鼠) 25 CYP 4502B2(老鼠) 32 CYP 4503A1(人) 3.2 CYP 4503A2(老鼠) 2.5 CYP 4504A1(老鼠) 1.6 β-肌动蛋白(老鼠) 2.1 GAPDH(老鼠) 2.3
3.说明增强放大的例子
根据刚描述的例子制备和处理平台。在对样品2进行培养之后，参 照图6，使用前面所描述的CCD摄象机检测装置拍摄2个图象。在不调 节瞬息谐振条件的超荧光模式下拍摄第一幅图象(图7a中的“超荧光”)。 在瞬息谐振条件下(7b中的“ER增强”)拍摄第二幅图象，即调节入 射激光束相对表面法线的角度直到透过芯片的光表现为最小。图象分布 (净信号)表明使用ER-增强所测得的强度比传统超荧光所得到的强度 大大约100倍。
在前面所描述的例子中，使用单个样品单元(41)使样品与平台的 传感区域相接触。应该理解，可以使用微滴定型样品容器来补偿具有多 个传感区域的平台，以允许对多个样品进行测量，从而改善测量效率。
4.用于识别单核苷酸多态性(SNP)的寡核苷酸微芯片
a.芯片制备
参照图2所描述的类型的传感器平台(尺寸18×18mm2)首先在三氯 甲烷(FLUKA，“purum”)中超声处理两次，然后在异丙醇(Merck， “Uvasol”)中处理两次，每次15分钟。然后在真空干燥器中干燥该平 台，并在UV清洁剂中清洁30分钟(Boeckel Industries Inc，model 135500 型)。将邻二甲苯加热到75℃(搅拌)，并且将2％v/v环氧丙氧基丙 基-三甲氧基硅烷(Fluka，“purum”)和0.2％v/v N-乙基二异丙胺(Fluka， “purum”)添加到加热的溶剂中(搅拌)。然后将该平台安装在框架中， 并在75℃下在溶液中培养7小时(搅拌)。随后，使用新鲜的乙腈(Fluka， “HPLC等级”)对该平台冲洗三次，每次15分钟。最后干燥该平台并 将该平台保存在真空下。
b.俘获元件的固定
将两种不同的氨基改性的寡核苷酸(俘获探针)在硅烷化过的平台 上印制成方格状排列(5×5＝25个斑点)。GMS 417环形针阵列用于印刷 (Genetic Microsystems，Boston，MA)。用做俘获分子的寡核苷酸的浓 度为100nmol/ml。斑点的直径为125微米，中心到中心的距离为500微 米。2寡核苷酸被称为cPM(“俘获最佳匹配”)和cMM(“俘获失配”)， 其差别仅在于一个基：
cPM：3‘CACAATTCCACA5‘-NH2
cMM：3‘CACAACTCCACA5‘-NH2
cPM和cMM在5‘端标记以氨基，使得寡核苷酸能够与环氧功能化 的平台共价结合。该阵列印制在尺寸为(18×18mm2)的平台的中心。随 后在饱和水蒸汽氛围中在密封容器中将该平台培养一整夜。第二天对芯 片进行干燥，并用1ml含水50％的尿素溶液冲洗该平台。或者，使用含 水牛血清溶液(BSA，1mg/ml)。在对芯片进行分块之后，用去离子水冲 洗该芯片，然后用氮气流进行干燥。
c.检测装置
使用前面例子中所描述的CCD装置。
d.芯片盒
使用前面例子中所描述的盒。
e.被分析物/样品
两个被Cy5-标记的称为PM(“最佳匹配”)和MM(“失配”) 的顺序为被固定的俘获寡核苷酸cPM和cMM的寡核苷酸用做被分析物：
PM：Cy5-5‘GTGTTAAGGTGT3‘
MM：Cy5-5‘GTGTTGAGGTGT3‘
被分析物溶液的浓度均为30pM。
f.分析过程
首先用1ml杂化缓冲剂(HB)冲洗平台两次，在冲洗过程之间有1 分钟的延迟。随后将大约15微滴定PM被分析物溶液(30pM)注入到 流体盒中。在30分钟的培养之后，用1ml HB冲洗该平台，在芯片的谐 振位置拍摄荧光图象(图9a中的“PM”)。随后，通过注入2×1ml的 含水50％尿素溶液，在注入之间有2分钟延迟，去除所结合的被荧光标 记的寡核苷酸(搅拌)。在另外的2分钟之后，通过注入2×1ml HB对芯 片进行清洗，两次注入之间延迟2分钟，并且在芯片的谐振位置拍摄荧 光图象(图9b中的“再生”)。最后，将大约15个微滴定MM被分析 物溶液(30pM)注入流体盒中。在30分钟的培养之后，用1ml的HB 再次对平台进行冲洗，并在芯片的谐振位置处拍摄荧光图象(图9c中的 “MM”)。所有步骤均在室温下执行。
g.数据处理
对于两个实验(培养30pM PM被分析物和30pM MM被分析物) 计算2不同组俘获点(cPM和cMM)的平均强度。另外，计算平均强度差 cPM-cMM和比值cPM/cMM。
h.结果
下表中概括了计算得出的所有数据。可以从所得到的数据清楚地识 别两个被Cy-5标记的PM和被Cy-5标记的MM、其差别仅在于一个基 (SNP)的寡核苷酸被分析物。
5.用于抗体免疫分析的例子
主要抗体被空间地溶解固定(例如方格图案)在传感器平台的表面 上。通过后续培养使被检测抗原与荧光标记的次级抗体结合(用于被检 测的各个抗原的第二抗原决定基表位的检测)，首先使用包含不同浓度各 种抗原的被分析物，然后使用荧光标记的次级抗体。
或者，可以在预培养阶段混合抗原(被分析物)与荧光标记的次级 抗体，允许荧光标记的次级抗体与抗原发生络合。在这个预培养步骤之 后，使用该混合物培养该传感器平台表面。
使用ER-装置定量分析与表面结合的荧光标记的免疫络合物(使用 适当的缓冲剂，PBS进行预冲洗如果需要进行后冲洗)。
6.用于多重免疫分析的蛋白质-微芯片
a.芯片制备
将前面所述类型的传感器平台(尺寸18×18mm2)在三氯甲烷(FLUKA， “purriss.”)中超声处理两次，随后在异丙醇(Merck，“Uvasol”)中处理 两次，每次15分钟。在真空中干燥该平台，并在UV清洁剂中清洗30 分钟(Boeckel工业公司135500型)。将芯片放置在一个小容器中，并 在0.5毫摩尔十八烷基磷酸盐的丙醇溶液中保存24小时。然后，用5ml 异丙醇冲洗该芯片来去除过量的烷基磷酸盐，并在氮气流中进行干燥。 该过程在平台的表面处产生了一种烷基磷酸盐的自聚集单分子层 (SAM)。该粘合促进层使该平台具有疏水性(接触角大约为100°)， 并且通过疏水相互作用对平台上的蛋白质进行吸附。
b.俘获元件的固定
在饱和水蒸汽氛围中将两种不同的单克隆抗体，抗-人体绒毛膜促 性腺激素(抗-hCG)和抗-白介素(抗-IL6)按方格状排列(4×4阵列， 每个抗体8个点)印到疏水的平台上。俘获抗体溶液的浓度分别为400 和100微克/毫升。使用喷墨打印机进行印制(Microdrop，Norderstedt，德 国)。点的直径为150微米，中心到中心的距离为320微米。在饱和水 蒸汽氛围中在密封容器内将所印制的阵列培养2小时。随后，干燥该芯 片，并用包含10％牛血清白蛋白(BAS)，5％蔗糖和0.02％叠氮化钠的 10ml磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS)进行冲洗。通过BSA的吸附作用该冲 洗步骤保护芯片的疏水性表面，并使在俘获元件被固定之后，该表面更 具亲水性。因此，该保护步骤防止蛋白质与平台的非特定结合，而且非 特定结合会导致背景荧光的增加。在保护之后，使用去离子水冲洗芯片 并用氮气干燥芯片。将该平台保存在冷藏箱中备用。
c.检测装置
使用例2中所描述的CCD装置。
d.芯片盒
使用例2中所描述的盒。
e.被分析物/样品
制备3种被分析物溶液：
I)包含500ng/ml Cy-5标记的IL6的溶液，抗原
II)包含50ng/ml Cy-5标记的人类绒毛膜促性腺激素(hCG)的溶 液，抗原
III)包含50ng/ml IL6和100ng/ml用Cy5标记的多元性繁殖系抗-IL6 抗体的预培养混合物(1小时)，
包含1％BSA的PBS pH7.0，用做被分析物的溶剂。
f.分析过程
制备三个平台(如6b所描述的)用于被分析物的培养，将平台安装 在盒中并用包含1％BSA的1毫升PBS pH7.0冲洗平台。随后，将大约 15微滴定被分析物溶液I)，II)和III)注入流体盒中。对于I)和II)， 每种的培养时间为2小时。对于被分析物III)，培养时间为12小时。在 对被分析物培养之后，用包含1％BSA的1毫升PBS pH7.0冲洗该平台。 在非谐振条件下拍摄荧光图象(超荧光，大约偏离谐振角7°)，并在谐 振条件下对每个芯片进行拍摄(谐振时，入射光相对法线大约为2.5°)。 图10中表示出所得到的图象和数据。所有步骤均在室温下进行。
g.数据处理
在Imagene Array软件(Biodiscovery，Los Angeles，CA)的帮助下 计算点的平均强度和背景。图10中的点平均表示用背景校正的感兴趣的 各个俘获元件的平均强度。另外，噪音被计算出作为背景与荧光图象的 标准偏差。从而，图10中的信号/噪音相当于背景标准偏差上的点平均之 比。
h.结果
图10中概括了计算得出的所有数据。图10中概括了在超荧光模式 和谐振条件下所得到的图象和数据。行I)和II)表示被固定的单克隆俘 获抗体与被标记的抗原(分别为Cy-5标记的IL6和hCG)之间免疫反 应的结果。行III)相当于被固定的单克隆抗体(抗-IL6)与预培养的IL6 抗原和相对IL6的Cy5-标记的次级多元性繁殖系抗体的混合物之间的三 明治型免疫反应。
对于行I)的结果，信号强度从超荧光模式中的读数46增加到平台 的谐振模式中的读数1100。这相当于相对点平均值增强大约24倍。信号 /噪音比从7.0(超荧光)增加到69.2(谐振)，相当于10倍。
