一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种和栽培种远缘杂交后
代的方法
技术领域
背景技术
[0002] 芝麻(Sesamum indicumL，2n＝26)属胡麻科胡麻属，是我国重要的优质油料作物和优势出口农产品。然而，由于栽培物种在长期进化和人工选择中，原本存在于野生物种的许多优良基因被淘汰，导致杂交亲本间遗传
基础越来越狭窄，遗传的多样性越来越贫乏。现有芝麻栽培品种抗病耐渍性较差，易受环境条件的影响，产量的
稳定性不佳，特别是遇到多雨年份，芝麻涝害严重、枯萎病和茎点枯病的发生，致使大面积枯死，产量和品质大幅度降低，严重影响芝麻生产的发展。
[0003] 芝麻属中的有些野生种具有高抗病抗逆耐渍等特性，将野生种极为丰富的遗传多样性和宝贵的抗病虫、抗逆境的基因导入栽培种可以增加栽培种资源的遗传多样性，对创制优良新种质和培育新品种具有重要意义，是解决芝麻产量低而不稳的一条有效途径。
[0004] 近二十年来，国内外学者先后就芝麻属远缘杂交技术开展了大量研究，但是采用常规的杂交方法，芝麻野生种与栽培种种间杂交并不能获得种间杂交F1后代。如Tarihal Ramesh等用‘野芝1号’(S.radiatum)做母本与栽培品种正反交结果得到的
种子没有发芽；刘红艳等用‘刚果野芝麻’和‘野芝1号’进行正反种间杂交，未能得到F1植株。
[0005] 幼胚(珠)离体培养技术是通过人为改善幼胚发育条件，提供幼胚发育必需的营养物质，促使幼胚发育成植株，是目前克服受精后发育障碍的有效方法，为创造遗传新种质提供一条重要途径。目前，采用常规方法进行亲缘关系较远的芝麻种属间杂交不易成功，芝麻在进行远缘杂交时普遍存在杂交不结实，结蒴率低和结籽率低，杂种胚不发育等现象。因此，利用幼胚挽救离体培养技术，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，进行芝麻栽培品种的种质改良，是提高芝麻品种抗性特征的重要技术途径。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种与栽培种远缘杂交后代的方法，解决了野生种芝麻(S.radiatum，2n＝64)与栽培品种芝麻(2n＝26)进行远缘杂交时存在的杂交不结实，杂种胚败育，无法获得杂种F1植株等问题。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
[0008] 一种利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种与栽培种远缘杂交后代的方法，包括如下步骤：
[0009] (1)亲本材料准备：母本选用芝麻栽培品种(2n＝26)，父本选用芝麻野生种(S.radiatum，2n＝64)，精选无病饱满的父母本籽粒以备种植；
[0010] (2)远缘杂交：当父母本均开花时，摘掉母本露白的花冠和雄蕊；用父本杂交
授粉；
[0011] (3)胚珠的剥取：取步骤(2)杂交授粉后生长发育了10～18天的幼蒴，用清
水将幼蒴表面冲洗干净，然后在无菌条件下对幼蒴表面进行消毒并用无菌水漂洗，最后切开幼蒴，轻轻剥出胚珠；
[0012] (4)幼胚挽救离体诱导培养：在无菌条件下，将步骤(3)得到的胚珠接种到MS诱导培养基中，在
温度28～30℃、光周期8～16h/d和光照强度1500～2000lux条件下离体诱导培养，使胚珠萌发得到幼胚；
[0013] (5)幼胚的分化培养：将步骤(4)得到的幼胚接种到分化培养基中，在温度28～30℃、光周期8～16h/d和光照强度1500～2000lux条件下分化培养直至幼胚发育成杂种F1
幼苗；
[0014] (6)杂种F1植株的获得、繁殖与保存：在无菌条件下，从培养基中取出杂种F1幼苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片叶子，将幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养直至形成完整的杂种F1植株后放在人工
气候培养箱中保存；将幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中进行扩繁，直至诱导分化出顶芽后，再将顶芽接种到生根培养基中培养直至形成完整的杂种F1植株并保存。
[0015] 上述方案中，步骤(3)所述取杂交授粉后生长发育了12d～18d的幼蒴。
[0016] 上述方案中，所述MS诱导培养基为：在MS基本培养基中添加0.3～0.5mg/L赤霉素、0.5～1mg/L 6-苄
氨基腺嘌呤、30g/L
蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0017] 上述方案中，所述分化培养基为：在MS基本培养基中添加0.3～0.6mg/L IBA(吲哚丁酸)、0.5～0.8mg/L AgNO3、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0018] 上述方案中，步骤(4)所述离体诱导培养的培养时间为25～30d；步骤(5)所述分化培养的培养时间为25～30d。
[0019] 上述方案中，所述生根培养基为：在MS基本培养基中添加0.2～0.5mg/L NAA(
萘乙酸)、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0020] 上述方案中，所述增殖培养基为：在MS基本培养基中添加1.5～3mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、1～2mg/L IAA(吲哚乙酸)、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0021] 上述方案中，所述幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养至形成完整的杂种F1植株的时间为20d～30d。
[0022] 上述方案中，所述幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中扩繁直至诱导分化出顶芽的时间为14d～20d。
[0023] 上述方案中，所述杂种F1植株的移栽种植方法为：将步骤(6)得到的杂种F1植株在室内自然光下开瓶炼苗2～3d，取出杂种F1植株并洗净附着在其表面的培养基，将其移栽到按
质量比计
泥炭:珍珠岩:蛭石＝1:1:1的穴盘中，置于27～30℃温度、保持60～70％
相对湿度条件下培养30d后带土移栽，即下地种植。
[0024] 本发明还结合了分子鉴定法和细胞学鉴定法对芝麻野生种和栽培种远缘杂交获得的杂种F1植株的真实性进行判断，具体的鉴定方法为：
[0025] (1)分子鉴定：分别提取父本野生种(S.radiatum，2n＝64)、母本栽培品种(2n＝26)及杂种F1植株的基因组DNA，将其分别作为模板，用SSR引物HS073(GenBank,JP643611)：
正向引物序列：5'-CCGAAGGGATAGATCGACAT-3'、反向引物序列：5'-ATCTTCCCTCCCTTTTCTGC-
3'进行PCR反应，然后将PCR反应产物进行凝胶
电泳分析；在凝胶成像仪上照相观察；根据在杂种F1植株的凝胶电泳带型上有无亲本的特异扩增条带，在早期鉴定杂种F1植株是否为真杂种：若杂种F1植株的电泳带型上有母本栽培种的特异性扩增条带190bp、父本野生种的特异性扩增条带170bp，则可以判断该杂种F1植株为真杂种，若没有则为假杂种。
[0026] (2)细胞学鉴定：取亲本及杂种F1植株的根尖，用0.002mol/L 8-羟基喹啉液预处理4h，然后用卡诺固定液固定，固定时频繁更换固定液直至材料褪色完全，放置
冰箱中保存备用；制片时，取出固定好的根尖，用1mol/L的
盐酸，60℃水浴处理4.5min进行
水解，解离后放入蒸馏水中漂洗3次，用改良石炭酸品红
染色8min至子房呈紫红色，压片，选取有丝分裂中期相较好的细胞在Olympus
显微镜下观察,统计其染色体的数目，进一步鉴定杂种F1真实性，真杂种的染色体数目应该为45条染色体。
[0027] 芝麻种间远缘杂交对于引入芝麻野生种优良基因，拓宽芝麻栽培种的遗传基础，促进种间的基因交流，创造新的芝麻中间类型具有重大意义；但进行芝麻种间远缘杂交时，若父母本亲缘关系较远、遗传差异较大、亲本之间染色体数目严重不对等、染色体结构不协调等将导致种间的远缘杂交不容易获得成功，杂种胚容易在早期发生败育，难以获得杂交后代F1植株。本发明将染色体数目相差大的亲本，即芝麻野生种(S.radiatum，2n＝64)与栽培种(2n＝26)进行种间远缘杂交，利用幼胚挽救技术克服受精后发育障碍，杂种胚败育无法获得杂种F1植株等问题，同时芝麻野生种(Sesamum radiatum，2n＝64)具有较好的抗病抗逆特性，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，有效的改良了芝麻栽培品种的种质。因此，本发明所述的利用幼胚挽救技术获得芝麻野生种芝麻与栽培种远缘杂交后代的方法具有实际的应用价值。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] (1)本发明选用染色体数目相差较大的亲本，即母本选用芝麻栽培种(2n＝26)、父本选用芝麻野生种(S.radiatum，2n＝64)进行种间远缘杂交，利用幼胚挽救技术克服了亲缘关系较远的芝麻种间远缘杂交容易发生幼胚败育而无法获得杂种F1植株的问题，同时芝麻野生种(Sesamum radiatum，2n＝64)具有较好的抗病抗逆特性，将野生种的抗病抗逆特性转入栽培种，可以有效改良芝麻栽培品种的种质；
