技术领域
[0001] 本实用新型涉及动物性食品快速检测领域，尤其是涉及一种喹诺
酮类药物的胶体金纳米棒快速检测试剂盒。
背景技术
[0002] 喹诺酮类(Quinolones，QNs)，是一类人工合成的含4-喹诺酮基本结构，对细菌DNA螺旋酶具有选择性抑制的抗生素。当前应用的喹诺酮大多为含有氟
原子的喹诺酮类。这类药物抗菌谱广，对革兰氏
染色呈阴性杆菌活性较高，对其他抗生素耐药的德细菌也具有良好的抗菌作用，无交叉耐药性；在体内分布广，体内和组织中药物浓度高；口服吸收好，
半衰期长，使用方便；与头孢菌素类药物相比，抗菌作用相似，但价格便宜。目前在兽医临床上常用的药物主要有诺氟沙星、
氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、氟甲喹等十几种，随着应用的增加，其各种毒
副作用也逐渐显现出来，主要体现在头晕、低血糖、恶心、胃肠道症状、中枢神经系统和过敏反应。特别是近几年，严重的不良反应发生率约为1.6％～1.8％，引起了全世界的关注。为了保障动物源性食品的安全，欧盟、美国及我国等很多国家都对喹诺酮类药物在动物源性食品中残留制定了最大残留限量(MRL)。我国农业部文件(农质发[2009]3号文件)中规定了2009年我国畜禽产品监测项目，禽肉中4种喹诺酮类药物残留是重要的监测项目之一。
[0003] 现有的喹诺酮类检测方法多为色谱法，但是这些方法的灵敏度受样品的
净化、浓缩等步骤的影响较大，再者这些方法需要复杂的仪器，过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。胶体金
免疫层析法以其灵敏、快速、准确、操作简便得到越来越广泛的应用，但目前的胶体金检测产品仍存在灵敏度低的状况。实用新型内容
[0004] 针对
现有技术存在的上述问题，本
申请人提供了一种金纳米棒试剂盒。本实用新型在传统的胶体金免疫层析
试纸基础上进行了改进，将胶体金标记
抗体复合物直接冻干于微孔中，使得检测过程中待测样本与金标抗体充分反应，提高 检测灵敏度。
[0005] 本实用新型的技术方案如下：
[0006] 一种金纳米棒试剂盒，由检测试纸和微孔试剂(8)组成；所述检测试纸由
底板(7)、吸
水板(1)、
硝酸纤维素膜(5)、样品吸液板(2)、MAX线(6)组成；
[0007] 所述硝酸
纤维素膜(5)叠放在底板(7)的中部上面；所述吸水板(1)叠放在底板(7)的其中一端的端头部分上面，所述样品吸液板(2)叠放在底板(7)的另一端的端头部分上面；
[0008] 所述硝酸纤维素膜(5)两端分别与吸水板(1)和样品吸液板(2)相交叠，且所述硝酸纤维素膜(5)位于吸水板(1)和样品吸液板(2)的下方；
[0009] 在所述底板(7)和硝酸纤维素膜(5)及样品吸液板(2)之间设置一层导流板(9)；所述导流板(9)的一个端部与底板(7)设置有样品吸液板(2)的那个端部平齐，所述导流板(9)的另一个端部与硝酸纤维素膜(5)靠近吸水板(1)的那个端部平齐；
[0010] 所述导流板(9)在背离底板(7)的那个面上设置竖直贯通整个板体的导流槽(10)，所述导流槽(10)平行于底板(7)的长度方向；所述导流板(9)在与硝酸纤维素膜(5)
接触的那个面上、在导流槽(10)上依次打固液孔(11)。
[0011] 所述导流槽(10)为两条以上；所述固液孔(11)位于导流槽(10)上，且间隔距离相同；所述导流槽(10)及固液孔(11)的深度为导流板(9)厚度的1/2～1/3；所述固液孔(11)的直径为导流槽(10)间距的0.05～0.3倍。
[0012] 从所述硝酸纤维素膜(5)靠近样品吸液板(2)的那一端开始，依次设置试验线(3)和控制线(4)；所述试验线(3)由喹诺酮-大分子蛋白偶联物包被；所述控制线(4)由羊抗鼠多克隆抗体包被；
[0013] 所述微孔试剂(8)为冻干后的金纳米棒标记喹诺酮单克隆抗体复合物。
