[0001] 技术领域本
发明涉及器官移植，尤其是确定器官移植状况，如接受或排斥的非手术方法和系统。
[0002] 背景技术在美国大约有52000人在等待接受肾移植的名单上。另外，每年有60000人死于肾病。
在1996年与1998年之间，在美国完成了94000例肾移植。1996年，被排斥的肾的数量占活体供体捐献肾的6%和死亡供体捐献肾的12%。另有报道提到，每三个接受肾移植的人至少会发生一例肾排斥。约翰霍普金斯（John Hopkins）在2002年的研究中提到，每年有12000个肾脏被移植，其中这些之中的5000个肾脏来自活体供体。然而，发现三分之一的这些移植的供体并不良好匹配。
[0003] 相当大比例的肾排斥是由免疫系统的作用引起的。通过谨慎选择与受者匹配的供体，然后施用一种形式的化学疗法来降低免疫系统对新移植器官的应答通常可以使这个问题降低至最低限度。通常使用的
化疗药物是环孢菌素，并且，最近是达克珠单抗。这些化疗药物还伴随有免疫抑制类固醇。另一个使排斥降低至最低限度的方法是从患者的血液中滤出供体特异性
抗体，这被称为
血浆除去法。
[0004] 这些方法通常都是不充分的，会导致器官被受者排斥。在器官移植24小时之内可能开始并且出现数天至数周的急性排斥反应中，免疫系统将移植器官细胞表面上的某些
蛋白质识别为配体并且产生抗体来攻击该器官的细胞。免疫系统制造出产生附着在这些配体上来破坏他们的抗体以及反抗这些移植细胞上的外来细胞表面蛋白质的T细胞（T淋巴细胞）的B淋巴细胞。作为外源细胞识别的最重要的蛋白质是主要组织相容性
复合体（MHC），MHC出现在所有无
脊椎动物细胞上并且属于人类白细胞相关
抗原（HLA抗原）。这些淋巴细胞的存在，主要由T细胞介导，表明该器官正在被排斥。T细胞识别已经结合至宿主细胞表面上的外源蛋白的MHC蛋白，并且它们也识别可能存在的外源MHC蛋白。抗体CD*和CD4是T细胞上的共受体，其中CD8主要表达在细胞毒性T细胞上，细胞毒性T细胞识别MHC I类蛋白，CD4主要表达在辅助T细胞和MHC II类蛋白上。
[0005] 体内存在着大量的淋巴细胞，大约有1012个，主要存在于淋巴系统和淋巴器官（胸腺、脾脏以及阑尾）中。淋巴细胞通常不会以任何数量存在于其他器官中，但是一旦识别异物，它们就会成倍繁殖并侵入器官。患者针对这种事件会遭受发热或有其他反应，典型地通过显微观察做移
植物活组织检查或其他手段来确定淋巴细胞的存在。存在着由于手术损伤本身引起的在移植之后的一个
炎症初期，在这种类型的任何研究中也必须予以考虑。
[0006] 通过活组织检查来监测器官移植是很痛苦的，有感染的
风险，并且引起发病。因此，仍然需要一种用于器官移植接受的非手术确定的系统和方法。
[0007] 发明披露本
申请与2010年3月16日提交的美国临时申请61/314,370有关，通过引用将该申请结合在此。本发明提供了一种用于器官移植状况（如接受或排斥）的非手术确定的系统和方法。该系统包括一个
磁场探测器，例如一个超导量子干涉装置
传感器，该磁场探测器包括一个磁脉冲发生器，该磁脉冲发生器被适配成将均匀磁化脉冲场施加至安置在测量台上的患者的移植器官；以及一个剩余磁场探测器，该剩余磁场探测器被适配成探测由该施加的脉冲磁场产生的残余磁场并且将其成像。该磁脉冲发生器可以包括一对亥姆霍兹线圈。该剩余磁场探测器可以包括梯度计阵列。根据本发明的一个示例性方法包括：提供一个超量子干涉装置
传感器系统；将抗体标记的多个
