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一组用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的引物对组合及 试剂盒

阅读：245发布：2020-07-15

专利汇可以提供一组用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的引物对组合及试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的引物对组合及试剂盒。所述引物对组合分别为SEQ ID NO:1‑2，SEQ ID NO:3‑4和SEQ ID NO:5‑6。其中SEQ ID NO:1‑2对应CD157基因；SEQ ID NO:3‑4对应IL‑1b基因；SEQ ID NO:5‑6对应MS4A6A基因。利用本发明的引物进行RT‑PCR扩展，然后将相关的基因表达水平代入建立的公式中，能将活动性结核病人与非结核性肺炎病人区分，使得结核诊断更加准确、快速。，下面是一组用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的引物对组合及试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一组用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的引物对组合，其特征在于，所述引物对组合分别为SEQ ID NO:1-2，SEQ ID NO:3-4和SEQ ID NO:5-6；其中SEQ ID NO:1-
2对应CD157基因；SEQ ID NO:3-4对应IL-1b基因；SEQ ID NO:5-6对应MS4A6A基因。
2.一种用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对组合。

说明书全文

一组用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的引物对

组合及试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一组用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的引物对组合及试剂盒。

背景技术

[0002] 结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病，结核分枝杆菌不仅可引起肺结核(85％)，而且可引起肺外多种器官的结核病。尽管目前已有有效的抗结核药物，但结核病仍然是当前感染性疾病的头号杀手，全球每年约200万人死于结核病；全球约三分之一的人口感染结核分枝杆菌，在这些被称为结核菌潜伏感染(LTBI)的人群中，有约10％最终将进展为活动性结核病。

[0003] 由于目前缺乏有效的结核病疫苗，结核病的预防控制主要依赖于早期发现、治疗、隔离活动性结核病人。然而，现今诊断活动性结核病的检测技术存在严重不足，不能满足临床和结核病预防控制的要求。结核病诊断的金标准为痰结核分枝杆菌微生物检查(痰图片或痰培养)，该检测技术虽然特异性高，但存在敏感性低(不足40％)，耗时长(结核菌培养耗时1-2个月)，实验室生物安全要求高的缺点。换而言之，目前60％-70％痰菌阴性的结核病人临床上的诊断需要其他的检测和数据支持。事实上，临床上该类型的结核病人的诊断大多数是临床诊断，即依靠临床表现、影像学或抗结核治疗效果进行诊断。这种诊断方法最大的缺点是不能将结核病与其结核菌引起的他肺部疾病区分。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一组用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的引物对组合及试剂盒。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供一种CD157、IL-1b和MS4A6A组合作为区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的分子标志物的用途。

[0006] 本发明还提供一组用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的引物对组合，其特征在于，所述引物对组合分别为SEQ ID NO:1-2，SEQ ID NO:3-4和SEQ ID NO:5-6；其中SEQ ID NO:1-2对应CD157基因；SEQ ID NO:3-4对应IL-1b基因；SEQ ID NO:5-6对应MS4A6A基因。

[0007] 本发明还提供一种用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的引物对组合。

[0008] 所述引物对组合及所述试剂盒用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的用途。

[0009] 所述引物对组合及所述试剂盒用于区分活动性结核病人与非结核性肺炎病人的方法，其特征在于，

[0010] 分别采用SEQ ID NO:1-2，SEQ ID NO:3-4或和SEQ ID NO:5-6作为引物，对待测病人PBMC的DNA进行RT-PCR反应；

[0011] 计算每个基因的相对表达量：根据实时定量PCR的结果，分别检测出3个基因的荧光定量CT值，通过R语言算法包Glmnet，建立机器学习模型套索/弹性网模型LASSO，然后得到蛋白组合换算的结果，用R表示；

[0012] 结果判断：当R>0.5时，则判断为活动性结核；反之，则为非结核性肺炎病人。

[0013] 进一步，所述RT-PCR反应的反应体系为：

[0014]

