本发明涉及一种在光动力疗法中有用的含有对肿瘤选择性的卟啉 化合物的冻干组合物。更具体地说，本发明涉及一种含有如已知的P HOTOFRIMII的聚血卟啉醚/酯制剂的冻干的组合及其冻干 制剂的生产方法。

采用卟啉及有关化合物的光动力疗法，若干年代已在此领域为人 们所熟知。早在本世纪四十年代，人们就已知卟啉在肿瘤组织中具有 发萤光的能力。卟啉看来能定位在肿瘤组织之中，在哪里被照光时， 它们能吸收一定波长的光线，从而提供了一种通过荧光的定位而探测 肿瘤的手段。因此，含有此类卟啉的制剂，对于诊断和检查这种肿瘤 组织是很有用的。而且，当以适当波长光照射时，此卟啉化合物还可 能破坏肿瘤组织，这可能是通过单氧(Singlet Oxygen)的生成。 (Weishaupt，K.R.，et al.，Cancer Research(1976)pp. 2326-2329)。

在对肿瘤进行全身性的治疗时，这些吸收光线的化合物，尤其是 与卟啉相关的化合物已广泛被用作为肿瘤治疗的一个方面。这些化合 物的实用性是取决于它们在瘤组织中的定位能力，而这种组织与周围 的正常组织界限分明(参见Dougherty，T.J.et al.，“Cancer： Prineiples and Practice of Oncology”(1982). V.T.de Vita，Jr.et al.，eds.，pp.(1836-1844)。  

除了全身性地用于肿瘤治疗之外，更多的新的出版物详述了卟啉 化合物的另一些用途。例如，美国专利第4,753,958号叙述了在治疗 皮肤病中的卟啉的用途。美国专利4,727,027号揭示了，用对光敏感 的化合物对含有诸如细菌和病毒的传染性有机体的生物样本进行灭菌 处理方法，其中，光敏剂有呋喃香豆素(farocumarin)及其衍生物。 如美国专利4,512,762号和4,574,682号所述，光敏卟啉对检查和治 疗动脉粥样硬化斑是很有用的。此外，美国专利4,500,507号和 4,485,806号中还描述了采用放射性示踪的卟啉化合物用于肿瘤成像。

一种被广泛应用于早期阶段的肿瘤检查和治疗的光动力疗法的光 敏制剂是一种血卟啉的粗制衍生物，也叫血卟啉衍生物Hp D或如 Lipson等人在J.Natl.Cancer Inst(1962)26：1-8中所述制 备的Lipson衍生物。采用这种制剂已进行了大量的研究，同时采用 这种衍生物治疗恶性肿瘤也已作了广泛地报道(Cancer Res. (1978)38：2628-2635；J.Natl. Cancer Inst.(1979)62： 231-237)。

Dougherty和他的合作者制备了一个更有效形式的血卟啉衍生物， 它是通过HpD的超滤作用以减低分子量分子的含量而制得。这项工 作是美国专利4,649,151号的主题，我们特此通过参考形式引入本发 明。本发明进一步详细描述了采用那些所描述的组合物，以光疗治疗 患者的方法。这种形式的药物实际上是一种由醚键(Doughterty，T. J.et al.，Adv，Exp.Med.Biol.(1983)160：3-13)和酯键 (Kessel，D.et al.，Photochem.Photobiol.(1987)36：463- 568)连接的卟啉单位的复杂混合物。这个复杂混和物，此处称为聚血 卟啉醚/酯( “PHE”)，已在商标名称PHOTOFRINII下上 市，它是本发明的主题。

目前，所提供的PHE是在正常的生理盐水中含有PHE的 2.5mg/ml或5mg/ml的溶液中，这种PHE受热时迅速降介，因而在室 温下相对来说是不稳定的。从而，此溶液必须保持冷冻状态以维持其 效力。而且，在较高温度下，此溶液倾向于显示出大量粒子形成，除 非被保持在冷冻并在使用之前随时溶解，这种较高的温度使此溶液变 得不适于用作注射制剂。

