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一种优化的 植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法及医药应用

阅读：448发布：2021-03-01

专利汇可以提供一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法及医药应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法及医药应用，本发明通过在植物中表达重组抗体Bevacizumab的重链和轻链融合蛋白，由于在融合蛋白中加入2A序列，使得抗体的重链和轻链得到接近1:1比例的表达，这个比例对完整抗体的组装起到明显的促进作用，我们的结果表明应用此系统表达的抗体产量较高。同时由于重组抗体的重链和轻链等比例的组装成比较稳定的四聚体结构，而减少了比较易降解的未组装多肽，因而得到较纯净一致的单克隆抗体。本发明将新法研制的贝伐单克隆抗体用于医药，用于治疗乳腺癌，用于治疗肺癌、恶性胶质瘤、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌和直肠癌。，下面是一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法及医药应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1.设计含有2A序列及Furin切点的贝伐单抗重链和轻链融合蛋白，序列依次包含:
1)抗体重链序列BHC
MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1)
2)重链内质网保留序列(KDEL)(SEQ ID NO:2)
3)Furin蛋白酶切割位点(RRKR)(SEQ ID NO:3)
4)连接肽(GSG)
5)2A序列(QLLNFDLLKLAGDVESNPGP)(SEQ ID NO:4)
6)抗体轻链序列BLC
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:5)
7)轻链内质网保留序列(KDEL)
步骤2.以水稻密码子优化并合成上述融合蛋白基因；
步骤3.构建贝伐单抗植物双元表达载体；
步骤4.采用农杆菌介导法将抗体基因导入水稻愈伤组织细胞并通过潮霉素筛选获得遗传转化水稻植株；
步骤5.采用Southern Blot以及Western Blot方法检测贝伐单抗在水稻中的表达；
步骤6.通过酶联免疫(ELISA)检测水稻中抗体的活性和含量；
步骤7.通过ProteinA亲和柱分离纯化抗体；
步骤8.通过SPR检测抗体对抗原的结合力；
步骤9.通过蛋白酶水解及质谱分析仪分析贝伐单克隆抗体糖基化；得到合乎标准的贝伐单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤1中确定Furin蛋白酶切割位点为RXXR(SEQ IDNO:6)、RX(R/K)R(SEQ ID NO:7)或RRKR(SEQ ID NO:8)，其中R为精氨酸，X为任何氨基酸，K为赖氨酸，其抗体融合蛋白序列表为：
MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDELRRKRGSGQLLNFDLLKLAGDVESNPGPMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECKDEL*(SEQ ID NO:9)；
所述抗体融合蛋白基因核酸序列(SEQ ID NO:10)为：
TTAATTAA(PacI酶切位点)ATG(蛋白质翻译起始)GAG TTC GGT CTC TCA TGG CTT TTT TTG GTT GCA ATT CTC AAA GGG GTT CAG TGC GAG GTG CAG TTG GTT GAA TCT GGT GGG GGG CTC GTT CAA CCG GGC GGG TCA CTT AGG CTC TCG TGT GCG GCT TCG GGA TAC ACG TTT ACG AAC TAC GGA ATG AAT TGG GTG AGG CAA GCA CCC GGA AAG GGC CTT GAG TGG GTT GGG TGG ATC AAT ACG TAC ACG GGT GAA CCT ACC TAC GCT GCT GAC TTT AAG AGA AGA TTT ACA TTC AGC CTG GAC ACA AGC AAG AGC ACC GCA TAT CTT CAG ATG AAC AGC CTT AGG GCT GAA GAT ACC GCG GTG TAC TAC TGC GCT AAA TAC CCT CAC TAC TAC GGG TCA AGT CAT TGG TAT TTC GAC GTT TGG GGG CAA GGG ACA TTG GTC ACA GTC TCT TCA GCT AGT ACT AAG GGA CCA TCC GTC TTT CCC CTG GCT CCA AGC AGT AAA AGC ACT AGC GGA GGG ACA GCG GCT TTG GGT TGT TTG GTC AAG GAT TAC TTT CCC GAA CCA GTC ACT GTG TCC TGG AAT TCG GGA GCT CTT ACC TCC GGG GTC CAC ACG TTC CCC GCC GTG CTG CAG AGC TCG GGG CTG TAC TCG CTG TCC TCC GTC GTC ACA GTT CCA TCG TCC TCG CTT GGA ACG CAG ACC TAT ATA TGC AAC GTT AAC CAT AAA CCT TCT AAC ACC AAA GTG GAT AAA AAA GTG GAG CCA AAA TCA TGT GAT AAA ACT CAT ACC TGC CCA CCT TGT CCA GCC CCG GAA TTG TTG GGT GGG CCG TCT GTT TTT CTG TTT CCC CCA AAA CCG AAG GAT ACA CTT ATG ATC TCC CGG ACG CCG GAG GTT ACG TGC GTT GTC GTT GAT GTG AGT CAT GAA GAC CCG GAG GTG AAA TTT AAC TGG TAC GTC GAT GGT GTC GAG GTC CAT AAC GCA AAA ACA AAG CCC CGC GAG GAA CAA TAC AAC TCG ACC TAC CGG GTC GTC AGC GTG CTG ACG GTC CTG CAC CAA GAT TGG CTC AAT GGA AAA GAA TAC AAG TGC AAG GTG AGC AAC AAA GCA CTG CCC GCG CCA ATC GAA AAG ACT ATC TCC AAA GCG AAA GGT CAG CCG AGG GAA CCC CAA GTG TAC ACC CTG CCG CCT AGT CGC GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGT CTT ACG TGC CTG GTG AAG GGA TTT TAT CCA TCT GAT ATC GCA GTC GAG TGG GAA TCC AAT GGC CAG CCA GAA AAC AAT TAT AAG ACT ACC CCA CCT GTT CTC GAT AGC GAT GGC TCG TTT TTC CTG TAC AGC AAA CTG ACT GTC GAT AAAAAA GAC GAG CTC AGT AGG TGG CAA CAA GGC AAC GTG TTC TCT TGC TCG GTG ATG CAC GAA GCA CTC CAC AAC CAT TAC ACC CAG AAG TCA TTG TCC CTG TCA CCC GGG AAG CGC CGC AAA AGG GGT AGC GGA CAG CTT CTT AAC TTC GAT CTG TTG AAG CTT GCT GGA GAC GTC GAA AGT AAC CCT GGA CCA ATG AAG TAT TTG CTT CCG ACA GCA GCG GCG GGG TTG TTG CTT CTC GCC GCG CAA CCG GCT ATG GCC GAC ATA CAG ATG ACT CAG AGC CCA TCA TCG CTG AGT GCG TCC GTT GGT GAT CGC GTC ACA ATT ACT TGC TCA GCA AGT CAG GAT ATT TCA AAT TAT TTG AAC TGG TAC CAA CAG AAG CCG GGA AAG GCT CCT AAA GTT CTC ATC TAC TTC ACT AGT AGC TTG CAC AGC GGG GTC CCA TCC AGA TTC TCG GGC TCC GGG TCC GGC ACC GAT TTC ACG