[0002] 本申请要求2012年10月19日提交的美国临时申请号61/715,992的权益，将该申请的整体内容作为参考并入本文中。
技术领域
[0003] 本
发明涉及检测
肺、胃肠道和全身感染的方法。
背景技术
[0004] 检测患者是否具有细菌感染对于为患者提供合适的
治疗来说是重要的。经常，该检测可能是困难的，因为感染
位置是在例如肺或胃肠道中。已经报道了通过测量挥发性气体的同位素标记的比率来检测细菌存在的方法，参见例如US 7,717,857。仍然需要更快地检测所述比率的方法。也仍然需要能够准确检测所述比率的便携式机器。
发明内容
[0005] 本发明提供了用于测定对象中细菌感染的存在或不存在的方法。所述方法包括给对象施用有效量的13C同位素标记的化合物，该化合物在细菌代谢后产生13CO2。所述方法还包括从对象收集至少一个呼出气样品并将该样品引导至检测设备的样品室。然后，启动检测设备的激光
光源以发射
波长对2054.37nm和2052.42nm、2054.96nm和2051.67nm、或2760.53nm和2760.08nm中的一对或多对，并将由此启动的激光引导穿过样品室中的样品，以所述波长撞击检测器。确定样品中存在的13CO2对12CO2的同位素比率，这使得能够确定关于对象的细菌感染的信息。
附图说明
[0006] 图1是用于根据本发明的一些实施方式使用的示例性激光吸收装置的平面图。
[0007] 图2示出了优选的跳跃扫描方案。
具体实施方式
[0008] 本发明涉及用于测定对象中细菌感染的存在或不存在的方法。细菌感染可位于对象的任何器官或系统(包括例如肺或胃肠道)中。可使用本文中描述的方法检测全身细菌感染。
[0009] 使用本发明的方法，可以检测能够将本发明的13C同位素标记的化合物转化为13CO2的任何细菌。这种细菌的实例包括绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鲍氏不动杆菌(Acenitobacter baumannii)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularenis)、奇异
变形杆菌(Proteus mirabilis)、曲霉(Aspergillus species)和难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)。
[0010] 本发明的方法包括给对象施用有效量的13C同位素标记的化合物，该化合物在细菌代谢后产生13CO2。这种化合物的示例性实例包括同位素标记的尿素、同位素标记的甘
氨酸、同位素标记的瓜氨酸或其混合物。其它优选的化合物包括同位素标记的酪氨酸、同位素标记的对羟基苯乙酸或其混合物。可通过任何已知的手段实现13C-同位素标记的化合物的施用。优选的施用方法包括吸入和摄入。经由注射即肌内注射、皮下注射、腹膜注射和皮内注射进行施用也在本发明的范围内。
[0011] 在本发明的范围内，可以在施用13C-同位素标记的化合物之前从对象收集一个或多个呼出气样品。这种样品在本发明的方法中可用作对照。
[0012] 在施用13C-同位素标记的化合物之后的合适时间段后，从对象收集一个或多个呼出气样品。“合适时间段”是指化合物被细菌转化为二
氧化
碳所需的时间长度。优选地，在施用后不超过40～70分钟后收集样品。
[0013] 可以将样品收集在任何适于含有呼出气样品的容器例如袋或小瓶中。也可以通过使用合适的吹口(mouthpiece)将样品直接呼入装置中。也可以通过使用鼻
插管从其它呼吸设备例如
呼吸机上的合适端口收集样品而将样品直接呼入装置中。
[0014] 对样品进行分析以确定样品中13CO2对12CO2的同位素比率。在给定时间段内或在活性
水平的测定达到预定的准确度之前，优选地对至少大多数的呼出气进行
采样，最优选地对每次的呼出气进行采样。
[0015] 将样品引导至检测设备的样品室。启动检测设备的激光光源以发射波长对2054.37nm和2052.42nm、2054.96nm和2051.67nm、或2760.53nm和2760.08nm中的一对或多对。将由此启动的激光引导穿过样品室中的样品，以所述波长撞击检测器。然后，可以确定样品中存在的13CO2对12CO2的同位素比率。