[0030] (2)本发明通过选择合适的幼胚挽救接种时期和离体诱导培养条件，杂种幼胚经挽救离体诱导培养后可以被诱导萌发，然后经过继代、增殖培养萌发成杂种F1植株，本发明方法克服了芝麻种间杂交的不
亲和性，利用挽救离体诱导培养获得杂种F1植株，并且还可以对杂种F1植株进行繁殖和长期保存，为转移和利用芝麻野生种的优良基因提供了便利条件；
[0031] (3)本发明提供了一套完整的利用幼胚离体挽救技术获得野生种芝麻与栽培种芝麻的远缘杂交后代(杂种F1植株)的方法，同时还提供了杂种F1植株的繁殖、保存和鉴定方法，对丰富芝麻品种的遗传基础、优化育种技术将发挥重要的积极作用。
附图说明
[0032] 图1为幼胚挽救离体诱导萌发获得幼胚的图片。
[0033] 图2为幼胚萌发的分化培养图片。
[0034] 图3为获得杂种F1植株的图片。
[0035] 图4为亲本与杂种F1植株的SSR标记鉴定电泳图，其中1、2、3均代表杂种F1植株。
[0036] 图5为亲本与杂种F1根尖染色体数目观察图：栽培品种(左)、杂种F1植株(中)与芝麻野生种(右)。
[0037] 图6为栽培品种(左)、杂种F1植株(中)与芝麻野生种(右)株型的对比图。
具体实施方式
[0038] 为了更好地理解本发明，下面结合
实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0039] 实施例1
[0040] 一种利用幼胚挽救技术获得野生种芝麻与栽培种芝麻远缘杂交后代的方法，包括如下步骤：(1)亲本材料准备：母本选用从
播种至开花期为40-50天的综合性状较好的栽培品种“中芝14”；父本选用野生种“野芝5号”(S.radiatum，2n＝64)为材料，精选无病饱满的籽粒以备种植；
[0041] (2)远缘杂交：当父母本均开花时，摘掉母本露白的花冠和雄蕊，挂牌；用父本授粉，记录杂交花数，授粉结蒴数；
[0042] (3)胚珠的剥取：分别选择杂交授粉后12d～18d发育时期的幼蒴，用清水将其表面冲洗干净，在超净
工作台下用75％酒精将幼蒴表面消毒30s，再用3％的
次氯酸钠消毒8～10分钟，然后用无菌水漂洗幼蒴2～3次，每次5～8分钟；在灭菌纸上用刀切开幼蒴，轻轻剥出杂种胚珠；
[0043] (4)幼胚挽救离体诱导培养：在无菌条件下，将步骤(3)得到的胚珠接种到MS诱导培养基中，在温度28～30℃、光周期16h/d和光照强度1500lux条件下培养25d～30d，诱导胚芽萌发(见图1)；所述幼胚诱导培养基是在MS基本培养基中加入0.5mg 6-BA，0.3mg/L GA3，30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0044] (5)幼胚萌发的分化培养：将步骤(4)得到的萌发幼胚接种到分化培养基中，在温度28～30℃、光周期16h/d和光照强度1500lux条件下分化培养25～30d，观察萌发的幼胚在不同的分化培养基中出现从生芽的情况，直至幼胚发育成杂种F1幼苗(见图2、图3)；所述分化培养基为：在MS基本培养基中添加0.3mg/L IBA、0.5mg/L AgNO3、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0045] (6)杂种F1植株的获得、繁殖与保存：在无菌条件下，从培养基中取出杂种F1幼苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片叶子，将幼苗顶芽区段置于生根培养基中培养20～30d，直至形成完整植株后保存在人工气候培养箱；将幼苗除顶芽外的其它区段置于增殖培养基中进行扩繁，直至诱导分化出顶芽后，再将顶芽接种到生根培养基中培养直至形成完整植株保存在人工气候培养箱；所述生根培养基为：在MS基本培养基中添加0.2mg/L NAA、
30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8；所述增殖培养基为：在MS基本培养基中添加
1.5mg/L6-BA、1mg/L IAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8；
[0046] (7)杂种F1植株移栽：将步骤(6)得到的根系发育良好的杂种F1植株在室内自然光下开瓶炼苗2～3d，取出杂种F1植株并洗净附着在其表面的培养基，将其移栽到泥炭∶珍珠岩∶蛭石＝1∶1∶1的穴盘中，置于27±2℃温度、保持60～70％相对湿度培养30d后带土移栽，即下地种植，正常管理。
[0047] 采用分子鉴定法鉴定本实施例杂交得到的杂种F1植株的真实性，具体包括如下步骤：