对于行II)的结果，信号强度从超荧光模式中的读数32增加到平台 的谐振模式中的读数646。这相当于相对点平均值增强了大约20倍。信 号/噪音比从5.0(超荧光)增加到75.1(谐振)，相当于15倍。
对于行III)的结果，信号强度从超荧光模式中的读数25增加到平台 的谐振模式中的读数296。这相当于相对点平均值增强大约12倍。信号/ 噪音比从3.8(超荧光)增加到44.1(谐振)，相当于12倍。
对于所有3个分析来说，处于谐振模式的芯片与非谐振模式(超荧 光)模式的同一芯片相比，点平均和信号/噪音比都高一个量级。行I) 和II)的荧光图象是互补的(方格形排列)。使用的所有芯片具有相同 组的俘获元件，即单克隆抗-hCG和单克隆抗-IL6。
应该理解对于所描述的实施例可能有多种可选方案。
本平台的另一个特征在于允许并行获得更大批的数据。并且该平台 可以多次使用。在升高温度下使用有机溶剂和/或赵托吡卡(chaotropic)反 应剂(盐溶液)可以对被固定的亲合络合物进行再生，同时基本上完全 地保持结合力。
在前面所给出的描述中，整个传感区域的面积被照射。还可能使用 未扩束的聚焦激光束，扫描传感区域，使得目标俘获元件依次被激活。 这种设置允许使用比CCD摄象机更廉价的光电检测器，例如可以使用光 电倍增管或雪崩光电二极管。并且由于激光能量被更有效地限制，这种 设置将进一步增强灵敏度。
还可能根据本发明设计平台，用做显微镜用载玻片，从而允许它们 和荧光显微镜一起使用。
还可以将该平台设计为与大型微观射流系统(microfluidic system)一 起使用，如WO97/02357中所描述的。
在前面的描述中，已经描述了平台在激励和传感荧光中的应用。应 该理解可以将该平台用于通过发光的改变检测亲合反应的装置中。还应 该理解该平台可以用于通过折射率变化检测亲合反应的装置中。
根据本发明的平台可以用于多种应用中，下面为非排他性列表。
-基因表达
-基因组学
-药物基因组学
-毒理基因组学
-毒理蛋白质组学
-遗传学
-药物遗传学
-毒理遗传学
-外显子/内含子表达分布
-人类白细胞抗原(HLA)定型
-剪接变体的分析
-蛋白质组学(芯片上蛋白质分析)
-病人监视(药物，代谢物和标记)
-点护理，“个人化药物”
-诊断学
-用于蛋白质组学的芯片上2d凝胶或通常的2d分离
-SNP(单核苷酸多态性)，小量测序
-高处理量筛选
-组合化学法
-蛋白质-蛋白质相互作用
-分子间相互作用
-基于芯片的蛋白质-抗体和肽相互作用
-绿色荧光蛋白(GFP)
-原位杂交
-共焦显微术
-荧光相关光谱术(FCS)
-传统显微术
-MALDI-TOF MS
与平面波导传感器不同，本发明没有表现出荧光串扰，并且很好地 限定了局部光强。本发明允许真正的多路复用，即转换器(transducer) 不要求成堆的下部结构(如平面波导的情形)，并且可以将其看作一通 用的平台，其中根据要求可以在技术可行的限度内改变识别元件的尺寸 和数量，而不需要改变芯片的结构(不必象平面波导那样将波纹区域与 传感区域分开)。另外，与现有荧光技术相比，本发明所发出的荧光强 度超过大约100倍。该实验装置非常简单，仅需要对入射光束的角度进 行简单调节。本发明中所描述的转换器可以顺利地用于传统荧光显微镜， 共焦显微镜和激光扫描器中。另外，对于具有宽谐振宽度[在半最大值处 限定的全宽度，FWHM(半最大值处带宽)]和谐振位置处于或接近正入 射时，不能使用角度调节。
平台的制造过程相当简单(廉价)，并且可以通过各个装置的适当 改变来很容易地提高现有系统(即荧光扫描器，显微镜，荧光微滴度平 板读出器等)的性能。
根据本发明的第一个方面，提供一种用于样品分析的平台，包括一 具有折射率(n1)的光学透明基板，一形成在该基板的一个表面上的薄的 光学透明层，所述透明层具有一大于(n1)的折射率(n2)；所述平台中 引入一或多个包含周期性沟槽的波纹结构，由其限定一或多个传感区域， 每个传感区域对应一或多个俘获元件，所述沟槽被赋于一定的轮廓、尺 寸和取向，使得或者
a)入射到所述平台上的相干光被衍射成单独的光束或衍射级，其相互 干涉导致透射光束的减少以及入射光的异常高的反射，从而在一或多个 传感区域表面处产生一增强的瞬息场；或者
b)入射在所述平台上的相干的线性偏振光被衍射成单独的光束或衍射 级，其相互干涉导致几乎所有透射光束消失以及入射光的异常高的反射， 从而在一或多个传感区域的表面处产生一增强的瞬息场。
根据本发明的第二个方面，提供一种平台，包括一具有折射率(n1) 的光学透明基板，形成在该基板的一个表面上的一薄的光学透明层，所 述透明层具有大于(n1)的折射率(n2)；所述平台在透明层中引入一基 本上在整个平台上的波纹结构，或者在平台上设置的多个分离的波纹结 构，所述波纹结构包括基本上平行的单衍射或多重衍射的周期性沟槽， 并且沟槽表示一或多个传感区域，其中：
(a)沟槽的深度在3nm至光学透明层厚度的范围内，
(b)光学透明层的厚度在30至1000nm范围内，
(c)波纹结构的周期在200至1000nm范围内，
(d)沟槽深度与光学透明层厚度之比在0.02至1的范围内，并且
(e)沟槽宽度与沟槽周期之比在0.2至0.8范围内。在使用中该设置可 以是这样的，使沟槽具有一定的轮廓、尺寸和取向，使得或者
a)入射到平台上的相干光被衍射成单独的光束或衍射级，其相互干涉 导致透射光束的减少和入射光的异常高的反射，从而在一或多个传感区 域的表面处产生一增强的瞬息场；或者
b)入射在所述平台上的相干的线偏振光被衍射成单独的光束或衍射 级，其相互干涉导致几乎所有透射光束消失以及入射光的异常高的反射， 从而在一或多个传感区域的表面处产生一增强的瞬息场。
如此处所使用的，取向被理解为是指线性偏振光的电场矢量平行于 或垂直于沟槽。如此处所使用的，相干光被理解为是指该辐射的相干长 度，即具有规定相位关系的入射光束的空间扩展，与平台厚度相比此相 干长度更大。
在入射光束(小于1μm)的波长范围内，瞬息场按指数规律衰减。
本发明的一个重要的方面在于平台的使用，在平台中可以产生所谓 的瞬息谐振。在现有技术中已经对异常反射现象进行了理论上的描述， 如SS Wang和RMagnusson在应用光学(Vol.32，No.14，1993年5月10 日，第2606至2613页)中标题为“导模谐振滤波器的理论和应用”的 论文中，和O.Parriaux等人在Pure & Applied Optics5，(1996)(第453-469 页)中题为“作为波导功能元件的耦合光栅”中所描述的。如在这些论 文中所解释的那样，在平面介电层衍射光栅中可能发生谐振现象，其中 当衍射光栅的沟槽具有足够深度并且辐射以一特定角度入射在波纹结构 上时，光能在反射和透射波之间几乎100％地切换。在本发明中在平台的 传感区域中采用这种现象，其中该传感区域包括足够深度的衍射沟槽， 并且引起光以一定角度入射在平台的传感区域上，从而在该传感区域发 生瞬息谐振。这就在传感区域中产生一增强的瞬息场，其被用来激发被 研究样品。应该注意到100％切换指的是使用平行光束和线性偏振相干光 来产生，也可以使用非平行聚焦激光束的非偏振光来获得一增强瞬息场 的效果。
在谐振条件下，单独的光束以这样一种方式进行相互干涉，使透射 光束消失(相消干涉)，且反射光束相长干涉产生异常高的反射。
对于前面提到的波纹层结构，通过选择适当参数，激发能保持高度 定位。在文献中将这种结构描述为光子能带隙结构，其折射率周期性空 间变化的材料使电磁辐射不能沿任何方向传播。光子带隙结构允许出现 高度定位的模式，参见例如C.Adlard，E.R.Pike和S.Sarkar在Phisical Review Letters[第79卷第9期，第1585-87页(1997)]上发表的题为“单 光子状态的定位”的文章。这种结构表现出相当大的传播损耗，相当于 模式定位在μm范围内。
与由例如玻璃或聚合物构成的光学被动平台不同，本发明的平台可 以认为是光学主动的。此处，光学主动意味着通过能量限制增加激发光 束的电磁场。
该平台的基板可以由无机材料，如玻璃、SiO2，石英，Si形成。或 者该基板可以由有机材料，如聚合物，最好是聚碳酸酯(PC)，聚甲基 丙烯酸甲酯(PMMA)，聚酰亚胺(PI)，聚苯乙烯(PS)，聚乙烯(PE)， 聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚氨酯(PU)构成。这些有机材料对 于点护理(POC)和个人化的医疗应用来说尤其优选，因为玻璃在这种 环境中不能被接受。与玻璃相比可以更加容易地形成(压印)塑料基板。 在一个例子中该基板由玻璃构成。
光学透明层可以由无机材料构成。或者可以由有机材料构成。在一 个例子中该光学透明层是一种金属氧化物，如Ta2O5，TiO2，Nb2O5，ZrO2， ZnO或HfO2。该光学透明层为非金属物质。
或者该光学透明层可以由有机材料制成，如聚酰胺，聚酰亚胺，聚 丙烯(PP)，PS，PMMA，聚丙烯酸，聚丙烯醚，聚硫醚，聚苯硫醚和 其衍生物(参见例如S S.Hardeckcr等人，J.Of Polymer Science B： Polymer Physics，Vol.31，1951-63，1993)。