[0015] 进一步，所述RT-PCR反应的反应程序为，95℃30秒；95℃5秒，60℃30秒，40个循环。

[0016] 发明人在前期的实验中通过基因芯片的方法检测了包括结核病人和其结核菌引起的他肺部疾病人外周血中的6000多个基因的表达，发现有多个基因在结核病人中特异性的表达，可作为结核诊断标志物。在此基础上对多个结核病人中差异表达的基因组合，发现以下的基因组合：CD157/IL-1b/MS4A6A能够在结核病人中特异性的表达。通过建立的运算公式将结核病和肺部非结核性肺炎病人分辨出来，从而建立结核病的诊断新方法。

[0017] 利用本发明的试剂盒，可以检测病人CD157/IL-1b/MS4A6A基因的表达情况，然后利用建立的运算公式模型，从而诊断病人是否患有活动性结核病。

[0018] 在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在合适条件下诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核苷及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行扩增反应。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但一般在15～25个核苷酸之间。

[0019] 在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。

[0020] 经实验证明，利用本发明设计的CD157/IL-1b/MS4A6A引物检测相关基因的表达，然后将相关的基因表达水平代入建立的公式中，发现通过本发明的方法计算出上述的基因组表达水平在结核病人中的表达显著低于非结核性肺炎病人。因此CD157/IL-1b/MS4A6A基因组可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速。

具体实施方式

[0021] 下面详细描述本发明的实施例，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0022] 实施例1：外周血单个核细胞(PBMC)悬液的制备

[0023] 在离心管中加入淋巴细胞分离液(Fresenius Kabi NOrge As:LYS3773)5ml；取上述不同类型人群的肝素抗凝静脉血各2ml与等量1M的磷酸缓冲液(PBS)充分混匀得到混合液，用移液器将混合液沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面上，保持清晰的界面，2000转/分离心20分钟；用吸管吸取中间云雾层置入另一离心管后接着加入5倍体积的1M PBS，1500转/分离心10分钟洗涤细胞，弃上清，相同条件重复洗涤细胞一次，接着加入含小牛血清体积百分比为10％的的RPMI1640(Thermo scientific：SH30807.01b)1ml，重悬细胞，得到PBMC悬液；每例取20μl的PBMC悬液于血球计数板上，计数细胞浓度。

[0024] 实施例2：RNA抽提

[0025] 采用Qiagene公司的RNeasy Mini Kit(货号74106)对上述得到的三组人群的PBMC悬液进行RNA抽提。具体操作是：取上述含1×106个细胞的PBMC悬液于去DNA酶和RNA酶的离心管中，3000转/分离心10分钟，弃上清；在细胞沉淀中加入350μl×Buffer RLT，充分混匀裂解；加入250μl无水乙醇，混匀，把液体转移到RNeasy柱子中，8,000g离心30秒，弃废液；加入350μl Buffer RW1以8，000g离心30秒，弃废液；加入80μl DNase溶液(10μl DNase+70μl Buffer RDD)，柱上消化15min，8，000g离心30秒，弃废液；加入350μl Buffer RW1，8，000g离心30秒，弃废液；加入500μl Buffer RPE，8，000g离心30秒，弃废液；空甩，8,000g离心1分钟；把柱子转移到一个去DNA酶和RNA酶的1.5ml离心管，加入40μl无RNase的ddH20，10,000g离心1分钟，收集三组人群的各20例的RNA于-80℃保存、待用。

[0026] 实施例3：反转录

[0027] 采用TAKARA公司的反转录试剂盒(DRR047)，取步骤二得到的RNA 0.5μg进行反转录，该试剂盒较传统反转录试剂盒增加了去除基因组DNA的步骤，可在最大程度上保证RNA的纯度和扩增的特异性。

[0028] 分步如下：

[0029] (1)基因组DNA的去除反应

[0030] 表1基因组DNA的去除反应体系表

[0031]试剂使用量
5×gDNA Eraser缓冲液 2μl
gDNA Eraser 1μl
总RNA 0.5μg
Rnase Free ddH20 补至10μl

