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针对血管生成因子的高度有效的单克隆抗体

阅读：981发布：2020-06-28

专利汇可以提供针对血管生成因子的高度有效的单克隆抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及针对血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素2(Ang-2)的中和单克隆抗体、包含其的药物组合物以及包括将此类药物组合物施用至患者的治疗方法。，下面是针对血管生成因子的高度有效的单克隆抗体专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种单克隆抗体(mAb)，所述单克隆抗体(mAb)结合并中和VEGF并且与VE1抗体具有相同表位。
2.如权利要求1所述的mAb，所述mAb包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有来自图3A中的VE1的轻链可变区序列的三个CDR，所述重链可变区具有来自图3B中的VE1的重链可变区序列的三个CDR。
3.如权利要求2所述的mAb，所述mAb是人源化抗体。
4.如权利要求2所述的mAb，所述mAb包含具有图3A中的HuVE1-L1或HuVE1-L2的序列的轻链可变区和具有图3B中的HuVE1-H1或HuVE1-H2的序列的重链可变区。
5.如权利要求2所述的mAb，所述mAb是Fv、Fab或F(ab’)2片段或单链抗体。
6.如权利要求2所述的mAb，所述mAb抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。
7.如权利要求2所述的mAb，所述mAb是双特异性抗体。
8.如权利要求7所述的mAb，所述mAb包含结合VEGF的第一结合结构域和结合HGF或FGF2或Ang-2的第二结合结构域。
9.如权利要求7所述的mAb，所述mAb是单体的同二聚体，每个单体包含结合VEGF的第一结合结构域和结合HGF或FGF2或Ang-2的第二结合结构域。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求2所述的mAb。
11.一种治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用如权利要求10所述的药物组合物。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述疾病是癌症。
13.一种单克隆抗体(mAb)，所述单克隆抗体(mAb)结合并中和Ang-2并且与A2T抗体具有相同表位。
14.如权利要求13所述的mAb，所述mAb包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有来自图13A中的A2T的轻链可变区序列的三个CDR，所述重链可变区具有来自图13B中的A2T的重链可变区序列的三个CDR。
15.如权利要求14所述的mAb，所述mAb是人源化抗体。
16.如权利要求15所述的mAb，所述mAb包含具有图13A中的HuA2T-L1或HuA2T-L2的序列的轻链可变区和具有图13B中的HuA2T-H1或HuA2T-H2的序列的重链可变区。
17.如权利要求14所述的mAb，所述mAb是双特异性抗体。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求14所述的mAb。
19.一种治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括施用如权利要求18所述的药物组合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述疾病是癌症。

说明书全文

针对血管生成因子的高度有效的单克隆抗体

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2015年9月14日提交的美国临时申请第62/218,226号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。发明领域

[0003] 本发明一般地涉及单克隆抗体(mAb)的组合和用于开发新的生物制品的重组DNA技术，并且更具体地例如涉及结合并中和血管内皮生长因子或血管生成素-2的单克隆抗体的产生。

[0004] 发明背景

[0005] 血管生成是从现有脉管系统形成新血管的过程。血管生成不仅是正常发育和组织再生所必需的，也是尺寸超过2mm-3mm的肿瘤生长所必需的(在N.Vasudev等人，Angiogenesis 17：471-494，2014中综述)，以为肿瘤供应氧和营养。人们因此提出，抑制血管生成可以抑制肿瘤生长(J.Folkman，N Eng J Med 285：1182-1186，1971)。异常血管生成还参与其他病理学状况，包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病和类风湿性关节炎。

[0006] 大量细胞因子促进血管生成，包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子1和2(FGF1和FGF2)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胎盘生长因子(PGF或PIGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管生成素1和2(Ang-1和Ang-2)、以及肝细胞生长因子(HGF)(在R.Gacche等人，ProgBiophys Mol Biol 113：333-354，2013中综述)。由VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D组成的VEGF同源生长因子家族通过介导内皮细胞增殖、迁移和管形成发挥重要作用(在T.Veikkola等人，Semin Cancer Biol 9：211-220，1999中综述)。其中，VEGF-A被研究的最彻底并且在正常血管生成和肿瘤血管生成中起关键作用；在本文中不具有字母标识符的VEGF应当指VEGF-A。

[0007] VEGF(即VEGF-A)是由两个相同的23kDa 单体组成的同二聚体糖蛋白。存在数种可变剪接的人VEGF同种型，包括VEGF121、VEGF165、VEGF189、和VEGF206(N.Ferrara等人，Nature Med 9：669-676，2003)。其中VEGF165是最丰富的并且是促有丝分裂的同种型，并且对应于23kDa亚基。VEGF189和VEGF206结合肝素并因此结合细胞外基质；VEGF165是可扩散的(VEGF的结构和生物学在Q.T.Ho等人，Int J Biochem Cell Biol 39：1349-1357，2007中综述)。
VEGF家族成员结合三种酪氨酸激酶细胞受体：VEGFR1(Flt-1)、VEGFR2(Flk-1；KDR)和VEGFR3，VEGF-A主要通过VEGFR2进行信号传导(在C.Fontanella等人，Ann Transl Med 2：
123，2014中综述)，所以本文中VEGFR2将也被称为VEGFR。VEGF与VEGFR2的结合导致受体二聚化、自磷酸化以及MEK-MAP和PI3K-AKT信号传导途径的活化，引起细胞增殖和内皮细胞存活。

[0008] 因为VEGF是肿瘤中血管生成的关键驱动物，VEGF的抑制剂具有治疗癌症的潜力。人VEGF的单克隆抗体(mAb)有效抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长(K.J.Kim等人，Nature 362：841-844，1993)。该抗体的人源化形式，贝伐单抗在一系列临床试
验中显示针对几种类型的癌症改进患者存活(在上文引用的N.Vasudev中综述)并且被批准用于与多种其他药物组合治疗以下类型的癌症：结肠直肠癌、肺癌、肾癌、宫颈癌和卵巢癌，以及用于治疗成胶质细胞瘤( 包装标签)。然而，贝伐单抗的无进展或整体存活益
处通常非常小，经常为数月(R.S.Kerbel，The Breast S3：S56-S60，2011)。为了试图改进贝伐单抗，已经生成了其他抗-VEGF mAb，包括MAb7392(WO 2011/159704)、人源化兔mAb hEBV321(Y.Yu等人，PLOS ONE 5：e9072，2010；美国专利第7,803,371号；US 2012/
0231011)、人源化mAb Y0317(Y.Chen等人，J Mol Biol：293：865-81，1999)、以及人mAb B20.4.1和B20.4.1.1(US 2009/0142343)。然而这些mAb尚未被批准用于市场化。

[0009] 血管生成素家族的细胞因子包括：血管生成素1(Ang-1)、血管生成素2(Ang-2)以及在人中被较少研究的血管生成素4(对于血管生成素的结构和功能以及其受体的综述，参见M.Thomas等人，Angiogenesis 12：125-137，2009和E.Fagiani等人，Cancer Letters 328：18-26，2013)。血管生成素是分泌型糖蛋白，二聚体分子量为70-75kDa，但也形成异源多聚体诸如三聚体和四聚体；这样的寡聚化对于受体活化是必需的。血管生成素结合并通过Tie-2酪氨酸激酶受体进行信号传导；Tie-1是一种能够与Tie-2异二聚化并调节信号转导的孤儿受体(orphan receptor)。Ang-1通过Tie-2进行正向信号传导，而Ang-2已经被报道为取决于环境的激动剂或拮抗剂。血管生成素以复杂的方式作用于脉管系统。Ang-1通常稳定血管并且对于胚胎中血管发育至关重要，而由内皮细胞释放的Ang-2可以充当Ang-1的竞争性拮抗剂并因此促进周细胞从内皮细胞脱离、顶端细胞的长出以及在VEGF的存在下促进血管生成。

[0010] 使用噬菌体展示和转基因小鼠，已经生成了特异性结合并中和Ang-2的几种人mAb，包括Ab536(J.Oliner等人，Cancer Cell 6：507-16，2004)、MEDI-3617(C.C.Leow等人，Int J Oncol 40：1321-30，2012和A.Buchanan等人，MAbs 5：255-62，2013)、LC06(M.Thomas等人，PLoS One.8：e54923，2013)以及REGN910(C.Daly等人，Cancer Res 73：108-18，2012)。这些mAb阻断Ang-2与Tie-2的结合、抑制血管生成并抑制多种模型中肿瘤异种移植物的生长。也已经报道了结合VEGF和Ang-2二者的双特异性抗体(Y.Kienast，Clin Cancer Res 19：6730-6740，2013)。

[0011] 要求保护的发明的概述

[0012] 在一个实施方案中，本发明提供了与本文公开的VE1抗体具有相同表位的针对人血管内皮生长因子(VEGF)的中和单克隆抗体(mAb)。示例性抗体是VE1和包含具有来自VE1的轻链可变区序列的三个CDR的轻链可变区和具有来自VE1的重链可变区序列的三个CDR的重链可变区的mAb，例如VE1的嵌合和人源化形式，诸如包含图3中列出的人源化轻链和重链的mAb。mAb抑制VEGF的至少一个、且优选地几个或全部生物学活性，包括结合其细胞受体。有利地，抗-VEGF mAb抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。还提供了包含任何此类mAb的药物组合物，以及通过施用此类药物组合物治疗患有疾病，例如癌症的患者的方法。

[0013] 在另一个实施方案中，本发明提供了与本文公开的A2T抗体具有相同表位的针对人血管生成素2(Ang-2)的中和单克隆抗体(mAb)。示例性抗体是A2T和包含具有来自A2T的轻链可变区序列的三个CDR的轻链可变区和具有来自A2T的重链可变区序列的三个CDR的重链可变区的mAb，例如A2T的嵌合和人源化形式，诸如包含图13中列出的人源化轻链和重链的mAb。mAb抑制Ang-2的至少一个、且优选地几个或全部生物学活性，包括结合其细胞受体和刺激血管生成。还提供了包含任何此类mAb的药物组合物，以及通过施用此类药物组合物治疗患有疾病，例如癌症的患者的方法。

[0014] 还提供了掺入来自上文提及的抗体的任一个的一个或更多个结合结构域，以及来自具有另一种靶的不同抗体的一个或更多个结合结构域的双特异性抗体。在优选的实施方案中，其他靶是人肝细胞生长因子(HGF)且不同抗体可以是HuL2G7，或者其他靶是人FGF2且不同抗体可以是人源化GAL-F2mAb。在示例性实施方案中，一个或更多个结合结构域来自人源化VE1 mAb且一个或更多个结合结构域来自针对Ang-2的人源化或人mAb，例如人源化A2T mAb。通常，双特异性抗体是单体的同二聚体，每个单体包含结合VEGF的第一结合结构域和结合HGF或FGF2或Ang-2的第二结合结构域。