衍射沟槽的深度可以在3nm至光学透明层厚度的范围内，最好为 10nm至光学透明层厚度，例如30nm至光学透明层的厚度。光学透明层 的厚度在30至1000nm范围内，例如50至300nm，最好为50-200nm， 波纹结构的周期可以在200至1000nm范围内，例如200至500nm，最 好为250-500nm，沟槽深度与光学透明层厚度之比可以处于0.02至1范 围内，例如0.25至1，最好为0.3至0.7，而且沟槽宽度与沟槽周期之比 (“占空比”)可以处于0.2至0.8范围内，例如0.4至0.6。
沟槽截面通常可为矩形。或者，沟槽可以为正弦式或锯齿形截面。 表面结构通常可为对称的。优选的几何结构包括矩形，正弦和梯形截面。 或者，沟槽可以具有锯齿形截面(闪耀光栅)或具有其它非对称几何结 构。在另一方面，沟槽深度可以改变，例如在周期调制中沟槽深度发生 变化。
该平台可以是正方形或矩形的，而且沟槽可以沿平台线性扩展从而 覆盖表面。或者平台可以为盘状，而且沟槽可以为圆形或线形。
沟槽可以形成在基板表面上。或者沟槽可以形成在光学透明层的表 面上。作为另一种可选方案，沟槽可以同时形成在基板的表面上和光学 透明层的表面上，基板表面为界面。
可以将单个传感区域的波纹表面设计为在一个特定的激发波长和一 种特定类型的偏振下操作最优。通过适当的方法，如几个相互平行或垂 直的周期性结构的重叠，可以得到适用于平台的多波长应用的周期性表 面起伏，(“多颜色”应用)。或者，可以将一个平台上的单个传感区域 设计为针对不同波长和/或偏振方向操作进行最优。
光学透明层的表面可以包括一或多个波纹化传感区域，其中每个波 纹化传感区域可以携带一或多个俘获元件。
每个俘获元件可以包含能够进行亲合反应的单独的俘获分子和/或俘 获分子的混合。各个俘获元件的形状可以是矩形，圆形，椭圆形或任何 其它形状。单个俘获元件的面积在1μm2到10mm2之间，例如在20μm2 到1mm2，最好在100μm2到1mm2之间。可以将俘获元件设置成规则的 两维阵列。俘获元件中心到中心(ctc)的距离可以在1μm至1mm之间， 例如5μm到1mm，最好为10μm到1mm。
每个传感区域上俘获元件的数量在1到1,000,000之间，最好在1到 100,000之间。在另一方面，可以不限制待固定在平台上的俘获元件的数 量，并且可以相当于例如构成感兴趣的物种或生物体的基因组的基因、 DNA序列、DNA基元、DNA微卫星(micro satelite)、单核苷酸多态性 (SNPs)、蛋白质或细胞碎片的数量，或者它们的选择或组合的数量。 在另一个方面，本发明的平台可以包含两个或多个物种例如小老鼠和大 老鼠的基因组。
为了能够固定俘获分子，该平台可以包含一设置在光学透明层表面 处的粘合促进层。该粘合促进层还可包括一多微孔层(陶瓷，玻璃，Si)， 来进一步增加分析和检测效力，或者包括一个凝胶层，该凝胶层可以用 做实现俘获元件固定和样品分析的介质，从而进一步增加分析和检测效 力，或者在凝胶电泳的意义上允许分析混合物的分离。该平台可以形成 有多个传感区域，每个传感区域具有其自身的衍射沟槽。
本发明平台的特征在于，由于波纹平台的特性，进入光学透明层的 光能被立即衍射出该层。因而没有导波发生或者可以忽略导波。一般传 播距离为100μm或更小，最好为10μm或更小。这是一个非常惊人的短 距离。传播距离是辐射能量减小到1/e时所经过的距离。
本发明的第三个方面在于提供用于分析样品的装置，该装置包括根 据第一或第二方面的平台，用于产生光束和用于引导光束、使光束以某 一角度入射到平台上的装置，使得在平台中发生瞬息谐振，从而在平台 的传感区域中产生一增强的瞬息场，以及用于检测设置在平台传感区域 上的材料特性的装置。入射光在平台上的全反射的角度限制了适合于产 生谐振条件的角度范围。最佳角度小于45°，例如30°或更小，例如20° 至10°或更低，例如0.1°至9.9°。该角度可能等于或近似正入射。光发生 装置可以包括一个用于发射相干激光束的激光器。其它适合的光源包括 放电灯或低压灯，例如Hg或Xe，其所发射的谱线具有足够大的相干长 度，以及发光二极管(LED)。该装置还可能包括用于引导激光束的光 学元件，使得激光束以一定角度θ入射在平台上，以及用于形成相干光束 偏振平面的元件，例如适合于透过线偏振光。可以由表达式θ＝n-λ/Λ来 限定θ，其中Λ为衍射沟槽的周期，λ为入射光的波长，n为光学透明层的 有效折射率。
可以使用的激光器的例子有气体激光器，固态激光器，染料激光器， 半导体激光器。如果需要，可以通过非线性光学元件对发射波长进行倍 频。特别适合的激光器为发射275至753nm之间波长的氩离子激光器， 氪离子激光器，氩/氪离子激光器，以及氦/氖激光器。非常适合的激光器 为二极管激光器或半导体材料的倍频二极管激光器，这些激光器具有小 尺寸和低功率消耗。
另一种适合的激励类型使用VCSEL’s(垂直腔面发射激光器)，可 以分别激励平台上的识别元件。
可以将检测装置设置成用于检测发光如荧光。可以用这种方法来标 记亲合对象，以便在将分析物分子与俘获分子相结合时发生福斯特 ()荧光能量转移(FRET)。取决于层系统的折射率值和相应的 菲涅尔系数，发光强度的最大值可能相对最大异常反射位置发生轻微的 偏移。
样品可以使用未稀释的或者带有添加溶剂的。适合的溶剂包括水， 含水缓冲溶液，蛋白质溶液，天然或人工低聚物或聚合物溶液，以及有 机溶剂。适合的有机溶剂包括酒精，酮，酯，脂肪族羟，醛类，乙腈或 腈。
增溶剂或添加剂可以包括，并且可以是有机或无机化合物或生化反 应剂，如焦碳酸二乙酯，苯酚，甲酰胺，SSC(柠檬酸钠/氯化钠)，SDS (十二烷基硫酸钠)，缓冲反应剂，酶，逆转录酶，RNAase，有机或无 机聚合物。
样品还可以包括不溶于所使用的溶剂的成分，如颜料粒子，分散剂 和天然及合成低聚物或聚合物。
用做标记的荧光染料可以被化学地或物理地，例如通过静电，与一 或多个存在于分析物溶液中和/或固定在平台上的亲合结合对象(或它们 的衍生物)相结合。在亲合反应中所包含的天然产生的低聚物或聚合物 如DNA，RNA，糖类，蛋白质或缩胺酸，以及人工合成的低聚物或聚合 物的情况下，还适合于添加染料。可以通过生物相互作用如生物素/抗生 物素蛋白结合或诸如HIS-tag偶合的金属络合物形成，将发光物质附着 在分析物溶液中存在的亲合对象上。
可以将一或多个发光标记附着在分析物溶液中存在的亲合对象上， 附着在固定在平台上的俘获元件上，或者同时附着在分析物溶液中存在 的亲合对象和固定在平台上的俘获元件上，来定量地确定一或多个亲合 结合对象的存在。可以选择发光标记的光谱特性，使其符合福斯特能量 转移或光致电子转移条件。从而受体和供体的距离和与浓度相关的发光 可以被用于分析物分子的定量分析。
可以在分子间和/或分子内这种结合成亲合反应中所包含的分子的供 体与受体之间相互作用的基础上进行亲合结合对象的定量分析。发光供 体和受体的分子内组合共价地与亲合结合对象相链接，分子信标 (Molecular Beacons)[S.Tyagi等人，Nature Biotechnology(天然生物 工程技术)，1996，14，303-308]改变了亲合反应中供体与受体之间的距 离，还可以被用做用于分析物溶液的俘获分子或添加剂。另外，可以使 用pH和潜在敏感的发光物质或对酶活性敏感的发光物质，如发光衍生物 的酶媒介形成。
转移荧光球(Transfluorospheres)或其衍生物可以被用做荧光标记， 并且化学发光或电子发光分子可以被用做标记。
为了附着在一或多个亲合对象上，对在400nm至1200nm范围内发 光的发光化合物进行功能化或改性，如下列物质的衍生物：
聚苯和杂芳族化合物
1，2-二苯乙烯，
香豆素，
呫吨染料，
次甲基染料，
噁嗪染料，
若丹明，
荧光素，
香豆素，1，2-二苯乙烯，
芘，苝，
菁蓝，氧杂菁蓝，酞菁，紫菜碱，水杨酸菁蓝(naphthalopcyanines)， 偶氮苯衍生物，联苯联苯乙烯，过渡金属络合物例如聚吡啶基/钌络合物， 三(2，2’-联吡啶基)氯化钌，三(1，10-菲咯啉)氯化钌，三(4，7-联苯-1， 10-菲咯啉)氯化钌，和聚吡啶基(polypyridy)/吩嗪/钌络合物，如八乙 基-铂-卟啉，铕和铽络合物可以被用做发光标记。
适用于血液或血浆分析的染料为具有吸收和发射波长在400nm至 1000nm范围内的染料。另外可以使用适合于双或三光子激励的发光物 质。
适用于本发明的染料可以包括用于共价结合的官能团，例如诸如荧 光素异硫氰酸盐的荧光素衍生物。还可适用的是从Amersham生命科学 得克萨斯有限公司和Molecular Probes有限公司买到的有用的荧光染 料。
其它适合的染料包括用脱氧核苷三磷酸盐(dNTP)改性的染料，能 够被酶催化引入到RNA或DNA链中。其它适合的染料包括Quantum Dot 粒子或小珠(Quantum Dot公司，Palo Alto，CA)或其衍生物，或者过 渡金属络合物的衍生物，可以在一个和相同限定波长处被激励，衍生物 在可识别的波长下表现出荧光发射。
可以通过直接结合发光标记检测分析物，或者通过与附加发光标记 的物质进行竞争，或者通过结合到用做一个和/或多个分析物物质和/或俘 获元件的标记的发光供体与发光/电子受体的与浓度-，距离-，pH-，电位 -，或氧化还原电位相关的相互作用来间接地检测分析物。可以测量供体 的发光和/或猝灭剂的发光，来定量分析待分析物。