[0048] (1)取野生种“野芝5号”(S.radiatum，2n＝64)与栽培品种“中芝14”(2n＝26)及杂种F1植株
叶片，采用CTAB法分别提取DNA。
[0049] (2)利用野生种“野芝5号”(S.radiatum，2n＝64)与栽培品种“中芝14”(2n＝26)及杂种F1植株的特异标记SSR引物HS073进行PCR反应，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，具体步骤如下：
[0050] A.PCR反应体系为如下：DNA
模版50ng/ml 2μL，10×Buffer 1μL，25mM的Mgcl20.6μ-1 -1L，10mmol·L dNTPs 0.2μL，10μg·L SSR引物HS0732μL，5UTaq DNA polymerase 0.1μL，加入无菌超纯水至终体积10μL；将上述成分混合后离心，加一滴矿物油
覆盖，防止水份
蒸发；进行PCR扩增：扩增在BIO-RAD基因扩增仪上进行；扩增程序为：95℃预变性3min，94℃变性30s，58℃
退火30s，72℃延伸45s，33个循环后72℃延伸10min；
[0051] B.反应结束后向PCR扩增产物中加入10μL Loading Buffer,混匀，取2.5μL所得样液，用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，电泳
电压为200V，电泳时间2.0h左右；胶显影、
银染将染色后的胶在凝胶成像仪上观测照相，根据特异标记HS073在杂种F1的带型上有无亲本的特异扩增条带，可以在早期鉴定F1杂种
植物的真实性。
[0052] 其中上述SSR引物HS073为：正向引物序列为：5'-CCGAAGGGATAGATCGACAT-3'；反向引物序列为：5'-ATCTTCCCTCCCTTTTCTGC-3'。
[0053] 本实施例杂交获得的杂种F1植株的鉴定结果见图4，从图中可以看出，杂种F1植株的带型上出现了母本栽培种的特异性扩增条带190bp、父本野生种的特异性扩增条带170bp，因此，鉴定结果表明了该F1杂种植物为真杂种。
[0054] 采用细胞学进一步鉴定杂种F1植株的真实性，具体操作步骤如下：分别取父本野生种“野芝5号”(S.radiatum，2n＝64)与母本栽培品种“中芝14”(2n＝26)及杂种F1植株的根尖，将其用0.002mol/L 8-羟基喹啉液预处理4h，卡诺氏固定液固定，固定时频繁更换固定液直至材料褪色完全，放置4℃冰箱中保存备用；制片时，取出固定好的根尖，用1mol/L的盐酸，60℃水浴处理4.5min进行水解，解离后放入蒸馏水中漂洗3次，用改良石炭酸品红染色8min至子房呈紫红色，压片，选取有丝分裂中期相较好的细胞在Olympus显微镜下观察,统计其染色体的数目，进一步鉴定杂种F1真实性。
[0055] 染色体数目确定结果表明：父本野生种“野芝5号”(S.radiatum，2n＝64)与母本栽培品种“中芝14”(2n＝26)种间杂交F1植株有丝分裂染色体制片显示为45条染色体(见图5)，因此，进一步鉴定杂种F1植株是真杂种。同时，亲本和杂种F1植株的外观形态见图6，从外观形态来看，杂种F1植株也属于真杂种。
[0056] 实施例2
[0057] 本实施例所述利用幼胚挽救技术获得野生种芝麻与栽培种芝麻远缘杂交后代的方法与实施例1大体相同，不同点在于：(1)所述幼胚诱导培养基为：在MS基本培养基中添加0.5mg/L赤霉素、1mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8；所述分化培养基为：在MS基本培养基中添加0.6mg/L IBA、0.8mg/L AgNO3、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8；(2)所述幼胚挽救离体诱导培养和幼胚分化培养的条件均为：温度
28～30℃、光周期8h/d、光照强度2000lux；(3)所述生根培养基为：在MS基本培养基中添加
0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8；所述增殖培养基为：在MS基本培养基中添加、3mg/L6-BA、2mg/L IAA、30g/L蔗糖和8g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
[0058] 对本实施例杂交获得的杂种F1植株，采用分子鉴定和细胞学方法鉴定其真伪性，鉴定的具体操作步骤同实施例1，鉴定的结果表明，杂种F1植株为真杂种。
[0059] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
