技术领域
[0001] 本
发明属于转基因作物生态
风险评价技术领域,具体涉及一种转基因抗虫水稻对寄生性天敌稻虱缨小蜂安全性评价方法。
背景技术
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有30多亿人口以稻米为食。同时水稻又是虫害最多的粮食作物之一，每年由于稻纵卷叶螟、钻蛀性螟虫等鳞翅目昆虫的为害，造成重大的产量损失（Cheng，1996；Nathan，2006）。在生产实际中，鳞翅目
害虫的防治长期依赖于化学
农药，
化学农药的滥用不但增加了水稻的生产成本，而且污染环境，还容易使害虫产生抗性，降低农药的药效（Su et al，2003）。因此，高抗鳞翅目的抗性品种是一种经济、有效、环保的防治手段。然而，在水稻及野生稻中，难以找到高抗鳞翅目昆虫的抗源。要培育高抗鳞翅目害虫的水稻品种，需借助于外源抗虫基因。Bacillus thuringiensis(Bt)杀虫蛋白被用作
生物源
杀虫剂已经有五十多年的历史，对鳞翅目害虫有稳定的防治效果。目前转Bt基因抗虫水稻是控制鳞翅目害虫的主要抗虫水稻。
[0003] 然而，抗虫转基因
植物的利用给人类带来利益的同时，也存在一定潜在的生态风险。转基因抗虫植物的生态安全性评价集中在：对靶标害虫的抗性治理、对非靶标生物和
生物多样性的影响、基因漂移问题和对
土壤微生物的影响等。转基因抗虫植物对非靶标生物的潜在影响是有关转基因作物环境风险评价的重要部分。目前，国际上的风险评价工作者以及转基因植物相关管理部
门广泛采用“分层次评价体系”开展转基因植物对非靶标生物影响方面的研究工作（Romeis et al.，2008；王圆圆等，2011）。该评价体系就是选择合适的受试生物，然后依次开展从实验室试验到半田间试验，再到田间试验分层次分阶段进行的系统评价。
[0004] 褐飞虱Nilaparvata lugens 是温带和热带水稻田间最主要的害虫之一，是转Bt基因水稻种植过程中重要的非靶标植食性昆虫。稻虱缨小蜂是稻飞虱主要的卵寄生性天敌，能明显降低稻飞虱的种群数量（Lou et al.，2013），在稻田中，卵寄生蜂有可能通过半翅目昆虫的蜜露，花粉，花蜜或者其它植物液体暴露于Bt蛋白，有存在生态风险的可能性，研究转基因水稻对稻虱缨小蜂的影响是转基因作物环境安全性评价的一个重要部分，那么，建立一套系统评价转Bt基因抗虫水稻对稻虱缨小蜂是否安全的方法尤为重要。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种安全有效、操作简便、成本低廉的转基因抗虫水稻对寄生性天敌稻虱缨小蜂安全性评价方法。
[0006] 本发明目的的实现方式为，转基因抗虫水稻对寄生性天敌稻虱缨小蜂安全性评价方法，包括如下3个部分：
[0007] (1)Tier-1毒性测定试验：评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物稻虱缨小蜂的潜在毒性；
[0008] ①对试验批次转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白进行生物活性测定
[0009] 以印度谷螟作为试验昆虫，将转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白加入印度谷螟人工
饲料中配制不同浓度梯度的饲料，饲料配好后，ELISA法检测不同浓度梯度该Bt蛋白的真实含量，并以纯饲料作为对照，在每份饲料中接入40头印度谷螟初孵幼虫，重复5次，7天后记录幼虫存活情况，计算LC50，以此判断转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的活性；
[0010] ②高剂量转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对稻虱缨小蜂存活率与生殖
力的影响，评价稻虱缨小蜂对该Bt蛋白的敏感性；
[0011] 用10%蜂蜜水作为稻虱缨小蜂食物，配制三种蜂蜜水用于试验，即：纯10%蜂蜜水（w/v）作为阴性对照、含有10倍含量以上于转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的10%蜂蜜水、含有10μg/ml PA的10%蜂蜜水作为阳性对照；
[0012] 对稻虱缨小蜂存活率的影响：取4小时内