[0014] 底板(7)是PVC
背板，样品吸液板(2)是玻璃纤维材料，微孔试剂(8)的微孔是聚苯乙烯材料；所述导流板(9)是纤维板。
[0015] 所述硝酸纤维素膜(5)两端与吸水板(1)和样品吸液板(2)相交叠的部分长度分别为1～2毫米。
[0016] 本试剂盒的使用方法如下：将水相待测样品加入金标微孔试剂(8)至微孔中固体充分溶解，样品中若含有喹诺酮类药物，样品中的喹诺酮类药物将与微 孔试剂(8)中喹诺酮单克隆抗体-金纳米棒标记物发生特异性结合。插入试纸条，由于毛细管作用样品将沿着试纸条吸水板端移动，当移动至固定有喹诺酮-大分子蛋白偶联物试验线时，由于喹诺酮单克隆抗体-金纳米棒标记物与样品中喹诺酮类药物优先结合成复合物而不能与喹诺酮-大分子蛋白偶联物结合，因此显色的金纳米棒不能滞留于试验线上，试验线处没有色带显示，即只有一条控制线为阳性。相反如果样品中没有喹诺酮类药物，喹诺酮单克隆抗体-金纳米棒标记物移动到试验线上，喹诺酮单克隆抗体就会与喹诺酮-大分子蛋白偶联物发生特异结合，使胶体金滞留于试验线上，即二条色带为阴性。
[0017] 当移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论样品中有无喹诺酮类药物，控制线都会显色。因此控制线无色带产生则代表操作有误，即检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。
[0018] 本实用新型有益的技术效果在于：
[0019] 本试剂盒改变了以往采用胶体金标记待测物质抗体的方法，而是采用金纳米棒标记待测物质的单克隆抗体。本实用新型所提供的检测试剂盒具有灵敏度高、操作简便、方便携带、成本低、检测结果可靠等特点。由于金纳米棒是首次用于检测试纸中，在使用中发现由于其分子结构为刚性，流动性差，吸收到检测试纸上以后，流动缓慢，在试验线附近也没有很好的与包被物吸收结合。故而在检测试纸上设置一个带有导流槽和固液孔的导流板，可以
加速金纳米棒标记的抗体和测试样品的混合物的流动和吸收、显色。
附图说明
[0020] 图1为本实用新型中检测试纸的主视结构图；
[0021] 图2为本实用新型中检测试纸的侧视结构图；
[0022] 图3为本实用新型中微孔试剂部分的结构图；
[0023] 图4为本实用新型的使用方法图；
[0024] 图5为导流板的结构图；
[0025] 图6为本实用新型的阴性结果图；
[0026] 图7为本实用新型的阳性结果图；
[0027] 图8、图9为本实用新型的无效结果图；
[0028] 图中：1、吸水板，2、样品吸液板，3、试验线，4、控制线，5、硝酸纤维素膜，6、MAX线，7、底板，8、微孔试剂，9、导流板，10、导流槽，11、固 液槽。
具体实施方式
[0029] 下面结合附图，对本实用新型进行具体描述。
[0030] 一、本试剂盒的组成：
[0031] 本实用新型所涉及的试剂盒是由检测试纸和微孔试剂8组成，如图1所示。其中检测试纸由底板7、吸水板1、硝酸纤维素膜5、样品吸液板2、MAX线6组成。底板7中部上方
叠加硝酸纤维素膜5，硝酸纤维素膜上5有平行的一条试验线(T线)3和一条控制线(C线)4；底板7一端端头上方叠加吸水板1，另一端端头上方叠加样品吸液板2，硝酸纤维素膜5两端分别与吸水板1和样品吸液板2相互交叠连接(交叠连接部分1～2毫米)，且位于吸水板1和样品吸液板2的下方。其中试验线3由喹诺酮-大分子蛋白偶联物包被，控制线4靠近吸水板，由羊抗鼠多克隆抗体包被。微孔试剂8为将喹诺酮单克隆抗体-金纳米棒标记物直接冻干于微孔中制成，如图3所示。
[0032] 二、喹诺酮类药物胶体金检测试剂盒的制备：
[0033] 1、喹诺酮-大分子蛋白偶联物即喹诺酮类药物半
抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定
[0034] 喹诺酮类药物是小分子物质，只有免疫
反应性，没有免疫原性，不能诱发