CTC ACC ATT TCA TCC CTT CAG CCC GAA GAC TTT GCC ACG TAT TAT TGT CAA CAA TAT TCT ACT GTG CCA TGG ACA TTT GGA CAG GGT ACC AAA GTC GAG ATT AAA AGA ACA GTT GCC GCA CCA TCA GTG TTT ATT TTT CCA CCA TCG GAC GAG CAA CTC AAA TCG GGT ACT GCC AGC GTC GTG TGC TTG CTT AAC AAC TTT TAC CCC AGA GAA GCA AAG GTT CAG TGG AAA GTT GAT AAT GCC CTC CAG TCG GGA AAC TCT CAA GAA TCC GTG ACC GAA CAA GAT AGC AAA GAT TCT ACA TAT TCC CTT AGT TCA ACA CTC ACA CTG TCA AAA GCA GAC TAC GAA AAG CAT AAG GTT TAT GCA TGT GAA GTT ACG CAC CAG GGT TTG TCC TCT CCA GTC ACG AAG AGT TTC AAC CGC GGG GAG TGT AAA GAC GAG CTC TAA(蛋白质翻译终止)ACGCGT(MluI酶切位点)，其中包含5’PacI(TTAATTAA)和3’MluI(ACGCGT)限制性内切酶位点。
3.根据权利要求1所述的一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤3构建贝伐单抗植物双元表达载体，是将融合蛋白基因DNA片段通过PacI和MluI限制性内切酶位点插入到双元载体pUN1390上的基因表达框，该基因位于玉米ubiquitin启动子的后面，及Nos终止子的前面；以上所述的酶切位点，也可以是任何限制性内切酶位点，通过基因合成，PCR引物，或连接序列插入到重组基因片段的两端，以便将重组基因插入到相应的位点；上述启动子可以是任何有利于基因表达的启动子，如上述玉米泛素(ubiquitin)启动子，水稻Actin启动子，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，农杆菌Nos启动子等组成性启动子；组织特异性启动子，如在水稻胚乳中特异性表达的Gt1,GluA,GluB启动子；诱导性启动子，如水稻干旱诱导启动子Oshox24P,雌二醇诱导表达启动子XVE；上述终止子是指任何能够使得基因转录终止的DNA序列，如上述Nos终止子以及T35终止子。
4.根据权利要求1所述的一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤4采用基因枪、农杆菌或其他基因转化法将抗体基因导入水稻愈伤组织细胞并通过潮霉素筛选获得遗传转化水稻植株，其具体步骤如下：
1)水稻愈伤组织的诱导:将成熟的日本晴种子去壳，用75％的酒精消毒30秒，再用5％次氯酸钠溶液消毒25分钟，无菌水漂洗3～5次，置无菌纸上，在超净工作台上吹干，接种于N6D2愈伤组织诱导培养基上，每个培养皿接种12～15粒，于28℃暗培养4周，期间切除胚根，每两周继代一次；
2)根癌农杆菌的活化:1)将转化了贝伐单抗质粒的农杆菌(EHA105)接种在含有50mg/L的卡纳霉素和50mg/L利氟平的LB液体培养基中，28℃，转速200转每分钟振荡培养18小时；
2)取1ml培养好的农杆菌放在2ml灭菌的离心管中，转速6000转每分钟，离心5分钟收集菌体，用200μl的AAM液体培养基重悬菌体，取10μl菌液接种到50ml含有200μM AS(乙酰丁香酮)的AAM液体培养基中，28℃，转速160转每分钟振荡培养2小时，以备转化之用；
3)农杆菌转化水稻胚性愈伤组织：1)浸染，选取直径为3～5mm的结构致密的愈伤组织颗粒，在制备好的AAM菌液中浸染10min；4)共培养，将浸染后的愈伤组织放在无菌滤纸上吸去组织表面的菌液，转接至共培养基N6D2-Co上，26℃暗培养3天；3)选择培养，将共培养3天的愈伤组织用含有0.01％吐温的无菌水漂洗5次，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中漂洗10分钟，将愈伤组织放置无菌滤纸上，在超净工作台上晾干愈伤组织上的水，再转接至选择培养基N6D-Se上，28℃暗培养四周；4)分化培养，将抗性愈伤组织转接至分化培养基MS-Re上，16小时光照，8小时黑暗，28℃培养至分化出绿苗；将小苗转接至用灭菌瓶装的生根培养基MS-Hf上，培养2周后，洗净小苗根上的培养基转到水中培养3天，然后移栽到大田。
5.根据权利要求4所述的一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的水稻组织培养所需培养基为：
N6D2培养基：3.9g/L Chus N6(Chu,1975)(CHP01-50LT，10402809，Caisson,USA)，N6维生素，(2mg/L甘氨酸，0.5mg/L烟酸，1.0mg/L维生素B1，0.5mg/L维生素B6)，0.1g/L肌醇，
1.0g/L水解酪蛋白，0.5g/L脯氨酸,0.5g/L谷氨酰胺,2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，
30g/L蔗糖，1M KOH调节pH5.8，3.0g/L植物凝胶，121℃，220KPa，灭菌20分钟；
N6D2-Co培养基：N6D2中加入10g/L 葡萄糖，1M KOH调节pH5.5，3.0g/L植物凝胶，121℃，
220KPa，灭菌10分钟，待培养基冷却到50℃，加入200uM的乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)；
N6D2-Se培养基：N6D2培养基冷却到50℃，121℃，220KPa，灭菌20分钟，加入50mg/L潮霉素B和500mg/L头孢霉素；
MS-Re培养基：4.6g/L MS(M10400-50.0，P06968，rpi，USA)，2.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，0.5mg/L萘乙酸(NAA)，1.0mg/L激动素(KT)，30g/L蔗糖，30g/L山梨醇，1M KOH调节pH5.8，3.0g/L Gelrite，121℃，220KPa，灭菌20分钟，冷却到50℃，加入50mg/L潮霉素B和
500mg/L头孢霉素；
MS-HF培养基：2.3g/L MS(M10400-50.0，P06968，rpi，USA)，30g/L蔗糖，1M KOH调pH5.8，3.0g/L Gelrite，121℃，220KPa，灭菌20分钟，冷却到50℃，加入50mg/L潮霉素B；
AAM培养基：0.5g/L水解酪蛋白，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，0.9g/L谷氨酰胺，0.3g/L天冬氨酸，3g/L氯化钾，10mg/L五水硫酸锰，3.0mg/L硼酸，2.0mg/L七水硫酸锌，0.25mg/L二水钼酸纳，0.025mg/L五水硫酸铜，0.025mg/L六水氯化钴，0.75mg/L碘化钾，15mg/L二水氯化钙，25mg/L七水硫酸镁，4mg/L乙二胺四乙酸(EDTA)，15mg/L二水磷酸二氢钠，1mg/L烟酸，
1mg/L维生素B6，10mg/L维生素B1，100mg/L肌醇，176mg/L精氨酸，75mg/L甘氨酸，1M KOH调节pH到5.2，0.22uM滤膜过滤除菌。
6.根据权利要求1所述的一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤1的转基因株系中抗体轻链与重链的表达比值0.99，或者比值范围在
0.11-1.9。
7.根据权利要求1所述的一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述植物源转基因水稻中Bevacizumab抗体的含量为每公斤鲜重中
160.7mg---242.8mg。
8.根据权利要求1所述的一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法，其特征在于：采用该制备方法制备并提纯的贝伐单克隆抗体为四聚体，其分子量为140-
160kDa，纯度大于95％。
9.根据权利要求1所述的一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述贝伐单克隆抗体的植物特异性糖基化，包括MMXF(M3Gn2X1F1),GnMXF(M3Gn3X1F1)和GnGnXF(M3Gn4X1F1)，占糖基化抗体总量的46.8％。
10.一种贝伐单克隆抗体药物，其特征在于：由权利要求1--9所述的一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法制得的贝伐单克隆抗体与常用药物载体制备得到的生物药物；该药物可取代商品药物阿瓦斯汀，应用于人体源；该药物用于治疗乳腺癌，肺癌、恶性胶质瘤、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌以及直肠癌。