[0016] 可以生成显示受试对象的呼吸气中13CO2对12CO2的比率随时间变化的图形或曲线。显示13CO2对12CO2的比率随时间增加的曲线是存在细菌感染的证据。
[0017] 将13CO2对12CO2的浓度或量(比率)与健康对象中的13CO2对12CO2的标准浓度(比率)进行比较，方便地生成了曲线。可以直接从该曲线确定或诊断细菌感染的存在或不存在。也可以使用用于比较输出比率与从健康对象预期的比率的其它方法。
[0018] 在示例性实施方式中，可以将这些测量到的浓度拟合成曲线，然后优选通过确定曲线的上升速率进行分析。这种分析(上升速率)表明对象中细菌感染的活性水平，这可以用于诊断对象中感染的存在和程度。这一相同的方法可以在
修改后用于确定感染疗法的有效性以及对感染的抑制和/或治愈的
预后。
[0019] 检测对象中细菌感染的存在或不存在的方法是在本发明的范围内，所述方法通过如下进行：将在施用13C-同位素标记的化合物后获得的呼出气样品中的13CO2对12CO2的同位13 13 12
素比率与在施用 C-同位素标记的化合物前从对象获得的呼出气样品中的 CO2对 CO2的同位素比率进行比较。
[0020] 在本发明的范围内，相比在吸入13C-同位素标记的化合物前从对象获得的呼出气样品中的13CO2对12CO2的同位素比率，在吸入13C-同位素标记的化合物后获得的呼出气样品13 12
中的 CO2对 CO2的比率的增加表明存在细菌性肺感染。
[0021] 此外，相比在摄入13C-同位素标记的化合物前从对象获得的呼出气样品中的13CO2对12CO2的同位素比率，在摄入13C-同位素标记的化合物后获得的呼出气样品中的13CO2对12CO2的比率的增加表明存在细菌性胃肠道感染。
[0022] 另外，相比在注射13C-同位素标记的化合物前从对象获得的呼出气样品中的13CO2对12CO2的同位素比率，在注射13C-同位素标记的化合物后获得的呼出气样品中的13CO2对12CO2的比率的增加表明存在细菌性全身感染。
[0023] 用于本发明的检测设备包括样品室，呼吸气样品可以被引导到该样品室中。这些装置还包括被启动以发射波长对2054.37nm和2052.42nm、2054.96nm和2051.67nm、或2760.53nm和2760.08nm中的一对或多对的激光光源。这些装置还包括用于检测一个或多个波长对的检测器。
[0024] 用于本发明的检测设备可包括小的、功率极低的
近红外二极管激光器以获得现场可携带的、具有高精确度和灵敏度的
电池驱动的δ13CO2测量仪。这些装置和使用它们的方法可用于确定具有细菌感染或怀疑具有细菌感染的对象的呼出气样品中的δ13CO2。
[0025] 优选的检测设备在不受
温度变化的不利影响的情况下，分析呼出的二氧化碳样品中的碳同位素比率。测量二氧化碳同位素比率的准确度和
精度可被二氧化碳基态群体的变化所影响。样品中同位素差异的起源可以是多种多样的且不是本发明的主题。相反，认为确定同位素比率的值是固有重要的和商业有用的。
[0026] 光学吸收
光谱学是基于公知的比尔-朗伯定律。通过测量
激光束强度I0因所述激光束被气体样品光学吸收而造成的变化来确定气体浓度。如果使用样品池进行分析，使得束的通道长度和测量装置的固有特性是恒定的，则吸
光度测量允许计算气体数量
密度n或气体浓度。
[0027] 气相二极管激光器吸收测量探测气体分子的单个吸
收线。这些吸收线对应于气体分子例如二氧化碳通过吸收光的
光子从基能态向更高激发能态的跃迁。这些线在降低的样品气体压
力下通常是非常窄的，由此允许在其它背景气体例如水
蒸汽存在下对气体进行选择性检测。因12C和13C之间的
质量差，CO2的同位素具有相对于彼此在迁移的波长处出现的独立的吸收线。
[0028] 吸光度测量受气体温度的影响，并且这种温度敏感性的幅度随着吸收线选择和光跃迁的总基态
能量而变化。一些在室温下的分子根据分子旋转和振动的速度而分布在多个分离的总能量不同的分子能态上。即，基态分子群体根据玻尔兹曼分布而分布在分离的旋转能态和振