然而，此种冷冻溶液的应用有许多缺点。因为，此冷冻液必须被 保持冷冻状态，并必须以冷冻状态才能被装运和储存，因而需要一个 特殊的冷冻条件。例如，此产品必须放在使用诸如干冰之类物作为冷 冻剂的特殊的容器里被装运，这是一主要的缺点，它增加了使用此产 品的成本和后勤工作量。在使用温度上，冷冻的溶液须被贮存于-20 ℃，而此温度低于某些冷藏箱的操作温度，因而需要一个特殊的致冷 设备。另外，此冷冻产品必须经过一个溶解阶段，因而不可能立即用 于患者。

这样，人们就需要一个PHE的配方，它在室温下可长期保持稳 定，无须保持冷冻，从而无须特殊的运输和贮藏的条件。

该领域技术人员知道，冻干一个在水溶液中相对不稳定的制品将 能得到一个稳定的，因而其货架寿命比水溶液更长的制品。从而，一 个冻干制品的优点超过粉状产品，因为它在注射服用之前可迅速溶解， 并容易于重新构成。冻干在水溶液中不稳定的制品的又一个优点是， 它能够以液态被加工并被灌入剂量容器内，在低温下干燥，从而消除 不利的热效应，并可在干燥状态(在那里可能更稳定的)被储存。 (见Remirgtio’s Pharmaceutical Seiences，Isfh edition.， pp.1483-1485(1975)。因此，冻干法将是一种取得在室温下具有所 需要的稳定性，因而无须冷冻保藏的PHE配方的理想方法。

Weinstein等人在美国专利第4,753,958号中揭示了一个治疗牛 皮癣和其它皮肤疾病所用的血卟啉衍生物的典型配方，它是通过由冻 干PHE的5mg/ml盐水溶液，并在一个适当的典型载体中重新构成而 制备的。

尽管冷冻干燥此冷冻PHE盐水溶液可能对制取适用于典型应用 的制品是有用的，本发明者发现，在冷冻干燥此盐水溶液时会遇到一 些问题。这些问题使配方很困难，所得的产品难于接受为注射用。当 试图冷冻干燥一种含有15mg/ml PHE和5.4％氯化钠的浓缩盐水溶液 时(此氯化钠数量需要在与水重构成产生一种等渗溶液，用于注射用 的2.5mg/ml PHE溶液)，会发生PHE活性组分的部分沉淀(盐析)。 另外，作为沉淀的结果，浓缩物的过滤极为困难，需要经常调换过滤 器。同样，一些活性组分在过滤器上被除去。这样，此冻干制品是不 同质的，它包括了分离的氯化钠和PHE相。这两个相可能由于差速 结晶作用而在冷冻过程之中产生分离。

再者，一种包含2.5mg/ml PHE的盐水溶液可被冷冻干燥，而此 冷冻干燥过程将相当长，因为有较多的水要除去，且，由于溶液中存 在氯化钠，同样会遇到过滤和沉淀中的问题。

因而，很明显，这里需要提供一个在室温下长期很稳定，从而无 须冷冻的PHE配方，但它能够克服冻干此盐水溶液所伴随的问题。

本发明的目的之一是提供一种配制在水溶液中相对不稳定的PH E的方法，以致生产出一种在室温下可长期稳定的产品。

本发明的另一目的是，提供一种PHE制剂，它是同质的，且适 用于注射。

本发明的再一目的是，提供一个冷冻干燥PHE溶液的方法，它 可以避免在冷冻干燥PHE盐水溶液中所伴随的问题。

由以下实施例可见，本发明的这些和其他目的和优点，对于此领 域技术人员将是显而易见的。

本发明在于发现了一个PHE光敏剂组合物，它在室温下是长期 稳定的，并可以通过冷冻干燥法获得。本发明还基于下列的发现：与 冷冻干燥PHE盐水溶液相关的问题可由以下措施避免：即从此溶液 中除去氯化钠和从此水溶液中冷冻干燥PHE，然后与非盐水稀释液 如5％葡萄糖注射液重新组合。