说明书全文

一种优化的 植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法及

医药应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法及医药应用。

背景技术

[0002] 贝伐单克隆抗体，简称(贝伐单抗)，其商品名为阿瓦斯汀(Avastin)，是重组的人源化单克隆抗体，为罗氏公司的癌症治疗畅销药物(http://www.avastin.com/patient)。2004年2月26日获得FDA的批准，是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药，其
2009年的销售额达59亿美元。贝伐单抗是通过中国仓鼠卵巢细胞表达系统生产的，分子量大约为149,000道尔顿。贝伐单抗是一种阻碍血管生成的药物，通过抑制血管内皮生长因子的作用阻断对肿瘤的血液供应，抑制肿瘤在体内扩散，增强化疗效果。在批准用于治疗乳腺癌之前，这种药物还被美国药管局批准用于治疗肺癌、恶性胶质瘤、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌和直肠癌，并在欧洲获准用于治疗乳腺癌。贝伐单抗的作用机制为：血管生成是新血管形成的过程(Wanget al.,2004)。肿瘤需建立独立的血供以使其直径超过1-2mm，因此血管生成是恶性肿瘤生长中的一个重要过程。VEGF为肿瘤血管生成的关键调控者，并且是唯一一种表达于整个肿瘤生命周期的血管生成因子。VEGF的持续表达，以及VEGF和内皮细胞的遗传学稳定性(基于临床前研究的观察结果)，可使“直接并且持续靶向于VEGF”成为一种重要的抗肿瘤策略(Presta et al.,1997；Ferrara et al.,2005)。

[0003] 随着分子生物学的发展，80年代初，科学家们开始利用基因工程技术来研制抗体，并逐渐形成了一门新型的跨学科技术------抗体生物技术(Antibody biotechnology)。它是以DNA重组技术为手段，将动物淋巴细胞所产生的抗体基因人为地改造后转入真核或原核细胞中进行表达，产生具有免疫活性的抗体或其功能片断。1989年美国医学生物学家Hiatt等(Hiatt etal.,1989)从小鼠中克隆了抗体重链和轻链基因，并分别用农杆菌介导法转入烟草，通过有性杂交和筛选鉴定，在后代同一植株中表达出由重链和轻链组装的功能性抗体，抗体量可达烟草叶总蛋白的1.3％。他的研究结果是人类利用异质细胞表达抗体的成功范例，打破了动植物物种之间的界限，引起了生物界的极大兴趣和高度重视。从此，分泌性抗体、完整抗体、嵌合抗体、Fab片段、scFv片段和双特异活性scFv片段等先后成功地在烟草、马铃薯、水稻、小麦或拟南芥的叶片、根、块茎和种子等器官中表达，表达水平通常占总可溶性蛋白的0.5％～2％(Barta et al.,1986；De Muynck et al.,2010；Desai et al.,2010；Xu et al.,2011；Huang and McDonald,2012)。1990年，During等(During et al.,1990)将抗体重链和轻链基因装入同一个表达载体盒，转入烟草后获得有抗原结合活性的抗体。1991年Benvenuto(Benvenuto et al.,1991)将一种神经肽单抗的VH基因插入植物表达载体，在烟草中获得表达，这种单域抗体具有抗原结合特性，表达量占可溶蛋白的1％。1992年，Owen等(Owen et al.,1992)构建成抗光敏色素的scFv基因，导入烟草后，scFv基因在转基因植株中高水平表达。De Wilde等(De Wilde et al.,1998)在拟南芥菜和烟草中表达了抗体IgG1的Fab片段，并证实两种植物表达出的抗体都具有抗原结合能力，但表达量不同。Kathuria等(Kathuria et al.,2002)成功地在烟草中表达了抗HCG的全长抗体，抗体量可达烟草叶总蛋白的4％。Rodriguez等(Rodriguez et al.,2005)在烟草叶中瞬时表达了抗表皮生长因子(EGF2R)的重组抗体，并证实其可识别A431肿瘤细胞表面的EGF2R。最近陈磊和于为常(陈磊and于为常,2015)通过密码子在水稻中成功表达了贝伐单抗(Bevacizumab)抗体，为通过植物生产抗癌抗体药物打下了基础。

[0004] 植物表达抗体研制包括以下程序：(1)克隆抗体基因；(2)构建抗体基因植物表达载体；(3)抗体基因导入植物细胞或获得遗传转化植物；(4)植物抗体的表达和纯化。抗体重链和轻链可变区(VH和VL)、以及恒定区(Fc)基因片段都可通过PCR方法从分泌抗体的杂交瘤细胞或通过噬菌体抗体库中扩增得到。抗体基因在植物中表达需要加入植物表达启动子，CaMV35S是常用的组成性启动子，也可利用组织特异性启动子使抗体在特定器官中表达。如用来自蚕豆(Vicia faba)的LeB4和USP启动子表达的ScFv在烟草种子中特异积累。抗体分泌到特定的细胞器对于抗体有效折叠和稳定是需要的。在抗体基因前加上信号肽(可来源于植物、酵母、小鼠)对抗体在特定亚细胞组分中合成和积累是重要的。已有的研究表明scFv片段C端加上内质网滞留信号肽KDEL或KDEI，能够在细胞内获得较高水平的积累。一些全抗体或Fab和scFv在细胞内表达量均不相同，表达量的高低在很大程度上受抗体片段本身骨架的影响。一般认为作用靶标在质外体则IgG或Fab是最佳选择，而scFv是内质网内靶标免疫调节的最佳选择。

[0005] 用植物表达完全抗体可采用不同的策略。一种是把重链和轻链基因分别转化植物，再通过有性杂交获得共表达植株；也可用两个基因的载体共转化同一植物，筛选获得共表达植株，还可把两个基因构建到同一个T-DNA上，使转基因工作更容易。抗体基因表达与功能鉴定可首先用原生质体进行。也可筛选建立抗体分泌细胞系用于抗体的发酵生产。抗体基因导入受体植物的途径通常是农杆菌介导法和基因枪轰击法，其它多种转基因方法也都可采用。植物抗体的回收及纯化通常包含多项步骤，如提取、沉淀、吸附、层析和渗滤等。