动能态周围。
[0029] Δδ13CO2的温度依赖性可影响基于二极管激光器的二氧化碳同位素测量的长期
稳定性和灵敏性[参考文献2-6]。具有近乎相等的基态能量的13CO2和12CO2的吸收线可用于获得相对温度不敏感性以进行同位素比率测量。
[0030] 垂直腔面发射激光器(VCSEL)已经显示获得10cm-1～15cm-1的扫描范围。它们已经用于产生坚固的、高精度现场仪器，例如由西南科学公司(Southwest Sciences,Inc)制造的激光湿度计和由南十字公司(Southern Cross Company)制造的手持式甲烷泄露检测器。因此，对于用于本发明的特定设备，可使用VCSEL，其可以以在整体试验设备背景中有用的扫描速率在整个所需的光谱波长范围中进行扫描，从而产生本发明的一些或全部的所需益-1
处。在一些实施方式中，使VCESL装置以千赫兹以上的扫描速率或在约10cm 范围内进行扫描。
[0031] 合适的激光源可由多个、通常一对激光发射体制成。这种发射体可以被制造成在波长对的优选波长之一处进行发射。用于本发明的VCSEL装置可从德国的Vertilas GmbH公司订购，还可以由激光发射体的其它来源制造。
[0032] 已经鉴定到成对的13CO2和12CO2谱线，每一对谱线对具有近乎零的基态能差，线间距小于12cm-1，而且基本上没有水干扰。现已发现这些谱线对在确定气体样品中13CO2/12CO2同位素比率中是高度有用的。使用这些谱线对进行测量的温度依赖性是理想地低的。
[0033] 在分析呼出气样品中，如下的谱线对在使用VCSEL在气体池中进行二氧化碳同位素吸收测量中是高度有用的。
[0034]12CO2波长(nm) 13CO2波长(nm)
2054.37 2052.42
2054.96 2051.67
2760.53 2760.08
[0035] 应理解，在前述谱线对中鉴定到的波长是标称的，列出的值的一些偏差可能是有用的。在这方面，应理解，有用的波长是与陈述的波长足够接近的波长，以便提供本发明的一种或多种益处。因此，这种波长提供提高的准确度、或提高的温度稳定性或本文中阐述的在CO2同位素比率测定方面的另一种所需性质。一般来讲，优选的波长在陈述的值的0.5纳米内。
[0036] 除了在所需波长处工作的激光光源外，用于本发明的设备包括用于容纳气体样品的样品容器，所述容器被构造成通过镜子的方式提供穿过样品的相对长的光通道。包括了一种或多种
信号检测器，还包括了用于控制激光器和用于收集和处理来自检测器的
输出信号的控制线路。促进样品收集、样品准备、数据解释和显示的其它装备等也可以被包括在本发明提供的系统和
试剂盒中。所有的这种部件优选是足够坚固的，以便允许将装置部署在实验室外面和甚至在手持背景中。
[0037] 本发明的设备也可用于系统或试剂盒中。系统或试剂盒的部件可包含样品收集容器例如不透气袋，优选具有注射端口、
注射器以及促进样品收集和转移至设备样品室的其它物件的不透气袋。这种样品收集元件可根据待取样的气体来源而呈现不同的构造。因此，例如当从对象的胃采集顶空气体样品时，样品收集元件可例如用于收集对象的呼吸气。
[0038] 已知便携式装置和系统具有适用于本发明的一些实施方式的元件的一般布置。例如，由南方十字公司销售的’96鹰手持式甲烷泄露检测器系统提供了样品容器、镜组件、电源、样品处理器和其它可适用于本发明的部件。然而，除此以外，这种系统不可用于这种用途。因此，必须提供二极管激光源，所述二极管激光源能够以有效的
频率、稳定性和准确度扫描需要的谱线对。同样地，需要检测器以及数据收集、存储、处理和显示或报道装置和/或
软件，所述检测器用于以需要的准确度检测所选择的谱线对中的光吸收。
[0039] 图1示出了可以与本发明一起使用的一种装置的特定方面。CO2光吸收测量装置被描述为100，其包含二极管激光源、镜114和气体样品室104。这些合起来与未显示的在样品室内部的优选反射面一起形成了光通道。该光通道实际上比室的物理长度长许多倍，这允许提高室中的气体样品对激光的吸收。方便地包括了一个或多个气体
