壳聚糖及聚乙二醇纳米颗粒作为生物活性分子的给药体系
阅读：369发布：2020-05-12
专利汇可以提供壳聚糖及聚乙二醇纳米颗粒作为生物活性分子的给药体系专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于释放 生物 活性分子的纳米颗粒体系，其包含经 聚乙二醇化 学修饰并被交联剂交联的壳聚糖 聚合物 或其衍生物。所述体系尤其可用于药物组合物、 疫苗 及 化妆品 配方。，下面是壳聚糖及聚乙二醇纳米颗粒作为生物活性分子的给药体系专利的具体信息内容。
1.包含用于释放生物活性分子的纳米颗粒的体系，其中所述纳米 颗粒包含结合物，所述结合物包含a)至少50％重量比的壳聚糖或其衍 生物，以及b)少于50％重量比的聚乙二醇(PEG)或其衍生物，其中组 分a)和b)均通过壳聚糖氨基基团共价结合，并且其特征在于所述纳米 颗粒通过交联剂交联。
2.如权利要求1所述的体系，其中壳聚糖或其衍生物相对于聚乙 二醇的比率优选为大于75％重量比。
3.如权利要求1所述的体系，其中聚乙二醇的比率优选为小于 25％重量比。
4.如权利要求1至3所述的体系，其中壳聚糖的聚合度或包含壳 聚糖或其衍生物的单体单元的数目为30至3000，优选为60至600。
5.如权利要求1至4所述的体系，其中所述壳聚糖或其衍生物具 有5至2000kDa的分子量，优选为10至500kDa，更优选为10至100 kDa。
6.如权利要求1至5所述的体系，其中所述壳聚糖或其衍生物具 有30％至95％的脱乙酰化程度，优选为60％至95％。
7.如权利要求1至6所述的体系，其中所述PEG为具有通式(III) 的修饰的PEG：
X1-(O-CH2-CH2)p-O-X2
(III)
其中X1为羟基保护基团，X2为氢或允许锚定在壳聚糖氨基基团 上的桥基团，p为聚合度。
8.如权利要求7所述的体系，其中X1为烷基基团，优选为甲基。
9.如权利要求1至8所述的体系，其中所述PEG具有50至500 的聚合度。
10.如权利要求1至9所述的体系，其中所述PEG具有2至20kDa 的分子量，优选为5至10kDa。
11.如权利要求1至10所述的体系，其中所述壳聚糖氨基基团或 所述壳聚糖衍生物的氨基基团用PEG的官能化为0.1％至5％，优选为 0.5％至1％。
12.如权利要求1至11中任一权利要求所述的体系，还包含选自 低分子量药物、多糖、蛋白、肽、脂质、寡核苷酸及核酸及其组合的 生物活性分子。
13.如权利要求1至12中任一权利要求所述的体系，其中所述交 联剂为聚磷酸盐，优选为三聚磷酸钠。
14.如权利要求1至13中任一权利要求所述的体系，其中所述纳 米颗粒的平均尺寸为1至999纳米，优选为50至800纳米。
15.如权利要求1至14中任一权利要求所述的体系，其中所述电 荷(Z电势)为+0.1mV至+50mV，优选为+1至+40mV。
16.药物组合物，其包含如权利要求1至15中任一权利要求所定 义的体系和能够预防、减轻或治疗疾病的生物活性分子。
17.如权利要求16所述的用于口服、含服、舌下、局部、透皮、 眼、鼻、阴道或肠胃外给药的组合物。
18.如权利要求16或17所述的组合物，其中所述生物活性分子 选自多糖、蛋白、肽、脂质、寡核苷酸、核酸及其组合。
19.如权利要求16至18中任一权利要求所述的组合物，其中所 述生物活性分子为胰岛素、肝素、蛋白抗原或DNA质粒。
20.包含如权利要求1至15中任一权利要求中所定义的用于释放 生物活性分子的体系的化妆品组合物。
21.如权利要求20所述的化妆品组合物，其中所述活性分子选自 抗痤疮剂、抗真菌剂、抗氧化剂、除臭剂、止汗剂、去头屑剂、皮肤 增白剂、晒黑剂、紫外光吸收剂、酶和化妆品抗微生物剂。
22.包含如权利要求1至15中任一权利要求中所定义的用于释放 生物活性分子的体系和抗原的疫苗。
23.如权利要求22所述的疫苗，其中所述抗原选自蛋白、多糖和 DNA分子。
24.如权利要求22或23所述的疫苗，其中所述抗原为破伤风类 毒素或白喉类毒素。
25.获得权利要求1至15中任一权利要求所定义的用于控制释放 生物活性分子的体系的方法，其包含：
a)制备壳聚糖-PEG结合物水溶液；
b)制备交联剂水溶液；以及
c)在搅拌下将步骤a)和b)的溶液混合，使得通过离子凝胶化作用 和后续的沉淀作用自发得到壳聚糖-PEG纳米颗粒。
26.如权利要求25所述的获得纳米颗粒的方法，其中所述交联剂 为三聚磷酸盐，优选为三聚磷酸钠。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述生物活性分子预 先溶于a)或b)中，或溶于另一加入到a)或b)中的水相或有机相中。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述生物活性分子选自胰岛 素、肝素、DNA质粒、破伤风类毒素和白喉类毒素。
技术领域
本发明涉及用于释放生物活性分子的纳米颗粒体系。尤其涉及由 可容纳生物活性分子的离子交联的壳聚糖-聚乙二醇结合物及其制备 方法。
背景技术
释放生物活性试剂的体系形成持续发展的研究领域。已知通过不 同给药途径对动物体或人体给予活性成分具有困难。某些药物，包括 肽、蛋白及多糖，由于上皮屏障的渗透性有限而不能通过粘膜表面有 效吸收。例如，胰岛素目前是通过皮下给药并因此是不受患者欢迎的， 胰岛素是那些通过诸如鼻粘膜屏障或肠粘膜屏障的粘膜屏障的能力很 差的活性成分之一，这使得如果要发现与皮下给药不同的途径，则有 必要开发使得该活性分子能够被更好吸收的给药体系。
在最近提出的克服药物所面对的生物屏障的可能性中，强调将活 性成分并入小尺寸颗粒中。所述颗粒与粘膜的相互作用受这些颗粒的 尺寸及其它因素的影响，所述相互作用随颗粒尺寸的降低而增加。
因此，专利申请US2004138095描述了用于释放胰岛素及其它活 性成分的、基于三嵌段聚乙二醇/亲水多聚氨基酸/疏水多聚氨基酸共聚 物的纳米颗粒水混悬液。接下来，专利US 5,641,515描述了用于胰岛 素可控释放的药物制剂，其包含由可生物降解的聚氰基丙烯酸酯形成 的纳米颗粒，其中俘获胰岛素形成复合物。
也开发了基于亲水聚合物的纳米颗粒体系用作释放药物的体系。 本领域中存在的大量文献显示了这一点。已发表了若干研究，其描述 了制备基于天然来源的大分子和多糖的亲水纳米颗粒的若干方法，所 述天然来源的大分子如白蛋白纳米颗粒(W.Lin et al.，Pharm.Res.，11， 1994)和明胶(H.J.Watzke et al.，Adv.Colloid Interface Sci.，50，1-14， 1994)，所述多糖如褐藻酸盐(M.Rajaonarivonvy et al.，J.Pharm.Sci.，82， 912-7，1993)。然而，这些方法大部分需要使用有机溶剂、油及高温， 这些方面极大地限制了这些体系的充分利用。这些方法中最无害的是 所提出的制备褐藻酸盐纳米颗粒的方法，其基于在钙存在下的离子凝 胶化过程以及随后的在阳离子聚电解质聚-L-赖氨酸存在下的硬化。然 而，这些纳米颗粒具有与全身毒性和聚-L-赖氨酸的高成本相关的缺 点。
相对于这些体系的另一选择是壳聚糖纳米颗粒的开发，现有技术 中有出版物描述了其对于活性成分给药的有效性以及得到这些纳米颗 粒的方法(J.Appl.Polym.Sci.1997，63，125-132；Pharm.Res.14，1997b， 1431-6；Pharm.Res.16，1991a，1576-81；S.T.P.Pharm.Sci.9，1999b， 429-436；Pharm.Res.16，1999，1830-5；J.Control Release 74，2001， 317-23及US 5,843,509)。这些纳米颗粒的缺点是其在特定pH和离子 强度条件下的稳定性有限。
文献WO-A-01/32751涉及制备纳米颗粒形式的壳聚糖或壳聚糖衍 生物的方法，其包括将壳聚糖或其衍生物溶于水性介质，然后在表面 改性剂的存在下提高pH至壳聚糖沉淀。
文献WO-A-99/47130涉及纳米颗粒，其具有生物相容的和可生物 降解的、来自至少一种聚阳离子(可以是壳聚糖)和至少一种聚阴离子 的聚电解质复合物，以及活性成分，能够通过在聚电解质复合物形成 的过程中或形成之后用至少一种交联剂(乙二醛、TSTU或EDAP)进一 步处理聚合电解质复合物而得到所述纳米颗粒。
得到与聚氧乙烯以及活性成分结合的壳聚糖纳米颗粒的方法也是 已知的(ES 2098188和ES 2114502)，所述活性成分可以是治疗或抗原 大分子。这些纳米颗粒的形成是通过由加入碱性试剂如三聚磷酸盐而 引起的壳聚糖与活性大分子以聚合纳米聚集体的形式联合沉淀而进 行。
另外，壳聚糖可以与聚乙二醇通过氨基官能团形成共价键而进行 修饰，这称为PEG修饰。专利EP 1304346和US 6,730,735描述了用 于通过粘膜给药的组合物，其包含壳聚糖及PEG结合物，二者通过壳 聚糖的氨基基团而共价结合。
专利申请US2004/0156904描述了用于释放药物试剂的体系，其中 活性试剂被并入基质，所述基质从包括壳聚糖-PEG及水不溶性聚合 物如聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)的组合物制备。
专利申请WO01/32751描述了在包括聚乙二醇的表面活性剂存在 下增加其所在溶液的pH而进行沉淀得到壳聚糖纳米颗粒。然而，PEG 与壳聚糖没有共价结合。
尽管许多出版物针对释放药物体系的开发，仍然需要提供一类对 生物活性分子具有很强的结合能力并允许其以控制速率释放的纳米颗 粒体系。