[0006] 目前，基因工程抗体的表达系统主要有哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母、昆虫以及植物。1)哺乳动物细胞表达体系：鼠骨髓瘤细胞是最理想的表达宿主，此外还有一些B淋巴细胞来源的细胞系。这些细胞具有一整套完整的合成、组装、分泌免疫球蛋白的细胞装置，能够产生完整的抗体分子。哺乳动物细胞表达的优点是能够将抗体多肽链正确装配、折叠并糖基化成有活性的完整分子，可以表达足够量的抗体，但生产成本高。2)大肠杆菌体系：大肠杆菌已被广泛地用于表达抗体功能片断，如Fab、Fv和scFv，但目前它还不能表达完整的抗体分子。利用大肠杆菌表达小分子抗体，具有规模大、速度快和成本低的优点，应用前景喜人。但原核表达中的一个重要问题是如何有效地控制转录的起始，进行预想的表达。目前已有两种类型的表达载体用于抗体的表达：IPTG诱导型和温度诱导型，它们各自的启动子tac2和KPL分别受IPTG和温度的控制。3)酵母表达体系：酵母能够有效地表达、组装和分泌具有免疫活性的抗体或其功能片断，但由于酵母对多肽的糖基化作用与哺乳动物细胞的修饰情况不同，从而影响了抗体的ACDC(依赖抗体的补体介导的细胞毒性)效力。目前认为酵母并非是好的表达体系。4)植物表达体系：1989年美国医学生物学家Hiatt首次报道了抗体在植物中的表达。他的研究结果是人类利用异质细胞表达抗体的成功范例，打破了动植物种属之间的界限，引起了生物界的极大兴趣和高度重视。目前用于表达完整抗体、Fab和scFv等抗体功能片断的植物有烟草和拟南芥菜。植物表达抗体的一大优势是能将全长重链和轻链组装成带有Fc区域的全抗体(而大肠杆菌能组装的最大抗体片段为单价Fab片段)，这些抗体能功能性的识别抗原并结合抗原。

[0007] 单克隆抗体是由2条重链和2条轻链组装成的四聚体。重链和轻链一般都通过不同的基因表达框分别表达。或者通过IRES(internal ribosome entry site)系统，将两个基因在同一个转录子上表达，但这些方法都无法实现重链和轻链的等量表达。如通过不同的基因表达框，尽管使用相同的启动子和终止子序列，但由于在基因转化过程中转基因在基因组中的插入位置不同，它们的表达受到周围基因组序列的影响产生位置效应，而使得重链和轻链蛋白的表达量不同。而使用IRES系统虽然重链和轻链在同一个转录子上，但在蛋白质翻译过程中由于IRES后面基因的翻译效率比前一个低，因此重链和轻链的表达量仍然不同。如以前通过水稻表达体系虽然也能形成完整的Bevacizumab抗体(陈磊、于为常，2015)，但由于表达系统中抗体的重链和轻链比例不佳，影响产量及抗体质量，如完整抗体四聚体的组装效率低，抗体降解等。

[0008] 另外在植物表达的重组蛋白，经常受到植物特异性糖基化的影响。而植物特异性蛋白糖基化，如β1,2-xylose和α1,3-fucose都发生在高尔基体(Golgi)。植物特异性糖基化会影响抗体的一些特性，如抗体的结合力，抗体在循环系统中的稳定性及引起人体对抗体的免疫反应等。这些特性是植物表达重组蛋白的主要缺陷，需要克服。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提出全新的一种优化的植物源重组人源化贝伐单克隆抗体的制备方法及医药应用。

[0010] 本发明的目的之一在于：通过2A表达等量的重链和轻链，使抗体组装效率提高，减少降解，从而提高抗体的产量和质量；

[0011] 本发明的另一目的在于通过设计内质网保留序列KDEL，从而减少或避免在高尔基体内的糖基化修饰；

[0012] 本发明的又一目的在于通过设计Furin蛋白酶切位点，切除2A序列，避免2A序列对抗体的影响；

[0013] 本发明还有一个目的在于将新法研制的贝伐单克隆抗体用于医药，用于治疗乳腺癌，用于治疗肺癌、恶性胶质瘤、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌和直肠癌。

[0014] 为了达到这些目的，本发明提出了如下的技术方案：

[0015] 一、优化植物源表达以水稻表达为例

[0016] 贝伐单抗水稻表达优化系统的技术方案包括以下步骤：

[0017] 步骤1.设计含有2A序列及Furin切点的贝伐单抗重链和轻链融合蛋白。如序列表SEQ ID NO:1所示，序列依次包含:

[0018] 1)抗体重链序列BHC

[0019]MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1)

[0020] 2)重链内质网保留序列(KDEL)(SEQ ID NO:2)

[0021] 3)Furin蛋白酶切割位点(RRKR)(SEQ ID NO:3)

[0022] 4)连接肽(GSG)

[0023] 5)2A序列(QLLNFDLLKLAGDVESNPGP)(SEQ ID NO:4)

[0024] 6)抗体轻链序列BLC

[0025]MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:5)

[0026] 7)轻链内质网保留序列(KDEL)

[0027] 步骤2.以水稻密码子优化并合成上述融合蛋白基因，如序列2)所示；其中包含5’PacI(TTAATTAA)和3’MluI(ACGCGT)限制性内切酶位点。

[0028] 步骤3.构建贝伐单抗植物双元表达载体。将融合蛋白基因DNA片段通过PacI和MluI限制性内切酶位点插入到双元载体pUN1390上的基因表达框，该基因位于玉米ubiquitin启动子的后面，及Nos终止子的前面(图1)。

[0029] 步骤4.采用农杆菌介导法将抗体基因导入水稻愈伤组织细胞并通过潮霉素筛选获得遗传转化水稻植株。

[0030] 步骤5.采用Southern Blot以及Western Blot方法检测贝伐单抗在水稻中的表达。

[0031] 步骤6.通过酶联免疫(ELISA)检测水稻中抗体的活性和含量。

[0032] 步骤7.通过ProteinA亲和柱分离纯化，得到贝伐单克隆抗体。

[0033] 步骤8.通过SPR检测抗体对抗原的结合力。

[0034] 步骤9.通过蛋白酶水解及质谱分析仪分析贝伐单克隆抗体糖基化。

[0035] 进一步的，将本发明制备方法得到的贝伐单克隆抗体与常用药物载体制备生物药物应用于人体源。

[0036] 更进一步的，将贝伐单克隆抗体制备的生物药物用于治疗乳腺癌，肺癌、恶性胶质瘤、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、结肠癌以及直肠癌。