用相同的方式可以按这种方法来标记亲合对象，使电子转移或光致 电子转移导致对分析物分子与俘获分子相结合基础上的荧光进行抑制。
用于荧光的适当的检测器包括CCD-摄象机，光电倍增管，雪崩光电 二极管，光电二极管，混合光电倍增管。
可以将检测装置设置来另外检测折射率的变化。
可以将入射光束设置来照射传感区域或一个共同平台上的所有传感 区域。或者可以将光束设置成仅照明待分析传感区域的一个小的子区域， 并且可以对光束和/或平台进行设置使它们可以进行相对运动以便扫描平 台的传感区域。
因而，可以以适当方式设置检测装置，以在单个曝光步骤中获得整 个传感区域的发光信号强度。或者可以对检测和/或激励装置进行设置以 便逐步扫描传感区域。
该装置可以包括一贴着(against)平台的传感区域定位的盒，以使样品 与传感区域相接触。该盒可以包含其它装置以便以小规模的方式执行样 品制备、稀释、浓缩、混合、生物/化学反应、分离(参见WO97/02357)。 该装置可以包括用于包含多个待研究样品的微滴定型装置。
本发明的第四个方面提供了一种用于分析一种或多种样品的方法， 包括将样品与根据第一或第二方面的平台的传感区域相接触，用光束照 射该平台使得在平台的传感区域中发生瞬息谐振，并检测从传感区域发 出的辐射。该方法可以包括向被研究样品添加荧光诱发材料，并且检测 由增强的瞬息场激励样品在所述样品中诱发的荧光。或者该方法可以包 括向被研究样品中添加荧光诱发或抑制材料，和/或将被研究样品转变成 荧光或抑制衍生物，并且检测固定在检测平台上的所述样品由增强瞬息 场激励而产生的荧光。
可以相信，提供一种传感器平台，其中每个传感区域具有固定在其 上的不只一个类型的俘获元件或分子，是一个新颖和富于创造性的概念。 无论对于为瞬息谐振模式还是更传统的诸如波导模式而设计的平台来 说，这种概念都适用。因此，根据本发明的另一个方面，提供一种用于 样品分析的平台，所述平台具有一或多个传感区域，每个传感区域用于 接收一或多个俘获元件，当用相干光对该平台进行照射时，其相互作用 可提供亲合反应的指示，其中每个俘获元件包括两种或多种类型的俘获 分子。
现在将仅通过例子，特别是参照附图对本发明进行描述。在附图中：
图1为示意图，说明用于分析根据本发明的平台的光学参数和瞬息 谐振条件的质量控制装置；
图2为示意图，说明根据本发明的传感器平台；
图3为示意图，表示相对于平台的瞬息场分布；
图4a和4b为表示芯片盒的示意图；
图5表示本发明一个实例中的阵列布局图；
图6示意性地表示出根据本发明一个实例的用于测量荧光的配置；
图7表示现有技术和本发明所得到的结果的比较；
图8说明了平台的其它形式；
图9a到9c表示使用目前的平台在例5所描述的谐振条件下，在30pM PM分析物的培育、再生和30pM MM分析物之后得到的荧光图象；
图10表示使用目前的平台在超荧光(epifluorescence)和例6所描 述的谐振条件下得到的荧光图象和数据。
现在将根据对样品中所激发的发光的确定来描述本发明。这种确定 包含了构成本发明一个方面的传感器平台的使用，不过应该理解这种平 台的使用不必限定于所描述的特定应用。在详细描述平台之前，将对其 进行概要说明，其中该平台可以被用于确定样品的发光。
下面是说明中所使用的限定术语。
平台：包含一或多个传感区域的整个变换器/芯片，
传感区域：能够通过谐振效应产生一瞬息场，并包含一或多个俘获 元件的整个波纹区域，
俘获元件：包含一或多种俘获分子种类(species)的单个传感标记 (sensing spot)，
俘获分子：能够进行亲合反应的单个分子。
参照图1表示出根据本发明一个方面的平台(10)，可以接收来自 激光器(11)的相干光，该激光经过透镜组(12，14)被进行扩束，产 生一被扩束的平行光束(16)，并且该光束被偏振片(18)偏振。如同 下面更加详细地解释的那样，平台(10)具有一传感区域，俘获分子固 定在传感区域上。光波长通常处于UV到NIR范围内，最好在350nm至 1000nm范围内。
该装置还包括一检测器(20)用来检测透过平台(10)的光，一CCD 摄象机(21)用来检测所反射的光，以及一数据处理单元(22)。
在该装置的使用过程中，高度平行、扩束的相干线偏振激光束(16) 入射在平台(10)的传感区域上，并且透过该平台的光被检测器(20) 检测，而且所反射的光被CCD摄象机(21)记录。被扩束的激发光束的 直径大于平台(10)的尺寸。通过旋转平台来调节光束在平台上的入射 角度，直到检测器(20)实际检测到没有光透过平台。这表明在平台的 传感区域中存在发生瞬息谐振的谐振位置。在这种条件下，由摄象机(21) 所记录的反射光强度达到最大值，数据处理单元(22)从摄象机得到数 据用于进行处理。
现在参见附图2，该平台(10)的实施例包括一玻璃基板(30)，在 其顶面中蚀刻了多个沟槽(31)。在基板(30)的上表面上沉积一层光 学透明的金属氧化物(32)，且在该层(32)中也形成了沟槽(33)。 该基板(30)可以由玻璃构成，如Schott制造的AF45玻璃，并且通常 厚度为0.5mm-1.0mm。应该理解其它有机或无机材料，只要是光学透明 的均可以用做基板。
光学透明层是一介电透明金属氧化物薄膜，如在633nm波长下具有 大约2.2的高折射率即比基板折射率高很多的Ta2O5。该层的厚度通常在 50至200nm或更大的范围内，例如50至300nm。波纹结构(31)和(33) 的周期在200-1000nm范围内，例如200至500nm，一般为250-500nm。 波纹结构/衍射沟槽的深度可以在3nm至光学透明层厚度的范围内，最好 为10nm至光学透明层的厚度。金属氧化物可以是若干例子诸如Ta2O5， TiO2，Nb2O5，ZrO2，ZnO或HfO2中任意一种。
在如图2所示的平台中，当偏振激光的平行光束以特定入射角入射 其上时，在层(32)中发生称之为异常反射的效应。当发生这种效应时 基本上没有光透过平台(10)，实际上所有的光在层(32)中反射，使 此相干激光被限制在非常薄的金属氧化物层(32)中。所产生的高激光 场部分地泄露到层(32)外面，产生瞬息场，该瞬息场瞬逝激发处于层 (32)表面上或非常邻近处的荧光材料。应该注意，仅当采用具有特定 或更大深度的衍射沟槽(31，33)时能够得到这种谐振条件，还应该注 意这种波纹结构的辐射损失非常高，从而实际上在金属氧化物层(32) 内没有发生最佳波长范围内任何电磁辐射的波导。最好是沟槽的深度至 少为10nm，不过在更浅沟槽时就开始产生瞬息谐振。然而，假设被研究 样品处于谐振发生处的层(32)附近，可以使用增强的瞬息场来激励发 光，如样品中的荧光。
本平台的一个重要特征在于在谐振位置处该瞬息场的幅度比现有技 术的装置(相当于失谐条件的超荧光)大近似100个量级。
这意味着发光强度，例如可以从样品中产生的荧光，也可以被增加100 倍。可以将平台的功能看做起体光栅作用的衍射结构，它衍射光，并且 衍射光束干涉产生谐振条件，其中从第一界面所反射的光和从作为层 (32)上表面的顶面所反射的光相长干涉，产生反射最大值。在谐振条 件下，激光能量基本上被限制在薄层(32)的厚度内，从而增加了电场 强度。对于给定激光波长和波纹结构周期，此谐振具有角度依赖性。角 度依赖性谐振通常在半最大高度(FWHM)处具有的宽度＞0.1°最好是0.5° 或更大，例如1.0°或更大。这种谐振宽度取决于沟槽深度，占空度和波纹 结构的几何形状。与波导光栅的耦合行为相比，所描述谐振的FWHM比 幅值大许多量级。
应该理解，可以通过适当的传统技术在平台上形成衍射沟槽(31， 33)。一种实现该目的的方法为通过照相技术蚀刻沟槽。在这种技术中， 在基板表面上沉积深度大约为1μm的光刻胶成分，然后通过使用双光束 干涉测量术/全息或者使用相位掩模在光刻胶中写入相当于形成沟槽的周 期性结构，然后使用氩气体通过活性离子蚀刻技术对光刻胶进行刻蚀， 最后从表面剥除剩余光刻胶材料。这种技术可以用于形成沟槽(31)和 (33)。引入波纹结构的其它方法包括浮凸印花，电子束写入，激光切 割，LIGA方法。
为了制备图2所描述类型的平台，以便该平台可以用于诸如图6所 说明的测量中，应该采用下述多个步骤。
第一步是清洁平台，以从平台表面去除杂质。可以通过多种方法来 实现该清洁步骤，例如通过紫外清洁器，通过等离子体清洗，或者通过 使用诸如酸性物，碱(bases)，溶剂，气体和液体进行化学清洗。
一旦已经完成平台的清洁，下一步是向金属氧化物层的表面施加一 层粘合促进剂。由于沉积在平台上的俘获元件本身不可能稳定地附着在 金属氧化层上，因而施加该层至平台上。有多种形成该层的方法。一种 方法是形成一层硅烷分子网状结构，另一种方法是使用称之为自组装单 分子层(SAM)。这些已知技术对于本领域技术人员来说是显而易见的。 例如在Colloids and Interface Science 6(L Boksanyi，O Liardon，E Kovats，1976，95-237)中描述的可能包含液态或气态相的硅烷化。例如， Abraham Ulman(1991，Academic Press inc.)在“超薄有机薄膜”中 描述的自组装单分子层的构成。另外，还有其它适合于固定俘获元件的 方法，如