人们惊奇地发现，一个可在室温下长期稳定的聚血卟啉醚/酯制 剂，可以通过从一种非盐水溶液中冷冻干燥此光敏剂和与一种非盐稀 释液重组冷冻干燥制品而配方制得。本发明提供了一种制备冷冻干燥 PHE的方法，由于其起始量较小而可快速完成，并避免了PHE成 分的沉淀，最终导致产生一种物质的制品。

本发明的PHE活性组分及其制备方法的详细描述可见于上述美 国专利4,649,151号。

根据本发明，冷冻干燥的PHE制剂是从一种在水中含约15 mg/ml的PHE的浓缩物制得。这个浓缩物然后经过冷冻干燥处理， 所得到的产品适于储存和运输。此冷冻干燥制品在使用前，与足够的 非盐稀释液，如5％的葡萄糖注射液重新组合，以提供一2.5mg/ml等渗 溶液，用于患者的诊断与治疗。

在本发明的一个最佳实施例中，约5ml的约15mg/ml的PHE浓 缩物，被放于适于冷冻干燥的管形瓶之中。这样，每个管形瓶带有每 瓶有75mg聚血卟啉醚/酯标签。接着每个5ml管形瓶被放进一个冷冻 干燥室冷冻足够的时间，至使产品温度保持-35℃或更低，以完成此 制品的冷冻。然后，此制品放在一升高的棚架温度下冷冻干燥，直至 获得一种具有令人满意的含水量的制品，随之冷冻干燥室恢复到正常 气压，然后对管形瓶进行密封。由于初始装瓶量很小(5ml)此制品通 常在24小时内被迅速冷冻干燥。与冷冻干燥大量的稀释溶液来说，这 就大大地降低了成本。这利所得到的制品可在室温下保存6个月以上 而不会产生任何效力的降低。在用于给患者治疗前，此冷冻干燥制品 用30ml 5％的葡萄糖注射液重新组合，以提供一种25mg/ml等渗溶液。

用于重组冷冻干燥制品的稀释液最好是5％葡萄糖注射液，但其他 非盐稀释液，如用于注射的消毒水也可应用。

此冷冻干燥制品与通常的盐水重组并用0.2μm的滤器过滤时， 在光学显微镜下可观察到大量的无益的微粒。当此制品与葡萄糖注射 液重组时，也观察不到有明显的粒子形成。因而，人们希望应用一种 非盐稀释液。

在本发明的此制品的形成中，可以期望包括其他的组分。按照需 要，这些组分可能包括有，影响溶液pH值的缓冲剂，湿润剂或乳化 剂，抗菌剂或防腐剂。非电介的填充剂，如甘露糖醇或葡萄糖也可包 括在内并被用于改善冷冻干燥饼状制品的特性。根据前面的详细说明， 对上述的组分连同其他合适的载体进行各种改进对于此领域的技术人 员来说是能够联想到的。所有这样的明显改进都是属于附属权利要求 的范围之内。

以下的实施例子显示出此冷冻干燥制剂和与现用的冷冻溶液作了 比较。这些例子并不被解释为对本发明权利要求中所述的范围的限定。

实施例1

按照Dougherty在美国专利4,649,151号中所描述方法，可以制 备一种含约15mg/ml聚血卟啉醚/酯的浓缩的PHE水溶液。对此浓 缩液冷冻保存，并在冷冻干燥前以3℃(±2℃)的冷水浴使其缓慢 溶解。然后对此溶解的浓缩液进行称量、并倒进一个已称出皮重的避 免光照的玻璃混合容器。然后对这种溶液进行混合直至均质。

一旦获得均质的混合液，如有必要，可测出溶解的批量浓缩物的 pH值，并以5％的盐酸或5％的氢氧化钠水溶液将其pH值调节至pH 7.2-7.8。然后，此浓缩液用二阶段过滤法进行灭菌过滤，这二阶 段过滤法包括一个0.45μm的聚偏二氟乙烯预滤器，随后用一个 0.2μm的同样型号的灭菌过滤器。