[0037] 本发明的技术关键点在于：

[0038] 通过2A表达等量的重链和轻链，使抗体组装效率提高，减少降解，从而提高抗体的产量和质量；

[0039] 通过设计内质网保留序列KDEL，从而减少或避免在高尔基体内的糖基化修饰，减少植物特异性糖基化；

[0040] 通过设计Furin蛋白酶切位点，切除2A序列，不影响抗体的结构及功能。

[0041] 本发明的优点及积极效果

[0042] 本发明通过在植物中表达重组抗体Bevacizumab的重链和轻链融合蛋白，由于在融合蛋白中加入2A序列，使得抗体的重链和轻链得到接近1:1比例的表达，这个比例对完整抗体的组装起到明显的促进作用，我们的结果表明应用此系统表达的抗体产量较高。同时由于重组抗体的重链和轻链等比例的组装成比较稳定的四聚体结构，而减少了比较易降解的未组装多肽，因而得到较纯净一致的单克隆抗体。另外由于在2A序列前设计了Furin蛋白酶切点，使得2A序列在表达后被切除，从而得到的抗体不含有2A序列，避免了因为引入额外序列而引起的抗体结构和功能的变化。通过在抗体重链和轻链多肽C末端添加KDEL内质网保留序列，使得抗体保留在内质网中，而不经过高尔基体分泌途径，减少了经高尔基体而产生的植物特异性糖基化。而植物特异性糖基化一般会影响重组蛋白的结构、功能，抗体在人体循环系统的稳定性及引起人体对该抗体的免疫反应。附图说明

[0043] 图1为本发明的贝伐单抗植物表达载体的构建图，其中融合蛋白基因BHC-KDEL-Furin-GSG-2A-BLC-KDEL位于玉米转录启动子PUbi后，Nos转录终止子TNos前。HptII基因在CaMV35S启动子(P35S)和35S终止子(T35S)之间表达潮霉素抗性基因，用于转基因植物的筛选。LB和RB分别为农杆菌双元载体pUN1390的左右边界。

[0044] 图2为本发明的贝伐单抗在转基因水稻--抗潮霉素水稻愈伤组织

[0045] 图3为本发明的贝伐单抗在转基因水稻--转基因试管苗

[0046] 图4为本发明的贝伐单抗在转基因水稻--水稻转基因植株

[0047] 图5为本发明的Southern Blot鉴定贝伐单抗转基因植株图；

[0048] 其中，(a)EcoRI酶切产生～3kb BHC+BLC融合蛋白片段，利用BLC基因探针杂交显示所有转基因水稻都有此转基因；

[0049] (b)EcoRI酶切，利用潮霉素基因(hptII)作为探针，杂交显示不同转基因植物中转基因拷贝数的变化，其中3、5、6、10为单拷贝转基因事件；7、9、11、13、15为两个拷贝转基因事件；其他为多拷贝转基因事件；2是野生型水稻DNA为阴性对照，1是质粒DNA作为阳性对照。

[0050] 图6为本发明采用Western Blot分析贝伐单抗在转基因水稻中的表达。

[0051] 其中，A)变性胶，B)非变性胶。PC：Bevacizumab单克隆抗体(Avastin,Lot No:H0129；Roche Pharma,Switzerland)作为阳性对照，NC为野生型水稻蛋白为阴性对照，#1-9为转基因水稻。

[0052] 图7为本发明的ELISA检测转基因植物中抗体的活性示意图。其中，PC为阿瓦斯汀阳性对照，NC为非转基因植物阴性对照，其他为转基因植物；

[0053] 图8为本发明的ELISA检测利用阿瓦斯汀标准品绘制标准曲线图；

[0054] 图9为本发明的ELISA检测不同转基因植物中抗体含量分析示意图；

[0055] 图10为本发明的不同转基因植物中SDS-PAGE检测提纯抗体(～150kD)示意图。

[0056] 其中，1-2：5μg抗体；3-4：2μg抗体；5-6:1μg抗体；7：0.5μg阿瓦斯汀对照。

[0057] 图11为表面等离子共振(SPR)检测阿瓦斯汀抗体与抗原的结合情况图；

[0058] 图12为表面等离子共振(SPR)检测本发明的抗体与抗原的结合情况图.[0059] 其中，HL为从转基因水稻中提纯的Bevacizumab抗体。

具体实施方式

[0060] 结合附图及实施例进一步描述本发明的技术方案

[0061] 实施例1Bevacizumab抗体融合蛋白的设计，合成及植物表达载体的构建[0062] 如附图1所示，设计含有2A序列及Furin切点的贝伐单抗重链和轻链融合蛋白。如序列表SEQ ID NO:1所示，序列依次包含:抗体重链序列BHC，内质网保留序列(KDEL)(SEQ ID NO:2)，Furin蛋白酶切割位点(RRKR)(SEQ ID NO:3)，连接肽(GSG)，2A序列(QLLNFDLLKLAGDVESNPGP)(SEQ ID NO:4)，抗体轻链序列BLC(SEQ ID NO:5)内质网保留序列(KDEL)。以水稻密码子优化并合成上述融合蛋白基因，如序列2所示。其中包含5’PacI(TTAATTAA)和3’MluI(ACGCGT)限制性内切酶位点。

[0063] 将融合蛋白基因DNA片段通过PacI和MluI限制性内切酶位点插入到双元载体pUN1390上的基因表达框，该基因位于玉米ubiquitin启动子的后面，及Nos终止子的前面。

[0064] 序列1：抗体融合蛋白序列

[0065]MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDELRRKRGSGQLLNFDLLKLAGDVESNPGPMKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECKDEL*(SEQ ID NO:9)；

[0066] 序列2：抗体融合蛋白基因核酸序列(SEQ ID NO:10)