-使用反应基对芯片表面进行化学改性，以及使用适当的衔接物对俘 获分子进行化学改性(U.Maskos和E.M.Southern，Nucleic Acids Research 1992，vol.20，1679-84)，
-使用光致反应链/团对表面和俘获分子进行改性(WO98/27430和 WO91/16425)，
-通过库仑相互作用进行固定(EP 0 472 990A2)，
-在螯合反应中通过标记进行连接(如蛋白质-标记，HIS-标记)，
-以及多种其它方法，例如如Klaus Mosbacher(主编)的Method in Enzymology Academic Press，纽约，Vol.137(1988)，“固定的酶和细 胞”中所描述的，
-等离子体引发包含官能团/反应基的粘合促进层的固定/产生，能够使 俘获分子或衍生的俘获分子直接连接，或者通过化学链接或光化学链接 使俘获分子或衍生的俘获分子间接连接。
例如可以通过具有3-(丙氧基缩水甘油)三甲氧基硅烷(GOPTS) 的硅烷化来制造粘合促进层。包含亲核性基团如胺类的化合物可以与硅 烷的环氧树脂官能起反应来进行共价固定。由于抗体由氨基酸组成，所 以这种硅烷化可以被用于例如包含多个氨基的抗体的固定。另外，作为 俘获分子的DNA/RNA/PNA链(strand)也可以由氨基进行改性，以便使 这些俘获分子共价地附着在平台上，如应用例4所示(SNP识别)。在 这个例子中，具有氨基的寡核苷酸已经被共价地固定在平台的表面处。 不过，为了实现这个目的可以对其它类型的俘获分子进行固定。
另外，为了改变表面特性可以对粘合促进层进行进一步地化学改性。 例如，为了控制平台的疏水/亲水平衡，硅烷化过的GOPTS平台能够与 功能化的饱和或未饱和的有机/杂-有机/无机分子/衍生物发生反应，即改 变平台的接触角。另外，可以使用离子化合物或潜在的离子化合物在平 台的表面处产生正电荷或负电荷。可以通过共价或物理吸附或带电分子 的库仑相互作用或上述方法的混合将俘获分子与改性的表面/平台相结 合。在下面的实施例2中对此进行了说明，其中使用3-氨基-1-丙醇来改 性第二反应步骤中硅烷化GOPTS平台的表面特性，以便固定 DNA/RNA/PNA俘获分子。在这个例子中，在平台表面上引入的氮(胺 基)被质子季铵化，因而提供正电荷与DNA的负电荷反应相互作用(聚 电解质特性)。除了3-氨基-1-丙醇以外，还可以使用其它的胺类有机衍 生物，如脂肪族胺或支化脂肪族胺，或者包含芳香族或非芳香族环状结 构的胺类，或者包含杂原子的胺类，或者包含官能团的胺类，或者包含 其化合物的胺类，来固定俘获分子，例如DNA/RNA/PNA链。
可以使用功能化的有机分子来提供烃链，给平台提供更大的疏水性， 可以使用极性基为平台提供更大的亲水性，或者可以使用离子基或潜在 离子基来引入电荷。例如，可以使用聚乙二醇(PEG)或其衍生物为平台提 供更大的亲水性，防止蛋白质到平台/表面的非特殊的吸收。
可以将反应基或光活性基附在平台的表面上，可以用作进一步反应 步骤的固定基。
通过用双亲的烷基磷酸酯(例如硬脂基磷酸酯)对平台进行处理可 以获得适用于固定抗体的作为粘合促进层的SAM。磷酸酯(盐)首基与 平台表面处的羟基反应，导致形成双亲的烷基磷酸酯(盐)的有序的单 分子层。磷酸氢(Hydrophophic)烷基链为平台的表面提供了疏水性， 使抗体能够进行物理吸附，如实施例6所示(多重免疫测定)。
SAM还可以用于其它俘获分子的固定，例如用于DNA/RNA/PNA 链。在这种情形中，可以使用双亲的磷酸酯(盐)/利用例如胺基或环氧 树脂基改性的磷酸酯(盐)。俘获分子可以直接与SAM结合，例如与胺 改性的SAM结合，或者在平台与胺类的有机衍生物例如脂肪族胺或分支 脂肪族胺，或包含芳香族或非芳香族环状结构的胺类，或者包含杂原子 的胺类，或者包含官能团的胺类，或者包含其化合物的胺类，或者任何 其它有机，杂-有机和/或无机分子(例如环氧树脂改性的SAM)反应之 后进行结合。
粘合促进层可以由多层组成，以便控制表面特性，例如疏水性，接 触角，电荷密度。另外，使用上述方法中任何一种附着在平台上的层可 以提供或引入化学官能度，或者是下一个随后的层要求的，或者用于链 接俘获分子或衍生的俘获分子。也可以将化学链接分子或光化学链接分 子的附着看作一个中间层，能够使俘获分子附着在平台上。
粘合促进层包括一层或多层无机和/或有机分子或其衍生物，提供附 加的化学、物理、光谱和/或光物理、光化学/生物/生化特性，以便控制所 产生的粘合促进层系统的整个功能特性。
这种具有不同官能度的层/分子的受控结合总体上归因于超分子化学 [J-M.Lehn，超分子化学-领域和展望。分子、超分子和分子器件(Nobel Lecture，8.12.1987)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，27，89，1988.]。所得到 的超分子结构提供了一种功能，其不同于用于各个层的单个分子的功能。 对于本发明，中间层也可以将发光物质引入这种层系中，可以在俘获分 子或改性的俘获分子被附着在平台上之前，被用做福斯特能量转移 (FRET)，或者光致电子转移，或者潜在敏感发光物质意义上的能量供 体或能量受体/猝灭剂。
对于前面所描述的表面处理方法，可以使用下面的有机或无机分子 及其衍生物：
胺类，改性的胺类，杰弗胺类(jeffamines)，脂肪族胺，酒精，酸， 醛类，酮，酰胺，酐，磷酸盐(酯)，膦酸盐(酯)，硫酸盐(酯)， 磺酸盐(酯)，硫醇，包含化合物的杂原子，芳香族和脂肪族有机官能 化分子，芳香族和脂肪族杂-有机分子，天然和人工合成聚合物，硅烷， 用化学或光化学反应基改性的分子，其衍生物和功能化的例如所列出各 种的ω-功能化衍生物。
原则上，对于组成一层或多层的层结构的构成，对于所使用的具有 所有上述表面处理的分子，要求化学反应基和/或具有特殊物理或电化学 特性(例如电荷)的化学族。
可以采用化学/光化学相互作用(例如添加剂，亲核性/亲电子性置换， 自由基之间的反应，凝结，与有机/杂-有机/无机羟基衍生物的反应，或 光致反应，或热致反应，Lewis酸/碱原则)，和/或
物理/电化学相互作用(例如库仑相互作用，疏水/亲水相互作用)， 和/或
生物相互作用(例如抗原/抗体，杂化作用，Streptavidin/Avidin-Biotine 相互作用，激动剂/拮抗剂相互作用)，和/或
光化学/光物理相互作用，用于结合这种层系/粘合促进层中所采用的 分子/成分。
还可以通过在平台的表面上沉积一个多微孔层或凝胶来实现粘合促 进，该多微孔层或凝胶的表面特性/功能便于俘获元件的沉积，缩短了所 需要的培养时间，增强了后续测量的灵敏度。多微孔层可以包括有机化 合物，如聚合物，单体，分子集合和超分子集合，或者可以包括无机化 合物，如玻璃，石英，陶瓷，硅和半导体。
可以通过使用例如3-(丙氧基缩水甘油)三甲氧基硅烷(GOPTS) 的硅烷化来制造粘合促进层。为了改变表面特性可以对粘合促进层进行 进一步化学改性。例如，硅烷化的GOPTS平台可以与功能化的饱和的 或未饱和的有机分子发生反应，以便控制平台的疏水/亲水平衡，从而改 变平台的接触角。
一旦已经在平台上形成该粘合促进层，必须采用另外的一或多个清 洁步骤来去除该层的制备过程中所使用的过量的化学材料。在清洁之后， 平台准备好接收俘获元件。
在沉积在平台上之前，在粘合促进层的3-D表面上形成俘获或识别 元件的二维阵列。可以使用多种方法来沉积该俘获元件阵列。用于沉积 俘获元件的技术包括喷墨式打印机，其具有压电致动器，电磁致动器， 压力阀/电磁阀致动器或其它测力传感器；使用热电致动器的喷气泡 (bubble jet)打印机；或激光致动器；环形销打印机；销测位仪装置； 如WO90/03382或WO92/10092中所描述的芯片内合成；非常大规模的 固定聚合物合成(VLSIPS)如WO98/27430中所描述的；固定在粘合促 进层表面处的特殊设计光反应基的光催化/光去保护；微接触打印机；微 接触书写笔；画笔或俘获元件的转移/冲压垫片；通过从诸如PMMA原 版例如使用PDMS(聚二甲氧基硅烷)或通过微机械或机械装置，或者 通过用于俘获元件本地输送的蚀刻技术通过铸造得到微流体通道和流体 单元；通过光切割形成俘获元件结构；或者使用其中一种前面提到的技 术或者任何其它光固定技术将俘获元件沉积在凝胶垫片上。
可沉积在平台上的俘获或识别元件可以有许多，并且可以是各种各 样的。通常来说，所使用的俘获分子应该能够发生亲合反应。可以用在 本平台中的识别或俘获分子的例子如下：
核苷酸，寡核苷酸(和其化学衍生物)
DNA(双链或单链)a)线性(和其化学衍生物)
b)环状(例如质粒，粘粒，BACs，ACs)
总RNA，信使(messenger)RNA，cRNA，线粒体RNA，人工RNA， aptamers PNA(肽核酸)
多克隆，单克隆，重组，工程化抗体，抗原，半抗原，抗体FAB亚 基(如果需要则进行改性)
蛋白质，修饰的蛋白质，酶，酶辅因子或抑制剂，蛋白质复合物， 植物血凝素，组氨酸标记的蛋白质，用于组氨酸标记成分(HIS-tag)的 螯合剂，标记的蛋白质，人工抗体，分子印记，质体膜受体，整个细胞， 细胞碎片和细胞亚结构，突触，激动剂/拮抗剂，细胞，细胞器如微粒体
小分子如苯二氮杂类(benzodiazapines)，
前列腺素，
抗生素，药物，代谢物，药物代谢物
天然产品
碳水化合物和衍生物
