技术领域
[0001] 本
发明是
生物材料的制备和应用,具体是由苯二胺与叶酸为原料制备碳量子点,是材料学技术、
荧光技术及
热疗技术的交叉应用。
背景技术
[0002] 光热
治疗(Photothermal therapy,PTT)是近年来快速发展的一种微创
肿瘤治疗技术,其原理在于通过将光能直接照射到肿瘤部位而使肿瘤组织局部
温度升高以抑制甚至杀伤肿瘤细胞,这种治疗方法能够明显地避免耐药性和降低严重的全身
副作用,因此光热治疗被看作是具有极大潜
力的新型治疗肿瘤的技术之一[1]。为了使PPT能够有效地对肿瘤细胞产生作用,需要提高激光诱导的 PTT 的效率以及肿瘤的选择性,对所使用的制剂需要符合以下几点:(1)纳米尺度大小,使具有光吸收性能的光热治疗剂能够进入肿瘤部位;(2)由于
生物组织内
水和
蛋白质对
近红外光的吸收较弱[2],理想的光热治疗剂在近红外光区域(650 950 nm)应具有较强的吸收;(3)良好的
生物相容性,利于人体代谢;(4)表面可以连~接上功能基团实现肿瘤的主动靶向吞噬[3];(5)成功的 PTT 需要依赖合适的成像技术来确定肿瘤的
位置、大小及光热治疗剂在体内的分布及在肿瘤组织的富集情况;其次需要实时监测 PTT 过程中肿瘤及周围健康组织温度的变化;最后借助于成像技术来进行治疗效果的评价。因此赋予光热治疗剂合适的成像功能成为近来研究的热点。
[0003] 在诸多光热治疗剂当中,碳量子点作为一种新兴材料,收到了广泛的关注。碳量子点材料由于其具有尺寸相关荧光性质及热疗作用,具有很大的潜力应用于纳米荧光材料领域。碳量子点的传统合成方法可分为
自上而下合成法和
自下而上合成法两大类,自上而下法包括激光销蚀法[4]、电化学法[5]、弧光放电法等;自下而上合成法包括化学
氧化法[6]、模板法[7]、
微波法[8]和
热分解法[9]等。利用
石墨烯水热法制备量子点,可用于肿瘤细胞的光热治疗[10]。Wang等人制备了量子点
纳米胶囊,成功实现了对于肿瘤细胞的光热治疗[11]。碳量子点还可以与碳管复合以实现肿瘤细胞的光热治疗[12]。
[0004] 本发明解决的技术问题是肿瘤细胞光热疗法诊疗碳量子点的合成制备问题,提供一种具有光学
稳定性好、生物相容性高、具有良好热疗效果和荧光造影能力的量子点的制备方法, 同时工艺简单、材料转化率高、易重复的优点。
发明内容
[0005] 本发明目的在于克服
现有技术的不足,公开了一种由苯二胺与叶酸得到的碳量子点制备方法;通过苯二胺与叶酸复合制备得到的碳点,具有上转换特性,在对癌症细胞具有荧光诊断的同时也具有热疗作用。该探针相较于其他方法具备诊疗一体的功效,可用于肿瘤治疗、生物分子检测及细胞成像等领域。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种苯二胺与叶酸得到的碳量子点的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)水热制备量子点溶液;
(2)
硅胶柱分离量子点得溶液I;将不同苯二胺-叶酸碳量子点
乙醇溶液置于旋蒸仪器中,于45摄氏度旋蒸至乙醇及水完全挥发,得到苯二胺碳量子点粗产,向得到的油状粘稠液体中加入层析溶液,搅拌至油状液体均匀分散在层析
溶剂之中,将所得溶液缓慢转移入硅胶层析柱之中,静置等待碳量子点粗产由于溶液极性逐渐分层,通过紫外光检测确定碳点层所在位置,并采集碳点溶液;
(3)旋蒸得到量子点;待采集完毕后,将所得到的碳量子点有机溶液通过旋蒸的方法去除其中的层析
有机溶剂;
(4)配置溶液,过滤冻干得到固体II,随后向所得固体产物中加入1%的乙醇溶液,通过过滤方法去除其中不容物,将所得溶液
冷冻干燥,得到最后所需的苯二胺-叶酸碳量子点。
[0007] 在苯二胺溶液中加入叶酸,至叶酸的终浓度为0.1~1mg,混合溶液中苯二胺与叶酸的