羽化且已交配的稻虱缨小蜂雌蜂30头，每10头接入一个玻璃管中，用尼龙网封口，分别用以上三种蜂蜜水饲养，早晚各更换一次食物，每天分别于早、中、晚记录其死亡情况，考察高剂量转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对稻虱缨小蜂存活率的影响；
[0013] 对稻虱缨小蜂生殖力的影响：用以上三种蜂蜜水分别饲养20头初羽化且已交配的稻虱缨小蜂雌蜂24小时，然后单头接入玻璃管中，玻璃管中含有褐飞虱产卵2～3天、15日龄稻苗；接虫后用尼龙网封口，6小时后移出寄生蜂，每天记录下一代稻虱缨小蜂羽化数量及性别，考察高剂量转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对稻虱缨小蜂生殖力的影响；
[0014] ③蜂蜜水中的转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白
稳定性以及生物活性；
[0015] 对饲喂前后含有转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的蜂蜜水分别进行取样，重复3次，ELISA检测该Bt蛋白含量，同时，将饲喂前后含有转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的蜂蜜水稀释至80±10%致死率的浓度，涂在印度谷螟人工饲料表面，
通风厨风干2小时后，接入30头印度谷螟初孵幼虫，重复3次，7天后记录其死亡情况；
[0016] (2)连续世代三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—稻虱缨小蜂的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过寄主介导对稻虱缨小蜂的安全性影响；
[0017] ①转Bt基因抗虫水稻对稻虱缨小蜂发育历期和寿命的影响
[0018] 将新羽化稻虱缨小蜂单对接入玻璃管中，并用尼龙网封口。玻璃管中分别装有15日龄已被褐飞虱产卵2～3天的不同水稻材料的稻苗。待稻虱缨小蜂寄生2小时后，移出寄生蜂，观察下一代稻虱缨小蜂的羽化情况，每2小时记录一次下一代稻虱缨小蜂羽化的时间、数量及性别，相应的水稻材料不同世代间重复以上寄生过程。每个水稻材料设40次重复；
[0019] 将羽化的稻虱缨小蜂成虫分雌雄于玻璃管中饲养，每管4头，用
脱脂棉饲喂10%蜂蜜水(w/v)，早晚各更换一次食物，每天分别于早、中、晚记录其死亡情况；
[0020] ②转Bt基因抗虫水稻对稻虱缨小蜂生殖力、雌性率及存活率的影响[0021] 将新羽化稻虱缨小蜂单对接入玻璃管中，处理方法同（2）①，将脱脂棉中加入10%蜂蜜水(w/v)，并将脱脂棉贴在玻璃管壁上饲喂稻虱缨小蜂，早晚饲喂一次；每天观察下一代稻虱缨小蜂羽化数量及性别，直到羽化完全；7天后，于体视镜下解剖稻茎，记录已寄生但未羽化的稻虱缨小蜂卵粒数，被寄生的卵变为红色；
[0022] 选择稻虱缨小蜂连续多代的发育历期、寿命、生殖力、雌性率以及存活率作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱卵介导的转Bt基因抗虫水稻对稻虱缨小蜂的安全性影响；
[0023] (3)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定稻虱缨小蜂暴露于转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的途径和程度；
[0024] 对于不同的水稻材料，分别对15日龄水稻叶鞘，产于水稻叶鞘的褐飞虱卵粒以及以褐飞虱卵作为寄主的稻虱缨小蜂进行取样，叶鞘30±1mg，褐飞虱卵200粒以及所有世代收集的稻虱缨小蜂成虫，每个处理重复3～5次；
[0025] 采用ELISA技术，分别对以上样品中转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的含量进行检测，确定稻虱缨小蜂是否通过褐飞虱卵途径暴露于转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白以及其暴露的程度。