[0067] TTAATTAA(PacI酶切位点)ATG(蛋白质翻译起始)GAG TTC GGT CTC TCA TGG CTT TTT TTG GTT GCA ATT CTC AAA GGG GTT CAG TGC GAG GTG CAG TTG GTT GAA TCT GGT GGG GGG CTC GTT CAA CCG GGC GGG TCA CTT AGG CTC TCG TGT GCG GCT TCG GGA TAC ACG TTT ACG AAC TAC GGA ATG AAT TGG GTG AGG CAA GCA CCC GGA AAG GGC CTT GAG TGG GTT GGG TGG ATC AAT ACG TAC ACG GGT GAA CCT ACC TAC GCT GCT GAC TTT AAG AGA AGA TTT ACA TTC AGC CTG GAC ACA AGC AAG AGC ACC GCA TAT CTT CAG ATG AAC AGC CTT AGG GCT GAA GAT ACC GCG GTG TAC TAC TGC GCT AAA TAC CCT CAC TAC TAC GGG TCA AGT CAT TGG TAT TTC GAC GTT TGG GGG CAA GGG ACA TTG GTC ACA GTC TCT TCA GCT AGT ACT AAG GGA CCA TCC GTC TTT CCC CTG GCT CCA AGC AGT AAA AGC ACT AGC GGA GGG ACA GCG GCT TTG GGT TGT TTG GTC AAG GAT TAC TTT CCC GAA CCA GTC ACT GTG TCC TGG AAT TCG GGA GCT CTT ACC TCC GGG GTC CAC ACG TTC CCC GCC GTG CTG CAG AGC TCG GGG CTG TAC TCG CTG TCC TCC GTC GTC ACA GTT CCA TCG TCC TCG CTT GGA ACG CAG ACC TAT ATA TGC AAC GTT AAC CAT AAA CCT TCT AAC ACC AAA GTG GAT AAA AAA GTG GAG CCA AAA TCA TGT GAT AAA ACT CAT ACC TGC CCA CCT TGT CCA GCC CCG GAA TTG TTG GGT GGG CCG TCT GTT TTT CTG TTT CCC CCA AAA CCG AAG GAT ACA CTT ATG ATC TCC CGG ACG CCG GAG GTT ACG TGC GTT GTC GTT GAT GTG AGT CAT GAA GAC CCG GAG GTG AAA TTT AAC TGG TAC GTC GAT GGT GTC GAG GTC CAT AAC GCA AAA ACA AAG CCC CGC GAG GAA CAA TAC AAC TCG ACC TAC CGG GTC GTC AGC GTG CTG ACG GTC CTG CAC CAA GAT TGG CTC AAT GGA AAA GAA TAC AAG TGC AAG GTG AGC AAC AAA GCA CTG CCC GCG CCA ATC GAA AAG ACT ATC TCC AAA GCG AAA GGT CAG CCG AGG GAA CCC CAA GTG TAC ACC CTG CCG CCT AGT CGC GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGT CTT ACG TGC CTG GTG AAG GGA TTT TAT CCA TCT GAT ATC GCA GTC GAG TGG GAA TCC AAT GGC CAG CCA GAA AAC AAT TAT AAG ACT ACC CCA CCT GTT CTC GAT AGC GAT GGC TCG TTT TTC CTG TAC AGC AAA CTG ACT GTC GAT AAA AAA GAC GAG CTC AGT AGG TGG CAA CAA GGC AAC GTG TTC TCT TGC TCG GTG ATG CAC GAA GCA CTC CAC AAC CAT TAC ACC CAG AAG TCA TTG TCC CTG TCA CCC GGG AAG CGC CGC AAA AGG GGT AGC GGA CAG CTT CTT AAC TTC GAT CTG TTG AAG CTT GCT GGA GAC GTC GAA AGT AAC CCT GGA CCA ATG AAG TAT TTG CTT CCG ACA GCA GCG GCG GGG TTG TTG CTT CTC GCC GCG CAA CCG GCT ATG GCC GAC ATA CAG ATG ACT CAG AGC CCA TCA TCG CTG AGT GCG TCC GTT GGT GAT CGC GTC ACA ATT ACT TGC TCA GCA AGT CAG GAT ATT TCA AAT TAT TTG AAC TGG TAC CAA CAG AAG CCG GGA AAG GCT CCT AAA GTT CTC ATC TAC TTC ACT AGT AGC TTG CAC AGC GGG GTC CCA TCC AGA TTC TCG GGC TCC GGG TCC GGC ACC GAT TTC ACG CTC ACC ATT TCA TCC CTT CAG CCC GAA GAC TTT GCC ACG TAT TAT TGT CAA CAA TAT TCT ACT GTG CCA TGG ACA TTT GGA CAG GGT ACC AAA GTC GAG ATT AAA AGA ACA GTT GCC GCA CCA TCA GTG TTT ATT TTT CCA CCA TCG GAC GAG CAA CTC AAA TCG GGT ACT GCC AGC GTC GTG TGC TTG CTT AAC AAC TTT TAC CCC AGA GAA GCA AAG GTT CAG TGG AAA GTT GAT AAT GCC CTC CAG TCG GGA AAC TCT CAA GAA TCC GTG ACC GAA CAA GAT AGC AAA GAT TCT ACA TAT TCC CTT AGT TCA ACA CTC ACA CTG TCA AAA GCA GAC TAC GAA AAG CAT AAG GTT TAT GCA TGT GAA GTT ACG CAC CAG GGT TTG TCC TCT CCA GTC ACG AAG AGT TTC AAC CGC GGG GAG TGT AAA GAC GAG CTC TAA(蛋白质翻译终止)ACGCGT(MluI酶切位点)

[0068] 实施例2农杆菌介导的贝伐单抗载体转化水稻愈伤组织

[0069] 1)水稻愈伤组织的诱导:将成熟的日本晴种子去壳，用75％的酒精消毒30秒，再用5％次氯酸钠溶液消毒25分钟，无菌水漂洗3～5次，置无菌纸上，在超净工作台上吹干，接种于N6D2愈伤组织诱导培养基上，每个培养皿接种12～15粒，于28℃暗培养4周，期间切除胚根，每两周继代一次。

[0070] 2)根癌农杆菌的活化:1)将转化了贝伐单抗质粒的农杆菌(EHA105)接种在含有50mg/L的卡纳霉素和50mg/L利氟平的LB液体培养基中，28℃，转速200转每分钟振荡培养18小时；2)取1ml培养好的农杆菌放在2ml灭菌的离心管中，转速6000转每分钟，离心5分钟收集菌体，用200μl的AAM液体培养基重悬菌体，取10μl菌液接种到50ml含有200μM AS(乙酰丁香酮)的AAM液体培养基中，28℃，转速160转每分钟振荡培养2小时，以备转化之用。

[0071] 3)农杆菌转化水稻胚性愈伤组织：1)浸染，选取直径为3～5mm的结构致密的愈伤组织颗粒，在制备好的AAM菌液中浸染10min；2)共培养，将浸染后的愈伤组织放在无菌滤纸上吸去组织表面的菌液，转接至共培养基N6D2-Co上，26℃暗培养3天；3)选择培养，将共培养3天的愈伤组织用含有0.01％吐温的无菌水漂洗5次，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中漂洗10分钟，将愈伤组织放置无菌滤纸上，在超净工作台上晾干愈伤组织上的水，再转接至选择培养基N6D-Se上，28℃暗培养四周(图2)；4)分化培养，将抗性愈伤组织转接至分化培养基MS-Re上，16小时光照，8小时黑暗，28℃培养至分化出绿苗(图3)。将小苗转接至用灭菌瓶装的生根培养基MS-Hf上，培养2周后，洗净小苗根上的培养基转到水中培养3天，然后移栽到大田(图4)。

[0072] 4)水稻组织培养所需培养基：

[0073] N6D2培养基：3.9g/L Chus N6(Chu,1975)(CHP01-50LT，10402809，Caisson,USA)，N6维生素，(2mg/L甘氨酸，0.5mg/L烟酸，1.0mg/L维生素B1，0.5mg/L维生素B6)，0.1g/L肌醇，1.0g/L水解酪蛋白，0.5g/L脯氨酸,0.5g/L谷氨酰胺,2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，30g/L蔗糖，1M KOH调节pH5.8，3.0g/L植物凝胶，121℃，220KPa，灭菌20分钟。

[0074] N6D2-Co培养基：N6D2中加入10g/L 葡萄糖，1M KOH调节pH5.5，3.0g/L植物凝胶，121℃，220KPa，灭菌10分钟，待培养基冷却到50℃，加入200uM的乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)。