质量比约为10:1;室温下轻微震荡,随后在180℃水热反应12h。
[0008] 待采集完毕后,将所得到的碳量子点有机溶液通过60℃旋蒸的方法去除其中的层析有机溶剂。
[0009] 一种按照上述所述的方法制备得到的碳量子点,所述量子点粒径为5~15nm。
[0010] 本发明提供的碳量子点的光热治疗效果通过检测在单位时间内PBS溶液的升温效率来检验,在5分钟内,制备得到的碳量子点温度可达到55℃,符合光热治疗的要求,可用于肿瘤的光热治疗。
[0011] 本发明有如下优势:叶酸的存在使得反应能够更加完全,提高了
能源的利用效率,得到了更高的碳量子点产率。
[0012] 该方法使用苯二胺及叶酸为碳量子点原料,原料简单易得,以水热法为高温碳化方法制备肿瘤细胞光热疗法诊疗碳量子点,操作简单,易于商业化。
[0013] 该碳点的生物相容性良好,在体内使用的安全性好,可以应用于细胞及组织荧光成像及光热治疗。
附图说明
[0015] 图2为实施例制备所得碳量子点的TEM照片。
[0016] 图3为实施例所得碳量子的升温曲线。
[0017] 图4为碳量子点显影所得的HEK293人胚肾细胞、U87mg脑胶质瘤细胞激光共聚焦照片。
[0018] 图5为碳量子点的HEK293人胚肾细胞及U87mg脑胶质瘤细胞毒性曲线。
具体实施方式
[0019] 苯二胺-叶酸碳点的制备过程如图1所示,以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明,而不限制本发明的范围。附图1为实施例的制备方法流程。
[0020] 实施例1:将邻苯二胺0.1g溶于10ml乙醇中避光于常温下搅拌,直至苯二胺固体全部溶解,得到均匀的溶液;将0.1g叶酸溶于10ml纯水中,于室温下搅拌,直至叶酸完全溶解,将苯二胺溶液及叶
酸溶液混合,置于100ml四氟乙烯反应釜中置于180摄氏度烘箱中放置12个小时。冷却至室温后,将所得溶液于45℃旋蒸,向得到的油状液体中加入甲醇与二氯甲烷的混合溶剂搅拌均匀,将所得到的溶液缓慢滴加入硅胶柱中静置分离,通过紫外灯确定所得到的碳点位置,收集所得到的碳点溶液,将得到的碳点溶液再次旋蒸,去除其中的有机溶剂后,加入无水乙醇,即得到苯二胺-叶酸碳量子点乙醇溶液。测得荧光产率为17.2%。附图2为实施例制备所得碳量子点的TEM照片,制备的碳量子点弥散分布,尺寸大小在5-10nm范围。附图3为实施例所得碳量子的升温曲线。
[0021] 实施例2:将间苯二胺0.1g溶于10ml乙醇中避光于常温下搅拌,直至苯二胺固体全部溶解,得到均匀的溶液;将0.1g叶酸溶于10ml纯水中,于室温下搅拌,直至叶酸完全溶解,将苯二胺溶液及叶酸溶液混合,置于100ml四氟乙烯反应釜中置于200摄氏度烘箱中放置12个小时。冷却至室温后,将所得溶液于45℃旋蒸,向得到的油状液体中加入甲醇与二氯甲烷的混合溶剂搅拌均匀,将所得到的溶液缓慢滴加入硅胶柱中静置分离,通过紫外灯确定所得到的碳点位置,收集所得到的碳点溶液,将得到的碳点溶液再次旋蒸,去除其中的有机溶剂后,加入无水乙醇,即得到苯二胺-叶酸碳量子点乙醇溶液。
[0022] 实施例3:将对苯二胺0.1g溶于10ml乙醇中避光于常温下搅拌,直至苯二胺固体全部溶解,得到均匀的溶液;将0.1g叶酸溶于10ml纯水中,于室温下搅拌,直至叶酸完全溶解,将苯二胺溶液及叶酸溶液混合,置于100ml四氟乙烯反应釜中置于220摄氏度烘箱中放置12个小时。冷却至室温后,将所得溶液于45℃旋蒸,向得到的油状液体中加入甲醇与二氯甲烷的混合溶剂搅拌均匀,将所得到的溶液缓慢滴加入硅胶柱中静置分离,通过紫外灯确定所得到的碳点位置,收集所得到的碳点溶液,将得到的碳点溶液再次旋蒸,去除其中的有机溶剂后,加入无水乙醇,即得到苯二胺-叶酸碳量子点乙醇溶液。