发明简述
本发明人发现由PEG修饰的壳聚糖纳米颗粒形成的体系允许与 生物活性分子的有效结合以及它们随后在适当生物环境中的释放，所 述纳米颗粒通过在造成壳聚糖交联的试剂的存在下进行离子凝胶化过 程得到。PEG修饰的壳聚糖纳米颗粒与未进行PEG修饰的壳聚糖纳米 颗粒相比具有显著的性能，例如在鼻腔粘膜给予胰岛素方面或在作为 对鼻腔粘膜给予白喉类毒素的反应的免疫原性方面。
因此，本发明的目的在于包含用于释放生物活性分子的纳米颗粒 的体系，其中所述纳米颗粒包含结合物，其包含a)至少50％重量比的 壳聚糖或其衍生物，以及b)少于50％重量比的聚乙二醇(PEG)或其衍 生物，其中组分a)和b)均通过壳聚糖氨基基团共价结合，并且其特征 在于所述纳米颗粒通过交联剂交联。
短语“生物活性分子”具有广泛的意义，并且包含例如下列分子： 小分子量药物、多糖、蛋白、肽、脂质、寡核苷酸、核酸以及其组合。 在本发明的一个变化中，生物活性分子的功能是预防、减轻、治疗或 诊断疾病。在本发明的另一个变化中，生物活性分子具有化妆品功能。
本发明的第二个方面涉及药物组合物或疫苗，其包含上文所定义 的纳米颗粒。在优选的方面，所述组合物或疫苗用于粘膜给药。
另一方面，本发明的目的是包含上文所定义的纳米颗粒的化妆品 组合物。
本发明的另一方面涉及包含壳聚糖-PEG纳米颗粒的组合物，在 纳米颗粒内能够保留一个或多个生物活性分子，如药物、疫苗或遗传 物质。本身不被看作生物活性分子但能够对给药体系的效率作出贡献 的肽、蛋白或多糖也能够被捕获在纳米结构内。
得到如所定义的用于释放生物活性分子的体系的过程组成本发明 的最后一方面，所述过程包含：
a)制备壳聚糖-PEG结合物水溶液；
b)制备交联剂水溶液；以及
c)在搅拌下将步骤a)与b)的溶液混合，使得壳聚糖-PEG纳米颗 粒通过离子凝胶化和随后的沉淀而自发得到。
在所述过程的一个变化中，在两相混合之前，活性成分被包括在 壳聚糖水溶液中或被包括在交联剂水溶液中。
附图的详细说明
图1A：壳聚糖PEG修饰程度、聚合物溶液的pH以及壳聚糖- PEG/TPP比率对纳米颗粒尺寸的影响。
图1B：壳聚糖PEG修饰程度、聚合物溶液的pH以及壳聚糖- PEG/TPP比率对纳米颗粒尺寸多分散性的影响。
图2A：在乙酸盐缓冲液(pH：4和7.4)中和在纯水(MQ)中孵育1 天后的与壳聚糖和壳聚糖-PEG纳米颗粒缔合的血浆DNA的琼脂糖 凝胶电泳分析。
图2B：在乙酸盐缓冲液(pH：4和7.4)中和在纯水(MQ)中孵育4 周后的与壳聚糖和壳聚糖-PEG纳米颗粒缔合的血浆DNA的琼脂糖 凝胶电泳分析。
图3：与壳聚糖和壳聚糖-PEG纳米颗粒缔合的血浆DNA在壳多 糖酶存在下的琼脂糖凝胶电泳分析。
图4A：PEG修饰程度对高分子量壳聚糖(CS)纳米颗粒转染效率的 影响。
图4B：pDNA负载量对高分子量壳聚糖(CS)纳米颗粒转染效率的 影响。
图5A：pDNA负载量对低分子量壳聚糖(CS)纳米颗粒转染效率的 影响。
图5B：PEG修饰程度对低分子量壳聚糖(CS)纳米颗粒转染效率的 影响。
图6：包含在不同制剂中的10 U/kg胰岛素或乙酸盐缓冲液(对照) 鼻内给药后的血糖。血糖以相对于基线值的％的平均值±S.E.M.表示。 下列数值为不同给药之前的基线数值：乙酸盐缓冲液(■)：423±16mg/dl (n＝7)；胰岛素(□)：430±15mg/dl(n＝7)；胰岛素在壳聚糖溶液中(●)： 439±12mg/dl(n＝8)；壳聚糖纳米颗粒(◆)：469±14mg/dl(n＝7)；壳聚糖 -PEG纳米颗粒(○)：458±21mg/dl(n＝8)。
图7：对禁食过夜的糖尿病大鼠鼻内给予含有胰岛素的制剂或乙 酸盐缓冲液后进行的葡萄糖耐量试验。在时间0以及鼻内给予乙酸盐 缓冲液(■)：(n＝10)；胰岛素(□)：(n＝6)；胰岛素在壳聚糖溶液中(●)： (n＝6)；壳聚糖纳米颗粒(◆)：(n＝6)；壳聚糖-PEG纳米颗粒(○)：(n＝6) 1小时之后胃内给予葡萄糖(2g每kg体重)。
图8：鼻内给予包含在不同壳聚糖和壳聚糖-PEG纳米颗粒制剂 中的10μg TD之后第0、7和14天小鼠血清中IgG抗-TD的最终滴 度(n＝6)。IN：鼻内；IP：腹膜内。
*统计学显著不同(α＜0.5)。
发明的详细描述
本发明的体系包含纳米颗粒，其结构包含交联的壳聚糖和聚乙二 醇(PEG)结合物，其中可包含有活性成分。
术语“纳米颗粒”被理解为包含结合物的结构，所述结合物由壳 聚糖与PEG之间通过壳聚糖氨基基团的共价结合而得到，且所述结合 物通过阴离子交联剂的作用发生离子凝胶化而进一步交联。共价键的 形成以及随后体系的离子交联产生独立的及可观察的特征物理实体， 其平均尺寸小于1μm，即，平均尺寸为1至999nm。
“平均尺寸”被理解为纳米颗粒群的平均直径，该纳米颗粒群在 其形成于其中的水介质中一起运动。这些体系的平均尺寸能够通过本 领域技术人员已知的标准方法进行测量，这些方法描述于例如下文的
实验部分。
体系的纳米颗粒被表征为具有小于1μm的平均颗粒尺寸，优选具 有1至999nm的平均尺寸，优选为50至800nm，更优选为50nm至500 nm。平均颗粒尺寸主要受壳聚糖与PEG的比率、壳聚糖脱乙酰基的程 度以及颗粒形成条件(壳聚糖-PEG浓度、交联剂浓度及二者之间的比 率)的影响。与由未经PEG修饰的壳聚糖形成的体系相比，PEG的存在 降低了平均颗粒尺寸。
另外，纳米颗粒能够具有电荷(通过Z电势测量)，其大小能够为 +0.1mV至+50mV，优选为+1至+40mV，取决于所提及的变量，尤其 取决于壳聚糖用PEG的官能化程度。纳米颗粒的正电荷因其有利于纳 米颗粒与粘膜表面的相互作用而受关注。然而，中性电荷可能因其肠 胃外给药而更受关注。
包含用于释放上文所定义的生物活性分子的纳米颗粒的体系的结 合物中的壳聚糖含量为超过50％重量比，优选为超过75％重量比。对 于PEG部分，其在结合物中的含量低于50％，优选低于25％。
壳聚糖是来自甲壳质(聚-N-乙酰基-D-葡糖胺)的天然聚合物，其中 N上乙酰基的重要部分已被水解反应除去。脱乙酰化程度通常在30至 95％，优选为60至95％，其表明5至40％的氨基基团被乙酰化。因此其 具有氨基多糖结构及阳离子性质。其包含具有通式(I)的单体单元的重 复：
其中n为整数，外加m个氨基基团被乙酰化的单元。n+m的和代表聚合 度，即壳聚糖链中单体单元的数目。
用于得到本发明壳聚糖-PEG结合物的壳聚糖具有5至2000kDa 的分子量，优选为10至500kDa，更优选为10至100kDa。能够使用的 商品化壳聚糖的实例为UPG 113、UP CL 213及UP CL 113，均能够购 自NovaMatrix，Drammen，Norway。
包含用于得到壳聚糖-PEG结合物的壳聚糖的单体单元的数目为 30至3000个单体，优选为60至600个。
还能够使用壳聚糖衍生物作为壳聚糖之外的选择，其被理解为壳 聚糖中的一个或多个羟基基团和/或一个或多个氨基基团被修饰以提 高壳聚糖的溶解性或增加其粘膜粘附性质。这些衍生物包括乙酰化的、 烷基化的或磺化的壳聚糖、硫醇化衍生物以及其它，如Roberts，Chitin Chemistry，Macmillan，1992，166中所述。当使用衍生物时，其优选自 O-烷基醚、O-酰基酯、三甲基壳聚糖、用聚乙二醇修饰的壳聚糖等。 其它可能的衍生物为盐，如柠檬酸盐、硝酸盐、乳酸盐、磷酸盐、谷 氨酸盐等。在任何情况下，本领域技术人员了解如何鉴别能够在壳聚 糖上进行而不影响最终制剂的商业生存能力和稳定性的修饰。
对于聚乙二醇(PEG)部分，其最通常的形式为具有通式(II)的聚合 物：
H-(O-CH2-CH2)p-O-H
(II)
其中p为整数，代表PEG聚合度。在本发明中，PEG聚合度范围为50至 500，其对应2至20kDa的分子量，优选为5至10kDa。
其中一个或两个羟基基团被修饰的修饰的PEG被用于形成壳聚糖 -PEG复合物。能够被用于得到壳聚糖-PEG结合物的修饰的PEGs包 括具有通式(III)的PEGs：
X1-(O-CH2-CH2)p-O-X2
(III)
其中：
X1为阻碍OH发生后续反应的羟基保护基团。羟基保护基团在本领 域是公知的，有代表性的保护基团(已经包括被保护的氧)为甲硅烷基 醚，如三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、叔丁基二甲基甲硅烷 基醚、叔丁基二苯基甲硅烷基醚、三异丙基甲硅烷基醚、二乙基异丙 基甲硅烷基醚、texyldimethylsilyl ether、三苯基甲硅烷基醚、二叔丁 基甲基甲硅烷基醚；烷基醚，如甲基醚、叔丁基醚、二苄醚、对甲氧 基苄基醚、3，4-二甲氧基苄基醚、三苯甲基醚、烯丙基醚；烷氧基甲 基醚，如甲氧基甲基醚、2-甲氧基乙氧基甲基醚、苄氧基甲基醚、对 甲氧基苄氧基甲基醚、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基醚；四氢吡喃基 醚及相关的醚；甲硫基甲基醚；酯，如乙酸酯、苯甲酸酯；三甲基乙 酸酯；甲氧基乙酸酯；氯乙酸酯；乙酰丙酸酯；碳酸酯，如碳酸苄基 酯、对硝基苄基碳酸酯、叔丁基碳酸酯、2，2，2-三氯乙基碳酸酯、2-(三 甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯，碳酸烯丙基酯。羟基保护基团的另外的实 例可见于参考书籍，如Green and Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)，John Wiley&Sons，Inc.，New York， 1999。在优选实施方案中，保护基团为烷基醚，更优选为甲基醚。