[0015] 附图简述

[0016] 图1.Bs(scFv)4-IgG双特异性抗体形式的示意图。上图(A)示出了个体可变区和恒定区；下图(B)示出了通过每个轻链区与各自的重链区一起折叠形成的结构域。VH1(相应的VL1)＝第一抗体的重链(相应的轻链)可变区；且对于第二抗体的VH2和VL2是类似的。CH1、CH2、CH3(相应的CL)＝重链(相应的轻链)恒定区结构域；V1(相应的V2)＝第一(相应的第二)抗体的完整可变结构域。

[0017] 图2.(A)示出了VE1而不是对照小鼠mAb mIgG捕获VEGF的ELISA测定。(B)示出了VE1比A4.6.1更好地阻断VEGF与VEGFR的结合的ELISA测定。

[0018] 图3.示出了与小鼠VE1和人受体V区比对的HuVE1-L1和HuVE1-L2轻链(A)和HuVE1-H1和HuVE1-H2重链(B)的成熟可变区的氨基酸序列。VE1序列中的CDR被加下划线，并且HuVE1序列中用小鼠VE1氨基酸取代的氨基酸被加双下划线。本文中，对于轻链和重链二者使用1-字母氨基酸编码和Kabat编号系统。

[0019] 图4.比较ChVE1和HuVE1变体#1、#2、#3、#4和阴性对照抗体hIgG的结合(A)和受体阻断(B)活性的ELISA测定。

[0020] 图5.比较HuVE1变体#3和#4与贝伐单抗和阴性对照hIgG的结合(A)和受体阻断(B)活性的ELISA测定。

[0021] 图6.(A)示出了HuVE1#4比贝伐单抗更好地抑制人脐带血管内皮细胞(HUVEC)的VEGF-诱导的增殖的生物测定。(B)比较指定的抗-VEGF mAb阻断VEGF与VEGFR2结合的能力的ELISA测定。

[0022] 图7.(A)示出了HuVE1#4(和贝伐单抗)(A)与VEGF-A(VEGF)结合而不与VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、HGF、和FGF2结合的ELISA测定，以及(B)示出了HuVE1#4(和贝伐单抗)与VEGF的VEGF-165、VEGF-121和VEGF-189同种型结合的ELISA测定。

[0023] 图8.(A)VEGF的人(Hu或h)/小鼠(Mu或m)嵌合形式的示意图。带阴影的，人序列；带斜线的，小鼠序列；KF，κ-flag。(B)HuVE1#4和贝伐单抗与(A)中的每一个构建体结合的ELISA测定。

[0024] 图9A、9B.HuVE1#4和贝伐单抗与如标注的VEGF的多种突变体的结合。WT；野生型VEGF。

[0025] 图10.(A)指定的抗-Ang-2mAb与人(h)、小鼠(m)和食蟹猴(cyno)Ang-2构建体的结合的ELISA测定。(B)指定的抗-Ang-2mAb与人、小鼠、人-小鼠嵌合的(h/m)和小鼠-人(m/h)嵌合的Ang-2构建体的结合的ELISA测定。

[0026] 图11.比较指定的mAb阻断(人)Ang-2与(人)Tie-2的结合的能力的ELISA测定。

[0027] 图12.A2B mAb的(成熟)轻链(A)和重链(B)可变区的氨基酸序列。

[0028] 图13.示出了与小鼠A2T和人受体V区比对的HuA2T-L1和HuA2T-L2轻链(A)以及HuA2T-H1和HuA2T-H2重链(B)的成熟可变区的氨基酸序列。A2T序列中CDR被加下划线，并且HuA2T序列中用小鼠A2T氨基酸取代的氨基酸被加双下划线。从小鼠T转换成人A以消除可能的糖基化位点的位置60处的氨基酸用阴影示出。

[0029] 图14.比较指定的HuA2T变体与Ang-2结合(A)和抑制Ang-2与Tie-2的结合(B)的能力的ELISA测定。

[0030] 图15.比较指定的HuA2T变体与Ang-2结合(A)和抑制Ang-2与Tie-2的结合(B)的能力的ELISA测定。

[0031] 图16.(A)比较指定的抗-Ang-2mAb抑制Ang-2与Tie-2的结合的能力的ELISA测定。(B)比较指定的抗-Ang-2mAb抑制HEK293-Tie-2细胞中Ang-2诱导的Tie-2磷酸化的能力的测定。

[0032] 图17.(A)示出B-HuA2T/HuVE1双特异性抗体而不是HuVE1同时结合Ang-2和VEGF的能力的ELISA测定。(B)比较B-HuA2T/HuVE1、HuVE1和贝伐单抗结合VEGF的能力的ELISA测定。

[0033] 图18.比较B-HuA2T/HuVE1和HuVE1抑制VEGF与VEGFR2的结合的能力的ELISA测定(A)，以及比较B-HuA2T/HuVE1和HuA2T抑制Ang-2与Tie-2的结合的能力的ELISA测定(B)。

[0034] 图19.(A)用VE1(5mg/kg)或单独的媒介物(PBS)每周两次处理的小鼠中COLO 205异种移植物的生长。(B)用HuVE1#3(5mg/kg)或单独的PBS每周两次处理的小鼠中COLO 205异种移植物的生长。

[0035] 图20.(A)用HuVE1或贝伐单抗(2.5mg/kg)或单独的媒介物(PBS)每周两次处理的小鼠中原发性肝肿瘤异种移植物的生长。(B)用HuVE1或贝伐单抗(1mg/kg)或单独的PBS处理的小鼠中RPMI 4788结肠肿瘤异种移植物在第6天和第9天的生长，如箭头指示的。

[0036] 图21.用HuVE1或贝伐单抗(5mg/kg)或单独的媒介物(PBS)每周一次处理的小鼠中原发性乳腺肿瘤异种移植物的生长。

[0037] 优选实施方案的详述

[0038] 1.抗体

[0039] 如本文中使用的，“抗体”意指含有能够结合抗原的一个或更多个结构域的蛋白，其中此类结构域衍生自天然抗体的可变结构域或与天然抗体的可变结构域同源。与不同抗体的混合物相比，单克隆抗体(“mAb”)仅仅是单一种类的抗体。本文描述的抗体通常是单克隆抗体，除非上下文另外指明。抗体的“抗原”意指抗体与其特异性结合的化合物，并且通常是多肽，但也可以是小肽或者小分子半抗原或碳水化合物或其他部分。抗体的实例包括天然的全长四聚体抗体；抗体片段诸如Fv、Fab、Fab’和(Fab’)2；单链(scFv)抗体(Huston等人，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879，1988；Bird等人，Science 242：423，1988)；单臂抗体(Nguyen等人，Cancer Gene Ther 10：840，2003)；和双特异性、嵌合的和人源化抗体，这些术语在下文进一步解释。抗体可以衍生自任何脊椎动物物种，包括鸡、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠和仓鼠)、兔、灵长类动物和人。包含恒定结构域的抗体可以是已知同种型IgG、IgA、IgM、IgD和IgE的任一种，以及其亚型(即，人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)、以及其同种异型(allotype)和同族同种异型(isoallotype)，包括占据同种异型和同族同种异型中多态性位点的残基的组合。抗体还可以是嵌合同种型，即，其恒定(C)区的一个或更多个可以包含来自不同同种型的区，例如与铰链一起的γ-1 CH1区、来自γ-2、γ-3和/或γ-4基因的CH2和/或CH3结构域。抗体还可以在恒定区中包含替换物(replacement)以降低或增加效应物功能，诸如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见，例如Winter等人，美国专利第5,624,821号；Tso等人，美国专利第5,834,597号；和Lazar等人，Proc Natl Acad Sci USA 103：4005，2006)，或者延长在人中的半衰期(参见，例如Hinton等人，J Biol Chem 279：6213，2004)。

[0040] 天然抗体分子通常是由两个相同的异二聚体组成的四聚体，每个异二聚体包含与一条重链配对的一条轻链。每条轻链和重链由可变(VL或VH，或者简单地V)区、然后是恒定(CL或CH，或者简单地C)区组成。CH区本身包括CH1、铰链(H)、CH2、和CH3区。在三维(3D)空间中，VL和VH区一起折叠以形成V结构域，V结构域也被称为结合结构域，因为它与抗原结合。CL区与CH1区一起折叠，使得轻链VL-CL和重链的VH-CH1区一起形成抗体的部分，其被称为Fab：一种天然的“Y形”抗体因此包含两个Fab，每个异二聚体中一个，形成Y的臂。一个异二聚体的CH2区与另一个异二聚体的CH2区相对定位，并且各自的CH3区彼此折叠，一起形成抗体的单个Fc结构域(Y的底部)，其与免疫系统的其他组分相互作用。

[0041] 在每个轻链或重链可变区中，存在3个被称为互补决定区(“CDR”)的短区段(平均约10个氨基酸的长度)。抗体可变结构域中的6个CDR(3个来自轻链，且3个来自重链)在3D空间中一起折叠以形成锁定靶抗原的实际的抗体结合位点。CDR的位置和长度已经由Kabat，E.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services，1983，1987准确地定义。不包含于CDR中的可变区的部分被称为框架(framework)，其形成用于CDR的环境。Chothia等人，J Mo1 Biol 196：901，1987已经定义了高变区或由结构确定的环的相关概念。

[0042] 如本文中使用的，“基因工程化”mAb是其基因已经借助重组DNA技术被构建或置于非天然环境(例如，小鼠中或细菌噬菌体上的人基因)的mAb，并因此包括嵌合抗体和人源化抗体，如下文描述的，但将不包括用传统杂交瘤技术制造的小鼠或其他啮齿动物mAb。嵌合抗体(或相应的嵌合抗体轻链或重链)是其中小鼠(或其他非人物种)抗体(或相应的抗体轻链或重链)的可变区与人抗体的恒定区组合的抗体(或相应的抗体轻链或重链)；其通过基因工程手段的构建是熟知的。此类抗体保持小鼠抗体的结合特异性，同时约2/3是人的。