[0023] 实施例4:将邻苯二胺0.1g溶于10ml乙醇中避光于常温下搅拌,直至苯二胺固体全部溶解,得到均匀的溶液;将0.1g叶酸溶于10ml纯水中,于室温下搅拌,直至叶酸完全溶解,将苯二胺溶液及叶酸溶液混合,置于100ml四氟乙烯反应釜中置于160摄氏度烘箱中放置12个小时。冷却至室温后,将所得溶液于45℃旋蒸,向得到的油状液体中加入甲醇与二氯甲烷的混合溶剂搅拌均匀,将所得到的溶液缓慢滴加入硅胶柱中静置分离,通过紫外灯确定所得到的碳点位置,收集所得到的碳点溶液,将得到的碳点溶液再次旋蒸,去除其中的有机溶剂后,加入无水乙醇,即得到苯二胺-叶酸碳量子点乙醇溶液。测得荧光产率为15.2%。制备的碳量子点弥散分布,尺寸大小在5-10nm范围。
[0024] 实施例5:将间苯二胺0.1g溶于10ml乙醇中避光于常温下搅拌,直至苯二胺固体全部溶解,得到均匀的溶液;将0.1g叶酸溶于10ml纯水中,于室温下搅拌,直至叶酸完全溶解,将苯二胺溶液及叶酸溶液混合,置于100ml四氟乙烯反应釜中置于180摄氏度烘箱中放置12个小时。冷却至室温后,将所得溶液于45℃旋蒸,向得到的油状液体中加入甲醇与二氯甲烷的混合溶剂搅拌均匀,将所得到的溶液缓慢滴加入硅胶柱中静置分离,通过紫外灯确定所得到的碳点位置,收集所得到的碳点溶液,将得到的碳点溶液再次旋蒸,去除其中的有机溶剂后,加入无水乙醇,即得到苯二胺-叶酸碳量子点乙醇溶液。
[0025] 实施例6:将对苯二胺0.1g溶于10ml乙醇中避光于常温下搅拌,直至苯二胺固体全部溶解,得到均匀的溶液;将0.1g叶酸溶于10ml纯水中,于室温下搅拌,直至叶酸完全溶解,将苯二胺溶液及叶酸溶液混合,置于100ml四氟乙烯反应釜中置于1700摄氏度烘箱中放置12个小时。冷却至室温后,将所得溶液于45℃旋蒸,向得到的油状液体中加入甲醇与二氯甲烷的混合溶剂搅拌均匀,将所得到的溶液缓慢滴加入硅胶柱中静置分离,通过紫外灯确定所得到的碳点位置,收集所得到的碳点溶液,将得到的碳点溶液再次旋蒸,去除其中的有机溶剂后,加入无水乙醇,即得到苯二胺-叶酸碳量子点乙醇溶液。
[0026] 碳量子点
纳米粒子的光热疗效果考察:将实施例1至6中制得的碳量子点置于分光皿中,用980nm近红外光照射,如附图3所示。可以看出苯二胺-叶酸碳量子均可以升温至55度以上;细胞对于碳量子点纳米粒子吞噬的显影观察:
将HEK293人胚肾细胞和U87mg脑胶质瘤细胞,以2×104个细胞/ 孔的浓度接种于平底四分皿中( 每孔100μL 培基),加入10μL 不同浓度的碳量子点材料混合入血清培基中在37℃、5%的CO2条件下孵育2小时;共孵育后加入多聚甲
醛进行细胞固定;附图4为碳量子点显影所得的HEK293人胚肾细胞、U87mg脑胶质瘤细胞激光共聚焦照片。
[0027] 碳量子点细胞毒性的评价:参照实施例1-6的步骤制备碳量子点。为考察其生物相容性,分别选取HEK293人胚肾细胞和U87mg脑胶质瘤细胞,以2×104个细胞/ 孔的浓度接种于96 孔细胞培养板内( 每孔100μL 培基),加入10μL 不同浓度的药物材料,在无血清培基中37℃、5%的CO2条件下孵育32小时;共孵育后75μL 无血清培养基溶液去除,补充含10%血清的新鲜培基至100μL,继续培养4h ;10μL Cell Counting Kit 单溶液
细胞增殖检测
试剂盒加入每孔,孵育4h ;直接在酶标仪490nm 处读数据,计算出细胞在不同浓度作用下的存活率。由图5可见,碳量子点在10 ~ 50mg/mL 的浓度范围内HEK293人胚肾细胞和U87mg脑胶质瘤细胞的影响。随着碳量子浓度增大,细胞的存活率略呈下降趋势, 32小时后HEK293人胚肾细胞和U87mg脑胶质瘤细胞存活率为86.8%和94.7%。附图5为碳量子点的HEK293人胚肾细胞及U87mg脑胶质瘤细胞毒性曲线。