X2能够是氢或允许锚定在壳聚糖氨基基团上的桥基团。所用的桥 分子的优选的但不是唯一的形式为琥珀酰亚胺或其衍生物。
或者，X1还能够是允许与氨基之外的其它基团锚定的基团。例如， 马来酰亚胺被用作桥分子以达到与SH基团的键接。
与PEG反应的壳聚糖氨基基团的数目，或者说，壳聚糖氨基基团 用PEG的官能化，称为PEG修饰，为0.1％至5％，优选为0.2％至2％，更 优选为0.5％至1％。
得到的壳聚糖-PEG结合物具有5至3000kDa的分子量，优选为10 至500kDa。
本发明的纳米颗粒体系的特征在于其通过壳聚糖-PEG结合物的 离子交联而形成。交联剂为允许壳聚糖-PEG结合物通过离子凝胶化 交联、有利于自发形成纳米颗粒的阴离子盐。在本发明中，交联剂为 聚磷酸盐，优选使用三聚磷酸钠(TPP)。得到纳米颗粒体系的交联很简 单，且如发明背景中所述，对本领域技术人员是已知的。
本发明的第二方面为包含上文所定义的纳米颗粒的药物组合物。 药物组合物的实例包括任何用于口服、含服、舌下给药或局部给药的 液体组合物(水中的或含有诸如粘度调节剂、pH缓冲剂等添加剂的水中 的纳米颗粒混悬液)或固体组合物(冻干或雾化的纳米颗粒，形成能够 用于制备颗粒剂、片剂或胶囊剂的粉末)，或用于透皮、眼、鼻、阴道 或肠胃外给药的液体或半固体形式。在非肠胃外的给药途径中，通过 提供具有相当正电荷的颗粒能够改善纳米颗粒与皮肤或粘膜的接触， 有利于纳米颗粒与所提到的负电荷表面的相互作用。在肠胃外给药途 径中，更具体地对于静脉给药，这些体系提供调节药物或与其缔合的 分子的体内分布的可能性。
在优选的方面，制剂通过粘膜给药。壳聚糖-PEG结合物的正电 荷通过药物与带负电的粘膜及上皮细胞表面的相互作用而提供药物在 粘膜表面上的更好吸收。
壳聚糖-PEG纳米颗粒是对生物活性分子具有高缔合能力的体 系。所述缔合能力取决于所并入分子的类型以及所述的制剂参数。因 此，本发明的另一方面是包含例如上文所定义的壳聚糖-PEG纳米颗 粒和至少一种生物活性分子的组合物。
术语“生物活性分子”涉及任何用于处理、治疗、预防或诊断疾 病或用于改善人和动物的生理和心理健康的物质。这些生物活性分子 能够包括从低分子量药物到多糖、蛋白、肽、脂质、寡核苷酸及核酸 类型的分子及其组合。与这些纳米颗粒缔合的分子的实例包括蛋白如 破伤风类毒素及白喉类毒素、多糖如肝素、肽如胰岛素以及编码若干 蛋白的质粒。
在优选实施方案中，所述生物活性分子为胰岛素。在另一优选实 施方案中，所述生物活性分子为白喉或破伤风类毒素。在另一优选实 施方案中，所述生物活性分子为肝素。在另一优选实施方案中，所述 生物活性分子为DNA质粒。
本发明的纳米颗粒体系还能够包括其它不具有治疗效果但形成化 妆品组合物的活性分子。这些化妆品组合物包括任何用于局部给予的 液体组合物(纳米颗粒混悬液)或乳液。能够掺入纳米颗粒中的活性分 子包括抗痤疮剂、抗真菌剂、抗氧化剂、除臭剂、止汗剂、去头屑剂、 皮肤增白剂、晒黑剂(tanning agent)、紫外光吸收剂、酶、化妆品抗微 生物剂等。
本发明的另一方面为包含上文所定义的纳米颗粒及抗原的疫苗。 通过纳米颗粒形成的体系给予抗原允许达成免疫应答。所述疫苗能够 包含蛋白、多糖或能够是DNA疫苗。严格地说，DNA疫苗是编码引起 免疫应答的抗原的表达的DNA分子。在优选实施方案中，抗原为破伤 风类毒素及白喉类毒素。
本发明的另一方面涉及制备例如上文所定义的壳聚糖-PEG纳米 颗粒的方法，其包含：
a)制备壳聚糖-PEG结合物水溶液；
b)制备交联剂水溶液；
c)在搅拌下将步骤a)和b)的溶液混合，使得通过离子凝胶化作用 和后续的沉淀作用而自发得到壳聚糖-PEG纳米颗粒。
通过在两种溶液混合前加入氢氧化钠而调节初始壳聚糖-PEG结 合物溶液的pH至达到4.5至6.5的值。
在所述方法的变化中，得到的壳聚糖-PEG/交联剂的比率为2/1 至8/1，优选3/1，该比率提供具有相对较低多分散性的制剂。然而，也 可能使用更高的壳聚糖-PEG/交联剂比率以及在更酸性的介质中制 备颗粒。
交联剂的存在允许交联壳聚糖-PEG结合物以形成网状物，在所 述网状物中能够插入随后能够被释放的生物活性分子。交联剂还赋予 纳米颗粒以使其适合作为给予生物活性分子的体系的尺寸、电势和结 构特征。
生物活性分子能够被直接包括在步骤a)或b)的溶液中，或预先分 散在水相或有机相中，使得通过离子凝胶化作用和后续的沉淀作用而 自发得到含有生物活性分子的壳聚糖-PEG纳米颗粒。
因此，能够通过下述方法并入生物活性分子：
a)将活性分子直接溶解在交联剂或壳聚糖-PEG溶液中；
b)在将活性分子合并到交联剂或壳聚糖-PEG溶液中之前将其 溶解在酸或碱水溶液中；或
c)在将活性分子合并到交联剂或壳聚糖-PEG溶液中之前将其 溶解在与水混溶的极性有机溶剂中。
制备壳聚糖-PEG纳米颗粒的方法能够进一步包含附加步骤，其 中所述纳米颗粒被冻干。从药物的角度，得到冻干形式的纳米颗粒是 很重要的，因为这样改善其贮存稳定性。壳聚糖-PEG纳米颗粒(具有 不同的PEG修饰度)能够在5％浓度的低温防护剂如葡萄糖的存在下被 冻干。可存在其它通常的添加剂。事实上，冻干前后颗粒尺寸的测定 没有显著的改变。或者说，纳米颗粒可被冻干并再次悬浮而不造成其 中的变化(表I)。
表I：冻干前后CS-PEG纳米颗粒的特征
制剂 尺寸(nm)P.I.* 冻干前 尺寸(nm) P.I. 用5％葡萄糖冻干后 壳聚糖-0.5％PEG 壳聚糖-1％PEG 74.7±9.5 0.231 76.9±6.0 0.500 78.6±18.3 0.224 87.7±22.3 0.418
*P.I.：多分散性指数。
下文描述了数个说明性实施例，显示本发明的特征和优点，但不 能被解释为对本发明目的的限制。
实施例
实施例1
壳聚糖-PEG纳米颗粒制备的优化
根据例如WO 9804244中所述的壳聚糖的离子凝胶化技术来制备 壳聚糖-PEG纳米颗粒。具体地，首先将具有0.5％或1％PEG修饰度 (被PEG官能化的氨基基团的百分比)的壳聚糖以1mg/mL的浓度溶于 高纯水中。为了研究其对纳米颗粒形成的可能的影响，通过在制备颗 粒之前加入NaOH将壳聚糖-PEG溶液的初始pH调节到4.5至6.5。 为了得到2/1、3/1和4/1的壳聚糖-PEG/TPP比率而将三聚磷酸钠(TPP) 以不同的浓度也溶于水。在磁力搅拌下往固定体积的壳聚糖-PEG溶 液(1.5mL)中加入固定体积的TPP溶液(0.6mL)后自发地发生纳米颗 粒的形成。
图1A和1B显示壳聚糖的PEG修饰度、聚合物溶液的pH以及壳 聚糖-PEG/TPP比率对纳米颗粒尺寸及多分散性所产生的影响。基于 所得到的结果能够推断具有0.5-1％PEG修饰度的壳聚糖-PEG纳米 颗粒能够在很宽的实验条件范围内容易地制备，pH是对纳米颗粒尺寸 影响最大的参数。另外，当PEG修饰度从0.5％增加到1％时，pH的 影响更大。
另外，纳米颗粒尺寸分布还受到壳聚糖PEG修饰度以及壳聚糖- PEG溶液的pH的影响。显然，得到具有较低分散性的制剂的最佳壳 聚糖-PEG/TPP比率为3/1。
纳米颗粒的尺寸是通过光子相关光谱法，使用专用于此目的的 Zetasizer III(Malvem Instruments，Malvern，UK)来测定。壳聚糖-PEG 纳米颗粒尺寸范围为70至310nm。
实施例2
壳聚糖纳米颗粒与壳聚糖-PEG纳米颗粒之间的比较
如从表II中能够观察到的，PEG修饰改变壳聚糖的溶解性。这影 响纳米颗粒的形成。在壳聚糖-PEG的情况下，最佳的壳聚糖/TPP比 率从典型的6/1至4/1转变为较低的值，典型为4/1至2/1。这些不同 可能是由于壳聚糖的化学修饰，改变了能够相互作用的可利用基团， 能够改变离子移变凝胶化条件。
表II
壳聚糖 壳聚糖-0.5％PEG 壳聚糖-1％PEG 初始pH 溶解性限度 4.7-4.8 6.4-6.5 4.6-4.7 6.9-7.1 4.6-4.7 7.1-7.2
关于纳米颗粒，能够观察到由PEG修饰的壳聚糖制备的纳米颗粒 与由纯壳聚糖形成的纳米颗粒有显著不同。这显示于表III，其中显示 了由壳聚糖、具有0.5％和1％PEG修饰度的壳聚糖(在初始pH值，以 其最佳聚合物比率)形成的纳米颗粒的特征。
PEG修饰造成纳米颗粒尺寸和表面电荷的显著降低。在后一种情 况中，PEG修饰度也具有强的影响，因为当PEG修饰度从0.5％增加 到1％时表面电荷降低的更多。
表III
尺寸(nm) P.I. 电势(mV) 壳聚糖，4/1 壳聚糖-0.5％PEG，3/1 壳聚糖-1％PEG，3/1 265±10 74±9 77±6 0.363 0.231 0.500 +29.1±1.1 +12.1±1.8 +1.6±0.6
P.I.＝多分散性指数
实施例3
负载有DNA的具有不同PEG修饰度的壳聚糖纳米颗粒的形成与表征
为了将其包裹，质粒DNA在形成纳米颗粒之前被并入到TPP溶 液中。随后将该含有DNA的TPP加入到壳聚糖-PEG溶液中，保持 磁力搅拌。理论DNA负载为用于制备纳米颗粒的壳聚糖-PEG总量 (1mg)的5％、10％或20％。包裹质粒DNA的效率经荧光(Pico绿dsDNA 染料)及琼脂糖凝胶电泳测定证实总是高于90％。
表IV、V和VI显示不同壳聚糖和壳聚糖-PEG纳米颗粒的特征。 与未负载的纳米颗粒类似，含有PEG的负载有DNA的制剂比不含有 PEG的制剂小很多并具有更少的表面正电荷。