[0026] 本发明通过Tier-1毒性测定试验评价转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白对非靶标生物稻虱缨小蜂的潜在毒性；通过水稻—褐飞虱—稻虱缨小蜂的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过寄主介导对稻虱缨小蜂的影响；采用ELISA检测手段鉴定稻虱缨小蜂暴露于转Bt基因抗虫水稻表达的Bt蛋白的途径和程度。最终，根据3个方面的研究数据综合分析转Bt基因抗虫水稻的种植对该非靶标生物产生的生态后果。
[0027] 本发明于实验室内建立了一套系统、科学的评价方法，对完善转Bt基因抗虫水稻对非靶标生物的影响研究具有重要意义，对确定转Bt基因抗虫水稻种植的生态安全性具有重要意义。
附图说明
[0028] 图1为取食纯蜂蜜水以及加入Cry2Aa蛋白与PA蜂蜜水的稻虱缨小蜂生存曲线图。
具体实施方式
[0029] 本发明的转Bt基因抗虫水稻选择转cry2Aa基因水稻T2A-1，表达Cry2Aa蛋白系Bt蛋白的一种，其对鳞翅目害虫有很高的抗性，非转基因亲本选择对照明恢63水稻，转cry2Aa基因水稻T2A-1
种子均由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供。明恢63水稻、转cry2Aa基因水稻T2A-1于长×宽×高=25cm×20cm×3cm的栽培盘中以Yoshida
营养液培育至大约15cm高后，用于评价试验。稻苗培育条件为
温度（26±2℃），
相对湿度（80%）。
[0030] 由于转Bt基因水稻表达的Cry2Aa蛋白含量有限，鉴于要使稻虱缨小蜂暴露于较高剂量的Cry2Aa蛋白，本
申请人购买了北京乐士宁科技有限公司生产的Cry2Aa蛋白，所购买的Cry2Aa蛋白与转Bt基因水稻T2A-1表达的Cry2Aa蛋白系同一种Bt蛋白，故本申请人以此代替转Bt基因水稻表达的Cry2Aa蛋白作为试验品。
[0031] 本发明的供试褐飞虱采自湖北武汉稻田，并在室内分别于转cry2Aa基因水稻T2A-1与明恢63的稻苗建立种群，饲养10代以上。稻虱缨小蜂由浙江大学昆虫科学研究所提供，在室内用带有褐飞虱卵的TN1稻苗饲养10代以上用于试验。饲养条件为温度（28±1℃），相对湿度（70±5%），光暗比（L14h:D10h）。印度谷螟敏感品系用于Cry2Aa蛋白活性测定。
[0032] 本发明的评价方法由Tier-1毒性测定试验，连续世代三级营养试验以及蛋白传递规律3个关键部分组成。下面分别进行详细说明。
[0033] (1)Tier-1毒性测定试验：评价转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1表达的Cry2Aa蛋白对非靶标生物稻虱缨小蜂的潜在毒性。
[0034] ①对试验批次Cry2Aa蛋白进行生物活性测定
[0035] 以印度谷螟作为试验昆虫，将购买的Cry2Aa蛋白加入印度谷螟人工饲料中配制5个浓度梯度，分别为2，10，20，30，40μg/g的饲料，并以纯饲料作为对照，饲料配好后，ELISA法检测不同浓度梯度Cry2Aa蛋白的真实含量，在每份饲料中接入40头印度谷螟初孵幼虫，重复5次，7天后记录幼虫存活情况，计算LC50，以此判断Cry2Aa蛋白的活性。
[0036] 通过ELISA检测印度谷螟人工饲料中Cry2Aa蛋白含量，5个浓度梯度的真实含量分别为0.29、8.96、14.29、24.74、32.10μg/g，Cry2Aa蛋白对印度谷螟初孵幼虫的LC50为14.89μg/g。说明购买的Cry2Aa蛋白具有较好的
杀虫活性。
[0037] ②高剂量Cry2Aa蛋白对稻虱缨小蜂存活率与生殖力的影响，评价稻虱缨小蜂对Cry2Aa蛋白的敏感性。
[0038] 用10%蜂蜜水作为稻虱缨小蜂食物，配制三种蜂蜜水用于试验，即：纯10%蜂蜜水（w/v）作为阴性对照、含有300μg/ml Cry2Aa的10%蜂蜜水、含有10μg/mlPA（砷酸二氢
钾）的10%蜂蜜水作为阳性对照。
[0039] 对稻虱缨小蜂存活率的影响：取4小时内羽化且已交配的稻虱缨小蜂雌蜂30头，每10头接入一个直径×高=3cm×25cm玻璃管中，用100目尼龙网封口，分别用以上三种蜂蜜水饲养，早晚各更换一次食物，每天分别于8:00，14:00，20:00记录其死亡情况，考察高剂量Cry2Aa蛋白对稻虱缨小蜂存活率的影响；
[0040] Kaplan-Meier生存分析结果表明：取食含有300μg/ml Cry2Aa蛋白蜂蜜水的稻虱缨小蜂与对照之间的存活率，无显著性差异(P=0.287)；而与对照相比，取食含有10μg/ml PA蜂蜜水的稻虱缨小蜂存活率则显著下降(P<0.001)（见图1）。