磁性纳米粒子注射到安置在测量台上的患者体内以便与移植器官特异性结合；施加一个均匀磁化脉冲场以磁化注射到患者体内的磁性纳米粒子；并且检测磁化纳米粒子的残余磁场，从而提供结合到患者的移植器官上的纳米粒子的图像。例如，该移植器官可以包括肾脏。该抗体标记的磁性纳米粒子可以包含一个涂覆有
生物相容性涂层的磁芯，该生物相容性涂层上附着有至少一种特异性抗体。例如，该磁芯可以包含
铁磁性材料，例如
氧化铁。例如，抗体标记的磁性纳米粒子可以包含与T细胞特异性结合的抗体。
[0008]
附图简要说明结合在本
说明书中并构成它的一部分的附图展示了本发明，并且与说明书一起描述了本发明。在附图中，同样的元件用同样的数字表示。
图1是用于器官移植接受的非手术确定的超导量子干涉装置（SQUID）传感系统的照片。
图2是用于人体中的器官移植接受的非手术确定的SQUID传感系统的示意图。
图3是用于器官移植接受的校准和非手术确定的磁性纳米粒子的示意图。
图4是一张全尺寸的肾脏模型照片，含有两个纳米粒子源。
图5A是用于SQUID传感器成像的纳米粒子的透射
电子显微镜(TEM）图像。FIG.5B是具有附着的纳米粒子的T细胞。
图6是连接至两个T细胞系的CD3抗体的孵育曲线的曲线图。
图7是显示方法灵敏度的曲线图，该方法是在经历排斥的肾移植中的状况下。
图8A是显示从固定数量的U937细胞获得的磁
信号的条形图，该磁信号作为用真正的人
全血稀释的函数。图8B显示了这些相同样品的普鲁士蓝
染色的显微照片。
图9A和9B是同基因小鼠
皮肤移植的H&E染色的
组织切片。
[0009] 实施本发明的方式和
工业实用性本发明可以使用超导量子干涉装置（SQUID）
磁传感器，用于器官移植状况，如状态、接受或排斥的非手术确定。SQUID传感器是能够探测由磁性纳米粒子簇产生的磁场强度的高灵敏度仪器。SQUID传感器使得能够进行器官移植接受的无创确定。另外，与活组织检查相比，该技术的无创性质允许更频繁地监测患者。如果发生T细胞已经浸润移植器官的情况，医师也可以利用这种技术来校准用药
水平。
[0010] T细胞聚集在器官的特定区域内。活组织检查只是从器官上
切除的一小
块组织样品，而不是就该整个器官进行取样。本发明可以使医师能够对整个器官成像。这允许医师评定正发生在患者体内的器官排斥达到何种程度（如果有的话）。这降低了针对有创活组织检查程序的要求，并且使得能够针对化疗效果而监测器官移植。例如，评定和量化在某一特定器官移植中的CD8 T细胞群的能
力能够补充并经常代替现有的器官移植监测方法（活组织检查）。该技术使得能够准确评定免疫系统对器官移植的反应，以确定是否正在发生急性或慢性排斥反应。本发明还提供了监测CD8以及CD4 T细胞的能力。
[0011] 生物磁SQUID传感器可以与抗体标记的磁性纳米粒子一起使用以检测移植器官中的过量淋巴细胞簇的积累。这个系统降低了针对活组织检查的要求并且提供了一种用于监测免疫抑制药物的疗效的无创方法。这个方法可以容易地识别这些淋巴细胞。由于活组织检查是痛苦的并且存在合乎情理的感染机会，减少活组织检查对患者大有益处。因为患者经常由于化疗而具有降低的免疫系统反应，感染受到了极大的关注。因此，可以显著消除对于有创程序的需要的任何方法将会对病人的幸福具有重大影响。
[0012] 图1显示了一个示例性的SQUID传感器，具有一个液态氦贮存杜瓦瓶11，位于图片的顶端。该传感器包括一个磁场脉冲发生器，该磁脉冲发生器被适配成将均匀磁化脉冲场施加至安置在测量台上的患者的移植器官；以及一个磁场探测器，该磁场探测器被适配成探测由该施加的脉冲场产生的残余磁场并且将其成像。作为举例，该磁场脉冲发生器可以包括形成一个亥姆霍兹线圈对的两个环形线圈14，这些线圈能够为纳米粒子提供一个磁化脉冲场。由这些线圈产生的均匀场可以变化但是典型地是在40至50高斯之间，并且