在所有情况下，DNA的存在还造成载体特征的变化，尤其是在高 DNA百分比时，其中表面电荷通常下降。关于纳米颗粒的尺寸，高 DNA负载允许诱导更交联结构的形成，这造成颗粒尺寸的下降。这能 够在未PEG修饰的载体的情况下观察到，其中尺寸从约270-300nm 下降至220nm。
然而，PEG修饰的载体的尺寸随DNA负载而增加，尤其是当使 用具有0.5％PEG修饰度的壳聚糖-PEG时。
表IV
不具有PEG的壳聚糖，4/1 尺寸(nm) P.I. 电势(mV) 空白 +5％DNA +10％DNA +20％DNA 265±10 278±17 309±2 216±7 0.363 0.340 0.378 0.363 29.1±1.1 40.5±5.6 41.6±0.8 35.2±1.8
表V
壳聚糖-0.5％PEG，3/1 尺寸(nm) P.I. 电势(mV) 空白 +5％DNA +10％DNA +20％DNA 74±9 115±14 131±13 181±8 0.231 0.227 0.207 0.209 +121±1.8 +13.4±2.1 +11.3±3.9 +5.7±1.6
表VI
壳聚糖-1％PEG，3/1 尺寸(nm) P.I. 电势(mV) 空白 +5％DNA +10％DNA +20％DNA 77±6 78±7 78±10 105±2 0.500 0.485 0.256 0.229 +1.6±0.6 +3.7±0.4 +1.3±2.1 -0.6±0.4
实施例4
体外质粒DNA释放
质粒DNA有效地缔合在壳聚糖及壳聚糖-PEG颗粒上。如图2A 和2B所示，当负载有质粒DNA的纳米颗粒在乙酸缓冲液(pH：4，pH：7.4) 及纯水(MQ)中孵育超过一个月时没有检测到质粒DNA释放(根据琼脂 糖凝胶电泳分析)。
实施例5
酶存在下的体外质粒DNA释放
如能够由电泳分析(图3)观察到的，当负载有质粒DNA的纳米颗 粒在壳聚糖酶的存在下(0.6mg/mL)于pH 6的乙酸盐缓冲液中孵育时， 质粒DNA能够由壳聚糖和壳聚糖-PEG纳米颗粒中释放。
这些结果表明质粒DNA有效缔合在纳米颗粒上，但其并不是不 可逆结合的，因为当聚合物载体被酶降解时其能够被释放。
实施例6
结合在壳聚糖-PEG纳米颗粒上的(GFP)质粒DNA的转染效率
评价了通过壳聚糖及壳聚糖-PEG纳米颗粒的方法在HEK293细 胞系模型中编码GFP质粒的转染效率。
图4显示壳聚糖PEG修饰度(0.5％和1％)对含有20％质粒DNA (pDNA)负载的高分子量壳聚糖纳米颗粒的转染效率产生的影响。每孔 的质粒剂量为1μg。结果表明0.5％的PEG修饰度对这些纳米颗粒的 转染能力具有正面影响。该PEG修饰度被选择用于后续实验。图4b 中所示的结果表明转染的效率随纳米颗粒的pDNA负载而增加。该观 察结果很有趣，因为质粒的剂量是常数(1μg)，并因此当pDNA负载 增加时纳米颗粒剂量下降。
还评价了低分子量壳聚糖-PEG纳米颗粒(10kDa，LMW CS-PEG NP)的质粒负载对转染效率的影响。在这种情况下，对较小的负载(5％) 观察到较高的表达水平(图5a)。另外，对该小负载(5％pDNA)，观察 到PEG修饰对转染效率具有负面影响(图5b)。
这些实验的主要结论是壳聚糖PEG修饰根据壳聚糖的分子量而 具有正面的(HMW CS-PEG NP)或负面的(LMW CS-PEG NP)影响。
实施例7
包裹的胰岛素及自由胰岛素以10 U/kg的浓度鼻内给药的生物学影响
为了将胰岛素包囊进壳聚糖纳米颗粒，预先将2.4mg胰岛素溶于 NaOH溶液中，随后加入1.2mL TPP。随后将该混合物加入到3mL 壳聚糖中。磁力搅拌5分钟后，将该制剂在10,000g离心40分钟。除 去上层清液，并将沉降物溶于缓冲液中。相应地，进行相同的过程以 制备壳聚糖-PEG纳米颗粒，但在2mg/mL的壳聚糖中加入10mg/mL 的PEG 400。
用光子相关光谱法测定，壳聚糖纳米颗粒的最终尺寸为605±15 nm，而壳聚糖-PEG纳米颗粒的最终尺寸为590±6nm。
最初在体重200至220g的雄性Wistar大鼠中通过注射链脲霉素 的pH4.5的柠檬酸盐缓冲液溶液而诱发糖尿病(65mg/kg i.v.)。当所述 大鼠用链脲霉素处理3周后其血糖浓度超过400mg/dl时被认为患有 糖尿病。
禁食的大鼠被用于进行此实验。将它们根据所给予的制剂分为不 同的组。不同的制剂如下：对照溶液(乙酸盐缓冲液，pH4.3)，溶于乙 酸盐缓冲液中的胰岛素，溶于壳聚糖溶液中的胰岛素，以及缔合在壳 聚糖纳米颗粒上的胰岛素和缔合在壳聚糖-PEG纳米颗粒上的胰岛 素，胰岛素的浓度为10 U/kg体重。通过在每一鼻孔使用Eppendorf 移液管放置小体积的这些制剂(10-20μL)而给药，这些大鼠以仰卧的姿 势用乙醚麻醉。然后使动物在整个实验过程中保持清醒以防止麻醉对 血液葡萄糖水平可能具有的任何影响。
为了测定血液葡萄糖水平，在鼻腔粘膜给药之前以及每15分钟直 至90分钟从尾静脉中采集血样。然后从鼻腔粘膜给药后第2小时至第 7小时每小时以及最终在第24小时采集血样。立即使用葡萄糖分析仪 (来自Chronolyss的Prestige)测定血液葡萄糖水平。实验过程中大鼠保 持禁食。
如图6所示，鼻腔粘膜给予pH4.3的乙酸盐缓冲液造成血糖随时 间缓慢且持续地下降，最大下降值为给药6小时后对照值的28％。10 U/kg的胰岛素乙酸盐缓冲液溶液的鼻腔粘膜给药对前述结果没有显 著的改变。然而，当胰岛素缔合在壳聚糖-PEG纳米颗粒上时，给药 后15分钟之内血糖水平下降18％(p＜0.01)，在给药后45分钟达到 45-50％(分别为p＜0.01及p＜0.001)的最大下降。必须强调，该下降保 持到至少鼻腔粘膜给药过后7小时。当缔合在壳聚糖纳米颗粒上的胰 岛素被鼻内给药时也观察到血糖水平的显著下降。在这种情况下，血 糖从30分钟开始显著下降，具体地说，下降16％(p＜0.01)，最大的下 降为在鼻内给药2小时后观察到的32％(p＜0.001)。当胰岛素溶于壳聚 糖溶液时，血糖也下降，但比胰岛素缔合在壳聚糖-PEG纳米颗粒上 时的下降程度显著减少。
实施例8
含有胰岛素的纳米颗粒对口服葡萄糖给药的升糖反应的影响
禁食过夜的糖尿病大鼠被用于进行该实验。对其鼻腔粘膜给予实 施例7所述的每一制剂。1小时后每组大鼠接受2g每kg体重的口服 葡萄糖给药。测定在葡萄糖给药之前和给药后10、20、30、60、90 及120分钟采集自尾静脉的血样中的血糖。
图7显示含有胰岛素的纳米颗粒对口服葡萄糖给药的升糖反应的 影响。在接受乙酸盐缓冲液的对照大鼠中，口服葡萄糖给药后血糖升 高，30分钟后达到其最大值105％(p＜0.001)。随后在2小时内血糖逐 步下降。相应地，胰岛素的乙酸盐缓冲液溶液(10 U/kg)没有显著改变 该结果。
然而，在壳聚糖溶液中相同量的胰岛素使对葡萄糖的升糖反应上 升189％(p＜0.05)，而缔合在壳聚糖或壳聚糖-PEG纳米颗粒上的胰岛 素使其分别上升193％(p＜0.01)和225％(p＜0.01)。
因此，比较基于所分析的不同制剂的A.U.C.(曲线下面积)，最有 效的制剂为对应于缔合在壳聚糖-PEG纳米颗粒上的胰岛素制剂，然 后是缔合在壳聚糖纳米颗粒上的胰岛素制剂，最后是对应于胰岛素在 壳聚糖溶液中的制剂。
这些结果显示使用本发明所述的壳聚糖-PEG纳米颗粒在糖尿病 大鼠中增加胰岛素的鼻腔粘膜吸收。实验结果显示缔合在壳聚糖- PEG纳米颗粒上的胰岛素(10 U/kg体重)从鼻内释放后15分钟开始到 最少7小时显著降低血糖并当发生口服给予葡萄糖时提高升糖反应。 对缔合在所述纳米颗粒上的4 U/kg的胰岛素检测到不那么显著的影 响。
当胰岛素缔合在只由壳聚糖形成纳米颗粒上或当胰岛素在壳聚糖 的溶液中时，其功效低于当其缔合在壳聚糖-PEG纳米颗粒上时，而 自由胰岛素在糖尿病大鼠中鼻内释放后对生物学参数不具有任何显著 影响。
实施例9
由负载有白喉类毒素的纳米颗粒产生的免疫应答的体内评价
白喉类毒素(DT)与壳聚糖或壳聚糖-PEG纳米颗粒的缔合是通过 将DT并入TPP水溶液中(300μg的DT)而进行。通过在磁力搅拌下向 3mL壳聚糖或壳聚糖-PEG溶液(1mg/mL)中加入不同体积的TPP水 溶液(1mg/mL)使纳米颗粒自发形成。计算TPP溶液的体积以达到壳聚 糖：TPP比率为8∶1及2∶1。壳聚糖以其具有86％脱乙酰化程度的盐酸 盐Protosan Cl113及Protosan Cl213的形式商品化。通过在10,000 g、5℃离心40分钟来分离壳聚糖纳米颗粒。在壳聚糖-PEG的情况 下，在3800g于离心超过滤器(Amiconultra-4 100000 NMWL， Millipore)上离心30分钟收集纳米颗粒。除去上清液，将纳米颗粒重 新悬浮在pH7.4的磷酸盐缓冲的盐水中，用于对小鼠给药。
通过鼻内免疫进行壳聚糖和壳聚糖-PEG的免疫原性。使用6周 龄及22-25g体重的雄性BALB/c小鼠。将小鼠分为5组。两组用负载 有DT的壳聚糖纳米颗粒(CS-113 Cl，CS-213 Cl)处理，一组用负载有 DT的壳聚糖-PEG纳米颗粒处理。所用的剂量为10μg的DT缔合在 100μg的纳米颗粒上并溶于10μL pH7.4的磷酸盐缓冲液中，每个鼻 孔给予5μL。另一组用pH7.4的磷酸盐缓冲的盐水中的自由类毒素(10 μg/小鼠)处理。另外，作为对照，一组腹膜内接受吸附于磷酸铝中的 DTP(白喉、破伤风及百日咳)疫苗(10μg/小鼠)。在第0、7和14天将 药剂给予清醒的大鼠。