泵112，以将气体样品输送入和输送出样品室，所述样品室可同样地设置有一个或多个压力计。优选地，也将参照气体室106与用于引导激光穿过参照气体室106的镜114一起使用。穿过样品室和参照室的光通道被引导至一个或多个检测器108以评价激光的强度。控
制模块中的处理器110通过与参照室中的参照样品进行参比，确定入射激光被样品室中的样品吸收的量。可通过装置机载的或装置外部的
固件的常规软件进行确定。优选地，提供电连接116以使信号或处理过的数据从装置输出到外部显示器或数据收集和处理装置。根据特定的优选实施方案，构成本发明设备和系统的一些或全部元件以及它们所执行的功能是在
控制器的控制下进行的。这种控制器可以机载在仪器上或在仪器外，可以是多用数字计算装置或者专用数字或数字模拟装置。控制器的控制可以为诸如对激光器、检测器、气体样品泵、处理器和其它部件的电源进行控制。
[0040] 在工作中，将怀疑含有二氧化碳的气体样品放置在本发明装置的气体室中。然后，使激光光源穿过样品室，优选经由循环的通路穿过样品室以增加整体通道长度并提高测量灵敏度。然后，将光源引导至一个或多个
传感器，解释传感器读数以产生样品吸收波长的值。用于进行这一测定的方法在本领域是已知的，并且包括例如直接吸收
光谱学、波长调制光谱学、腔衰荡光谱学和其它可选方法。通过比较具有各个所选择的波长对的光的吸收，二氧化碳样品中碳12和碳13同位素的值变为已知。必然地可以计算它们的比率。对于本发明的一些优选实施方式来说，提供了参照气体样品，并对该参照气体样品进行照射、检测和信号解释。由此得到的数据被用于使产生自样品室的照射的数据标准化。
[0041] 设备的机械学包括向激光光源、检测器以及任何数据存储、显示和处理元件供应电力，其优选地在数字控制器或模拟控制器的控制之下。也可以使用数字计算机或者可以另外使用数字计算机。这种计算机可以是机载的或通过控制界面进行连接。
[0042] 优选通过波长调制光谱学(WMS)实现根据本发明的光吸收的测定。尽管WMS以前已经用于δ13CO2测量[17]，但是其从来未用于谱线对，所述谱线对现在已经被确定用于二氧化碳中同位素比率的测定。
[0043] 尽管根据需要可使用直接测量，但与直接吸收光谱学相比，在本发明中优选使用WMS。对于直接吸光度测量来说，激光器
电流逐渐增加以致波长输出在气体吸收线上被重复扫描并且生成的光谱是共平均的。直接吸收光谱的分析包括检测大的检测器信号上的小的变化。对于非常低的浓度变化来说，这是有问题的。为了进行WMS，将小的高频正玄调制
叠加在二极管激光器电流斜坡上。这一电流调制产生在相同高频处的激光波长的调制。目标气体的吸收将波长调制转换为入射在检测器上的激光强度的幅度调制，向检测器光电流添加了AC分量。检测器光电流在二倍调制频率2f检测下进行解调。这仅选择性地放大了AC分量(零背景测量)并且将测量从近DC迁移至其中激光噪声降低的更高频率。通过在高得足以避免激光输出功率的
波动的频率(>10kHz)处进行信号检测，极大地降低了光谱噪声，激光过剩(1/f)噪声。在仔细优化的实验室设置中，WMS测定到低至1×10-7的吸光度，其接近检测器噪声极限。然而，在紧凑的现场仪器中，背景假象通常将可检测的最小吸光度α最小限制至1×10-5s-1/2。α最小的值可通过在100秒～300秒的时期内，用改进缩放t1/2对2f信号进行更长时间的求平均来改进。
[0044] 本文中描述的产生气体样品中相对温度不敏感的δ13CO2同位素比率测定的13CO212
和 CO2吸收线对被无需测量的若干吸收线所隔开。不是在每一对中的两个目的峰之间连续扫描激光波长，而是使
电子以跳跃扫描方式运行激光器。这在图2中示出。激光器电流扫描被编程为具有迅速改变波长的不连续性。优选地不使用跳跃后最开始的一些数据点，因为在电流跳跃后激光波长可能不会立刻稳定。本发明中使用的VCSEL即使用四个电流跳跃也可以以这种方式运行，以便同时测量五个不同的吸收线而不会有过度的灵敏度降低。
[0045] 用于口服施用或吸入施用即肺施用的组合物如另外在本文中描述的。口服组合物包括粉剂或颗粒剂、在水或非水性介质中的混悬液或溶液、袋剂、胶囊剂或片剂。可能需要
增稠剂、稀释剂、