[0043] 人源化抗体是基因工程化抗体，其中来自非人“供体”抗体(例如鸡、小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的CDR被接枝到人“受体”抗体序列中，使得人源化抗体保持供体抗体的结合特异性(参见，例如Queen，美国专利第5,530,101号和第5,585,089号；winter，美国专利第5,225,539号；Carter，美国专利第6,407,213号；Adair，美国专利第5,859,205号、第6,881,557号；
Foote，美国专利第6,881,557号)。受体抗体序列可以为，例如成熟的人抗体序列、人抗体序列的共有序列、胚系(germline)人抗体序列或两种或更多种此类序列的组合物。因此，人源化抗体是具有完全或基本上来自供体抗体一些或全部CDR和完全或基本上来自人抗体序列的可变区框架序列和恒定区(如果存在)的抗体。类似地，人源化轻链(相应的重链)具有完全或基本上来自供体抗体轻链(相应的重链)的至少一个、两个和通常全部三个CDR，和基本上来自人轻链(相应的重链)受体链的轻链(相应的重链)可变区框架和轻链(相应的重链)恒定区(如果存在)。人源化抗体通常包含人源化重链和人源化轻链。当相应的CDR之间的对应氨基酸(如根据Kabat定义的)的至少85％、90％、95％或100％是相同的，那么人源化抗体中的CDR基本上来自于非人抗体中的对应CDR。当对应氨基酸(如根据Kabat定义的)的至少
85％、90％、95％或100％是相同的，那么抗体链的可变区框架或恒定区基本上分别来自于人可变区或人恒定区。

[0044] 如同本申请中其他地方，此处的百分比序列同一性是通过根据Kabat编号规定(Eu索引，CH区)最大化对齐的抗体序列确定的。比对后，如果受试抗体区(例如重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的同一区进行比较，则受试抗体和参考抗体之间的百分比序列同一性是在受试抗体区和参考抗体区二者中被相同氨基酸占据的位置的数目除以两个区的比对位置的总数目，空位不计，乘以100以转化成百分比。

[0045] 为了保持人源化抗体的高结合亲和力，可以使用两种另外的结构元素中的至少一种。参见美国专利第5,530,101号和5,585,089号(通过引用并入本文)，其提供构建人源化抗体的详细的指导。在第一种结构元素中，通过从许多已知的人抗体中适当地选择受体抗体重链，受体或人源化抗体的重链可变区的框架被选择为与供体抗体的重链可变区的框架具有高序列同一性(65％与95％之间)。在第二种结构元素中，在构建人源化抗体时，人受体抗体的框架(CDR之外)中选定的氨基酸根据指定规则被替换为来自供体抗体的对应氨基酸。具体地，框架中待被替换的氨基酸基于其与CDR相互作用的能力被选择。例如，被替换的氨基酸可以邻接供体抗体序列中的CDR或在人源化抗体的CDR的4-6埃以内，如在3-维空间中测量的。

[0046] 设计人源化抗体的其他方法也可以被使用以获得与上文描述的美国专利第5,530,101号和第5,585,089号中的方法，例如“超人源化(superhumanization)”(参见Tan等人，J Immunol 169：1119，2002，和美国专利第6,881,557号)或Studnicak等人，Protein Eng 7：805，1994的方法相同结果。此外，产生基因工程化的、降低免疫原性的mAb的其他方法包括“改形(reshaping)”、“超嵌合(hyperchimerization)”和镶饰(veneering)/重塑(resurfacing)，如例如Vaswami等人，Annals of Allergy，Asthma and Immunology 81：
105，1998；Roguska等人，Protein Eng 9：895，1996；和美国专利第6,072,035号和第5,639,
641号中描述的。镶饰抗体(veneered antibodV)通过替换非人供体抗体的可变区框架中可能有助于B细胞表位或T细胞表位的特定氨基酸，例如暴露的残基而更像人的(human-like)(Padlan，Mol Immunol 28：489，1991)。其他类型的基因工程化抗体包括使用噬菌体展示方法(Dower等人，WO91/17271；McCafferty等人，WO92/001047；Winter，WO92/20791；以及Winter，FEBS Lett 23：92，1998，其每一个通过引用并入本文)或者通过使用转基因动物(Lonberg等人，WO93/12227；Kucherlapati WO91/10741，其每一个通过引用并入本文)制造的人抗体。

[0047] 术语“抗体”或“mAb”还包括双特异性抗体。“双特异性抗体”是含有结合第一抗原的第一结构域和结合第二抗原的第二(不同的)结构域的抗体，其中第一结构域和第二结构域衍生自天然抗体的可变结构域或与天然抗体的可变结构域同源。第一抗原和第二抗原可以是相同抗原，在该情况下，第一结构域和第二结构域可以结合抗原上的不同表位。术语双特异性抗体包括多特异性抗体，其除了第一结构域和第二结构域以外包含结合抗原并且源自天然抗体的可变结构域或与天然抗体的可变结构域同源的一个或更多个其他结构域。术语双特异性抗体还包括包含源自天然抗体的可变结构域或与天然抗体的可变结构域同源的第一结合结构域和源自另一类型的蛋白(例如，受体的细胞外结构域)的第二结合结构域的抗体(“双特异性抗体-免疫黏附素”)。

[0048] 双特异性抗体已经以多种形式产生(参见，例如Kontermann，MAbs4：182-197，2012及其中引用的参考文献)，例如单链可变片段(scFv)、Fab-scFv和scFv-scFv融合蛋白(Coloma等人，Nat Biotechnol 15：125-6，1997；Lu等人，J Immunol Methods 267：213-26，2002；Mallender，J Biol Chem 269：199-206，1994)、Bs(scFv)4-IgG(Zuo等人，Protein Eng 13：361-367，2000)、双可变结构域抗体(Wu等人，Nat Biotechnol 25：1290-7，2007)以及双抗体(Holliger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90：6444-8，1993)。双特异性F(ab’)2抗体片段已经通过化学偶联(Brennan等人，Science 229：81，1985)或通过使用亮氨酸拉链(Kostelny等人，J Immunol 148：1547-53，1992)产生。具有每个重链-轻链对具有不同的V区的更天然成形的双特异性抗体可以例如通过将单独产生的两个重链-轻链对进行化学交联来制造(Karpovsky等人，J ExpMed 160：1686-701，1984)。天然成形的双特异性抗体还可以通过在通过融合两个杂交瘤细胞系制造的单个细胞(“四源杂交瘤(quadroma)”；
Milstein等人，Nature 305：537-40)中表达所需的重链和轻链二者产生或者通过转染制造的单个细胞中表达所需的重链和轻链二者产生。可以通过使用“knobs-into-holes”技术促进在细胞中表达的正确轻链和重链的缔合以形成期望的双特异性抗体(Ridgway等人，Protein Eng 9：617-21，1996；Atwell等人，J Mol Biol 270：26-35，1997；和美国专利第7,
695,936号)；任选地通过一个轻链-重链对的抗原结合片段(Fab)内的重链和轻链结构域的交换或“互换(crossing over)”，从而产生被称为“CrossMabs”的双特异性抗体(Schaefer等人，Proc Natl Acad Sci USA 108：11187-92，2011；WO 2009/080251；WO 2009/080252；
WO 2009/080253)。

[0049] 如果抗体以比不结合抗原的不相关抗体显著更大的程度结合该抗原，则称该抗体“特异性”结合该抗原，并且因此通常具有至少约106M-1，但优选107M-1、108M-1、109M-1或1010M-1的对该抗原的结合亲和力(Ka)。通常，当称抗体结合抗原时，意指特异性结合。如果称抗体不结合抗原，意指实验误差内的指示结合的任何信号与来自不相关对照抗体的信号不可区分。mAb的表位是mAb与其结合的抗原的区域。如果两种抗体的每一种竞争性抑制(阻断)另一种与抗原的结合，则判断两种抗体结合相同表位或重叠表位。竞争性抑制结合意指1x或5x过量的一种抗体抑制另一种抗体的结合的至少50％、但优选地75％，或者10x、20x或100x过量的一种抗体抑制另一种抗体的结合的至少75％、但优选地90％或甚至95％或99％，如在竞争性结合测定中测量的(参见，例如Junghans等人，Cancer Res 50：1495，1990)。如果在竞争性结合测定中，第二mAb抑制(第一mAb的)结合的抑制浓度50(IC50)与第一mAb抑制其自身结合的IC50相当，即在2倍或3倍以内，则称一种mAb(第二mAb)与另一种mAb(第一mAb)“完全地”竞争与抗原的结合。如果第二mAb抑制(第一mAb的)结合的IC50基本上大于第一mAb抑制结合的IC50，例如大于第一mAb抑制结合的IC50的3倍或5倍或10倍，则称第二mAb与第一mAb“部分地”竞争与抗原的结合。通常，如果每一个mAb与彼此完全地竞争与抗原的结合，则两种mAb在抗原上具有相同表位，并且如果至少一种mAb与另一种mAb部分地竞争结合，则两种mAb具有重叠表位。可选地，如果减少或消除一种抗体的结合的抗原中的基本上所有氨基酸突变都减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位，而如果减少或消除一种抗体的结合的一些但不是所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠表位。

[0050] 2.抗-VEGF和抗-Ang-2抗体

[0051] 当本文中提及生长因子或受体诸如VEGF、Ang-2、HGF和FGF2时，意指生长因子或受体的人形式，除非另外指明。

[0052] 如果结合部分地或完全地抑制VEGF(相应的Ang-2)的一种或更多种生物学活性，即，当mAb被用作单一剂时，结合VEGF的单克隆抗体，即抗-VEGF mAb(或相应的结合Ang-2的mAb，即抗-Ang-2 mAb)被称为中和VEGF(相应的Ang-2)，或被称为中和的(neutralizing)。中和抗体可以抑制的VEGF的生物学特性是VEGF结合其细胞受体、诱导其受体磷酸化以及诱导人脐带血管内皮细胞(HUVEC)增殖或诱导血管生成的能力。中和抗体可以抑制的ANG-2的生物学特性是Ang-2结合其细胞受体、诱导其受体磷酸化以及诱导血管生成的能力。浓度为例如0.01μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/m1、20μg/m1或50μg/ml的本发明的中和mAb抑制VEGF(相应的Ang-2)的生物学功能的约至少50％、但优选地75％、更优选地90％或95％或甚至99％、且最优选地约100％(基本上完全地抑制)，如通过实施例下描述的或本领域已知的方法测定的。通常，当使用的VEGF(相应的Ang-2)的量恰好足以完全刺激生物学活性，或为0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、3μg/ml或10μg/ml时，测量抑制程度。优选地，mAb不仅中和上文列出的生物学活性中的一个还中和上文列出的生物学活性中的两个、三个或若干个；出于本文的目的，被用作单一剂的mAb中和VEGF(相应的Ang-2)的全部生物学活性，被称为“完全中和”，并且此类mAb是最优选的。