脉冲持续时间典型地为300-800毫秒。作为举例，该磁场探测器可以包括多个SQUID二阶轴向梯度计，这些梯度计被容纳在突出穿过
支撑架13的口吻状物12中。有七个梯度计容纳在这个示例性的口吻状物中，一个位于中心，另外六个在2.15厘米半径的一个圆圈内。各梯度计与一个低温SQUID感应耦合。在这个实例中，SQUID和测量平台以及这些磁化线圈都由一个木制
框架支撑。非磁性支撑系统包括一个三维平台15，例如，该三维平台可以由不带金属成分的塑料构成。上面两个黑色旋钮控制x-y平台在+/-10厘米范围内移动，而下面的旋钮用来控制该测量台在20厘米范围内升降。可以将一个样品架插到测量台上，该测量台可以容纳纳米粒子样品、活细胞样品或活小鼠。
[0013] 图2显示了一个示例性的SQUID传感器，该传感器可以用于对人体器官移植接受的检查。木制或其他非导电结构23可以与图1所示的支撑架相似。该测量台可以用安置病人的床25代替。两个较大的亥姆霍兹线圈24包括在床上和床下的木制圆形模板。这些较大的线圈还可以用来产生均匀脉冲场并且磁化已经注射到病人体内的磁性纳米粒子。可以增加在图1所示的系统中使用的线圈的
电流以便再次产生在40至50高斯范围的磁场。与在图1中所示的系统相似，具有磁性梯度计阵列的SQUID杜瓦瓶21可以用来测量由磁化纳米粒子产生的残余磁场变化。
[0014] 图3是可以用于人体器官移植接受的校准和体内研究的磁性纳米粒子30的示意图。磁性纳米粒子30的中心可以包含磁芯31。例如，磁芯31可以是在直径上大约20-30纳米的氧化铁。这个磁芯31可以涂覆有生物相容性涂层32，如葡聚糖、羟基或胺，针对该移植器官的特异性抗体33附着于该涂层上。例如，该特异性抗体可以与响应于器官移植接受的一种T细胞结合。该抗体将会对这种T细胞表面上的T细胞受体是特异性的。一种这样的特异性抗体是CD抗体，然而其他对器官移植接受特异的抗体可以通过共轭方法附着到该生物相容性表面上。
[0015] 图4是全尺寸肾脏模型的照片，该肾脏模型含有两个纳米粒子源。每个来源具有5.26×1010个Simag-1411羧基涂覆的纳米粒子，这些纳米粒子结合到抗体CD3上并且附着到活T细胞（Jurkat细胞系）上。有8.22×106个细胞，每个细胞具有附着的3×104个纳米粒子（直径为24nm），
覆盖了21%的可用抗原位点。
[0016] 表1显示了在图4中所示的模型照中的活T细胞的物理测量
位置与从SQUID传感器阵列推导的空间位置的比较，这是从细胞上的磁性纳米粒子的磁化获得的。表1
[0017] 图5A是用于SQUID传感器成像的纳米粒子的透射电子显微镜（TEM）图像。图5B是附着有纳米粒子的T细胞。这些纳米粒子相当均匀，并且大致呈球形，具有25nm的直径；在直径上该细胞直径大约为10微米，具有通过CD2抗体附着到其上的大约100000个纳米粒子。
[0018] 图6显示了针对连接至两个T细胞系的CD3抗体的孵育曲线。使用了针对两种白血病T细胞的细胞系，使得它们能够生长，并且测量了它们的附着标记的磁性纳米粒子的能力。非白血病细胞系应当具有如同这些细胞的相似的特性。这些曲线图显示，不同细胞系的磁矩有所不同，正如针对这两种特定的白血病细胞所预期的那样，其中这些Jurkat细胞具有的受体数量大于SupT1细胞系的受体数量。这些结果表明，这些细胞在不到一小时就吸收了这些粒子。