给予第一次药剂后的第14、28、42、56和70天从小鼠的尾部取 得血样进行体内免疫应答测定。在第70天还依次采集肠、支气管肺泡 及唾液灌洗样品。通过腹膜内注射匹鲁卡品(50μL，1mg/mL)而诱发分 泌唾液。收集每只小鼠100μL的最初唾液流。然后用戊巴比妥麻醉小 鼠并将其处死。通过注射和在气管中吸入5mL的灌洗介质以通过静 脉内套管的方式使肺充气而得到支气管肺泡灌洗液。无菌条件下依次 除去肠的片段(十二指肠、空肠、回肠)，并在4mL的1mM PMSF、1 mM碘乙酸和10mM EDTA的溶液中匀浆。通过离心使样品澄清并加 入叠氮化钠、PMSF和牛血清作为防腐剂。在进行抗体浓度测定之前 所有的样品均保存在-20℃。
通过ELISA测试对血清和粘膜组织中抗体的响应进行评价。首先 用100μL DT的pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液溶液包被微量板 (DYNEX，immulon)(4μg/孔)并在4℃孵育过夜。在步骤之间，用pH 7.4的PBST (0.01M PBS或含有5％v/v Tween20的磷酸盐缓冲液) 洗涤孔三次。为了最小化非特异性反应，在所有孔中加入100μL的 PBSTM(含有5％w/v的脱脂乳粉末和0.1w/v的叠氮化钠作为防腐剂 的PBST)并将其在37℃孵育1小时。用PBST洗涤后将样品在PBSTM 中分两步进行系列稀释，并将板在37℃再孵育2小时。然后将100μL 的山羊抗小鼠IgG免疫球蛋白过氧化物酶结合物在PBSTM中以 1∶2000稀释，加入到孔中，并在37℃孵育2小时。洗涤板，将50μL 的邻苯二胺二盐酸盐(0.45mg/mL)加入到作为底物的pH5.0的0.05M 柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中。显色(37℃，30分钟)后在酶标仪(3350-UV， Biorad)上于450nm读取板。
图8显示鼻内免疫之后由负载有DT的纳米颗粒及对照DT溶液 引起的抗白喉IgG水平。该图还显示对应于腹膜内给药的商品化制剂 (吸附于磷酸铝中的DT)的结果。概括地说，该结果表明，第一个月之 后，对于负载有DT的纳米颗粒所观察到的IgG水平比对应于流体疫 苗的IgG水平显著较高(p＜0.05)。实际上，这些值可与那些对于肠胃外 给药的用作佐剂的制剂(吸附于磷酸铝中的DT)所得到的值相比。因 此，这些结果清楚地显示含有纳米颗粒的制剂的佐剂作用。应强调的 另一观察结果使免疫应答随时间增加并持续。最后，对于纳米颗粒组 合物的影响，很有趣的是，表明壳聚糖的分子量对壳聚糖纳米颗粒所 达到的免疫应答没有影响，然而，壳聚糖PEG修饰对纳米颗粒的功效 有显著的影响。实际上，一个月后壳聚糖-PEG纳米颗粒的IgG水平 显著高于壳聚糖纳米颗粒的IgG水平。
在最近提出的克服药物所面对的生物屏障的可能性中，强调将活 性成分并入小尺寸颗粒中。所述颗粒与粘膜的相互作用受这些颗粒的 尺寸及其它因素的影响，所述相互作用随颗粒尺寸的降低而增加。
因此，专利申请US2004138095描述了用于释放胰岛素及其它活 性成分的、基于三嵌段聚乙二醇/亲水多聚氨基酸/疏水多聚氨基酸共聚 物的纳米颗粒水混悬液。接下来，专利US 5,641,515描述了用于胰岛 素可控释放的药物制剂，其包含由可生物降解的聚氰基丙烯酸酯形成 的纳米颗粒，其中俘获胰岛素形成复合物。
也开发了基于亲水聚合物的纳米颗粒体系用作释放药物的体系。 本领域中存在的大量文献显示了这一点。已发表了若干研究，其描述 了制备基于天然来源的大分子和多糖的亲水纳米颗粒的若干方法，所 述天然来源的大分子如白蛋白纳米颗粒(W.Lin et al.，Pharm.Res.，11， 1994)和明胶(H.J.Watzke et al.，Adv.Colloid Interface Sci.，50，1-14， 1994)，所述多糖如褐藻酸盐(M.Rajaonarivonvy et al.，J.Pharm.Sci.，82， 912-7，1993)。然而，这些方法大部分需要使用有机溶剂、油及高温， 这些方面极大地限制了这些体系的充分利用。这些方法中最无害的是 所提出的制备褐藻酸盐纳米颗粒的方法，其基于在钙存在下的离子凝 胶化过程以及随后的在阳离子聚电解质聚-L-赖氨酸存在下的硬化。然 而，这些纳米颗粒具有与全身毒性和聚-L-赖氨酸的高成本相关的缺 点。
相对于这些体系的另一选择是壳聚糖纳米颗粒的开发，现有技术 中有出版物描述了其对于活性成分给药的有效性以及得到这些纳米颗 粒的方法(J.Appl.Polym.Sci.1997，63，125-132；Pharm.Res.14，1997b， 1431-6；Pharm.Res.16，1991a，1576-81；S.T.P.Pharm.Sci.9，1999b， 429-436；Pharm.Res.16，1999，1830-5；J.Control Release 74，2001， 317-23及US 5,843,509)。这些纳米颗粒的缺点是其在特定pH和离子 强度条件下的稳定性有限。
文献WO-A-01/32751涉及制备纳米颗粒形式的壳聚糖或壳聚糖衍 生物的方法，其包括将壳聚糖或其衍生物溶于水性介质，然后在表面 改性剂的存在下提高pH至壳聚糖沉淀。
文献WO-A-99/47130涉及纳米颗粒，其具有生物相容的和可生物 降解的、来自至少一种聚阳离子(可以是壳聚糖)和至少一种聚阴离子 的聚电解质复合物，以及活性成分，能够通过在聚电解质复合物形成 的过程中或形成之后用至少一种交联剂(乙二醛、TSTU或EDAP)进一 步处理聚合电解质复合物而得到所述纳米颗粒。
得到与聚氧乙烯以及活性成分结合的壳聚糖纳米颗粒的方法也是 已知的(ES 2098188和ES 2114502)，所述活性成分可以是治疗或抗原 大分子。这些纳米颗粒的形成是通过由加入碱性试剂如三聚磷酸盐而 引起的壳聚糖与活性大分子以聚合纳米聚集体的形式联合沉淀而进 行。
另外，壳聚糖可以与聚乙二醇通过氨基官能团形成共价键而进行 修饰，这称为PEG修饰。专利EP 1304346和US 6,730,735描述了用 于通过粘膜给药的组合物，其包含壳聚糖及PEG结合物，二者通过壳 聚糖的氨基基团而共价结合。
专利申请US2004/0156904描述了用于释放药物试剂的体系，其中 活性试剂被并入基质，所述基质从包括壳聚糖-PEG及水不溶性聚合 物如聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)的组合物制备。
专利申请WO01/32751描述了在包括聚乙二醇的表面活性剂存在 下增加其所在溶液的pH而进行沉淀得到壳聚糖纳米颗粒。然而，PEG 与壳聚糖没有共价结合。
尽管许多出版物针对释放药物体系的开发，仍然需要提供一类对 生物活性分子具有很强的结合能力并允许其以控制速率释放的纳米颗 粒体系。
发明简述
本发明人发现由PEG修饰的壳聚糖纳米颗粒形成的体系允许与 生物活性分子的有效结合以及它们随后在适当生物环境中的释放，所 述纳米颗粒通过在造成壳聚糖交联的试剂的存在下进行离子凝胶化过 程得到。PEG修饰的壳聚糖纳米颗粒与未进行PEG修饰的壳聚糖纳米 颗粒相比具有显著的性能，例如在鼻腔粘膜给予胰岛素方面或在作为 对鼻腔粘膜给予白喉类毒素的反应的免疫原性方面。
因此，本发明的目的在于包含用于释放生物活性分子的纳米颗粒 的体系，其中所述纳米颗粒包含结合物，其包含a)至少50％重量比的 壳聚糖或其衍生物，以及b)少于50％重量比的聚乙二醇(PEG)或其衍 生物，其中组分a)和b)均通过壳聚糖氨基基团共价结合，并且其特征 在于所述纳米颗粒通过交联剂交联。
短语“生物活性分子”具有广泛的意义，并且包含例如下列分子： 小分子量药物、多糖、蛋白、肽、脂质、寡核苷酸、核酸以及其组合。 在本发明的一个变化中，生物活性分子的功能是预防、减轻、治疗或 诊断疾病。在本发明的另一个变化中，生物活性分子具有化妆品功能。
本发明的第二个方面涉及药物组合物或疫苗，其包含上文所定义 的纳米颗粒。在优选的方面，所述组合物或疫苗用于粘膜给药。
另一方面，本发明的目的是包含上文所定义的纳米颗粒的化妆品 组合物。
本发明的另一方面涉及包含壳聚糖-PEG纳米颗粒的组合物，在 纳米颗粒内能够保留一个或多个生物活性分子，如药物、疫苗或遗传 物质。本身不被看作生物活性分子但能够对给药体系的效率作出贡献 的肽、蛋白或多糖也能够被捕获在纳米结构内。
得到如所定义的用于释放生物活性分子的体系的过程组成本发明 的最后一方面，所述过程包含：
a)制备壳聚糖-PEG结合物水溶液；
b)制备交联剂水溶液；以及
c)在搅拌下将步骤a)与b)的溶液混合，使得壳聚糖-PEG纳米颗 粒通过离子凝胶化和随后的沉淀而自发得到。
在所述过程的一个变化中，在两相混合之前，活性成分被包括在 壳聚糖水溶液中或被包括在交联剂水溶液中。
附图的详细说明
图1A：壳聚糖PEG修饰程度、聚合物溶液的pH以及壳聚糖- PEG/TPP比率对纳米颗粒尺寸的影响。
图1B：壳聚糖PEG修饰程度、聚合物溶液的pH以及壳聚糖- PEG/TPP比率对纳米颗粒尺寸多分散性的影响。
图2A：在乙酸盐缓冲液(pH：4和7.4)中和在纯水(MQ)中孵育1 天后的与壳聚糖和壳聚糖-PEG纳米颗粒缔合的血浆DNA的琼脂糖 凝胶电泳分析。
图2B：在乙酸盐缓冲液(pH：4和7.4)中和在纯水(MQ)中孵育4 周后的与壳聚糖和壳聚糖-PEG纳米颗粒缔合的血浆DNA的琼脂糖 凝胶电泳分析。
图3：与壳聚糖和壳聚糖-PEG纳米颗粒缔合的血浆DNA在壳多 糖酶存在下的琼脂糖凝胶电泳分析。