[0053] 本发明的抗-VEGF mAb优选是VEGF(即，VEGF-A)特异性的，即，它们不(特异性)结合或仅以低得多的程度(例如，最好低于10倍)结合与VEGF相关的蛋白，诸如VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D以及其他血管生成因子例如HGF和FGF2。类似地，本发明的抗-Ang-2 mAb优选是Ang-2特异性的，即，它们不(特异性)结合或仅以低得多的程度(例如，最好低于10倍)结合与Ang-2相关的蛋白，诸如Ang-1和Ang-4以及其他血管生成因子例如HGF和FGF2。本发明的mAb通常具有至少107M-1但优选地108M-1或更高、且最优选地109M-1或更高或甚至1010M-1或更高的对其特异性靶的结合亲和力(Ka)。抗-VEGF mAb结合人VEGF且抗-Ang-2 mAb结合人Ang-2，但有利地也结合来自其他物种例如小鼠或非人灵长类动物诸如食蟹猴的VEGF(相应的Ang-2)，理想地具有类似于对人VEGF(相应的人Ang-2)的结合亲和力(例如，在10倍以内)的结合亲和力。本发明的MAb包括以上描述的抗体的各种形式，包括具有结合VEGF或Ang-2的结合结构域的双特异性抗体。人VEGF的序列在Swiss-Prot P15692中提供，其中前26个残基是信号肽，其在成熟VEGF-A中被去除。

[0054] 本文中描述的抗-VEGF mAb VE1是本发明的一个实例。与VE1具有相同或重叠表位的中和mAb提供其他实例。嵌合的、人源化或人中和抗-VEGF mAb，例如VE1的嵌合或人源化形式诸如HuVE1，是特别优选的实施方案。在其他优选的实施方案中，mAb是双特异性抗体，其包含来自具有以上提及的一个或更多个特性(例如中和VEGF)的本发明的抗-VEGF mAb(例如VE1或VE1的人源化形式)的一个或更多个结合结构域和来自任选地结合并中和HGF(例如L2G7mAb或其人源化形式，诸如HuL2G7，如美国专利第7,220,410号和第7,632,926号中描述的)或FGF2(例如GAL-F2 mAb或其人源化形式，如美国专利第8,101,725号中公开的)的mAb的第二结合结构域。最优选地，抗-VEGF mAb抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长，如通过实施例中的测定或本领域另外已知的测定的任何一个评价的。本发明还包括具有单独地或总体地与VE1的CDR在氨基酸序列方面为至少90％、95％或98％或完全相同的CDR，并且保持其功能特性的mAb，或者与VE1的区别在于少量功能上不重要的氨基酸的取代(例如保守取代，如以下定义的)、缺失、或插入的mAb。

[0055] 本文描述的抗-Ang-2 mAb A2T和A2B也是本发明的实例。与A2T或A2B具有相同或重叠表位的中和mAb提供其他实例。嵌合的、人源化或人中和抗-Ang-2 mAb，例如A2T或A2B的嵌合或人源化形式诸如HuA2T，是特别优选的实施方案。在特定实施方案中，mAb是双特异性抗体，其包含来自具有以上提及的一个或更多个特性(例如中和Ang-2)的本发明的抗-Ang-2 mAb(例如A2T或A2B或其人源化形式)的一个或更多个结合结构域以及来自另一种mAb(诸如以上提及的抗HGF和抗FGF2 mAb)的第二结合结构域。理想地，抗-Ang-2 mAb抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长，如通过实施例中的测定或本领域另外已知的测定的任一个评价的。本发明还包括具有单独地或总体地与A2T或A2B的CDR在氨基酸序列方面为至少90％、95％或98％或完全相同的CDR，并且保持其功能特性的mAb，或者其与A2T或A2B的区别在于少量功能上不重要的氨基酸的取代(例如保守取代，如以下定义的)、缺失、或插入的mAb。

[0056] 分离出具有本文描述的期望特性的单一、原型抗-VEGF或抗-Ang-2 mAb，例如分别为VE1或A2T之后，则通过使用本领域已知的方法生成具有相似性质的其他mAb(包括与VE1竞争结合VEGF的mAb和/或与VE1具有相同表位的mAb)是简单的。例如，小鼠可以用VEGF免疫接种、产生杂交瘤、并且筛选所得mAb与VE1竞争结合VEGF的能力。小鼠也可以用包含VE1与其结合的表位的VEGF的较小片段免疫接种。表位可以通过例如筛选与跨越VEGF的一系列重叠肽的结合来定位。以这些方式生成的小鼠mAb随后可以被人源化。可选地，Jespers等人，Biotechnology 12：899，1994(其通过引用并入本文)的方法可以被用于指导与VE1具有相同表位并因此具有相似特性的mAb的选择。使用噬菌体展示，首先VE1的重链与轻链(优选人轻链)的库(repertoire)配对以选择VEGF结合mAb，并且然后，将新的轻链与重链(优选人重链)的库配对以选择与VE1具有相同表位的VEGF结合mAb(优选人VEGF结合mAb)。可选地，VE1的变体可以通过使编码VE1的重链和轻链的cDNA突变获得。相同程序可以被应用于开发与A2T或A2B竞争结合Ang-2的mAb和/或与A2T或A2B具有相同表位的mAb。

[0057] 本发明的优选的抗-VEGF mAb，诸如HuVE1，结合与贝伐单抗的表位不同(即不相同)的表位(尽管表位可以重叠)，从而抗体与贝伐单抗竞争结合VEGF。具体地，VEGF中大幅度削弱贝伐单抗与VEGF结合的一个或更多个氨基酸取代可不影响，或不以相同程度影响本发明的mAb的结合，或者反之亦然。本发明的优选的抗体具有比贝伐单抗高至少2倍、但更优选地3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或甚至10倍的对VEGF的结合亲和力。类似地，本发明的优选的抗体比贝伐单抗好至少2倍、但更优选3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或甚至10倍地抑制VEGF与VEGFR2的结合(通常通过贝伐单抗的抑制的抑制浓度-50％(IC 50)与优选的抗体的抑制的IC50的比率来测量)。

[0058] 基因工程化mAb，例如嵌合或人源化或双特异性mAb，可以通过多种本领域已知的方法表达。例如，编码其轻链和重链V区的基因可以从重叠的寡核苷酸合成并与可用的C区一起插入到提供必需的调控区(例如启动子、增强子、多聚A位点等)的表达载体(例如从Invitrogen商购可得)。CMV启动子-增强子的使用是优选的。然后，使用多种熟知的方法诸如脂质转染或电穿孔，表达载体可以被转染到多种哺乳动物细胞系诸如CHO或非生产性骨髓瘤(non-producing myelomas)(包括Sp2/0和NS0)中，并且通过适当的抗生素筛选来选择表达抗体的细胞。参见，例如美国专利第5,530,101号。更大量的抗体可以通过在商购可得的生物反应器中生长细胞产生。

[0059] 表达之后，本发明的mAb(包括双特异性mAb)可以根据本领域的标准程序纯化，诸如微量过滤、超滤、蛋白A或G亲和色谱法、尺寸排斥色谱法、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法和/或基于有机染料等的其他形式的亲和色谱法。优选至少约90％或95％同质性的基本纯的抗体，并且最优选98％或99％或更高同质性的基本纯的抗体用于药物用途。还理解，当mAb通过常规程序制造时，轻链和/或重链的氨基末端或羧基末端处的一个至几个氨基酸(诸如重链的C末端赖氨酸)在一部分或所有分子中可以缺失(missing)或者被衍生化，并且这样的合成物仍被认为是同一mAb。

[0060] 3.双特异性抗体

[0061] 本发明包括包含来自任何以上提及的mAb，优选VE1或A2T或A2B、或者与VE1或A2T或A2B具有相同表位的mAb、或者具有来自VE1或A2T或A2B的CDR的mAb，包括VE1或A2T或A2B的人源化形式(诸如HuVE1或HuA2T)的结合结构域的双特异性抗体。这种双特异性抗体的第二结合结构域可以例如结合另一种生长因子诸如表皮生长因子(EGF)、任何成纤维细胞生长因子诸如FGF2、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子β(TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)、任何形式的血小板衍生生长因子(PDGF)或神经调节蛋白或调蛋白(heregulin)以及血管生成素1或2，或者可选地这些生长因子的任何受体的任何细胞外结构域。优选地，第二结合结构域将来自人源化或人mAb。结合这些生长因子或受体的人形式是优选的。这些生长因子和受体的示例性序列可以从例如Swiss-Prot数据库容易地可得。美国专利第7,632,926号(出于所有目的，其通过引用并入本文)中描述的抗-HGF mAb HuL2G7的结合(可变)结构域或包含其CDR中的一个或更多个的结合结构域是特别优选的，抗-FGF2 mAbGAL-F2的人源化形式的结合结构域(美国专利第8,101,725号的图11中所示的序列)也是特别优选的。在特别优选的实施方案中，一个结合结构域来自本文公开的任何抗-VEGF mAb诸如HuVE1，并且第二结合结构域来自本文公开的任何抗-Ang2 mAb诸如HuA2T。

[0062] 本发明的双特异性抗体可以是任何形式，例如在上文引用的Kontermann中列出的任何形式。在一个优选的实施方案中，双特异性抗体为上文引用的Zuo等人中描述的Bs(scFv)4-IgG形式并且在图1中示出。在此形式中，单链(scFv)形式中的一个结合结构域连接至CL区并因此变成轻链的N-末端结构域，而scFv形式中的另一个结合结构域连接至CH1结构域并因此变成重链的N-末端结构域；两条轻链和两条重链与普通IgG抗体一样形成同二聚体，但包含两个每个结合结构域。因此，Bs(scFv)4-IgG形式的优点在于它是同二聚体，每个单体中具有相同的重链和轻链，使得不需要采取任何预防措施以确保正确的异二聚化。通常选择(G4S)3GS作为每个scFv中连接VL和VH区的接头。每个scFv结合结构域可以是VL-接头-VH的形式或是VH-接头-VL的形式(如图1A所示)，并且任一个结合结构域可以是轻链的一部分，而另一个结合结构域是重链的一部分，因此，从两种给定的结合结构域(例如HuVE1和HuL2G7或HuA2T的那些结合结构域)可以制备总计2×2×2＝8种Bs(scFv)4-IgG抗体的变体，其可以具有不同的特性。在本发明特别优选的实施方案中，scFv VH-接头-VL形式的HuVE1 V结构域连接至CH1，而scFv VH-接头-VL形式的另一抗体结构域诸如HuL2G7或HuA2T V结构域连接至CL。