天然和人工配体
类固醇，激素
肽
天然或人工聚合物
分子探针
天然和人工受体
及其化学衍生物
螯合反应剂，冠醚，配体，超分子集合
指示剂(pH，电位，膜电位，氧化还原电位)
组织样品(组织微阵列)。
可以使用多种方法使俘获分子的活性或密度最优化。可以将其上沉 积有俘获元件的平台在饱和水蒸汽环境下培养一规定时间，以便使印刷 的轨迹回湿。这可使俘获分子的密度最优化，即增加每单位面积可能的 结合位置。随后可以对所培养的芯片烘烤一定时间，例如对于cDNA俘 获分子在80℃下烘烤一分钟。可以用少量纯净水或任何其它适当液体或 溶液将平台喷湿，以避免过量未结合材料所造成的俘获元件的交叉污染。 在这些过程之后，可以将所制备的平台保存在干燥器中以备使用。在使 用芯片之前，可能要求使用0.1至10ml杂化缓冲液或其它适当的溶液/液 体对其进行另外的冲洗步骤，复活/复水干燥的俘获元件，并且进一步去 除过量的未结合俘获元件/缓冲剂残余物。在DNA俘获分子的情形中， 发现当在50至85℃之间的温度处执行冲洗时，冲洗过程最有效。
可以使用杂化站所，如Genomic Solutions Inc.，Michigan，US的Gene TAC杂交站自动进行芯片操作的处理步骤。
所描述的特殊测量技术为涉及特定荧光的发光。在进行测量时，将 被研究样品放在平台的传感区域上，在平台上设置有俘获元件。为了得 到荧光，在测量开始之前将荧光物质加入系统。可以将荧光物质加入样 品，例如作为被标记的亲合对象，不过还可以将荧光物质附着在平台上 的俘获元件上。测量是基于这个事实，即通过与被分析物或待研究样品 发生相互作用而改变从包含被标记俘获分子的俘获元件和/或从被标记的 亲合对象发出荧光。可以使用不同激励和发射波长的标签，存在一种或 几种不同的标签，标签1用于对照实验，标签2用于实验。
图3示意性地表示出在谐振位置处瞬息场的能量分布，以及它是如 何扩展到金属氧化层(32)表面之外，使得能够激发处于传感区域的表 面邻近处的荧光物质，例如附着于俘获分子的荧光物质或者附着于与俘 获分子(38)结合的分子的荧光物质。在大约一微米范围内，瞬息场呈 指数减小至零。
应该理解到在执行分析时进行一或多个测量。一种可能是样品与俘 获元件接触之前的背景测量。在样品已经与俘获元件相接触或者在样品 与俘获元件接触之后可以进行第二个测量。为了比较多个样品，例如基 因表达实验中“control(控制)”和“treated(处理)”样品，在实施 例2所描述的“control”实验之后芯片可以被再生，可以进行另外的背 景测量和将“treated”样品施加给芯片之后/过程中的测量。为了得到有 关亲合对象的反应动力信息，可以将完整的一组测量作为培养时间和/或 后冲洗时间函数进行记录。图6表示用于这种测量的典型装置。将图2 中所示的平台调节到获得瞬息谐振的角度，并且使用CCD摄象机(66) 测量从平台表面发出的荧光。这就表示从沉积在平台上的俘获元件阵列 上每个位置发出荧光。可以对其进行分析，推论在俘获元件与被研究样 品之间发生的反应的亲合性。
图6中所示的装置在一次曝光中收集了全部发光，例如荧光，一次 曝光中整个平台的图象，在测量过程中不必要运动任何部分。这种非扫 描装置可能会非常简单和廉价，尤其适合于点护理应用或便携系统。另 一种典型的装置利用光学元件将相干激光限制在微米范围内，从而提高 焦点中的电场，并对传感区域进行扫描。
应该理解，可以使用本技术对多种样品进行分析。通常样品被完全 溶解以便分析，这可能包括一种或多种被检测物质。样品可以是净化和 被处理的组织的溶液，或者从活体解剖和实验研发中得到的其它材料， 包括用于诊断目的的样品。样品还可以是生物媒质，如蛋黄，体液或其 组成部分，如血液，血清和尿。还可以为地表水，溶液或从天然或合成 媒质中的提取物，如土壤或植物的一部分，来自生物方法的液体或合成 液体。
为了进行测量，可以将样品放入图4a和4b所示类型的样品盒中。 该盒包括一由诸如PMMA的聚合物制成的外壳(41)。已经将这种聚合 物加工成限定一个中心隔室(44)，中心隔室的尺寸相当于平台的尺寸。 在隔室(44)中形成另一个凹陷来限定一小室(46)，通过O-形环(47) 对小室(46)的边缘进行密封。小室(46)在其顶部和底部是敞开的。 可以通过流送线(45)将被分析溶液引入到O-形环(47)中的小室(46) 内。可以通过阀门(43)控制流送线(45)中的流量。该盒包括一个盖 子(49)，盖子设置在外壳上面并固定于外壳(41)上，以封闭盒的顶 部。盖子(49)包括一位于隔室(46)上的窗(50)，从而允许辐射穿 过盖子进入盒(46)。
在使用该盒时，外壳(41)邻接平台的表面设置，在平台上形成有 俘获元件，使得盖子(49)远离该表面。这使得隔室(46)与平台的传 感区域相通。然后通过流送线(45)将被研究样品加到隔室(46)中， 使得与平台表面上的俘获元件相接触。然后如前所述在多个俘获点处对 所产生的荧光进行测量。
图8说明平台可选择的形状。
可以用多种方法设置传感元件，例如矩形，圆形，正六边形同心， 椭圆形，线形或错综复杂的形状。传感区域可以是矩形，圆形或任何其 它形状。沟槽可以被设置成等间距直线，或者等间距圆形，或者可以相 当于这种结构的一部分。
平台可以是矩形或盘形或者为任何其它几何结构。该平台包括一或 多个传感区域，每个传感区域包括一或多个俘获元件，并且每个俘获元 件可以包括一或多个被标记的或没有被标记的俘获分子。
该平台还适合于微滴定型平板/装置以在单个微滴定穴(well)中执行一 或多个分析。对于所有平板类型：96，384，1536，或者更高数量的微滴 定穴都可以实现，与各个微滴定平板的尺寸无关。
下面是平台的特例：
1.3-D平台的物理性能：异常反射
1a.平台1
基因芯片变换器平台包括一0.7mm厚的平面透明基板(Schott制造 的玻璃AF45)。在该基板中使用光刻方法(沉积光刻胶，＜1μm；通过 双光束干涉/全息在光刻胶中写入周期性结构；使用氩气体用活性离子刻 蚀来蚀刻光刻胶；剥离残余光刻胶)蚀刻一周期性表面结构。
该表面结构的形状接近于正弦形。单个结构的宽度(周期)为360nm。 沟槽的深度为大约38nm。
在均匀结构的玻璃表面上面沉积一绝缘的透明金属氧化物薄膜 (Ta2O5)，该金属氧化物薄膜在633nm波长下具有大约2.2的高折射率。 通过离子电镀法来沉积金属氧化物薄膜。层厚为130nm。由于高能量和 各向异性沉积过程，玻璃表面的主要结构被转移到金属氧化物层的顶面。
当高度平行、扩束的相干激光束以特殊的角度θ(对应于所谓的谐振 位置)照射到变换器上时，几乎所有的光被变换器平台反射，0级透射强 度被减小到小于1％(与任意角度处的90-95％相比)。
几乎所有的光均被反射的谐振条件的宽度Δθ，与波长λ(633nm，固 定的)和辐射损失系数α成正比。辐射损失系数受光栅沟槽深度、波纹结 构的几何结构和占空度的影响，且随着沟槽深度的增加几乎呈二次方增 加。对于我们的情形(激光波长633nm，130nm金属氧化物层，38nm 沟槽深度)，辐射损失系数大约为2000/cm，即在这种层系中所引导的激 光束的传播距离，在由该周期结构衍射出平台之前，为1/2000cm＝5μm。 这是一个相当短的距离。从而在这些条件下没有波导发生。通过改进平 台主要参数，可以进一步减小传播距离。
作为谐振效应的特征，对于4mm直径区域将平行光束(TE偏振) 的强度调节为100μW(Newport NRC1835功率计)。平台法线与入射光 束之间的角度被旋转为偏离异常反射的中心位置(谐振条件)1至2度。 中心位置处于2.5°。然后以5/1000°步进速度(Newport NRC控制器 PM500)对平台进行旋转，并改变监测到的透射光束的功率。在谐振角 下，少于1％(＜1μW)的初始透射光束到达检测器。入射激光束的功率 被完全反射(镜面反射光束：接近100％)。
在我们的情形中，对于异常反射的半最大值处的全宽度(FWHM) 为0.9°。在整个传感器表面上(18mm×18mm)反射的均匀性优于90％。
1b.平台2
表面结构的形状接近于矩形。单个结构的宽度(周期)为360nm。 沟槽的深度为大约52nm。在均匀结构的玻璃表面上沉积一层介电透明金 属氧化物薄膜(Ta2O5)，该金属氧化物薄膜在633nm波长处具有大约2.15 的高折射率。通过溅射来形成金属氧化物薄膜。层厚为150nm。由于高 能量和各向异性沉积过程，玻璃的主要结构被转移到金属氧化物层的顶 面。
当高度平行、扩束的相干激光束以相当于谐振位置的特殊角θ照射到 传感器上时，几乎所有的光都被传感器平台反射，0级透射光强度被减小 到小于1％(与任意角度处的90-95％相比)。
几乎所有的光均被反射的谐振条件的宽度Δθ，与辐射损失系数α成正 比。对于我们的情形(激光波长633nm，150nm金属氧化物层，52nm 沟槽深度)，辐射损失系数大约为2000/cm，即在这种层系统中所引导的 激光束的传播距离，在由周期结构衍射出平台之前，1/2000cm＝5μm。 从而在这些条件下，没有波导发生。
作为谐振效应的特征，对于4mm直径区域将平行光束(TE偏振) 的强度调节为600μW(Newport NRC1835功率计)。平台法线与入射光 束之间的角度被旋转为偏离异常反射位置(谐振条件)4度。然后以5/1000° 步进速度(Newport NRC控制器PM500)对平台进行旋转，改变监测到 的透射光束的功率。在谐振角，少于0.5％(＜3μW)的初始透射光束到 达检测器。入射激光束的功率被完全反射(镜面反射光束：接近100％)。