在浓缩液的过滤完成之后，按瓶签每瓶75mg的量，装入30ml的管 形瓶中。然后，这些管形瓶被放入冷冻干燥室。对此灭菌浓缩液冷冻 至少2小时使产品温度为-35℃或更低。然后，在棚架温度为+35℃ 下被冷冻干燥，直至此制品温度达+20℃-+25℃，此温度保持5小 时。然后，以脱水氮排气使冷冻干燥恢复至大气压温度，对管形瓶加 上盖子，并从冷冻干燥室取出封口。

在给患者作光动力疗法之前，管形瓶内容物与30ml的5％葡萄糖重 组，以备注射用。

实施例2

在Karl Fischer测定法中所测定含水量小于1％的冷冻干燥PH E是根据实施例1的方法，并再加上一个步骤制得的，即，在此制品 保持在+20℃-25℃5小时后，再提高此制品温度到33℃-37℃，并 保持制品在此温度6-10小时。然后，此冷冻干燥室如实施例1所述 恢复到大气压，接着对管形瓶加上塞子并密封。

实施例3

按照实施例1方法制备冷冻干燥PHE。然后在一个变化的温度 和时间间隔下，用高压液相色谱法(HPLC)，在下述条件下，测试 此制品的稳定性。

流动相A：四氢呋喃、甲醇、含0.02％冰醋酸的水的1∶1∶1的混

合液，用NaOH将其pH调节为5.0-5.1。

流动相B：含90％的四氢呋喃的水溶液。

柱：超球体ODS，5微米微粒，尺寸150×4.6mm

(Beckman)。

温度：环境温度(室温)

流速：1.0ml/分

注射量：20mcl

检测方式：在410nm紫外线吸收

溶解程序：-100％流动相A，直至原卟啉峰被完全洗脱(约9.5 -13分钟)。 -与100％流动相B线性相关1分钟。 -100％流动相B，直至PHE被完全洗脱(约16-25   分钟)。 -与100％流动相A线性相关3分钟。 -注射之间，用100％流动相A至少平衡5分钟。 其结果列于表(1)

                 表1

             冷冻干燥PHE

             PHE含量，HPLC面积百分比 条件          批量一  批量二  批量三  批量四    批量五 始初量        100.00  100.00  100.00  100.00    100.00 -20℃，6个月  95.2    95.6    98.7     -        - 3℃，3个月    95.2    95.6    100..9   101.0    100.2\ 3℃，6个月    93.9    92.8    98.9     -        - 23℃，1个月   95.2    93.7    98.9     96.5     96.6\ 23℃，3个月   93.4    93.3    93.5     94.7     94.7\ 23℃，6个月   93.0    93.7    93.0     -        - 37℃，1个月   93.2    92.7    93.6     93.4     92.6\ 37℃，3个月   90.1    89.9    89.7     92.4     91.4\ 在相似条件下，PHE冷冻溶液的HPLC稳定性测试数据，展 示了表(2)所列结果：

                   表2

             冷冻干燥PHE

          PHE含量，HPLC面积百分比   条件         批量一   批量二  批量三   初始量       100      100     100 -20℃，6个月   92.9     101.3   - +5℃，3个月    83.2     93.4    85.2  5℃，6个月    81.4     86.9    84.1  5℃，9个月    77.1     81.9    77.9 25℃，3个月    82.4     91.2    83.8 25℃，6个月    86.4     93.9    87.8 25℃，9个月    77.1     91.5    88.8

对表(1)和表(2))所列的数据进行的检验表明，本发明的冷冻干 燥P H E组合物显示了比冷冻液具有更大、更长久的稳定性，在室温 下，其效力至少可保持6个月之久。

实施例4

根据实施例1制备的冻冷冻干燥PHE，并以一个HIAC计数 器测试其粒子数。获得下列结果。

              表3

             冷冻干燥PHE

                 粒子分析* 每个容器(30ml)的粒子数 稳定性批号 条  件         批量一   批量二    批量三   批量四    批量五 初始量           -      -         -        200        300 3℃，3个月       -      -         -        400        300 3℃，6个月      4600    1400      500      -          - 23℃，3个月      -      -         -        400        400 23℃，6个月     5700    1500      600      -          - 所有粒子数量代表粒子≥10 *由PIAC仪器所测定 以电阻率法血液计数器对冷冻溶液进行颗粒分析列于表(4)。