机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。
[0035] (1)喹诺酮类药物半抗原的合成
[0036] 将诺氟沙星0.64g溶于20ml三氯甲烷中，加入二环己基
碳二亚胺(DCC)0.82g、适量催化剂4-二甲
氨基吡啶(DMAP)和1,3-丙二胺0.30g，室温反应10h，过滤，将液相水洗，无水NaS2O4干燥，除去
溶剂后柱层析纯化得到丙二胺单诺氟沙星酰胺化衍
生物。
[0037] (2)免疫原的制备——喹诺酮类药物半抗原与
牛血清
白蛋白偶联物合成
[0038] 取喹诺酮类药物半抗原23mg用2ml DMF溶解完全，制成溶液Ⅰ；取BSA100mg用7ml 0.1mol/L PBS(pH7.0)溶解完全，制成溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ加入溶液Ⅱ中制成溶液Ⅲ；取碳化二亚胺(EDC)100mg用1ml水溶解后缓慢加入溶液Ⅲ中，室温搅拌2h；用0.01mol/L PBS
透析三天，每天换液三次，得免疫原。
[0039] (3)包被原的制备——喹诺酮类药物半抗原与卵清蛋白偶联物合成
[0040] 取喹诺酮类药物半抗原23mg用2ml DMF溶解完全，制成溶液Ⅰ；取OVA100mg用7ml 0.1mol/L PBS(pH7.0)溶解完全，制成溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ加入溶液Ⅱ中制成溶液Ⅲ；取EDC
100mg用1ml水溶解后缓慢加入溶液Ⅲ中，室温搅拌2h；用0.01mol/L PBS透析三天，每天换液三次，得包被原。
[0041] (4)喹诺酮-大分子蛋白偶联物即喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定[0042] 将喹诺酮类药物半抗原、载体蛋白、喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在
波长200～800nm范围内扫描，得到喹诺酮类药物半抗原、载体蛋白、喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。
[0043] 2、喹诺酮单克隆抗体的制备
[0044] (1)动物免疫
[0045] 将步骤1得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
[0046] (2)细胞融合和克隆化
[0047] 取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0048] (3)细胞冻存和复苏
[0049] 将杂交瘤细胞用冻存液制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0050] (4)单克隆抗体的制备与纯化
[0051] 增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和
硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
[0052] 所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加
小牛血清和
碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的
质量分数为20％，碳酸氢钠在细胞培养基中的质量分数为0.2％；所述细胞培养基的pH为7.4。
[0053] 3、羊抗鼠抗抗体的制备
[0054] 以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
[0055] 4、金纳米棒标记微孔试剂的制备