由于根据与平台1相比更深的沟槽，扩展了平台2的谐振宽度，+1 和-1衍射级的谐振曲线相互重叠，在法线入射处产生单一极宽的谐振。 对于异常反射半最大谐振值的全宽度(FWHM)在我们的情形中为4.2°。 在整个传感器表面(18mm×18mm)上反射的均匀性优于95％。
2.用于基因表达分析的例子
a)制备
参照图2所描述的类型的传感器平台(尺寸18mm×18mm2)首先被 在三氯甲烷(FLUKA，“purriss.”)中超声处理两次，然后在异丙醇(Merch， “Uvasol”)中处理两次，每次15分钟。然后将该平台在真空中干燥， 并且用UV清洁剂(Boeckel industries Inc，model 135500)清洁30分钟。 将邻二甲苯加热到75℃(搅拌)，并且将2％v/v 3-环氧丙氧基丙基-三甲 氧基硅烷(Fluka，“purum”)以及0.2％v/v N-乙基二异丙基胺 (Fluka，“purum”)加入到加热的溶剂中(搅拌)。将该平台安装在框 架中，然后在75℃下在溶液中培养7小时(搅拌)。随后，将该平台放 入新鲜的乙腈(Fluka，“HPLC等级”)中超声处理三次，每次15分钟。 然后将该平台在2％v/v 3-氨基-1-丙醇(Fluka，“purum”)溶液中在乙 腈中超声处理15分钟，然后在室温下在相同溶液中培养一整夜(搅拌)。 第二天，首先在新鲜的异丙醇(Fluka，“HPLC等级”)中将该平台超 声处理三次15分钟，随后在新鲜的甲醇(Merck，“Uvasol”)中处理三 次15分钟。最后，干燥该平台，并将其保存在真空干燥器中。
b)识别元件的固定
使用喷墨打印机(Microdrop GmbH，Norderstedt，德国)将包括10 个不同cDNA的阵列(每个cDNA10重复为：CYP 450 1A1，CYP450 2B1 EST.，CYP 450 2B1，CYP 450 2B2，CYP 450 3A1 humen，CYP 450 3A2， CYP 450 4A1，β-肌动蛋白，GAPDH，外标物)印在平台上。cDNA溶液 的浓度为50ng/μL。直径(10个喷墨液滴/位置)为大约250μm，斑点之 间的间距大约为500μm。从而，10×10阵列的整个尺寸大约为5×5mm2。 图5示意性地表示出所固定的cDNA斑点的排列和说明。阵列被印制在 尺寸为(18×18mm2)的平台的中心。随后，在饱和水蒸汽氛围中在密封 容器内将该平台培养一整夜。第二天，将所培养的芯片烘烤一预定时间， 比如说在80℃下烘烤一分钟。然后用去离子水冲洗该平台，并使用氮气 进行干燥。
c)检测设备
图6中示意性地表示出所使用的检测设备。激励激光器(61)(HeNe 激光器，633nm，1.3mW)和20×扩束器(64)共同(62)固定在角度计 (63)上。二向色反射镜(68)将扩束的激光光束朝向平台(67)引导。 激光束的旋转中心处于平台(67)的金属氧化物层的平面内。从平台表 面发射的荧光经过二向色反射镜(68)被收集。另外使用荧光滤色片(65) 将荧光(69)从激励光中分离出来。使用装配有Nikon Noct镜头(数值 孔径1.2)的冷却的CCD摄象机(Astrocam EEV 30/11)测量从平台表 面发出的荧光图象。角度计允许调节入射的扩束的激光束相对平台的表 面法线的角度。在瞬息谐振条件(即调节入射的扩束激光束的角度，使 透过平台的光表现为最小)下拍摄荧光图象。
d)芯片盒
图4示意性地表示出将该平台安装在由PMMA/聚合物制造的特别设 计的盒(41)中。凹陷(44)区域的尺寸为(18×18×0.7mm3)，培养室 (46)为0.2mm深。培养室中的溶液通过0.5mm直径的流通道(45) 进行交换，流通道穿入PMMA中。通过进口/出口(42)交换盒的内含 物。将平台设置在该盒的相应的凹陷区中，使传感区域朝向培养室。固 定盖子(49)，按压平台使之密封。盖子中铣出的/微切削加工出的窗口 (50)允许激励光的照射和获取平台表面的荧光图象。盒子的阀门到阀 门之间的体积为大约14μL。
e)变性单元
使用热电元件控制流体盒中平台的变性(79℃)，培养(42℃)， 再生(79℃)和清洗(42℃)温度。
f)样品制备
使用2组老鼠(每组3只)用于当前研究。使用80mg苯巴比妥，钠 盐，在每千克活体重量(0.9％w/v NaCl)溶液中处理一组老鼠(treated)， 并且仅使用0.9％NaCl处理第二组老鼠(control)。连续进行4天处理。 在4天末，动物被杀死，使用液氮迅速冻结肝脏样品，并保存在-80℃下。
随后，分离总RNA/mRNA并通过反向翻译标记成第一链cDNA(采 用标记的脱氧核苷酸，与用于控制和处理的荧光标签相同或不同)，净 化并溶解于20μL杂化缓冲剂中。
g)分析过程
使用Cavro步进喷水器将缓冲剂和溶液抽取/吸出到盒中。执行下面 的步骤测量老鼠中的CYP450电感应：
1)在79℃下使用1ml杂化缓冲剂(HB)预冲洗30分钟，对与HB 接触的平台的背景1进行测量。
2)将“control”样品注入盒中，在79℃下变性30分钟，然后在42℃ 下培养一整夜。
3)在42℃下使用1mL HB后冲洗10分钟，测量与HB接触的平台 的“control”强度。
4)再生：在79℃下使用1mL杂化缓冲剂(HB)冲洗30分钟，测 量与HB接触的平台的背景2。
5)将“treated”样品注入盒中，在79℃下变性30分钟，然后在42℃ 下培养一整夜。
6)在42℃下使用1mL HB后冲洗10分钟，测量与HB接触的平台 的“treated”强度。
在瞬息谐振条件下对所有荧光图象进行测量。
h)数据处理
计算所有斑点的净强度(control-背景1和treated-背景2)，并且 在外标物强度的帮助下对treated数据组的所有强度进行归一化。通过除 法计算出各个基因之间的表达比率(重叠改变)
重叠改变＝归一化的treated/controll
计算出每10个重复实验的平均值。
i)结果
在瞬息谐振条件下测量的ER-芯片通常表示大约100倍的增强强度 和改进的信号/背景比值。
下表中概括了重叠改变的平均值：
基因 重叠改变 CYP 4501A1(老鼠) 1.6 CYP 4502B1EST.(老鼠) 16 CYP 4502B1(老鼠) 25 CYP 4502B2(老鼠) 32 CYP 4503A1(人) 3.2 CYP 4503A2(老鼠) 2.5 CYP 4504A1(老鼠) 1.6 β-肌动蛋白(老鼠) 2.1 GAPDH(老鼠) 2.3
3.说明增强放大的例子
根据刚描述的例子制备和处理平台。在对样品2进行培养之后，参 照图6，使用前面所描述的CCD摄象机检测装置拍摄2个图象。在不调 节瞬息谐振条件的超荧光模式下拍摄第一幅图象(图7a中的“超荧光”)。 在瞬息谐振条件下(7b中的“ER增强”)拍摄第二幅图象，即调节入 射激光束相对表面法线的角度直到透过芯片的光表现为最小。图象分布 (净信号)表明使用ER-增强所测得的强度比传统超荧光所得到的强度 大大约100倍。
在前面所描述的例子中，使用单个样品单元(41)使样品与平台的 传感区域相接触。应该理解，可以使用微滴定型样品容器来补偿具有多 个传感区域的平台，以允许对多个样品进行测量，从而改善测量效率。
4.用于识别单核苷酸多态性(SNP)的寡核苷酸微芯片
a.芯片制备
参照图2所描述的类型的传感器平台(尺寸18×18mm2)首先在三氯 甲烷(FLUKA，“purum”)中超声处理两次，然后在异丙醇(Merck， “Uvasol”)中处理两次，每次15分钟。然后在真空干燥器中干燥该平 台，并在UV清洁剂中清洁30分钟(Boeckel Industries Inc，model 135500 型)。将邻二甲苯加热到75℃(搅拌)，并且将2％v/v环氧丙氧基丙 基-三甲氧基硅烷(Fluka，“purum”)和0.2％v/v N-乙基二异丙胺(Fluka， “purum”)添加到加热的溶剂中(搅拌)。然后将该平台安装在框架中， 并在75℃下在溶液中培养7小时(搅拌)。随后，使用新鲜的乙腈(Fluka， “HPLC等级”)对该平台冲洗三次，每次15分钟。最后干燥该平台并 将该平台保存在真空下。
b.俘获元件的固定
将两种不同的氨基改性的寡核苷酸(俘获探针)在硅烷化过的平台 上印制成方格状排列(5×5＝25个斑点)。GMS 417环形针阵列用于印刷 (Genetic Microsystems，Boston，MA)。用做俘获分子的寡核苷酸的浓 度为100nmol/ml。斑点的直径为125微米，中心到中心的距离为500微 米。2寡核苷酸被称为cPM(“俘获最佳匹配”)和cMM(“俘获失配”)， 其差别仅在于一个基：
cPM：3‘CACAATTCCACA5‘-NH2
cMM：3‘CACAACTCCACA5‘-NH2
cPM和cMM在5‘端标记以氨基，使得寡核苷酸能够与环氧功能化 的平台共价结合。该阵列印制在尺寸为(18×18mm2)的平台的中心。随 后在饱和水蒸汽氛围中在密封容器中将该平台培养一整夜。第二天对芯 片进行干燥，并用1ml含水50％的尿素溶液冲洗该平台。或者，使用含 水牛血清溶液(BSA，1mg/ml)。在对芯片进行分块之后，用去离子水冲 洗该芯片，然后用氮气流进行干燥。