[0063] 在本发明的另一个实施方案中，双特异性抗体为例如上文引用的Wu等人中描述的双可变结构域形式(参见图1A，其中加有标注)。这样的双特异性mAb包含两个每个结合结构域，每个结合结构域中的一个依次连接。多种肽接头可以用于连接第一结构域和第二结构域，例如重链中的ASTKGPSVFPLAP和轻链中的RTVAAPSVIFIPP，或两条链中的(G4S)3GS。例如，HuL2G7或HuA2T的可变结构域可以是第一结构域(VL1-VH1)，而HuVE1的可变结构域可以是第二结构域(VL2-VH2)；并且接头可以是上文提及的前者接头。

[0064] 在本发明的其他优选的实施方案中，包含轻链和重链的HuVE1 mAb的一个单体与包含轻链和重链的HuL2G7或HuA2T mAb的一个单体配对，以形成具有IgG分子的正常构型的异二聚体。如果全部四条链将在细胞中表达，则通过将knobs和holes插入相应的重链的CH3区来促进期望的异二聚体双特异性抗体而不是同二聚体的形成(Ridgway等人，Protein Eng 9：617-21，1996；Atwell等人，J Mol Biol 270：26-35，1997；和美国专利第7,695,936号)，同时通过一个单体之内的重链和轻链的“互换”促进轻链和重链的正确配对以形成HuVE1和HuL2G7或HuA2T单体的每一个(Schaefer等人，Proc Natl Acad Sci USA 108：11187-92，2011；WO 2009/080251；WO 2009/080252；WO 2009/080253)。

[0065] 本发明还提供了变体双特异性抗体，其轻链和重链与上文具体描述的轻链和重链的区别在于少量(例如通常不超过1个、2个、3个、5个或10个)的替换、缺失或插入，通常在C区或V区框架，但可能在CDR中。在变体序列中进行的最常见的替换相对于被替换的氨基酸是保守的。可以如下对氨基酸进行分组用于确定保守取代，即组内取代：第I组(疏水侧链)：met、ala、val、leu、ile；第II组(中性亲水侧链)：cys、ser、thr；第1II组(酸性侧链)：asp、glu；第IV组(碱性侧链)：asn、gln、his、lys、arg；第V组(影响链定向的残基)：gly、pro；以及第VI组(芳族侧链)：trp、tyr、phe。

[0066] 优选地，双特异性抗体中的替换对抗体的结合亲和力或效价没有实质影响，即，对其中和VEGF和第二结合结构域的靶诸如HGF或Ang-2的生物学活性的能力没有实质影响。优选地，变体序列与原始序列为至少90％、更优选至少95％、且最优选至少98％相同。另外，可以使用恒定区的其他同种异型或同种型。

[0067] 4.治疗方法

[0068] 在优选的实施方案中，本发明提供了包含本文描述的抗体的药物制剂。药物制剂包含在生理上可接受的载体中的mAb，任选地具有赋形剂或稳定剂，所述药物制剂为冻干或水性溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度对接受者无毒，并且包括pH通常为5.0至8.0、最通常为6.0至7.0的缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐或乙酸盐；盐例如氯化钠、氯化钾等以实现等渗；抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白、亲水聚合物诸如聚山梨醇酯80、氨基酸、碳水化合物、螯合剂、糖类和本领域技术人员已知的其他标准成分(Remington′s Pharmaceutical Science第16版，Osol，A.Ed.1980)。mAb通常以1mg/ml-100mg/ml的浓度存在，但最通常以10mg/ml-50mg/ml，例如10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、
40mg/ml或50mg/ml的浓度存在。

[0069] 在另一个优选的实施方案中，本发明提供了通过施用药物制剂中的本发明的抗-VEGF或抗-Ang-2 mAb，诸如VE1或A2T或其人源化和/或双特异性形式来治疗患有疾病的患者的方法，通常以抑制与疾病相关的血管生成。在药物制剂中制备的mAb可以通过任何合适的途径施用至患者，特别是肠胃外地、通过静脉输注或团注注射(bolus injection)、肌肉内地或皮下地施用。静脉输注可以在短至15分钟内给予，但更通常地持续30分钟，或者在1小时、2小时或甚至3小时内给予。mAb也可以被直接注射到疾病部位(例如肿瘤)，或者被封装到运载剂诸如脂质体中。给予的剂量足以缓解待治疗的状况(“治疗有效剂量”)并且可能为0.1mg/kg体重至5mg/kg体重，例如1 mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg或5mg/kg，但可以高达10mg/kg或甚至15mg/kg或20mg/kg或30mg/kg，例如在1mg/kg-10mg/kg或1mg/kg-20mg/kg的范围内。还可以给予固定的单位剂量，例如50mg、100mg、200mg、500mg或1000mg，或者剂量2
可以基于患者的表面积，例如1000mg/m 。通常施用1个和8个之间的(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个)剂量以治疗癌症，但可给予10个、20个或更多个剂量。取决于例如mAb的半衰期，mAb可以每天、每周两次、每周、每隔一周、每月或以一些其他间隔施用持续1周、2周、4周、6周、8周、3-6个月或更长时间。重复的治疗过程也是可能的，长期施用也是可能的。

[0070] 特别易受用本发明的抗-VEGF和/或抗-Ang-2 mAb的疗法影响的疾病包括与血管生成和/或升高的VEGF和/或Ang-2水平相关的那些疾病，包括实体瘤，例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌(小细胞或非小细胞)、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌(肝细胞癌)、肾癌(肾细胞癌)、头颈部肿瘤、黑素瘤、肉瘤和脑肿瘤(例如成胶质细胞瘤)。血液恶性肿瘤诸如白血病和淋巴瘤也可以是易受影响的。在优选的实施方案中，mAb与其他疗法组合(即与其一起，即，在其之前、期间或之后)施用。例如，为了治疗癌症，本发明的mAb可以与任何一种或更多种已知的化学治疗药物一起施用，例如烷化剂诸如卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、卡铂、奥沙利铂、丙卡巴肼和环磷酰胺；抗代谢物例如氟尿嘧啶、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、氨甲蝶呤和羟基脲；包括植物生物碱和抗生素的天然产物，诸如博来霉素、多柔比星、柔红霉素、伊达比星、依托泊苷、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)和Taxol(紫杉醇)或相关化合物诸如拓扑异构酶1抑制剂伊立替康；以及酪氨酸激酶的抑制剂诸如 (伊马替尼)、 (舒尼替尼)、 (索拉非尼)、
(埃罗替尼)、 (拉帕替尼)、 (吉非替尼)和 (克唑替
尼)； (西罗莫司)和其他mTOR抑制剂；和血管生成抑制剂；以及WO 2005/
017107 A2(其通过引用并入本文)中列出的所有批准的和实验性的抗癌剂。本发明的抗体可以与1种、2种、3种或更多种这些其他剂组合使用，优选地在标准化学治疗方案中组合使用。通常，其他剂是已经被认为或已知对待治疗的癌症类型有效的那些剂。

[0071] 本发明的抗-VEGF和/或抗-Ang-2 mAb可以与其一起施用以治疗癌症的其他剂包括生物制品诸如单克隆抗体，包括针对HER2抗原的或 (帕妥珠单抗)；针对VEGF的或针对表皮生长因子(EGF)受体的抗体诸如 (西妥昔
单抗)和 (帕尼单抗)，以及抗体-药物缀合物诸如KadcylaTM(ado曲妥珠单抗
(ado-trastuzumab emtansine))。针对HGF的mAb是特别优选的，以用于与抗-VEGF或抗-Ang-2 mAb一起使用，所述针对HGF的mAb包括mAbL2G7(Kim等人，Clin Cancer Res 12：
1292，2006和美国专利第7,220,410号)并且特别是其嵌合和人源化形式诸如HuL2G7(美国专利第7,632,926号)；WO 2005/017107 A2中描述的人抗-HGF mAb，特别是2.12.1；以及WO
07143090 A2或WO 07143098 A2中描述的HGF结合蛋白；以及与以上提及的任何mAb竞争结合的其他中和抗-HGF mAb。结合RON或HGF的Met受体的mAb也是优选的，例如已被基因工程化为仅具有一个“臂”(即结合结构域)的抗-cMet mAb OA-5D5(Martens等人，Clin Cancer Res 12：6144，2006)。结合FGF2的mAb诸如如美国专利第8,101,725号中公开的GAL-F2的人源化形式也是优选的。此外，抗-VEGF或抗-Ang-2 mAb可以与任何形式的手术和/或放射疗法一起使用。

[0072] 包括本发明的抗-VEGF和/或抗-Ang-2 mAb抗体的治疗(例如标准化学疗法)与相同的治疗(例如化学疗法)但不使用mAb相比，可以将患有特定类型的癌症(诸如上文列出的那些癌症)的患者的中位无进展存活或总体存活时间增加至少20％或30％或40％、但优选50％、60％至70％或甚至100％或更长；或增加(至少)2个月、3个月、4个月、6个月或12个月。
另外或可选地，包括mAb的治疗(例如标准化学疗法)与相同治疗(例如化学疗法)但不使用抗-VEGF mAb相比，可以将患者(特别是当复发时或为难治性的)的完全反应率(complete response rate)、部分反应率(partial response rate)或客观反应率(objective
response rate)(完全+部分)增加至少30％或40％、但优选50％、60％至70％或甚至100％。

[0073] 通常，在临床试验(例如II期、II/III期或III期试验)中，前述相对于接受单独的化学疗法(或加安慰剂)的患者的对照组，用化学疗法加本发明的抗-VEGF和/或抗-Ang-2 mAb治疗的患者的中位无进展或总体存活和/或反应率的增加例如在p＝0.05或0.01或甚至0.001水平是统计学显著的。还应理解的是，反应率由癌症临床试验中通常使用的客观标准确定，例如，如国家癌症研究所(the National Cancer Institute)和/或食品和药物管理局(Food and Drug Administration)所接受的，例如RECIST标准(实体瘤中的反应评估标准(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors))。

[0074] 本发明的抗-VEGF和/或抗-Ang-2 mAb也可用于治疗子宫内膜异位和炎症和自身免疫性疾病，特别是与血管生成或VEGF或Ang-2相关的疾病，包括其中已显示出VEGF的作用的炎性肠病(克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)(参见Gorlatova等人，PLoS One 6：e27269，2011和Hauser等人，Genes Immun 13：321-7，2012)、类风湿性关节炎、银屑病和肾病诸如血管球性肾炎、以及眼部疾病诸如年龄相关性黄斑变性或糖尿病相关的视网膜病。对于眼部疾病，可以被直接注射到眼部的mAb的片段诸如Fab或(Fab’)2可以是特别合适的。