[0041] 对稻虱缨小蜂生殖力的影响：用以上三种蜂蜜水饲养20头初羽化且已交配的稻虱缨小蜂雌蜂24小时，然后单头接入直径×高=3cm×25cm玻璃管中，玻璃管中含有褐飞虱产卵2～3天、15日龄稻苗；接虫后用100目尼龙网封口，6小时后移出寄生蜂，每天记录下一代稻虱缨小蜂羽化数量及性别，考察高剂量Cry2Aa蛋白对稻虱缨小蜂生殖力的影响；。
[0042] 观察结果：取食纯10%蜂蜜水、含300μg/ml Cry2Aa蛋白的蜂蜜水以及含10μg/ml PA的蜂蜜水的稻虱缨小蜂产卵量分别为14.5±1.84粒，16.1±1.68粒，3.7±0.63粒，Dunnett test分析结果表明：与对照相比，取食含有300μg/ml Cry2Aa蛋白蜂蜜水的稻虱缨小蜂产卵量无显著性差异(P=0.650)，而取食含有10μg/ml PA蜂蜜水的稻虱缨小蜂产卵量则显著下降(P<0.001)。
[0043] ③蜂蜜水中的Cry2Aa蛋白稳定性以及生物活性；
[0044] 为了确保稻虱缨小蜂在12小时内取食的蜂蜜水中Cry2Aa蛋白的稳定性及生物活性，对饲喂前后含有Cry2Aa蛋白的蜂蜜水分别进行取样，重复3次，ELISA检测其Cry2Aa蛋白含量，同时，将饲喂前后含有Cry2Aa蛋白的蜂蜜水稀释10倍，涂在印度谷螟人工饲料表面，通风厨风干2小时后，接入30头印度谷螟初孵幼虫，重复3次，7天后记录其死亡情况。
[0045] 未被稻虱缨小蜂取食的蜂蜜水中Cry2Aa蛋白的提取效率约为94.5%，其含量为283.5±7.4μg/ml；缨小蜂取食12小时后，蜂蜜水中Cry2Aa蛋白含量下降了24.9%，为
212.9±26.6μg/ml。虽然取食前后，蜂蜜水中Cry2Aa蛋白含量有所下降，但其含量远超出转cry2Aa基因水稻T2A-1表达的Cry2Aa蛋白含量的10倍以上。
[0046] 印度谷螟生测结果表明：稻虱缨小蜂取食前与取食后含有Cry2Aa蛋白的蜂蜜水，涂在印度谷螟人工饲料表面后，对印度谷螟初孵幼虫的致死率分别为87.8%与86.7%，远远高于纯10%蜂蜜水（致死率10.0%）。
[0047] 综上所述，稻虱缨小蜂暴露于高剂量且具有杀虫活性的Cry2Aa蛋白，表明其对Cry2Aa蛋白不敏感。
[0048] （2）连续世代三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—稻虱缨小蜂的食物链评价转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1通过寄主介导对稻虱缨小蜂的安全性影响。
[0049] ①转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1对稻虱缨小蜂发育历期和寿命的影响[0050] 将TN1水稻饲养的新羽化稻虱缨小蜂单对接入直径×高=3cm×25cm玻璃管中，并用100目尼龙网封口。玻璃管中分别装有15日龄已被褐飞虱产卵2～3天的T2A-1或明恢63稻苗。待稻虱缨小蜂寄生2小时后，移出寄生蜂，观察下一代稻虱缨小蜂的羽化情况，每2小时记录一次下一代稻虱缨小蜂羽化的时间、数量及性别，相应的水稻材料不同世代间重复以上寄生过程。每个水稻材料设40次重复；
[0051] 将羽化的稻虱缨小蜂成虫分雌雄于玻璃管中饲养，每管4头，用脱脂棉饲喂10%蜂蜜水(w/v)，早晚各更换一次食物，每天分别于8:00，14:00，20:00记录其死亡情况。
[0052] 以不同水稻材料饲养的褐飞虱卵为寄主的稻虱缨小蜂发育历期如表1所示，[0053] 表1
[0054]
[0055] 注：表中数据为平均数±标准误，括号中数字表示观测样本数。
[0056] 同一行中，转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1与对照水稻明恢63采用U检验进行统计学比较。
[0057] 由表1可见，无论雌雄，各世代间转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1与亲本对照相比，稻虱缨小蜂的发育历期均无显著性差异。
[0058] 以不同水稻材料饲养的褐飞虱卵为寄主的稻虱缨小蜂寿命如表2所示，[0059] 表2
[0060]
[0061] 注：表中数据为平均数±标准误，括号中数字表示观测样本数。