[0056] (1)制备金纳米棒
[0057] 2.5ml 2.5×104的HAuCl4溶液与2.5ml 2.5×104的CTAB溶液混合，然后加入0.6ml的
冰冻的0.01M NaBH4溶液并搅拌10min得到
种子溶液。5ml的0.08M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液与4ml的0.25ml的5×104的氯金酸水溶液混合，加入0～50微升的0.01M硝酸
银(AgNO3)溶液，搅拌均匀然后加入20微升0.1M
抗坏血酸，搅拌2min得到无色透明的生长溶液。1ml种子溶液加入到9ml的生长溶液中，搅拌1min，然后静置一周，得到深紫蓝色纳米金棒溶液。
[0058] 把喹诺酮类药物单克隆抗体标记的金纳米棒液，
吸附微孔上，冻干后得到微孔试剂8备用，如图3所示。
[0059] 5、试验线和控制线的制备
[0060] 试纸的试验线3和控制线4平行于硝酸纤维素膜5上，试验线3由喹诺酮-大分子蛋白偶联物包被，控制线4靠近吸水板由羊抗鼠多克隆抗体包被。
[0061] 6、检测试纸的组合
[0062] 检测试纸由底板7、吸水板1、硝酸纤维素膜5、样品吸液板2、MAX线6组成，底板中部为硝酸纤维素膜5，硝酸纤维素膜上有一条试验线3(T线)和一条控制线4(C线)，在底板7一端端头为吸水板1，另一端端头为样品吸液板2，硝酸纤维素膜5两端分别与吸水板1和样品吸液板4相互交叠连接(交叠连接部分1～2毫米)。
[0063] 为了克服金纳米棒标记的抗体与待测样品混合后流动性差、在试验线上滞留性差的缺点，在底板7和硝酸纤维素膜5及样品吸液板2之间设置一层导流板9；导流板9的一个端部与底板7设置有样品吸液板2的那个端部平齐，导流板9的另一个端部与硝酸纤维素膜5靠近吸水板1的那个端部平齐；
[0064] 导流板9在背离底板7的那个面上设置竖直贯通整个板体的导流槽10，导流槽10平行于底板7的长度方向；所述导流板9在与硝酸纤维素膜5接触的那个面上、在导流槽10上依次打固液孔11。
[0065] 所述导流槽10为两条以上，优选7～8条。所述固液孔11位于导流槽10上，且间隔距离相同；所述导流槽10及固液孔11的深度为导流板9厚度的1/2～1/3， 优选1/3；所述固液孔11的直径为导流槽10间距的0.05～0.3倍，优选0.2倍。如图2和图5所示。导流槽10为
润湿性好、吸水性好的纤维板，如
棉纤维板，人造纤维板等。
[0066] 7、使用方法
[0067] 如图4所示，用移液枪移取40μl待检液加入金标孔后反复吹打直至金标孔中红色固体充分溶解混匀，孵育2min；插入试纸条，同时开始计时；5分钟读取结果，5分钟后结果无效。
[0068] 三、结果判读
[0069] (1)阴性：T线
色度比C线深或一样深，表示样品中待检物浓度低于
检测限，或不含待检物，如图6所示。
[0070] (2)阳性：T线色度比C线浅，或T线不显色，则表示样品中待检浓度高于检测限；T线比C线越浅，表示样品中待检物浓度越高，如图7所示。
[0071] (3)无效：未出现质控线C线显色，表明操作过程不正确或检测卡已失效，即检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。如图8、图9所示。
[0072] 四、测试结果
[0073] 本测试盒可以检出的喹诺酮类药物的最低浓度如表1所示。本试剂盒检测环境的要求是：室温。
[0074] 表1
[0075]喹诺酮类 检测限μg/kg 喹诺酮类 检测限μg/kg
恶喹酸 5 恩诺沙星 3
环丙沙星 10 二氟沙星 12
氟甲喹 8 沙拉沙星 18
达氟沙星 20 诺氟沙星 5
培氟沙星 8 依诺沙星 12
那氟沙星 10 氧氟沙星 28
奥比沙星 50 洛美沙星 90
麻保沙星 72
[0076] 从表1的数据可以看到，本测试盒灵敏度远高于目前市场上常见的类似产品，大大拓展了喹诺酮类药物的检测手段。