[0075] 5.其他方法

[0076] 本发明的mAb还可用于诊断、预后和实验室方法。它们可以被用于测量患有肿瘤的患者的肿瘤中或循环中的VEGF或Ang-2的水平，并因此追踪并指导肿瘤的治疗。例如，与升高的或高水平的VEGF(相应的Ang-2)相关的肿瘤将特别易受用抗-VEGF(相应的抗-Ang-2)mAb治疗的影响。在特定实施方案中，mAb可以被用于ELISA或放射性免疫测定中以测量例如肿瘤活检样本中或血清中或细胞培养物中VEGF分泌细胞的培养基上清液中的VEGF或Ang-2的水平。使用结合不同表位(即不竞争结合)的两种抗-VEGF(相应的抗-Ang-2)mAb在开发检测VEGF(相应的Ang-2)的灵敏的“三明治”ELISA中特别有用。对于多种测定，mAb可以用荧光分子、自旋标记的分子、酶或放射性同位素进行标记，并且可以与进行VEGF或Ang-2的测定的所有必需试剂一起以试剂盒的形式提供。在其他用途中，抗-VEGF(相应的抗-Ang-2)mAb被用于通过亲和色谱法来纯化VEGF(相应的Ang-2)。6.实施例

[0077] 实施例1：抗-VEGF mAb的生成

[0078] 为了生成并测定结合并阻断人VEGF的活性的mAb，首先产生谷胱甘肽合成酶-VEGF融合蛋白，GST-VEGF。为了这一目的，使用标准分子生物学方法，构建编码全长人VEGF165的cDNA并将其插入到pGEX表达载体(Invitrogen)的衍生物中，并在BL21(DE3)大肠杆菌(E.coli)细胞(Novagen)中表达。通过使用谷胱甘肽-琼脂糖柱(Sigma-Aldrich)从大肠杆菌裂解物纯化GST-VEGF。通过将FLAG标签(氨基酸DYKDDDDK)连接至pCI载体(Invitrogen)的衍生物中的人VEGF165的羧基(相应的氨基)末端并在哺乳动物293F细胞中表达，产生两种其他融合蛋白VEGF-FLAG(相应的FLAG-VEGF)。使用VEGF特异性ELISA定量分泌到培养物流体中的VEGF-FLAG或FLAG-VEGF的量。对于阻断测定，将人VEGF受体2(VEGFR2)的细胞外结构域(氨基酸1至760)连接至人Igγ-1 Fc恒定区(铰链-cH2-cH3)以生成人VEGFR-Fc，其在哺乳动物细胞中产生并使用蛋白A柱纯化。购买人VEGF-121、VEGF-165、VEGF-186、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1和小鼠VEGF-A(R&D Systems)。

[0079] 将Balb/c小鼠用Ribi佐剂中的纯化的GST-VEGF在每个后足垫每周两次地免疫接种16-18次(对于第一次注射为10μg，且对于随后的注射为5μg)。最后一次加强免疫后3天，使用35％聚乙二醇，将腘淋巴结细胞与鼠骨髓瘤细胞P3X63AgU.1(ATCC CRL 1597)融合。如描述的在HAT培养基中选择杂交瘤(Chuntharapai和Kim，J Immunol 163：766，1997)。融合后10天，在如下文描述的VEGF结合ELISA、然后是VEGF/VEGFR阻断ELISA中筛选杂交瘤培养物上清液。通过针对VEGF结合以及针对VEGF/VEGFR阻断进行筛选，将选择的杂交瘤克隆两次。从13个融合物中筛选约20,000个杂交瘤后，VE1.7被选为最佳抗-VEGF抗体。本文中该抗体将被称为VE1。使用同种型分型试剂盒，VE1的同种型被确定为IgG2a，κ。

[0080] 实施例2：用于表征抗-VEGF mAb的测定

[0081] 在本专利申请中描述的每个ELISA测定的每个步骤通过与适当的试剂在室温孵育1小时进行，除了初始的板包被步骤在4℃过夜、然后用2％BSA封闭1小时进行。在每个步骤之间，将板在含有0.05％吐温20的PBS中洗涤3次。数据点通常是一式三份的；通常在一式三份的数据点之间存在很小的变化性。为了测量mAb与VEGF的直接结合，将板首先用肝素(50μg/ml)包被过夜，然后与人VEGF165(0.3μg/ml)一起孵育过夜，并随后用BSA封闭。将孔与用于筛选的杂交瘤上清液或与递增浓度的纯化的VE1 mAb或待测试的其他抗-VEGF mAb一起孵育，并且通过加入HRP-山羊抗小鼠IgG和随后的TMB底物检测结合的mAb。为了测量mAb结合溶液中的VEGF的能力(捕获测定)，将板首先用山羊抗-mIgG-Fc(2μg/ml)包被。将孔与递增浓度的纯化的VE1 mAb或待测试的其他抗-VEGF mAb一起孵育，并且随后，与VEGF-Flag(0.5μg/ml)(对于纯化的mAb)或VEGF-FLAG+FLAG-VEGF(对于杂交瘤上清液)加小鼠IgG(30μg/ml)一起孵育。通过在小鼠IgG(15μg/ml)的存在下添加HRP-抗-Flag M2(Sigma)并随后添加TMB底物来检测结合的VEGF-Flag。为了测量mAb的阻断活性，将板首先用山羊抗-hIgG-Fc(2μg/ml)包被。然后将孔与VEGFR-Fc(0.5μg/ml)一起孵育，并随后与预混有VEGF-Flag(0.5μg/m)的用于筛选的杂交瘤上清液或者递增浓度的纯化的VE1 mAb或待测试的其他抗-VEGF mAb一起孵育。通过添加HRP-抗-Flag M2并随后添加TMB底物来检测结合的VEGF-Flag。

[0082] 实施例3：VE1抗体的结合和阻断活性。

[0083] VE1结合VEGF的能力在上文描述的直接结合和捕获测定中被证明(图2A)。使用上文描述的阻断测定，比较了VE1抑制VEGF结合其受体VEGFR(VEGFR2)的能力(中和抗-VEGF mAb的关键特性)与被人源化以制造贝伐单抗的A4.6.1 mAb抑制VEGF结合其受体VEGFR(VEGFR2)的能力。如图2B中示出的，VE1完全并且以比A4.6.1明显更低的浓度抑制VEGF与VEGFR的结合。

[0084] 实施例4：人源化VE1抗体的构建和表征

[0085] VE1 mAb的轻链和重链可变区的克隆、嵌合mAb的构建和表达、以及人源化VE1 mAb的设计、构建、表达和纯化都使用标准分子生物学方法进行，例如如美国专利第7,632,926号(其出于所有目的通过引用并入本文)针对L2G7 mAb描述的。VE1的(成熟的)轻链和重链可变(V)区的氨基酸序列分别在图3A和3B的首行中示出(标注为VE1)。更具体地，为了设计人源化VE1 mAb，一般遵循Queen等人，美国专利第5,530,101号和第5,585,089号的方法。分别选择人VK序列AAS01771和VH序列AAC18292，如分别在图3A和3B的最后一行示出的，充当VE1的VL和VH序列的受体序列，因为它们与其具有特别高的框架同源性(即序列同一性)。计算机生成的VE1可变结构域的分子模型被用于定位VE1框架中与CDR足够接近以与CDR潜在地相互作用的氨基酸。为了设计人源化VE1轻链和重链可变区，来自小鼠VE1 mAb的CDR首先被概念上接枝到受体框架区中。在其中计算机模型显示与CDR密切接触(其可能是保持CDR构型所需的)的框架位置处，来自小鼠抗体的氨基酸被取代为人框架氨基酸。以此方式设计了人源化轻链和人源化重链的每一个的两种形式。对于轻链，要么不进行此类取代(HuVE1-L1)，要么在残基46和81处进行取代(HuVE1-L2)；对于重链，重链的残基46、69和71被取代(HuVE1-H1)，或者这些残基加上另外的残基2和67被取代(HuVE1-H2)，全部都指的是Kabat编号。这些人源化轻链和重链V区序列分别在图3A和3B中(中间的行，如标注的)示出，其中它们与相应的VE1供体和人受体V区对齐——CDR(如根据Kabat定义的)被加下划线并且以上列出的取代的氨基酸被加双下划线。V区序列与人κ和γ-1C区连接。通过将每一个人源化轻链与每一个人源化重链组合，产生四种不同的人源化VE1抗体，称为HuVE1#1、#2、#3和#4，如在下表中示出的，其中每条链中的取代的数目在括号中给出。此外，通过将(小鼠)VE1的V区与人κ和γ-1C区组合构建了嵌合VE1 mAb，称为ChVE1。

[0086] 表：HuVE1变体

[0087]HuVE1 轻链重链
#1 L1(0) H1(3)
#2 L1(0) H2(5)
#3 L2(2) H1(3)
#4 L2(2) H2(5)

[0088] 在如上文实施例2中描述的捕获测定(但使用山羊抗-hIgG-Fc代替用于将mAb结合至板的抗-mIgG-Fc)中比较ChVE1和四种形式的HuVE1结合VEGF的能力。使用ChVE1而不是VE1，使得全部mAb可以使用相同试剂在一次测定中被比较；预期ChVE1与VE1结合相同抗原，因为它具有相同的V区。如在图4A中观察到的，全部抗体都良好地结合VEGF，但HuVE1#3和#4以与ChVE1约相同的程度结合，而HuVE1#1和HuVE1#2的结合程度则不那么好。在上文实施例2中描述的测定中比较了ChVE1和四种形式的HuVE1阻断VEGF结合VEGFR的能力。如在图4B中观察到的，全部抗体都阻断VEGF与VEGFR的结合，但HuVE1#3和#4以与ChVE1约相同的程度抑制，而HUVE1#1和HuVE1#2的抑制程度则不那么好。这些结果示出了在HuVE1-L2中进行的两个氨基酸取代改进了包含此轻链的人源化mAb的活性，并且当提供的HuVE1-L2被用于人源化VE1的轻链时没有亲和力损失。另外的研究主要用HuVE1#4进行，其将在下文中被称为HuVE1。

[0089] 在上文使用的相同测定中比较HuVE1#3和HuVE1#4与贝伐单抗的结合(捕获)VEGF并阻断VEGF与VEGFR的结合的能力，如在图5A中(对于结合)和在图5B中(对于阻断)示出的。使用软件，根据该数据计算结合的有效浓度50％(EC50)对于贝伐单抗为0.09μg/mL，而对于HuVE1#3和HuVE1#4二者仅为0.02μg/mL。类似地，计算阻断的抑制浓度50％(IC50)对于贝伐单抗为0.34μg/mL，而对于HuVE1#3仅为0.05μg/mL且对于HuVE1#4仅为0.06μg/mL，使得在抑制VEGF结合VEGFR的关键活性中，HuVE1#3和HuVE1#4分别为贝伐单抗的约7倍和6倍更有效。