                  表4

                冷冻干燥PHE

                 粒子分析*

                每个容器(30ml)的粒子数

          稳定性批号 条件           批量一  批量二    批量三 初始量         -       1163       - -20℃，6个月   2039    4184       605 +5℃，3个月    6372    16664      4555  5℃，6个月    9565    28768      7160 5℃，9个月   19406    42730    21104 25℃，3个月  14059    18457    10519 25℃，6个月  10211    5332     9742 25℃，9个月  32197    14338    23501

*以Coulter计数器(电阻率法血液计数器)进行测定

对上述数据进行检查显示了，冷冻干燥制品将把颗粒形成水平保 持低于可注射的USP规格之下即每个容器不超过10000个粒子，其 粒径大于或等于10微米。而冷冻溶液则显示了温度在-20℃之上，时 间间隔低到3个月，有大量粒子形成。

实施例5

根据实施例1所制得的冷冻干燥PHE是用T.Dougherty等在 《J.N.Canier Inst》55∶115所揭示方法作生物活性试验。根 据此方法，由“供应者”DBA/2HA小鼠取得的SMT-F肿瘤可 被植入到DBA/2HA小鼠作试验。在肿瘤植入后，带肿块尺寸为4 ×4mm至6mm×6mm的10只小鼠被选出，并以用冷冻干燥PHE与5％ 葡萄糖水液重组而制得的PHE溶液(4.2mg/ml)注射入其腹膜内。注 射后24小时，用氙弧灯，在相当于光强度为157.5mw/cm2的距离，以 630纳米红光照射此肿瘤30分钟，光强度可由测光强计测得。经过结 果说明：照射后7天、10天试验鼠中有一半或更多的鼠无肉眼可见的 或可触摸到的肿瘤。采用重组的冷冻干燥PHE进行生物测定结果列 于表(5)。

           表5

           冷冻干燥PHE

           生物测定数据 生物测定结果稳定性批号

             批量一  批量二  批量三  批量四  批量五 初始量           通过    通过    通过    通过    通过 -20℃，6个月     通过    通过    -        -      -   3℃，3个月     通过    通过    -       通过    通过   3℃，6个月     通过    通过    通过    -       - 23℃，1个月      通过    通过    通过    通过    通过 23℃，3个月      通过    通过    -       通过    通过 23℃，6个月      通过    通过    通过    -       - 37℃，1个月      通过    通过    通过    通过    通过 37℃，3个月      通过    通过     -      通过    通过 使用如上述同样方法，PHE冷冻干燥溶液的生物测定结果列于 表(6)。

                 表6

                 PHE冷冻溶液

                  粒子分析

                     几批生物测定结果 条件        批量一    批量二    批量三 初始量      通过      通过       -  -20℃，3个月     -       -      通过 -20℃，6个月    失败    通过     - -20℃，9个月    失败    通过    失败   5℃，3个月    通过    通过    失败   5℃，6个月    失败    失败    失败   5℃，9个月    通过    失败    通过 25℃，3个月     失败    通过    通过 25℃，6个月     失败    失败    失败 25℃，9个月     通过    失败    失败

从表5和表6的结果比较可见，本发明的冷冻干燥PHE在室温 下，至少有6个月的间隔，在活体内试验中保持其生物活性，而在同 样条件下，冷冻溶液则显示了其生物活性相当大的变化。

实施例6

含有甘露糖醇作为填充剂的冷冻于燥PHE，是根据实施例1步 骤，再加上一个量相当于PHE重量的甘露糖醇于玻璃混合容器的溶 解浓缩物而制得。

实施例7

含有葡萄糖作为填充剂的冷冻干燥PHE是可按实施例6的方法， 并以葡萄糖替代甘露糖醇而制得。