图4A：PEG修饰程度对高分子量壳聚糖(CS)纳米颗粒转染效率的 影响。
图4B：pDNA负载量对高分子量壳聚糖(CS)纳米颗粒转染效率的 影响。
图5A：pDNA负载量对低分子量壳聚糖(CS)纳米颗粒转染效率的 影响。
图5B：PEG修饰程度对低分子量壳聚糖(CS)纳米颗粒转染效率的 影响。
图6：包含在不同制剂中的10 U/kg胰岛素或乙酸盐缓冲液(对照) 鼻内给药后的血糖。血糖以相对于基线值的％的平均值±S.E.M.表示。 下列数值为不同给药之前的基线数值：乙酸盐缓冲液(■)：423±16mg/dl (n＝7)；胰岛素(□)：430±15mg/dl(n＝7)；胰岛素在壳聚糖溶液中(●)： 439±12mg/dl(n＝8)；壳聚糖纳米颗粒(◆)：469±14mg/dl(n＝7)；壳聚糖 -PEG纳米颗粒(○)：458±21mg/dl(n＝8)。
图7：对禁食过夜的糖尿病大鼠鼻内给予含有胰岛素的制剂或乙 酸盐缓冲液后进行的葡萄糖耐量试验。在时间0以及鼻内给予乙酸盐 缓冲液(■)：(n＝10)；胰岛素(□)：(n＝6)；胰岛素在壳聚糖溶液中(●)： (n＝6)；壳聚糖纳米颗粒(◆)：(n＝6)；壳聚糖-PEG纳米颗粒(○)：(n＝6) 1小时之后胃内给予葡萄糖(2g每kg体重)。
图8：鼻内给予包含在不同壳聚糖和壳聚糖-PEG纳米颗粒制剂 中的10μg TD之后第0、7和14天小鼠血清中IgG抗-TD的最终滴 度(n＝6)。IN：鼻内；IP：腹膜内。
*统计学显著不同(α＜0.5)。
发明的详细描述
本发明的体系包含纳米颗粒，其结构包含交联的壳聚糖和聚乙二 醇(PEG)结合物，其中可包含有活性成分。
术语“纳米颗粒”被理解为包含结合物的结构，所述结合物由壳 聚糖与PEG之间通过壳聚糖氨基基团的共价结合而得到，且所述结合 物通过阴离子交联剂的作用发生离子凝胶化而进一步交联。共价键的 形成以及随后体系的离子交联产生独立的及可观察的特征物理实体， 其平均尺寸小于1μm，即，平均尺寸为1至999nm。
“平均尺寸”被理解为纳米颗粒群的平均直径，该纳米颗粒群在 其形成于其中的水介质中一起运动。这些体系的平均尺寸能够通过本 领域技术人员已知的标准方法进行测量，这些方法描述于例如下文的
实验部分。
体系的纳米颗粒被表征为具有小于1μm的平均颗粒尺寸，优选具 有1至999nm的平均尺寸，优选为50至800nm，更优选为50nm至500 nm。平均颗粒尺寸主要受壳聚糖与PEG的比率、壳聚糖脱乙酰基的程 度以及颗粒形成条件(壳聚糖-PEG浓度、交联剂浓度及二者之间的比 率)的影响。与由未经PEG修饰的壳聚糖形成的体系相比，PEG的存在 降低了平均颗粒尺寸。
另外，纳米颗粒能够具有电荷(通过Z电势测量)，其大小能够为 +0.1mV至+50mV，优选为+1至+40mV，取决于所提及的变量，尤其 取决于壳聚糖用PEG的官能化程度。纳米颗粒的正电荷因其有利于纳 米颗粒与粘膜表面的相互作用而受关注。然而，中性电荷可能因其肠 胃外给药而更受关注。
包含用于释放上文所定义的生物活性分子的纳米颗粒的体系的结 合物中的壳聚糖含量为超过50％重量比，优选为超过75％重量比。对 于PEG部分，其在结合物中的含量低于50％，优选低于25％。
壳聚糖是来自甲壳质(聚-N-乙酰基-D-葡糖胺)的天然聚合物，其中 N上乙酰基的重要部分已被水解反应除去。脱乙酰化程度通常在30至 95％，优选为60至95％，其表明5至40％的氨基基团被乙酰化。因此其 具有氨基多糖结构及阳离子性质。其包含具有通式(I)的单体单元的重 复：
其中n为整数，外加m个氨基基团被乙酰化的单元。n+m的和代表聚合 度，即壳聚糖链中单体单元的数目。
用于得到本发明壳聚糖-PEG结合物的壳聚糖具有5至2000kDa 的分子量，优选为10至500kDa，更优选为10至100kDa。能够使用的 商品化壳聚糖的实例为UPG 113、UP CL 213及UP CL 113，均能够购 自NovaMatrix，Drammen，Norway。
包含用于得到壳聚糖-PEG结合物的壳聚糖的单体单元的数目为 30至3000个单体，优选为60至600个。
还能够使用壳聚糖衍生物作为壳聚糖之外的选择，其被理解为壳 聚糖中的一个或多个羟基基团和/或一个或多个氨基基团被修饰以提 高壳聚糖的溶解性或增加其粘膜粘附性质。这些衍生物包括乙酰化的、 烷基化的或磺化的壳聚糖、硫醇化衍生物以及其它，如Roberts，Chitin Chemistry，Macmillan，1992，166中所述。当使用衍生物时，其优选自 O-烷基醚、O-酰基酯、三甲基壳聚糖、用聚乙二醇修饰的壳聚糖等。 其它可能的衍生物为盐，如柠檬酸盐、硝酸盐、乳酸盐、磷酸盐、谷 氨酸盐等。在任何情况下，本领域技术人员了解如何鉴别能够在壳聚 糖上进行而不影响最终制剂的商业生存能力和稳定性的修饰。
对于聚乙二醇(PEG)部分，其最通常的形式为具有通式(II)的聚合 物：
H-(O-CH2-CH2)p-O-H
(II)
其中p为整数，代表PEG聚合度。在本发明中，PEG聚合度范围为50至 500，其对应2至20kDa的分子量，优选为5至10kDa。
其中一个或两个羟基基团被修饰的修饰的PEG被用于形成壳聚糖 -PEG复合物。能够被用于得到壳聚糖-PEG结合物的修饰的PEGs包 括具有通式(III)的PEGs：
X1-(O-CH2-CH2)p-O-X2
(III)
其中：
X1为阻碍OH发生后续反应的羟基保护基团。羟基保护基团在本领 域是公知的，有代表性的保护基团(已经包括被保护的氧)为甲硅烷基 醚，如三甲基甲硅烷基醚、三乙基甲硅烷基醚、叔丁基二甲基甲硅烷 基醚、叔丁基二苯基甲硅烷基醚、三异丙基甲硅烷基醚、二乙基异丙 基甲硅烷基醚、texyldimethylsilyl ether、三苯基甲硅烷基醚、二叔丁 基甲基甲硅烷基醚；烷基醚，如甲基醚、叔丁基醚、二苄醚、对甲氧 基苄基醚、3，4-二甲氧基苄基醚、三苯甲基醚、烯丙基醚；烷氧基甲 基醚，如甲氧基甲基醚、2-甲氧基乙氧基甲基醚、苄氧基甲基醚、对 甲氧基苄氧基甲基醚、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基醚；四氢吡喃基 醚及相关的醚；甲硫基甲基醚；酯，如乙酸酯、苯甲酸酯；三甲基乙 酸酯；甲氧基乙酸酯；氯乙酸酯；乙酰丙酸酯；碳酸酯，如碳酸苄基 酯、对硝基苄基碳酸酯、叔丁基碳酸酯、2，2，2-三氯乙基碳酸酯、2-(三 甲基甲硅烷基)乙基碳酸酯，碳酸烯丙基酯。羟基保护基团的另外的实 例可见于参考书籍，如Green and Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)，John Wiley&Sons，Inc.，New York， 1999。在优选实施方案中，保护基团为烷基醚，更优选为甲基醚。
X2能够是氢或允许锚定在壳聚糖氨基基团上的桥基团。所用的桥 分子的优选的但不是唯一的形式为琥珀酰亚胺或其衍生物。
或者，X1还能够是允许与氨基之外的其它基团锚定的基团。例如， 马来酰亚胺被用作桥分子以达到与SH基团的键接。
与PEG反应的壳聚糖氨基基团的数目，或者说，壳聚糖氨基基团 用PEG的官能化，称为PEG修饰，为0.1％至5％，优选为0.2％至2％，更 优选为0.5％至1％。
得到的壳聚糖-PEG结合物具有5至3000kDa的分子量，优选为10 至500kDa。
本发明的纳米颗粒体系的特征在于其通过壳聚糖-PEG结合物的 离子交联而形成。交联剂为允许壳聚糖-PEG结合物通过离子凝胶化 交联、有利于自发形成纳米颗粒的阴离子盐。在本发明中，交联剂为 聚磷酸盐，优选使用三聚磷酸钠(TPP)。得到纳米颗粒体系的交联很简 单，且如发明背景中所述，对本领域技术人员是已知的。
本发明的第二方面为包含上文所定义的纳米颗粒的药物组合物。 药物组合物的实例包括任何用于口服、含服、舌下给药或局部给药的 液体组合物(水中的或含有诸如粘度调节剂、pH缓冲剂等添加剂的水中 的纳米颗粒混悬液)或固体组合物(冻干或雾化的纳米颗粒，形成能够 用于制备颗粒剂、片剂或胶囊剂的粉末)，或用于透皮、眼、鼻、阴道 或肠胃外给药的液体或半固体形式。在非肠胃外的给药途径中，通过 提供具有相当正电荷的颗粒能够改善纳米颗粒与皮肤或粘膜的接触， 有利于纳米颗粒与所提到的负电荷表面的相互作用。在肠胃外给药途 径中，更具体地对于静脉给药，这些体系提供调节药物或与其缔合的 分子的体内分布的可能性。
在优选的方面，制剂通过粘膜给药。壳聚糖-PEG结合物的正电 荷通过药物与带负电的粘膜及上皮细胞表面的相互作用而提供药物在 粘膜表面上的更好吸收。
壳聚糖-PEG纳米颗粒是对生物活性分子具有高缔合能力的体 系。所述缔合能力取决于所并入分子的类型以及所述的制剂参数。因 此，本发明的另一方面是包含例如上文所定义的壳聚糖-PEG纳米颗 粒和至少一种生物活性分子的组合物。
术语“生物活性分子”涉及任何用于处理、治疗、预防或诊断疾 病或用于改善人和动物的生理和心理健康的物质。这些生物活性分子 能够包括从低分子量药物到多糖、蛋白、肽、脂质、寡核苷酸及核酸 类型的分子及其组合。与这些纳米颗粒缔合的分子的实例包括蛋白如 破伤风类毒素及白喉类毒素、多糖如肝素、肽如胰岛素以及编码若干 蛋白的质粒。
在优选实施方案中，所述生物活性分子为胰岛素。在另一优选实 施方案中，所述生物活性分子为白喉或破伤风类毒素。在另一优选实 施方案中，所述生物活性分子为肝素。在另一优选实施方案中，所述 生物活性分子为DNA质粒。