[0062] 同一行中，转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1与对照水稻明恢63采用U检验进行统计学比较。
[0063] 由表2可见，无论雌雄，各世代间转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1与亲本对照相比，稻虱缨小蜂的寿命均无显著性差异。
[0064] ②转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1对稻虱缨小蜂生殖力、雌性率及存活率的影响[0065] 将TN1水稻饲养的新羽化稻虱缨小蜂单对接入玻璃管（规格同上）中，处理方法同（2）①，将脱脂棉中加入10%蜂蜜水(w/v)，并将脱脂棉贴在玻璃管壁上饲喂稻虱缨小蜂，早晚饲喂一次；每天观察下一代稻虱缨小蜂羽化数量及性别，直到羽化完全；7天后，于体视镜下解剖稻茎，记录已寄生但未羽化的稻虱缨小蜂卵粒数，被寄生的卵变为红色。
[0066] 以不同水稻材料饲养的褐飞虱卵为寄主的稻虱缨小蜂生殖力如表3所示，[0067] 表3
[0068]
[0069] 注：表中数据为平均数±标准误，括号中数字表示观测样本数。
[0070] 同一行中，转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1与对照水稻明恢63采用学生t检验进行统计学比较。
[0071] 由表3可见，各世代间转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1与亲本对照相比，稻虱缨小蜂的生殖力均无显著性差异。
[0072] 以不同水稻材料饲养的褐飞虱卵为寄主的稻虱缨小蜂雌性率(%)如表4所示，[0073] 表4
[0074]
[0075]
[0076] 注：表中数据为平均数±标准误，括号中数字表示观测样本数。
[0077] 同一行中，转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1与对照水稻明恢63采用学生t检验进行统计学比较。
[0078] 由表4可见，各世代间转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1与亲本对照相比，稻虱缨小蜂的雌性率均无显著性差异。
[0079] 以不同水稻材料饲养的褐飞虱卵为寄主的稻虱缨小蜂存活率(%)如表5所示，[0080] 表5
[0081]
[0082] 注：表中数据为平均数±标准误，括号中数字表示观测样本数。
[0083] 同一行中，转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1与对照水稻明恢63采用学生t检验进行统计学比较。
[0084] 由表5可见，各世代间转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1与亲本对照相比，稻虱缨小蜂的存活率均无显著性差异。
[0085] 双因素方差分析世代，品种以及世代与品种的交互作用对稻虱缨小蜂生殖力、雌性率及存活率的影响如表6所示，
[0086] 表6
[0087]
[0088] 由表6可见，品种，世代以及品种×世代对稻虱缨小蜂生殖力及存活率均无显著影响，而雌性率仅仅受世代显著性影响。
[0089] 经过连续多代长期观察结果表明，由褐飞虱卵介导的Cry2Aa蛋白对稻虱缨小蜂生命表参数无显著性影响。
[0090] 3、Cry2Aa蛋白在水稻—褐飞虱—稻虱缨小蜂食物链的传递规律
[0091] 对于两种不同的水稻材料，分别对15日龄水稻叶鞘，产于水稻叶鞘的褐飞虱卵粒以及以褐飞虱卵作为寄生的稻虱缨小蜂进行取样，叶鞘30±1mg，褐飞虱卵200粒以及所有世代收集的稻虱缨小蜂成虫，每个处理重复3～5次。ELISA检测前，要对虫体体表用PBST缓冲液进行清洗，以除去体表
吸附的Cry2Aa蛋白。
[0092] T2A-1水稻叶鞘组织中，Cry2Aa蛋白含量为13.9±1.2μg/g鲜重，而以T2A-1饲养的褐飞虱所产卵粒中，并未检测到Cry2Aa蛋白的存在，而稻虱缨小蜂成虫体内却检测到16.8±2.1ng/g Cry2Aa蛋白。在该试验体系中，稻虱缨小蜂体内Cry2Aa蛋白可能来源于褐飞虱取食T2A-1水稻所排泄的蜜露。
[0093] 综合高剂量Cry2Aa蛋白喂食试验结果，连续多代三级营养生命表参数以及蛋白传递规律综合分析，证明了转cry2Aa基因抗虫水稻T2A-1对稻虱缨小蜂的生态安全性。