[0075] N6D2-Se培养基：N6D2培养基冷却到50℃，121℃，220KPa，灭菌20分钟，加入50mg/L潮霉素B和500mg/L头孢霉素。

[0076] MS-Re培养基：4.6g/L MS(M10400-50.0，P06968，rpi，USA)，2.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，0.5mg/L萘乙酸(NAA)，1.0mg/L激动素(KT)，30g/L蔗糖，30g/L山梨醇，1M KOH调节pH5.8，3.0g/L Gelrite，121℃，220KPa，灭菌20分钟，冷却到50℃，加入50mg/L潮霉素B和500mg/L头孢霉素。

[0077] MS-HF培养基：2.3g/L MS(M10400-50.0，P06968，rpi，USA)，30g/L蔗糖，1M KOH调pH5.8，3.0g/L Gelrite，121℃，220KPa，灭菌20分钟，冷却到50℃，加入50mg/L潮霉素B。

[0078] AAM培养基：0.5g/L水解酪蛋白，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，0.9g/L谷氨酰胺，0.3g/L天冬氨酸，3g/L氯化钾，10mg/L五水硫酸锰，3.0mg/L硼酸，2.0mg/L七水硫酸锌，
0.25mg/L二水钼酸纳，0.025mg/L五水硫酸铜，0.025mg/L六水氯化钴，0.75mg/L碘化钾，
15mg/L二水氯化钙，25mg/L七水硫酸镁，4mg/L乙二胺四乙酸(EDTA)，15mg/L二水磷酸二氢钠，1mg/L烟酸，1mg/L维生素B6，10mg/L维生素B1，100mg/L肌醇，176mg/L精氨酸，75mg/L甘氨酸，1M KOH调节pH到5.2，0.22uM滤膜过滤除菌。

[0079] 实施例3Southern blot鉴定贝伐单抗转基因水稻(图5)

[0080] 1)制备地高辛标记的探针：以贝伐单抗双元表达载体DNA为模板，轻链(BLC)和潮霉素基因(hptII)的正反向引物分别扩增制备轻链和hptII的地高辛标记的探针。

[0081] PCR反应溶液为:质粒DNA10ng作为模板，正反向引物各1μL，Premix Ex Taq Hot Start Version 15μl,1μL的DIG-dUTP，双蒸水定容到30μL。

[0082] PCR扩增反应程序为：95℃5分钟，95℃20秒，60℃20秒，72℃1.5分钟，30个循环，72℃5分钟。PCR反应结束后，取3μL反应液电泳检测。

[0083] 2)转贝伐单抗基因水稻总DNA的酶解：转贝伐单抗基因水稻叶片总DNA 15ug，用EcoRI进行酶解，37℃反应过夜。每个样品的酶解反应体系为：总DNA 15μg，CutSmart缓冲液10μL，100U的EcoRI，双蒸水定容100μL。其中以野生型水稻基因组DNA作为阴性对照，贝伐单抗质粒为阳性对照。酶解反应结束后，上样5μL进行电泳检测，纯化，溶解在15μL双蒸水中，4℃备用或-20℃保存。

[0084] 3)酶解产物的电泳：将纯化后的酶解产物上样于1.0％琼脂糖凝胶，以5V/cm 电压电泳3小时；拍照，标记分子量的位置；将凝胶放到0.2N盐酸中处理10分钟，用双蒸水漂洗一下；放入变性缓冲液中处理30分钟；放入中和缓冲液中处理30分钟。

[0085] 4)DNA印记到杂交膜：根据琼脂糖凝胶的大小，剪取大小合适的杂交膜，用双蒸水润湿；玻璃板放在托盘上，取1张3M滤纸，用转移缓冲液浸湿，放在玻璃板上，去除滤纸与玻璃板中的气泡。在托盘中加入适量转移缓冲液；将凝胶放在滤纸上，去除凝胶和印迹表面间的气泡；将杂交膜放在凝胶上面，并再次排气泡；将2张3M滤纸(比杂交膜稍大)转移缓冲液湿透后放在杂交膜上；在胶的周围放上一圈保险膜，防止液池中的液体直接流到凝胶上方的纸巾层(即“短路”现象)。在滤纸上放一叠吸水纸，然后压上重约300g的物体，转移过夜；将杂交膜在稀释10倍的转移缓冲液中漂洗一下，置于超净台下晾干，于80℃烘箱烘2小时。

[0086] 5)杂交：将烘烤后的膜用灭菌水润湿卷起，放入杂交管中，加入30ml杂交液，放在42℃预杂交2小时；倒掉预杂交液，再加入10ml新的杂交液于42℃预热；取出已经做好的探针，冰上融化，加入到已经预热的杂交液里，42℃杂交过夜。

[0087] 6)杂交后处理：倒出杂交液，在杂交管中倒入100ml洗脱缓冲液W1，室温下洗脱5分钟，重复一次。倒掉洗脱缓冲液W1，加入100ml洗脱缓冲液W2，于65℃洗脱15分钟，重复一次；取出膜，放入铺有保鲜膜的小平盘中，加入洗脱缓冲液W3，洗脱5分钟；倒掉洗脱缓冲液W3，加入50ml封闭液S1，室温孵育15分钟；倒掉封闭液S1，加入10ml地高辛抗体反应液S2，孵育
15分钟；将膜取出放入另一个盒子，加入100ml洗脱缓冲液W3，室温下洗脱15分钟，重复洗脱一次；加入20mL的检测缓冲液S3，孵育5分钟；倒掉检测缓冲液S3，加入2ml CSPD孵育5分钟；
将膜取出平铺在保鲜膜上，将其包裹起来，放在37℃孵育5分钟。

[0088] 7)显影和定影：将包好的膜放在暗匣子中，在暗房中将X-胶片放在包好的膜上，关闭暗夹，37℃放置30分钟；回暗室中取出胶片，放入显影液中浸泡2分钟，在水中冲一下，再放入定影液浸泡2分钟，在流水中冲洗胶片，取出晾干。

[0089] 8)Southern blot所需试剂：

[0090] 变性缓冲液：20g/L NaOH，87.75g/L NaCl；

[0091] 中和缓冲液：60.05g/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)，87.75g/L NaCl，37％的浓盐酸调节pH7.2；

[0092] 转移缓冲液(20×SSC)：175.3g/L NaCl，88.2g/L柠檬酸三钠4M盐酸调节pH7.0；

[0093] 洗脱缓冲液W1：2×SSC；0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)(M/V)；

[0094] 洗脱缓冲液W2：0.5×SSC；0.1％SDS；

[0095] 洗脱缓冲液W3：11.607g/L马来酸，8.775g/L NaCl，用固体NaoH调节pH值至7.5，用前加入0.3％吐温20；

[0096] 检测缓冲液S3：12.1g/L Tris，5.85g/L NaCl，调节pH 9.5；

[0097] 杂交液：70g/L SDS，50％甲酰胺，25％20XSSC，2％脱脂奶粉(罗氏)，50ml 1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)，1.0g/L十二烷基肌胺酸钠；