本发明的纳米颗粒体系还能够包括其它不具有治疗效果但形成化 妆品组合物的活性分子。这些化妆品组合物包括任何用于局部给予的 液体组合物(纳米颗粒混悬液)或乳液。能够掺入纳米颗粒中的活性分 子包括抗痤疮剂、抗真菌剂、抗氧化剂、除臭剂、止汗剂、去头屑剂、 皮肤增白剂、晒黑剂(tanning agent)、紫外光吸收剂、酶、化妆品抗微 生物剂等。
本发明的另一方面为包含上文所定义的纳米颗粒及抗原的疫苗。 通过纳米颗粒形成的体系给予抗原允许达成免疫应答。所述疫苗能够 包含蛋白、多糖或能够是DNA疫苗。严格地说，DNA疫苗是编码引起 免疫应答的抗原的表达的DNA分子。在优选实施方案中，抗原为破伤 风类毒素及白喉类毒素。
本发明的另一方面涉及制备例如上文所定义的壳聚糖-PEG纳米 颗粒的方法，其包含：
a)制备壳聚糖-PEG结合物水溶液；
b)制备交联剂水溶液；
c)在搅拌下将步骤a)和b)的溶液混合，使得通过离子凝胶化作用 和后续的沉淀作用而自发得到壳聚糖-PEG纳米颗粒。
通过在两种溶液混合前加入氢氧化钠而调节初始壳聚糖-PEG结 合物溶液的pH至达到4.5至6.5的值。
在所述方法的变化中，得到的壳聚糖-PEG/交联剂的比率为2/1 至8/1，优选3/1，该比率提供具有相对较低多分散性的制剂。然而，也 可能使用更高的壳聚糖-PEG/交联剂比率以及在更酸性的介质中制 备颗粒。
交联剂的存在允许交联壳聚糖-PEG结合物以形成网状物，在所 述网状物中能够插入随后能够被释放的生物活性分子。交联剂还赋予 纳米颗粒以使其适合作为给予生物活性分子的体系的尺寸、电势和结 构特征。
生物活性分子能够被直接包括在步骤a)或b)的溶液中，或预先分 散在水相或有机相中，使得通过离子凝胶化作用和后续的沉淀作用而 自发得到含有生物活性分子的壳聚糖-PEG纳米颗粒。
因此，能够通过下述方法并入生物活性分子：
a)将活性分子直接溶解在交联剂或壳聚糖-PEG溶液中；
b)在将活性分子合并到交联剂或壳聚糖-PEG溶液中之前将其 溶解在酸或碱水溶液中；或
c)在将活性分子合并到交联剂或壳聚糖-PEG溶液中之前将其 溶解在与水混溶的极性有机溶剂中。
制备壳聚糖-PEG纳米颗粒的方法能够进一步包含附加步骤，其 中所述纳米颗粒被冻干。从药物的角度，得到冻干形式的纳米颗粒是 很重要的，因为这样改善其贮存稳定性。壳聚糖-PEG纳米颗粒(具有 不同的PEG修饰度)能够在5％浓度的低温防护剂如葡萄糖的存在下被 冻干。可存在其它通常的添加剂。事实上，冻干前后颗粒尺寸的测定 没有显著的改变。或者说，纳米颗粒可被冻干并再次悬浮而不造成其 中的变化(表I)。
表I：冻干前后CS-PEG纳米颗粒的特征
制剂 尺寸(nm)P.I.* 冻干前 尺寸(nm) P.I. 用5％葡萄糖冻干后 壳聚糖-0.5％PEG 壳聚糖-1％PEG 74.7±9.5 0.231 76.9±6.0 0.500 78.6±18.3 0.224 87.7±22.3 0.418
*P.I.：多分散性指数。
下文描述了数个说明性实施例，显示本发明的特征和优点，但不 能被解释为对本发明目的的限制。
实施例
实施例1
壳聚糖-PEG纳米颗粒制备的优化
根据例如WO 9804244中所述的壳聚糖的离子凝胶化技术来制备 壳聚糖-PEG纳米颗粒。具体地，首先将具有0.5％或1％PEG修饰度 (被PEG官能化的氨基基团的百分比)的壳聚糖以1mg/mL的浓度溶于 高纯水中。为了研究其对纳米颗粒形成的可能的影响，通过在制备颗 粒之前加入NaOH将壳聚糖-PEG溶液的初始pH调节到4.5至6.5。 为了得到2/1、3/1和4/1的壳聚糖-PEG/TPP比率而将三聚磷酸钠(TPP) 以不同的浓度也溶于水。在磁力搅拌下往固定体积的壳聚糖-PEG溶 液(1.5mL)中加入固定体积的TPP溶液(0.6mL)后自发地发生纳米颗 粒的形成。
图1A和1B显示壳聚糖的PEG修饰度、聚合物溶液的pH以及壳 聚糖-PEG/TPP比率对纳米颗粒尺寸及多分散性所产生的影响。基于 所得到的结果能够推断具有0.5-1％PEG修饰度的壳聚糖-PEG纳米 颗粒能够在很宽的实验条件范围内容易地制备，pH是对纳米颗粒尺寸 影响最大的参数。另外，当PEG修饰度从0.5％增加到1％时，pH的 影响更大。
另外，纳米颗粒尺寸分布还受到壳聚糖PEG修饰度以及壳聚糖- PEG溶液的pH的影响。显然，得到具有较低分散性的制剂的最佳壳 聚糖-PEG/TPP比率为3/1。
纳米颗粒的尺寸是通过光子相关光谱法，使用专用于此目的的 Zetasizer III(Malvem Instruments，Malvern，UK)来测定。壳聚糖-PEG 纳米颗粒尺寸范围为70至310nm。
实施例2
壳聚糖纳米颗粒与壳聚糖-PEG纳米颗粒之间的比较
如从表II中能够观察到的，PEG修饰改变壳聚糖的溶解性。这影 响纳米颗粒的形成。在壳聚糖-PEG的情况下，最佳的壳聚糖/TPP比 率从典型的6/1至4/1转变为较低的值，典型为4/1至2/1。这些不同 可能是由于壳聚糖的化学修饰，改变了能够相互作用的可利用基团， 能够改变离子移变凝胶化条件。
表II
壳聚糖 壳聚糖-0.5％PEG 壳聚糖-1％PEG 初始pH 溶解性限度 4.7-4.8 6.4-6.5 4.6-4.7 6.9-7.1 4.6-4.7 7.1-7.2
关于纳米颗粒，能够观察到由PEG修饰的壳聚糖制备的纳米颗粒 与由纯壳聚糖形成的纳米颗粒有显著不同。这显示于表III，其中显示 了由壳聚糖、具有0.5％和1％PEG修饰度的壳聚糖(在初始pH值，以 其最佳聚合物比率)形成的纳米颗粒的特征。
PEG修饰造成纳米颗粒尺寸和表面电荷的显著降低。在后一种情 况中，PEG修饰度也具有强的影响，因为当PEG修饰度从0.5％增加 到1％时表面电荷降低的更多。
表III
尺寸(nm) P.I. 电势(mV) 壳聚糖，4/1 壳聚糖-0.5％PEG，3/1 壳聚糖-1％PEG，3/1 265±10 74±9 77±6 0.363 0.231 0.500 +29.1±1.1 +12.1±1.8 +1.6±0.6
P.I.＝多分散性指数
实施例3
负载有DNA的具有不同PEG修饰度的壳聚糖纳米颗粒的形成与表征
为了将其包裹，质粒DNA在形成纳米颗粒之前被并入到TPP溶 液中。随后将该含有DNA的TPP加入到壳聚糖-PEG溶液中，保持 磁力搅拌。理论DNA负载为用于制备纳米颗粒的壳聚糖-PEG总量 (1mg)的5％、10％或20％。包裹质粒DNA的效率经荧光(Pico绿dsDNA 染料)及琼脂糖凝胶电泳测定证实总是高于90％。
表IV、V和VI显示不同壳聚糖和壳聚糖-PEG纳米颗粒的特征。 与未负载的纳米颗粒类似，含有PEG的负载有DNA的制剂比不含有 PEG的制剂小很多并具有更少的表面正电荷。
在所有情况下，DNA的存在还造成载体特征的变化，尤其是在高 DNA百分比时，其中表面电荷通常下降。关于纳米颗粒的尺寸，高 DNA负载允许诱导更交联结构的形成，这造成颗粒尺寸的下降。这能 够在未PEG修饰的载体的情况下观察到，其中尺寸从约270-300nm 下降至220nm。
然而，PEG修饰的载体的尺寸随DNA负载而增加，尤其是当使 用具有0.5％PEG修饰度的壳聚糖-PEG时。
表IV
不具有PEG的壳聚糖，4/1 尺寸(nm) P.I. 电势(mV) 空白 +5％DNA +10％DNA +20％DNA 265±10 278±17 309±2 216±7 0.363 0.340 0.378 0.363 29.1±1.1 40.5±5.6 41.6±0.8 35.2±1.8
表V
壳聚糖-0.5％PEG，3/1 尺寸(nm) P.I. 电势(mV) 空白 +5％DNA +10％DNA +20％DNA 74±9 115±14 131±13 181±8 0.231 0.227 0.207 0.209 +121±1.8 +13.4±2.1 +11.3±3.9 +5.7±1.6
表VI
壳聚糖-1％PEG，3/1 尺寸(nm) P.I. 电势(mV) 空白 +5％DNA +10％DNA +20％DNA 77±6 78±7 78±10 105±2 0.500 0.485 0.256 0.229 +1.6±0.6 +3.7±0.4 +1.3±2.1 -0.6±0.4
实施例4
体外质粒DNA释放
质粒DNA有效地缔合在壳聚糖及壳聚糖-PEG颗粒上。如图2A 和2B所示，当负载有质粒DNA的纳米颗粒在乙酸缓冲液(pH：4，pH：7.4) 及纯水(MQ)中孵育超过一个月时没有检测到质粒DNA释放(根据琼脂 糖凝胶电泳分析)。
实施例5
酶存在下的体外质粒DNA释放
如能够由电泳分析(图3)观察到的，当负载有质粒DNA的纳米颗 粒在壳聚糖酶的存在下(0.6mg/mL)于pH 6的乙酸盐缓冲液中孵育时， 质粒DNA能够由壳聚糖和壳聚糖-PEG纳米颗粒中释放。
这些结果表明质粒DNA有效缔合在纳米颗粒上，但其并不是不 可逆结合的，因为当聚合物载体被酶降解时其能够被释放。
实施例6
结合在壳聚糖-PEG纳米颗粒上的(GFP)质粒DNA的转染效率
评价了通过壳聚糖及壳聚糖-PEG纳米颗粒的方法在HEK293细 胞系模型中编码GFP质粒的转染效率。
图4显示壳聚糖PEG修饰度(0.5％和1％)对含有20％质粒DNA (pDNA)负载的高分子量壳聚糖纳米颗粒的转染效率产生的影响。每孔 的质粒剂量为1μg。结果表明0.5％的PEG修饰度对这些纳米颗粒的 转染能力具有正面影响。该PEG修饰度被选择用于后续实验。图4b 中所示的结果表明转染的效率随纳米颗粒的pDNA负载而增加。该观 察结果很有趣，因为质粒的剂量是常数(1μg)，并因此当pDNA负载 增加时纳米颗粒剂量下降。