[0032] 按照表1配好反应体系后，在42℃温浴2min，所得即为去除基因组DNA的RNA反应液，于4℃下保存。

[0033] (2)反转录反应

[0034] 反应体系配制均在冰上进行，具体体系如下：

[0035] 表2反转录反应体系表

[0036]试剂使用量
5×Prime Script缓冲液2 4μl
PrimeScript RT酶混合物I 1μl
RT引物混合物 1μl
去除基因组DNA的RNA反应液 10μg
Rnase Free ddH2O 补至20μl

[0037] 按照表2配好反应体系后，在37℃温浴15min，85℃放置5秒，反应完得到反转录产物，放4℃保存。

[0038] 实施例4：荧光定量PCR反应

[0039] 模板：上述所得反转录产物作为荧光定量PCR反应的模板，模板用量为1μl。利用CD157/IL-1b/MS4A6A基因(NG_032578.1)序列，设计表3的引物(由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成)。

[0040] 表3引物序列表

[0041]

[0042] PCR反应的体系：

[0043] PCR反应采用TAKARA公司的 Premix Ex TaqTMII(货号：DRR081D)，此产品能够抑制非特异性反应，在宽广的范围内进行更加准确的定量。本Buffer和改良后的HotStart法用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS组合使用，可以进行再现性好、可信度高的Real TimePCR解析。

[0044] 表4PCR反应的体系表

[0045]

[0046] 按照上表配制荧光定量的反应液，并使用仪器为ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行实时定量PCR反应。

[0047] 实时定量PCR反应采用两步法PCR，扩增标准程序：95℃30秒；95℃5秒，60℃30秒，40个循环。

[0048] 实施例5：实验数据处理和检测结果的判断

[0049] 根据实时定量PCR的结果，分别检测每个基因的CT值。一次以6例的PBMC为例(其中样本1-3为非结核性肺炎患者，样本4-6活动性结核病人)，分别检测出3个基因的荧光定量CT值，通过R语言算法包Glmnet，建立机器学习模型套索/弹性网模型(LASSO)，然后得到蛋白组合换算的结果(用R表示)。

[0050] 判读样本的类型。判断标准为：当R>0.5时，则判断为活动性结核患者。反之，则为非结核性肺炎病人。

[0051] 表5 6例样本三个基因的CT值以及蛋白组合换算的结果表

[0052] CD157 IL1-B MS4A6A R值
样本1 18.81699944 19.85099983 17.49799919 0.051979883
样本2 20.47800064 23.38599968 20.77799988 0.097066745
样本3 17.62899971 12.74400043 17.79700089 0.049131244
样本4 19.14900017 9.87100029 22.14100075 0.792579128
样本5 19.84499931 13.24600029 20.78700066 0.876919261
样本6 17.90699959 16.66600037 19.44300079 0.972986521

[0053] 从表5可以看出，样本1-3的R值小于0.5，为非结核性肺炎病人；样本4-6的R值大于0.5，为活动性结核病人。与实际情况完全符合。

[0054] 实施例6：本发明的在分辨活动性结核的敏感性和特异性

[0055] 本实施例将人群分为两组：活动性结核病患者(24例)、非结核性肺炎病人(26例)，通过检测每例外周血单个核细胞(PBMC)中CD157/IL-1b/MS4A6A基因CT，最后代入公式后计算出各样本的结果及判断结果，结果数值大于0.5诊断为活动性结核。

[0056] 结果见表6，

[0057] 表6不同类型临床样本检测结果表

[0058]

[0059]

[0060] 从表6可以看出，利用本试剂盒检测24例活动性结核病人中，21例判断为活动性结核，真阳性率为87.5％，说明本发现的蛋白芯片检测方法很好的特异性；检测的26例非活动性结核病人中，2例判断为活动性结核，假阳性率为7.69％，说明本发现的蛋白芯片检测方法很好的敏感性。

[0061] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

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