[0090] 最后，与贝伐单抗相比，确定了HuVE1(HuVE1#4)抑制VEGF诱导的人脐带血管内皮细胞(HUVEC)增殖的能力，一种用于中和mAb的活性的测定。为了进行该测定，将5,000个HUVEC铺板于96孔ELISA板的每个孔中的具有1％FCS和0.1％BSA的EBM-2培养基中并且孵育过夜，然后在含有0.1％FCS和0.1％BSA的EBM-2中孵育24小时。然后将细胞在具有20ng/mL VEGF加上递增浓度的mAb的相同培养基中孵育3天；根据制造商的说明使用WST-8确定增殖的程度。如在图6A中观察到的，HuVE1能够将增殖抑制至背景水平(无VEGF)，计算的IC50为0.057μg/mL，与贝伐单抗的0.36μg/mL相比，即，在此生物测定中，HuVE1为贝伐单抗的约6倍更有效，与上述受体阻断测定中的结果完全一致。

[0091] 我们还比较了HuVE1的活性与几种之前公开的声称具有高结合亲和力或活性的抗-VEGF mAb的活性，如通过在上文描述的测定中抑制VEGF结合VEGFR2的能力所测量的。其他mAb首先基于其公开的序列被合成：人源化兔mAb hEBV321(US 2012/0231011)、亲和力-成熟的人源化mAbY0317(EP 1 787 999)、以及人mAb B20.4.1和B20.4.1.1(US 2009/0142343)。如在图6B中观察到的，在测定中，这些mAb的任何一个的活性都比不上HuVE1，并且一些的活性明显较低。

[0092] 为了显示HuVE1特异性结合VEGF-A，将0.2μg/mL该蛋白以及VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和两种其他生长因子HGF和FGF2首先在已经用肝素(50μg/mL)包被的ELISA板上孵育。然后将孔与2μg/mL HuVE1或对照mAb贝伐单抗、HuL2G7、人源化GAL-F2抗-FGF2、或阴性对照hIgG一起孵育，然后用HRP-山羊抗人IgG和随后的TMB底物进行检测。如在图7A中观察到的，对照mAb HuL2G7和人源化GAL-F2分别仅结合HGF和FGF2，而HuVE1(和贝伐单抗)仅结合VEGF-A，高于背景水平(结合hIgG)，表明HuVE1对VEGF-A的特异性。因为(小鼠)VE1与其人源化形式以相同的方式结合，所以它必然也是VEGF-A特异性的。在以类似方式但用A4.6.1(2μg/mL)而不是肝素包被ELISA板进行的以捕获VEGF的另一项实验中，HuVE1(和贝伐单抗)结合VEGF-A的三种不同的同种型(图7B)：最短的形式VEGF121，最丰富的形式VEGF165、以及VEGF189。

[0093] 实施例5：HuVE1的表位

[0094] 为了确定HuVE1(并因此VE1)的表位，我们测量了其与在羧基端连接了人κ恒定区、然后是Flag肽的VEGF的一系列衍生物(VEGF-KF)结合的能力。为此目的，将ELISA孔用山羊抗-人-Ig-Fc(2μg/mL)包被，用2％BSA封闭、与0.1μg/mL HuVE1(HuVE1#4)或用于比较的贝伐单抗一起孵育，随后与适当形式的VEGF-KF一起孵育，并用HRP-M2-抗-Flag和底物检测。首先注意到HuVE1和贝伐单抗不结合小鼠VEGF(图8B的第二列，如标注的)。遵循本领域中广泛使用的方法，我们因此制造了人VEGF和小鼠VEGF之间的一系列嵌合分子(图8A)，并测量了HuVE1和贝伐单抗与每一个的结合。如在图8B中观察到的，这些mAb仅结合其中氨基酸区域79-104(图8A中短双箭头所示)来自人VEGF的那些嵌合VEGF，因此将该区域鉴定为包含mAb的表位，与之前对于贝伐单抗报道的一致。

[0095] 为了更准确地比较HuVE1的表位和贝伐单抗的表位，测量了这些mAb与一系列VEGF突变体的结合(图9)。某些突变诸如M81A和K84A(图9A)以及G88S或G88A(图9B)明显降低了HuVE1和贝伐单抗二者的结合，表明氨基酸位置81、84和88位于这两种mAb的表位中。然而，氨基酸诸如83和92处的突变明显降低了贝伐单抗的结合，但对HuVE1的结合几乎没有影响或没有影响。这在双重突变M83A/G92A的情况下甚至更清楚地被观察到，所述双重突变M83A/G92A基本上消除了贝伐单抗的结合，但对HuVE1的结合至多具有适度作用。我们得出结论，某些氨基酸诸如M83和G92位于贝伐单抗的表位中但不在HuVE1的表位中，所以这些mAb在VEGF上必然具有重叠但不相同的表位。

[0096] 实施例6：抗-Ang-2mAb的生成

[0097] 为了生成和测定结合并阻断人Ang-2活性的mAb，使用标准分子生物学方法构建了几种Fc-融合蛋白。出于此目的，构建编码人、鼠和鼠-人或人-鼠嵌合Ang-2的纤维蛋白原样(F)结构域(氨基酸274至496)的cDNA(分别被称为hAng-2(F)、mAng-2(F)、m/hAng-2(F)和h/mAng-2(F))，其中嵌合形式分别由连接人Ang-2的氨基酸411-496的鼠Ang-2的氨基酸274-410，或反之组成。将这些cDNA在N-末端或C-末端与人Ig γ-1 Fc区(铰链-cH2-cH3)连接(分别被称为Fc-Ang-2(F)和Ang-2(F)-Fc，具有适当的修饰物)，或者在C-末端与人κ恒定区、随后是Flag肽连接(被称为hAng-2(F)-KF等)、插入到pCI载体(Invitrogen)的衍生物中、转染并在293F哺乳动物细胞中表达。通过使用蛋白A柱(Sigma-A1drich)从293F培养物上清液纯化Fc融合蛋白。另一种融合蛋白Flag-m/hAng-2(F)通过以下产生：将FLAG标签(氨基酸DYKDDDDK)连接至pCI载体(Invitrogen)的衍生物中的鼠/人嵌合Ang-2(F)的N-末端、在293F细胞中表达并使用抗-FLAG柱纯化。另一种蛋白，肽-KLH，通过将来自hAng-2的肽(氨基酸464-483)与KLH化学缀合来制备。对于阻断测定，将人Tie-2受体的细胞外结构域(氨基酸1至760)连接至人Ig γ-1 Fc恒定区(铰链-cH2-cH3)以生成人Tie-2-Fc，其在哺乳动物细胞中产生并使用蛋白A柱纯化。

[0098] 将Balb/c雌性小鼠用Ribi佐剂中的抗原在每个后足垫每周两次地免疫接种(对于第一次注射为10μg，且对于随后的注射为5μg或如所示出的)。一组小鼠用hAng-2(F)-Fc免疫接种12次，加上最后的用Fc-hAng-2(F)的加强免疫。第二组小鼠用hAng-2(F)-Fc与mAng-2(F)-Fc交替免疫接种6次、然后用Flag-m/hAng-2(F)免疫接种3次、然后用hAng-2(F)-Fc与mAng-2(F)-Fc交替免疫接种3次、然后用肽-KLH(6μg)免疫接种2次并且最后用m/hAng-2(F)-Fc加强免疫。该最后的加强免疫后三天，如上文所描述的将腘淋巴结细胞与鼠骨髓瘤细胞P3X63AgU.1融合并在HAT培养基中选择杂交瘤。如下文所描述的，在hAng2(F)-KF捕获ELISA、然后是Ang-2Tie2阻断ELISA中初步筛选杂交瘤培养物上清液。通过针对Ang2(F)-KF结合以及针对Ang-2/Tie2阻断活性进行筛选，将选择的杂交瘤克隆两次。在从26个融合物中筛选约26,000个杂交瘤后，基于其高结合和阻断活性，从第一组小鼠中的一只小鼠的融合物中选择mAb A2B14.6(本文被称为A2B)，并从第二组小鼠中的一只小鼠的融合物中选择mAbA2T.10.2(本文被称为A2T)。使用同种型分型试剂盒，将A2B和A2T分别确定为IgG2b和IgG2a同种型。

[0099] 为了比较A2B和A2T与之前示出具有有效抗血管生成作用的其他抗-Ang-2mAb，我们基于其公开的序列合成了几种此类mAb的可变结构域基因：Ab356(上文引用的J.Oliner等人；WO 03/030833中的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)；REGN910(上文引用的C.Daly等人，REGN910在http：//www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug？cdrid＝693224的NCI药物字典中被鉴定为nesvacumab，且随后通过检索nesvacumab在http：//www.genome.jp/dbget获得序列)；MEDI-3167(上文引用的A.Buchanan等人，图1A和摘要以及正文)，以及LC06(上文引用的M.Thomas等人和S.Fenn等人，Plos One 8：e61953-e61953，2013；蛋白数据库中的4IMK)。我们还生成了人-小鼠嵌合抗体muAb356、muMEDI-3167和muREGN910，其中使用标准构建和表达方法将各个mAb的人V区连接至小鼠C区，如此，这些mAb可以在相同测定中与小鼠抗体A2B和A2T进行比较；当然，嵌合mAb预期与相应的人mAb具有相同的结合和阻断活性。

[0100] 实施例8：抗-Ang-2mAb的表征

[0101] 为了测量抗-Ang-2mAb结合Ang-2的能力，将用山羊抗-小鼠IgG-Fc(2μg/mL)包被的板与杂交瘤上清液或待测试的纯化的mAb(2μg/mL)、然后与hAng-2(F)-KF(1μg/mL)一起孵育。通过添加HRP-山羊-抗-IgG-κ(Sigma)并且然后添加TMB底物来检测结合的hAng2(F)-KF。使用适当的Ang-2(F)-KF构建体，以这种方式还测量了mAb与鼠Ang-2以及与食蟹猴Ang-2的结合。与之前公开的抗体Ab536、MEDI-3167和REGN910不同，mAb A2B和A2T二者都与人和食蟹猴Ang-2结合，但不可检测地与鼠Ang-2结合(图10A)。因为如此，A2B和A2T必然具有与这些之前的mAb不同的表位。在类似的测定中，示出了这些mAb的任何一个都不结合Ang-1。

[0102] 为了确定抗-Ang-2 mAb的表位，我们还使用ELISA测定来测量这些mAb与上文描述的嵌合m/hAng2(F)-KF和h/mAng2(F)-KF蛋白的结合能力。A2B mAb结合h/mAng-2-KF但不结合m/hAng-2-KF，而A2T mAb结合m/hAng-2-KF但不结合h/mAng-2-KF(图10B)，显示A2B和A2T具有不同表位并且A2T的表位包含于氨基酸411-496区域中。