还评价了低分子量壳聚糖-PEG纳米颗粒(10kDa，LMW CS-PEG NP)的质粒负载对转染效率的影响。在这种情况下，对较小的负载(5％) 观察到较高的表达水平(图5a)。另外，对该小负载(5％pDNA)，观察 到PEG修饰对转染效率具有负面影响(图5b)。
这些实验的主要结论是壳聚糖PEG修饰根据壳聚糖的分子量而 具有正面的(HMW CS-PEG NP)或负面的(LMW CS-PEG NP)影响。
实施例7
包裹的胰岛素及自由胰岛素以10 U/kg的浓度鼻内给药的生物学影响
为了将胰岛素包囊进壳聚糖纳米颗粒，预先将2.4mg胰岛素溶于 NaOH溶液中，随后加入1.2mL TPP。随后将该混合物加入到3mL 壳聚糖中。磁力搅拌5分钟后，将该制剂在10,000g离心40分钟。除 去上层清液，并将沉降物溶于缓冲液中。相应地，进行相同的过程以 制备壳聚糖-PEG纳米颗粒，但在2mg/mL的壳聚糖中加入10mg/mL 的PEG 400。
用光子相关光谱法测定，壳聚糖纳米颗粒的最终尺寸为605±15 nm，而壳聚糖-PEG纳米颗粒的最终尺寸为590±6nm。
最初在体重200至220g的雄性Wistar大鼠中通过注射链脲霉素 的pH4.5的柠檬酸盐缓冲液溶液而诱发糖尿病(65mg/kg i.v.)。当所述 大鼠用链脲霉素处理3周后其血糖浓度超过400mg/dl时被认为患有 糖尿病。
禁食的大鼠被用于进行此实验。将它们根据所给予的制剂分为不 同的组。不同的制剂如下：对照溶液(乙酸盐缓冲液，pH4.3)，溶于乙 酸盐缓冲液中的胰岛素，溶于壳聚糖溶液中的胰岛素，以及缔合在壳 聚糖纳米颗粒上的胰岛素和缔合在壳聚糖-PEG纳米颗粒上的胰岛 素，胰岛素的浓度为10 U/kg体重。通过在每一鼻孔使用Eppendorf 移液管放置小体积的这些制剂(10-20μL)而给药，这些大鼠以仰卧的姿 势用乙醚麻醉。然后使动物在整个实验过程中保持清醒以防止麻醉对 血液葡萄糖水平可能具有的任何影响。
为了测定血液葡萄糖水平，在鼻腔粘膜给药之前以及每15分钟直 至90分钟从尾静脉中采集血样。然后从鼻腔粘膜给药后第2小时至第 7小时每小时以及最终在第24小时采集血样。立即使用葡萄糖分析仪 (来自Chronolyss的Prestige)测定血液葡萄糖水平。实验过程中大鼠保 持禁食。
如图6所示，鼻腔粘膜给予pH4.3的乙酸盐缓冲液造成血糖随时 间缓慢且持续地下降，最大下降值为给药6小时后对照值的28％。10 U/kg的胰岛素乙酸盐缓冲液溶液的鼻腔粘膜给药对前述结果没有显 著的改变。然而，当胰岛素缔合在壳聚糖-PEG纳米颗粒上时，给药 后15分钟之内血糖水平下降18％(p＜0.01)，在给药后45分钟达到 45-50％(分别为p＜0.01及p＜0.001)的最大下降。必须强调，该下降保 持到至少鼻腔粘膜给药过后7小时。当缔合在壳聚糖纳米颗粒上的胰 岛素被鼻内给药时也观察到血糖水平的显著下降。在这种情况下，血 糖从30分钟开始显著下降，具体地说，下降16％(p＜0.01)，最大的下 降为在鼻内给药2小时后观察到的32％(p＜0.001)。当胰岛素溶于壳聚 糖溶液时，血糖也下降，但比胰岛素缔合在壳聚糖-PEG纳米颗粒上 时的下降程度显著减少。
实施例8
含有胰岛素的纳米颗粒对口服葡萄糖给药的升糖反应的影响
禁食过夜的糖尿病大鼠被用于进行该实验。对其鼻腔粘膜给予实 施例7所述的每一制剂。1小时后每组大鼠接受2g每kg体重的口服 葡萄糖给药。测定在葡萄糖给药之前和给药后10、20、30、60、90 及120分钟采集自尾静脉的血样中的血糖。
图7显示含有胰岛素的纳米颗粒对口服葡萄糖给药的升糖反应的 影响。在接受乙酸盐缓冲液的对照大鼠中，口服葡萄糖给药后血糖升 高，30分钟后达到其最大值105％(p＜0.001)。随后在2小时内血糖逐 步下降。相应地，胰岛素的乙酸盐缓冲液溶液(10 U/kg)没有显著改变 该结果。
然而，在壳聚糖溶液中相同量的胰岛素使对葡萄糖的升糖反应上 升189％(p＜0.05)，而缔合在壳聚糖或壳聚糖-PEG纳米颗粒上的胰岛 素使其分别上升193％(p＜0.01)和225％(p＜0.01)。
因此，比较基于所分析的不同制剂的A.U.C.(曲线下面积)，最有 效的制剂为对应于缔合在壳聚糖-PEG纳米颗粒上的胰岛素制剂，然 后是缔合在壳聚糖纳米颗粒上的胰岛素制剂，最后是对应于胰岛素在 壳聚糖溶液中的制剂。
这些结果显示使用本发明所述的壳聚糖-PEG纳米颗粒在糖尿病 大鼠中增加胰岛素的鼻腔粘膜吸收。实验结果显示缔合在壳聚糖- PEG纳米颗粒上的胰岛素(10 U/kg体重)从鼻内释放后15分钟开始到 最少7小时显著降低血糖并当发生口服给予葡萄糖时提高升糖反应。 对缔合在所述纳米颗粒上的4 U/kg的胰岛素检测到不那么显著的影 响。
当胰岛素缔合在只由壳聚糖形成纳米颗粒上或当胰岛素在壳聚糖 的溶液中时，其功效低于当其缔合在壳聚糖-PEG纳米颗粒上时，而 自由胰岛素在糖尿病大鼠中鼻内释放后对生物学参数不具有任何显著 影响。
实施例9
由负载有白喉类毒素的纳米颗粒产生的免疫应答的体内评价
白喉类毒素(DT)与壳聚糖或壳聚糖-PEG纳米颗粒的缔合是通过 将DT并入TPP水溶液中(300μg的DT)而进行。通过在磁力搅拌下向 3mL壳聚糖或壳聚糖-PEG溶液(1mg/mL)中加入不同体积的TPP水 溶液(1mg/mL)使纳米颗粒自发形成。计算TPP溶液的体积以达到壳聚 糖：TPP比率为8∶1及2∶1。壳聚糖以其具有86％脱乙酰化程度的盐酸 盐Protosan Cl113及Protosan Cl213的形式商品化。通过在10,000 g、5℃离心40分钟来分离壳聚糖纳米颗粒。在壳聚糖-PEG的情况 下，在3800g于离心超过滤器(Amiconultra-4 100000 NMWL， Millipore)上离心30分钟收集纳米颗粒。除去上清液，将纳米颗粒重 新悬浮在pH7.4的磷酸盐缓冲的盐水中，用于对小鼠给药。
通过鼻内免疫进行壳聚糖和壳聚糖-PEG的免疫原性。使用6周 龄及22-25g体重的雄性BALB/c小鼠。将小鼠分为5组。两组用负载 有DT的壳聚糖纳米颗粒(CS-113 Cl，CS-213 Cl)处理，一组用负载有 DT的壳聚糖-PEG纳米颗粒处理。所用的剂量为10μg的DT缔合在 100μg的纳米颗粒上并溶于10μL pH7.4的磷酸盐缓冲液中，每个鼻 孔给予5μL。另一组用pH7.4的磷酸盐缓冲的盐水中的自由类毒素(10 μg/小鼠)处理。另外，作为对照，一组腹膜内接受吸附于磷酸铝中的 DTP(白喉、破伤风及百日咳)疫苗(10μg/小鼠)。在第0、7和14天将 药剂给予清醒的大鼠。
给予第一次药剂后的第14、28、42、56和70天从小鼠的尾部取 得血样进行体内免疫应答测定。在第70天还依次采集肠、支气管肺泡 及唾液灌洗样品。通过腹膜内注射匹鲁卡品(50μL，1mg/mL)而诱发分 泌唾液。收集每只小鼠100μL的最初唾液流。然后用戊巴比妥麻醉小 鼠并将其处死。通过注射和在气管中吸入5mL的灌洗介质以通过静 脉内套管的方式使肺充气而得到支气管肺泡灌洗液。无菌条件下依次 除去肠的片段(十二指肠、空肠、回肠)，并在4mL的1mM PMSF、1 mM碘乙酸和10mM EDTA的溶液中匀浆。通过离心使样品澄清并加 入叠氮化钠、PMSF和牛血清作为防腐剂。在进行抗体浓度测定之前 所有的样品均保存在-20℃。
通过ELISA测试对血清和粘膜组织中抗体的响应进行评价。首先 用100μL DT的pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液溶液包被微量板 (DYNEX，immulon)(4μg/孔)并在4℃孵育过夜。在步骤之间，用pH 7.4的PBST (0.01M PBS或含有5％v/v Tween20的磷酸盐缓冲液) 洗涤孔三次。为了最小化非特异性反应，在所有孔中加入100μL的 PBSTM(含有5％w/v的脱脂乳粉末和0.1w/v的叠氮化钠作为防腐剂 的PBST)并将其在37℃孵育1小时。用PBST洗涤后将样品在PBSTM 中分两步进行系列稀释，并将板在37℃再孵育2小时。然后将100μL 的山羊抗小鼠IgG免疫球蛋白过氧化物酶结合物在PBSTM中以 1∶2000稀释，加入到孔中，并在37℃孵育2小时。洗涤板，将50μL 的邻苯二胺二盐酸盐(0.45mg/mL)加入到作为底物的pH5.0的0.05M 柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中。显色(37℃，30分钟)后在酶标仪(3350-UV， Biorad)上于450nm读取板。
图8显示鼻内免疫之后由负载有DT的纳米颗粒及对照DT溶液 引起的抗白喉IgG水平。该图还显示对应于腹膜内给药的商品化制剂 (吸附于磷酸铝中的DT)的结果。概括地说，该结果表明，第一个月之 后，对于负载有DT的纳米颗粒所观察到的IgG水平比对应于流体疫 苗的IgG水平显著较高(p＜0.05)。实际上，这些值可与那些对于肠胃外 给药的用作佐剂的制剂(吸附于磷酸铝中的DT)所得到的值相比。因 此，这些结果清楚地显示含有纳米颗粒的制剂的佐剂作用。应强调的 另一观察结果使免疫应答随时间增加并持续。最后，对于纳米颗粒组 合物的影响，很有趣的是，表明壳聚糖的分子量对壳聚糖纳米颗粒所 达到的免疫应答没有影响，然而，壳聚糖PEG修饰对纳米颗粒的功效 有显著的影响。实际上，一个月后壳聚糖-PEG纳米颗粒的IgG水平 显著高于壳聚糖纳米颗粒的IgG水平。
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