c.检测装置
使用前面例子中所描述的CCD装置。
d.芯片盒
使用前面例子中所描述的盒。
e.被分析物/样品
两个被Cy5-标记的称为PM(“最佳匹配”)和MM(“失配”) 的顺序为被固定的俘获寡核苷酸cPM和cMM的寡核苷酸用做被分析物：
PM：Cy5-5‘GTGTTAAGGTGT3‘
MM：Cy5-5‘GTGTTGAGGTGT3‘
被分析物溶液的浓度均为30pM。
f.分析过程
首先用1ml杂化缓冲剂(HB)冲洗平台两次，在冲洗过程之间有1 分钟的延迟。随后将大约15微滴定PM被分析物溶液(30pM)注入到 流体盒中。在30分钟的培养之后，用1ml HB冲洗该平台，在芯片的谐 振位置拍摄荧光图象(图9a中的“PM”)。随后，通过注入2×1ml的 含水50％尿素溶液，在注入之间有2分钟延迟，去除所结合的被荧光标 记的寡核苷酸(搅拌)。在另外的2分钟之后，通过注入2×1ml HB对芯 片进行清洗，两次注入之间延迟2分钟，并且在芯片的谐振位置拍摄荧 光图象(图9b中的“再生”)。最后，将大约15个微滴定MM被分析 物溶液(30pM)注入流体盒中。在30分钟的培养之后，用1ml的HB 再次对平台进行冲洗，并在芯片的谐振位置处拍摄荧光图象(图9c中的 “MM”)。所有步骤均在室温下执行。
g.数据处理
对于两个实验(培养30pM PM被分析物和30pM MM被分析物) 计算2不同组俘获点(cPM和cMM)的平均强度。另外，计算平均强度差 cPM-cMM和比值cPM/cMM。
h.结果
下表中概括了计算得出的所有数据。可以从所得到的数据清楚地识 别两个被Cy-5标记的PM和被Cy-5标记的MM、其差别仅在于一个基 (SNP)的寡核苷酸被分析物。
5.用于抗体免疫分析的例子
主要抗体被空间地溶解固定(例如方格图案)在传感器平台的表面 上。通过后续培养使被检测抗原与荧光标记的次级抗体结合(用于被检 测的各个抗原的第二抗原决定基表位的检测)，首先使用包含不同浓度各 种抗原的被分析物，然后使用荧光标记的次级抗体。
或者，可以在预培养阶段混合抗原(被分析物)与荧光标记的次级 抗体，允许荧光标记的次级抗体与抗原发生络合。在这个预培养步骤之 后，使用该混合物培养该传感器平台表面。
使用ER-装置定量分析与表面结合的荧光标记的免疫络合物(使用 适当的缓冲剂，PBS进行预冲洗如果需要进行后冲洗)。
6.用于多重免疫分析的蛋白质-微芯片
a.芯片制备
将前面所述类型的传感器平台(尺寸18×18mm2)在三氯甲烷(FLUKA， “purriss.”)中超声处理两次，随后在异丙醇(Merck，“Uvasol”)中处理 两次，每次15分钟。在真空中干燥该平台，并在UV清洁剂中清洗30 分钟(Boeckel工业公司135500型)。将芯片放置在一个小容器中，并 在0.5毫摩尔十八烷基磷酸盐的丙醇溶液中保存24小时。然后，用5ml 异丙醇冲洗该芯片来去除过量的烷基磷酸盐，并在氮气流中进行干燥。 该过程在平台的表面处产生了一种烷基磷酸盐的自聚集单分子层 (SAM)。该粘合促进层使该平台具有疏水性(接触角大约为100°)， 并且通过疏水相互作用对平台上的蛋白质进行吸附。
b.俘获元件的固定
在饱和水蒸汽氛围中将两种不同的单克隆抗体，抗-人体绒毛膜促 性腺激素(抗-hCG)和抗-白介素(抗-IL6)按方格状排列(4×4阵列， 每个抗体8个点)印到疏水的平台上。俘获抗体溶液的浓度分别为400 和100微克/毫升。使用喷墨打印机进行印制(Microdrop，Norderstedt，德 国)。点的直径为150微米，中心到中心的距离为320微米。在饱和水 蒸汽氛围中在密封容器内将所印制的阵列培养2小时。随后，干燥该芯 片，并用包含10％牛血清白蛋白(BAS)，5％蔗糖和0.02％叠氮化钠的 10ml磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS)进行冲洗。通过BSA的吸附作用该冲 洗步骤保护芯片的疏水性表面，并使在俘获元件被固定之后，该表面更 具亲水性。因此，该保护步骤防止蛋白质与平台的非特定结合，而且非 特定结合会导致背景荧光的增加。在保护之后，使用去离子水冲洗芯片 并用氮气干燥芯片。将该平台保存在冷藏箱中备用。
c.检测装置
使用例2中所描述的CCD装置。
d.芯片盒
使用例2中所描述的盒。
e.被分析物/样品
制备3种被分析物溶液：
I)包含500ng/ml Cy-5标记的IL6的溶液，抗原
II)包含50ng/ml Cy-5标记的人类绒毛膜促性腺激素(hCG)的溶 液，抗原
III)包含50ng/ml IL6和100ng/ml用Cy5标记的多元性繁殖系抗-IL6 抗体的预培养混合物(1小时)，
包含1％BSA的PBS pH7.0，用做被分析物的溶剂。
f.分析过程
制备三个平台(如6b所描述的)用于被分析物的培养，将平台安装 在盒中并用包含1％BSA的1毫升PBS pH7.0冲洗平台。随后，将大约 15微滴定被分析物溶液I)，II)和III)注入流体盒中。对于I)和II)， 每种的培养时间为2小时。对于被分析物III)，培养时间为12小时。在 对被分析物培养之后，用包含1％BSA的1毫升PBS pH7.0冲洗该平台。 在非谐振条件下拍摄荧光图象(超荧光，大约偏离谐振角7°)，并在谐 振条件下对每个芯片进行拍摄(谐振时，入射光相对法线大约为2.5°)。 图10中表示出所得到的图象和数据。所有步骤均在室温下进行。
g.数据处理
在Imagene Array软件(Biodiscovery，Los Angeles，CA)的帮助下 计算点的平均强度和背景。图10中的点平均表示用背景校正的感兴趣的 各个俘获元件的平均强度。另外，噪音被计算出作为背景与荧光图象的 标准偏差。从而，图10中的信号/噪音相当于背景标准偏差上的点平均之 比。
h.结果
图10中概括了计算得出的所有数据。图10中概括了在超荧光模式 和谐振条件下所得到的图象和数据。行I)和II)表示被固定的单克隆俘 获抗体与被标记的抗原(分别为Cy-5标记的IL6和hCG)之间免疫反 应的结果。行III)相当于被固定的单克隆抗体(抗-IL6)与预培养的IL6 抗原和相对IL6的Cy5-标记的次级多元性繁殖系抗体的混合物之间的三 明治型免疫反应。
对于行I)的结果，信号强度从超荧光模式中的读数46增加到平台 的谐振模式中的读数1100。这相当于相对点平均值增强大约24倍。信号 /噪音比从7.0(超荧光)增加到69.2(谐振)，相当于10倍。
对于行II)的结果，信号强度从超荧光模式中的读数32增加到平台 的谐振模式中的读数646。这相当于相对点平均值增强了大约20倍。信 号/噪音比从5.0(超荧光)增加到75.1(谐振)，相当于15倍。
对于行III)的结果，信号强度从超荧光模式中的读数25增加到平台 的谐振模式中的读数296。这相当于相对点平均值增强大约12倍。信号/ 噪音比从3.8(超荧光)增加到44.1(谐振)，相当于12倍。
对于所有3个分析来说，处于谐振模式的芯片与非谐振模式(超荧 光)模式的同一芯片相比，点平均和信号/噪音比都高一个量级。行I) 和II)的荧光图象是互补的(方格形排列)。使用的所有芯片具有相同 组的俘获元件，即单克隆抗-hCG和单克隆抗-IL6。
应该理解对于所描述的实施例可能有多种可选方案。
本平台的另一个特征在于允许并行获得更大批的数据。并且该平台 可以多次使用。在升高温度下使用有机溶剂和/或赵托吡卡(chaotropic)反 应剂(盐溶液)可以对被固定的亲合络合物进行再生，同时基本上完全 地保持结合力。
在前面所给出的描述中，整个传感区域的面积被照射。还可能使用 未扩束的聚焦激光束，扫描传感区域，使得目标俘获元件依次被激活。 这种设置允许使用比CCD摄象机更廉价的光电检测器，例如可以使用光 电倍增管或雪崩光电二极管。并且由于激光能量被更有效地限制，这种 设置将进一步增强灵敏度。
还可能根据本发明设计平台，用做显微镜用载玻片，从而允许它们 和荧光显微镜一起使用。
还可以将该平台设计为与大型微观射流系统(microfluidic system)一 起使用，如WO97/02357中所描述的。
在前面的描述中，已经描述了平台在激励和传感荧光中的应用。应 该理解可以将该平台用于通过发光的改变检测亲合反应的装置中。还应 该理解该平台可以用于通过折射率变化检测亲合反应的装置中。
根据本发明的平台可以用于多种应用中，下面为非排他性列表。
-基因表达
-基因组学
-药物基因组学
-毒理基因组学
-毒理蛋白质组学
-遗传学
-药物遗传学
-毒理遗传学
-外显子/内含子表达分布
-人类白细胞抗原(HLA)定型
-剪接变体的分析
-蛋白质组学(芯片上蛋白质分析)
-病人监视(药物，代谢物和标记)
-点护理，“个人化药物”
-诊断学
-用于蛋白质组学的芯片上2d凝胶或通常的2d分离
-SNP(单核苷酸多态性)，小量测序
-高处理量筛选
-组合化学法
-蛋白质-蛋白质相互作用
-分子间相互作用
-基于芯片的蛋白质-抗体和肽相互作用
-绿色荧光蛋白(GFP)
-原位杂交
-共焦显微术
-荧光相关光谱术(FCS)
-传统显微术
-MALDI-TOF MS
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