调味剂、分散助剂、乳化剂或粘结剂。用于肺施用的组合物包括药用可接受的载体、添加剂或赋形剂、以及推进剂和任选地促进对对象进行肺递送的
溶剂和/或分散剂。
[0046] 可根据本领域已知的方法制备注射用无菌组合物。
[0047] 尽管本发明已经参照多个实施方式和可选实施方式进行了阐述，但是本
说明书不应视为限制性的。本发明仅由其
权利要求书所估量。
[0048] 参考文献
[0049] 1.Bell,G.D.等,14C-urea breath analysis,a non-invasive test for Campylobacter pylori in the stomach(14C尿素呼吸分析，胃中幽
门螺旋菌的无创性试验).Lancet,1987.1:p.1367-1368.
[0050] 2.Chelboun,J.和P.Kocna,Isotope selective nondispersive infrared spectrometry can compete with isotope ratio mass spectrometry in cumulative 13CO2breath tests:assessment of accuracy(在累积性13CO2呼吸试验中同位素选择性非色散红外光谱法能与同位素比值质谱法相当：准确度的评估).Kin.Biochem.Metab.,
2005.13(34):p.92-97.
[0051] 3.Castrillo,A.等,Measuring the 13C/12C isotope ratio in atmospheric CO2by means of laser absorption spectrometry:a new perspective based on a 2.05-μm diode laser(借助激光吸收光谱法测定大气CO2中的13C/12C同位素比率：基于
2.05-μm二极管激光器的新观点).Isotopes in Environmental and Health Studies,
2006.42(1):p.47-56.
[0052] 4.Gagliardi,G.等,High-precision determination of the13CO2/12CO2isotope ratio using a portable 2.008-μm diode-laser spectrometer(使用便携式2.008-μm二极管激光器光谱仪的13CO2/12CO2同位素比率的高精度测定).Appl.Phys.B,2003.77:p.119-124.
[0053] 5.Horner,G.等,Isotope selective analysis of CO2with tunable diode laser(TDL)spectroscopy in the NIR(在NIR中用可调谐二极管激光器(TDL)光谱法对CO2进行同位素选择性分析).Analyst,2004.129:p.772-778.
[0054] 6.Wahl,E.H.等,Applications of cavity ring-down spectroscopy to high precision isotope ratio measurement of 13C 12C in carbon dioxide(腔衰荡光谱法在二氧化碳中的13C、12C的高精度同位素比率测量中的应用).Isotopes in Environmental and Health Studies,2006.42:p.21-35.
[0055] 7.Hovde,D.C.等.Trace Gas Detection Using Vertical Cavity Surface Emitting Lasers(使用垂直腔面发射激光器的痕量气体检测).在Optical Remote Sensing for Environmental and Process Monitoring(用于环境和过程监控的光学远程检测)中.1995.San Francisco,CA.
[0057] 9.美国专利5,929,442