[0098] 封闭液S1：1％脱脂奶粉(M/V)溶解在洗脱缓冲液W3中；

[0099] 地高辛抗体反应液S2：将Anti-Digoxigenin-AP以10000转每分钟离心5分钟，吸取上层溶液以1：10000溶解于封闭液S1。

[0100] 实施例4Western Blot分析贝伐单抗在转基因水稻中的表达

[0101] 1)样品制备：

[0102] a)以转基因水稻叶片为材料，在液氮中研磨。称取30mg研磨好叶片组织加入30μl提取缓冲液(200mM Tris-HCl,pH 8.0,100mM NaCl,400mMsucrose,10mM EDTA,1mM phenylmethylsulfonyl fluoride,0.05％Tween20)，旋涡振荡，在冰上放置10分钟，然后在4℃，13000转每分钟离心10分钟，取上清到新的离心管中。

[0103] 2)电泳分离：将25μg提取总蛋白和SDS上样缓冲液混合，然后在变性条件下，样品上样前加5％巯基乙醇2-mercaptoethanol，煮5分钟变性)或非变性条件下跑10％SDS-PAGE电泳。100V电泳2小时。

[0104] 3)转膜：卸下胶板，剥离胶，将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，将PVDF膜放入甲醇浸泡饱和3-5秒钟放入转移缓冲液中平衡10min。装配转移三明治：从下向上依次为3层滤纸、胶、PVDF膜、3层滤纸，每层放好后，用试管赶去气泡。插上电极，20V，45分钟。转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

[0105] 4)免疫杂交与显色：将膜放入双蒸水中浸泡10分钟，取出放入20ml 5％脱脂奶粉的封闭液中室温孵育1小时。加入稀释5000倍的辣根过氧化酶(HRP)标记羊抗人IgG(LC+HC)(ProteinTech Group,USA)，室温孵育2小时。15mlTBS-T洗3次，每次5min。蛋白检测(按照Thermo Pierce ECL Western BlottingSubstrate试剂盒操作)。

[0106] 5)变性SDS-PAGE显示出2个条带，分别为～50kDa重链和～25kDa轻链(图6A)。

[0107] 6)非变性SDS-PAGE显示出1个～150kDa条带，为抗体四聚体(图6B)，没有观察到降解产物。

[0108] 7)通过ImageJ 软件分析图6A中条带的灰度值，计算轻链/重链的比例如表1。9个转基因株系中轻链/重链的比值平均数为0.99，和对照商品阿瓦斯汀的比值相同。

[0109] 表1.不同转基因植物中轻链/重链表达量比值

[0110]转基因植物株系 LC:HC比值
阳性对照PC 0.99
1 0.68
2 1.18
3 1.00
4 0.99
5 1.00
6 0.11
7 0.60
8 1.49
9 1.90
平均值+方差 0.99±0.52

[0111] 实施例5转基因水稻中Bevacizumab抗体的活性分析及定量

[0112] 1)转基因植物总蛋白的提取同实例4，然后按1:100稀释后，去100μL加入ELISA酶标版孔中，于25℃孵育1小时，让抗体和酶标版孔中的hVEGF抗原蛋白充分结合。酶标版孔中预先涂有hVEGF生长因子蛋白(SHIKARIQ-BEVA,Matriks Biotechnology Co.Ltd.,Turkey)。

[0113] 2)用1xPBST洗涤3次后，加入辣根过氧化酶(HRP)标记的streptavidine，并在25℃孵育0.5小时。

[0114] 3)用1xPBST洗涤3次后，加入TMB底物，并在25℃孵育20分钟。

[0115] 4)加终止液终止反应，用酶标仪在450nm 波长检测颜色反应的读值。

[0116] 5)以商品阿瓦斯汀作为阳性对照，非转基因植物作为阴性对照，转基因植物反应皆为阳性(图7)，证明转基因植物表达有活性的抗体，可以和抗原结合。

[0117] 6)利用阿瓦斯汀为标准品，通过上述ELISA方法绘制标准曲线(图8)。

[0118] 7)通过和标准曲线比较，计算出转基因植物中抗体的含量(图9)，含量最低为每公斤鲜重含160.7mg，最高可达242.8mg。

[0119] 实施例6通过亲和层析从转基因水稻中提纯Bevacizumab单克隆抗体

[0120] 1)取50克转基因植物材料，总蛋白的提取同实施例4。

[0121] 2)蛋白粗提液经0.45μm滤膜过滤。

[0122] 3)用蛋白结合缓冲液(0.02M sodium phosphate buffer,pH 7.0)平衡HiTrap Protein A HP柱。

[0123] 4)过滤后的蛋白提取液上柱，并用5倍柱体积的蛋白结合缓冲液洗柱。

[0124] 5)用洗脱液(0.1M Glycine-HCl,pH 2.7)洗脱柱上结合的抗体，并收集于含1/5洗脱体积的1M Tris-HCl(pH 9.0)中，中和到pH值7.0。

[0125] 6)收集到的抗体用分子量30kDa的滤膜(分子量,30kDa,Millipore,USA)超滤纯化。

[0126] 7)利用上述实例5中ELISA方法测定抗体浓度，两个样品中回收到抗体的浓度相当于每克新鲜组织中抗体含量为135.1和101.1μg，回收率分别为55.6％和59.8％。

[0127] 8)利用上述实例4中非变性SDS-PAGE胶上分离，考马斯亮蓝染色方法检测抗体的质量和纯度。结果发现绝大部分抗体为约150kDa的四聚体(图10)及少量降解产物。纯度大于95％。

[0128] 9)提纯的抗体可用于下面的SPR结合实验及糖基化分析。

[0129] 实施例7表面等离子共振SPR检测抗体和抗原的结合力

[0130] 1)将hVEGF抗原蛋白结合于GE CM5感应芯片上。

[0131] 2)以不同浓度将阿瓦斯汀抗体及上述提纯抗体分别同芯片上的抗原结合，检测表面等离子共振情况(图11、12)并计算抗体和抗原的结合和解离系数(表2)。

[0132] 3)由表2可以看出，从转基因水稻中提纯的抗体对抗原hVEGF的结合力强于阿瓦斯汀抗体，有可能作为阿瓦斯汀的替代产品用于癌症治疗。

[0133] 表2.抗体与抗原的结合(ka)和解离(kd)系数及结合力(KD)

[0134] ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
HL 1.90E+04 5.35E-04 2.81E-08
PC 9.21E+03 1.82E-03 1.98E-07

[0135] 实施例8转基因水稻中提纯抗体的糖基化分析

[0136] 1)上述实施例4中提纯的抗体用Trypsin蛋白酶水解成多肽。

[0137] 2)多肽经过毛细管反向层析分离后用quadrupole time-of-flight(Q-TOF)Ultima Global(Waters)质谱仪进行分析。

[0138] 3)利用Peptide Mass program(http://www.expasy.org/tools/peptide-mass.html)将质谱数据和Trypsin蛋白酶水解的Bevacizumab氨基酸序列比较得出糖基化数据(如表3所示)。

[0139] 4)由表3可以看出，植物特异性糖基化，包括MMXF(M3Gn2X1F1),GnMXF(M3Gn3X1F1)和GnGnXF(M3Gn4X1F1)占总量的46.8％。

[0140] 表3.转基因水稻表达单克隆抗体Bevacizumab糖基化

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