[0103] 为了测量A2B和A2T阻断(人)Ang-2与其受体(人)Tie-2结合的能力，将ELISA板首先用山羊抗-hIgG-Fc(2μg/mL)、随后用Tie-2-Fc(0.3μg/mL)并且然后用与杂交瘤上清液或纯化的抗-Ang-2 mAb混合的50ng/mL或100ng/mL的Ang-2包被。使用0.5μg/mL的生物素化的抗-Ang-2抗体(R&DSystems)、然后添加HRP-链霉亲和素和TMB底物检测结合的Ang-2。在该测定中，A2B和A2T二者都完全抑制Ang-2与Tie-2的结合，比MEDI-3167和REGN910略有效，并且比Ab536显著更有效(图11)。

[0104] 实施例9：人源化A2T抗体的构建和表征

[0105] 如上文针对VE1所描述的，克隆A2B和A2T mAb的轻链和重链可变区并测序——A2B的序列在图12中示出。嵌合A2T mAb的构建和表达，以及人源化A2T mAb的设计、构建、表达和纯化也都使用标准分子生物学方法进行，如上文针对VE1 mAb所描述的。A2T的(成熟)轻链和重链可变(V)区的氨基酸序列分别在图13A和13B的首行中示出(标注为A2T)。分别选择人VK序列AIT39024和VH序列AIT38751，如分别在图13A和1 3B的最后一行示出的，充当A2T VL和VH序列的受体序列，因为它们与其具有高框架同源性。对于轻链，来自小鼠序列的取代在残基49处(HuA2T-L1)、或者在残基43和49处(HuA2T-L2)进行；对于重链，重链的残基28、48和49被取代(HuA2T-H1)或者这些残基加上另外的残基37和66被取代(HuA2T-H2)，全部都指的是Kabat编号。另外，构建每个重链的两种形式：要么在来自小鼠序列的位置60处(在重链CDR2中)具有T，要么在来自人受体序列的位置60处具有A，以消除根据模式N-X-S/T预测的位置58处的潜在的N-连接的糖基化位点。这些人源化的轻链和重链V区序列分别在图13A和13B中(中间的行，如标注的)示出(其中重链的位置60处具有A)，其中它们与相应的VE1供体和人受体V区对齐——CDR(如根据Kabat定义的)被加下划线并且以上列出的取代的氨基酸被加双下划线。将V区序列与人κ和γ-1C区连接。通过将每一个人源化轻链与每一个人源化重链组合，产生两组四种不同的人源化A2T抗体，在位置60处具有T的被称为HuA2T#1、#
2、#3和#4，并且在位置60处具有A的相应地被称为HuA2T#1(d)、#2(d)、#3(d)和#4(d)，如在下表中示出的，其中每条链中的取代的数目在括号中给出。此外，通过将(小鼠)VE1的V区与人κ和γ-1C区组合构建嵌合A2T mAb，称为ChA2T。

[0106] 表：HuA2T变体

[0107]HuA2T 轻链重链
#1 L1(1) H1(3)
#2 L1(1) H2(5)
#3 L2(2) H1(3)
#4 L2(2) H2(5)

[0108] 在结合和阻断测定中将在位置60处具有T的HuA2T形式与在位置60处具有A的相应形式进行比较，并且未观察到显著差异，如例如在图14A中(对于结合)和图14B中(对于阻断)所观察到的。此外，在测定中，HuA2T形式以与ChA2T相同的程度结合Ang-2(图14A)，并且实际上比ChA2T略好地阻断Ang-2与Tie-2的结合(图14B)，表明在人源化期间没有活性损失。因为由于可能的蛋白异质性和其他问题而优选在抗体V区中不进行糖基化，因此使用去糖基化(d)形式的HuA2T进行了进一步研究。全部四种mAb HuA2T#1(d)、#2(d)、#3(d)和#4(d)非常类似地结合(图15A)和阻断(图15B)，其中HuA2T#4(d)可能仅略优于其他mAb。因此，在以下的全部内容中，将HuA2T#4(d)简化地称为HuA2T。我们还示出了HuA2T在阻断Ang-2与Tie-2的结合方面的活性，与之前描述的人抗-Ang-2 mAbREGN910和LC06类似(图16A)。

[0109] 最后，我们在更具生物特性的测定中比较了HuA2T、REGN910和LC06的活性：Ang-2诱导的Tie-2磷酸化的抑制。将HEK293人胚胎肾细胞(ATCC CRL 1573)首先用表达载体中的Tie-2基因转染，如此，这些HEK293-Tie-2细胞表达全长人Tie-2受体。细胞在24孔板中在具有10％胎牛血清的DMEM培养基中生长。用不含血清的DMEM-0.1％BSA替换培养基，并将细胞孵育18小时。在多个浓度的mAb的存在下，用人重组Ang-2(R&DSystems；1μg/mL)刺激细胞持续20分钟(37℃，5％CO2)。磷酸化Tie-2的水平按照制造商的说明通过ELISA试剂盒确定(R&D Systems#DYC2720)。三种mAb类似地抑制磷酸化，HuA2T略好于LC06(图16B)。

[0110] 实施例10：双特异性HuVE1/HuA2T抗体

[0111] 使用图1中示意性示出的Bs(scFv)4-IgG形式，构建被称为B-HuA2T/HuVE1的双特异性抗体，其包含来自HuVE1抗-VEGF mAb和HuA2T抗-Ang-2 mAb的结合结构域。关于图1A中的标注，VL1和VH1分别为HuVE1-L1和HuVE1-H2(图3)，而VL2和VH2分别为HuA2T-L1和HuA2T-H2(图13)，相应的重链和轻链结构域之间的接头是(G4S)3GS，且恒定区是人IgG1，κ同种型的。为了显示双特异性B-HuA2T/HuVE1 mAb能够同时结合VEGF和Ang-2，将ELISA板用GST-VEGF(谷氨酰胺合成酶和VEGF的融合蛋白)包被，然后与递增浓度的双特异性mAb或对照mAb HuVE1一起孵育，随后与hAng-2(F)-KF一起孵育并用HRP-抗-Flag M2和TMB底物检测。在该测定中，只有能够结合板上的GST-VEGF和溶液中的Ang-2二者的分子才能给出阳性信号。对于B-HuA2T/HuVE1，情况正是如此，而对于仅可以结合VEGF的HuVE1，情况并非如此(图17A)。

[0112] 为了比较作为单独mAb的HuVE1和HuA2T的活性与其作为B-HuA2T/HuVE1的部分的活性，我们首先使用实施例2中描述的VEGF捕获测定比较HuVE1和B-HuA2T/HuVE1的结合活性。如通过EC50测量的，B-HuA2T/HuVE1的结合活性比HuVE1的结合活性仅降低约2倍，并且重要的是，仍然比贝伐单抗好得多(图17B)，贝伐单抗当然已知在人类中对癌症有效。类似地，使用实施例8中描述的结合测定，B-HuA2T/HuVE1对Ang-2的结合活性比HuA2T的结合活性降低约3倍。最后，使用实施例8中描述的阻断测定，测量B-HuA2T/HuVE1抑制VEGF结合VEGFR2的能力(图18A)以及抑制Ang-2结合Tie-2的能力(图18B)：B-HuA2T/HuVE1能够基本上完全阻断VEGF和Ang-2二者与其受体的结合，尽管活性分别比HuVE1和HuA2T低约2倍。由于HuVE1和HuA2T的结合结构域在B-HuA2T/HuVE1中呈单链形式，因此存在一些活性损失并不令人意外。

[0113] 实施例11：VE1和HuVE1抑制肿瘤异种移植物的生长的能力

[0114] 如之前所描述的用不同剂量方案进行异种移植物实验(Kim等人，Nature 362：841，1993)。将通常在完全DMEM培养基中生长的人肿瘤细胞收获在HBSS中。在雌性无胸腺裸鼠(5-6周龄)的背部用在0.1ml HBSS中的2-10x 106个细胞进行皮下注射。当肿瘤尺寸通常达到100mm3时，将小鼠随机分组并以0.1ml的体积每周两次地i.p.施用5mg/kg(总计100μg)的mAb，或者使用指示的其他剂量方案。通过测量两个维度[长度(a)和宽度(b)]每周两次确定肿瘤尺寸。肿瘤体积根据V＝ab2/2计算并表示为平均肿瘤体积±SEM。每个处理组中小鼠的数目通常是5-7只小鼠。可以例如使用学生t检验对最终数据点进行统计学分析。

[0115] 图19A示出了用VE1(5mg/kg，每周两次)处理抑制COLO 205结肠肿瘤(ATCC CCL-222)异种移植物的生长。类似地，图19B示出了以相同剂量方案用HuVE1#3的治疗以与VE1约相同的程度抑制COLO 205异种移植物的生长。为了显示HuVE1在一些模型中在抑制肿瘤异种移植物方面优于贝伐单抗，使用较低剂量的两种mAb，因为较高剂量的贝伐单抗本身高度有效。在原发性肝肿瘤模型中，其中人肿瘤在小鼠中传代并且未转化为细胞系，当mAb以
2.5mg/kg每周两次给药时，HuVE1相对于贝伐单抗存在更大效力的趋势(图20A，p＝0.1)。而当在第6天和第9天以1mg/kg给药时，贝伐单抗对RPMI 4788结肠肿瘤细胞的异种移植物无效(Roswell Park Institute，在M.Aonuma等人，Anticancer Res 19：4039-4044，1999中引用)，HuVE1部分有效(图20B，p＝0.01，HuVE1相比贝伐单抗)。

[0116] 类似地，在原发性乳腺肿瘤异种移植物模型中，当mAb以5mg/kg每周一次给药时，HuVE1相对于贝伐单抗存在更大效力的趋势(图21)。

[0117] ***

[0118] 尽管已经参照当前优选的实施方案描述了本发明，但应该理解的是，可以在不脱离本发明的情况下进行各种修改。除非从上下文中另外明显，否则本发明的任何步骤，要素，实施方案，特征或方面可以与任何其他步骤，要素，实施方案，特征或方面一起使用。为了所有目的，所有引用的出版物、专利和专利申请(包括登录号)等都通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利和专利申请被明确地和单独地指出通过引用整体并入用于所有目的一样。“本文”一词应表示本专利申请中的任何地方，而不仅仅在“本文”一词出现的章节内。如果多于一个序列在不同时间与一个登录号相关联，则截止本申请的有效申请日的与该登录号相关联的序列是预期的，有效申请日是指实际申请日或较早的披露所述登录号的优先权申请的申请日。

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