[0019] 图7显示了对于经历排斥反应的肾脏移植中的情况下的T细胞实验的外推结果（使用Jurkat细胞结果）。假定肾脏在形状上与图4中所示的模型的形状相似，并且假定其含有如同插入该模型中的小瓶中的T细胞簇，这些T细胞簇代表攻击肾脏的实际T细胞簇。上部曲线代表检测T细胞的灵敏度，作为到测试的SQUID传感器系统的传感器的距离的函数。下部曲线代表在相对于传感器和和本底电磁噪声的最佳条件下运行的SQUID系统。这些结果表明，T细胞在肾脏内的平均深度大约为6厘米，测试的系统能够检测大约两万个细胞，然而预期的是，在被排斥的肾脏中的一个典型的T细胞簇可能含有一亿个或更多个细胞。
[0020] 图8显示了通过测量作为细胞稀释的函数的磁信号的这种靶向方法的特异性的调查结果。在图8A中的条形图显示了从固定数量的U937细胞（另一个T细胞白血病细胞系）获得的磁信号，作为用真正的人全血稀释度的函数。在图8B中的显微照片是这些相同样品的普鲁士蓝染色，显示了每个细胞的纳米粒子的数量随着该稀释度的增加而下降。还进行了各种滴定和其他实验来确定SiMag（Chemicell，柏林）和Ocean（Ocean Nanotech,Little Rock Arkansas）磁性纳米粒子的最大位点结合（maximum site binding）、并且确定作为存在的细胞的数量的函数的饱和水平。
[0021] 使用其中完成了皮肤移植的动物模型，进行了确定移植排斥反应的方法的证明，这些皮肤移植是针对与供体具有相同的遗传背景的小鼠（小白鼠）以及具有不同的背景的小鼠（小黑鼠）而完成的。当用带有抗体（这些抗体针对攻击无关供体的器官的T细胞）的磁性纳米粒子注射这些小鼠时，这些小白鼠没有显示出在移植物附近的T细胞征象，而小黑鼠则显示出存在有数以百万计的T细胞；也就是说，出现了该移植物的排斥反应的征象。这通过在小黑鼠上的移植物的随后脱落，而在小白鼠上的移植物整合到皮肤中而得到了核实。
[0022] 使用了涉及皮肤移植的动物模型。在这种模型中，从正常小鼠背部肩胛骨区切除一块皮肤，然后将来自一个不同品系的小鼠的背部或尾部的皮肤施用到该暴露的区域（同种异体移植）。可替代地，将具有来自一只在遗传上完全相同的小鼠的皮肤区域的小鼠作为对照（同基因移植）。这种移植模型操作相对简单，并且提供了允许直接检查移植成功/排斥的优点。在这些程序完成后，从另一种动物获取皮肤
补片，并且以相同的方式施用，并且遵循与针对
伤口愈合所开发的相同的方法。在一段固定时间之后，对小鼠注射结合有抗体的纳米粒子，这些抗体是特异性地针对T细胞产生的。然后将小鼠放置在SQUID系统中，测量剩余磁场（magnetic remanence field）。在移植排斥过程中，在若干时间点对小鼠进行成像，并且在每个SQUID成像期间后，可以使用钻取活组织检查切下在供体/受体接合处的一个小的皮肤区域来证实T细胞浸润。
[0023] 图9A和9B是等基因小鼠皮肤移植的H&E染色的组织切片（其中：Ep，为受者的内生表皮（endogenous epidermis）；De，为真皮；HF，为毛囊；SG，为皮脂腺）。在这些实例中，供体背部皮肤被移植到在遗传上完全相同的受体的背部。在两周之后采集皮肤，并且用显微镜进行检查。在供体与受体皮肤之间的接合处（箭头）均显示在两个图中（受体（R）皮肤和供体（D）皮肤用虚线隔开）。供体皮肤在两个图中均显现出正在再上皮化（DEp），位于移植物的下方（Gr）。
[0024] 本发明已经被描述为用于器官移植接受的非手术确定的一种系统和方法。应当理解的是，以上描述对于本发明原理的应用仅仅是说明性的，本发明的范围由根据说明书解读的
权利要求决定。本发明的其他变体和
修改对于本领域技术人员而言是明显的。
