通过使用非缀合抗体和缀合的抗体、抗体组合及融合蛋白的B细胞恶性瘤和自身免疫病的免疫方法
阅读：632发布：2020-07-07
专利汇可以提供通过使用非缀合抗体和缀合的抗体、抗体组合及融合蛋白的B细胞恶性瘤和自身免疫病的免疫方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于 治疗 和诊断 哺乳动物 B细胞相关病、T细胞相关病或自身免疫病的方法，所述方法是通过向所述哺乳动物同时或相继 给药 包括药学上可接受的载体和至少一种缀合 抗体 的治疗组合物进行的，其中并不进行非 放射性 标记抗体的预先投药。，下面是通过使用非缀合抗体和缀合的抗体、抗体组合及融合蛋白的B细胞恶性瘤和自身免疫病的免疫方法专利的具体信息内容。
1.一种治疗组合物在制造用于治疗哺乳动物疾病的药物中的用 途，所述治疗组合物包括药学上可接受的载体和至少一种缀合抗体 或其片断，或缀合抗体融合蛋白或其片断，其中并不进行非放射性 标记抗体的预先投药，且其中向所述哺乳动物同时地和相继地给药 所述治疗组合物。
2.权利要求1的用途，其中任选地与所述缀合抗体或其所述片 断或者所述缀合抗体融合蛋白或其所述片断一起添加非缀合抗体或 片断或者非缀合抗体融合蛋白或其片断，作为维持治疗以防增生的 肿瘤或患自身免疫病的细胞靶逃逸。
3.权利要求1或2的用途，其中所述缀合和非缀合的抗体、抗 体融合蛋白或其片断靶向于选自下组的抗原：CD3、CD4、CD5、CD8、 CD11c、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、 CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、 MUC1、腱生蛋白、Ia、HMI.24、HLA-DR以及肿瘤相关抗原。
4.权利要求3的用途，其中所述肿瘤相关抗原是血管内皮抗原。
5.权利要求3的用途，其中所述哺乳动物选自人和家畜或宠物。
6.权利要求3的用途，其中所述缀合和非缀合的抗体、抗体融 合蛋白或其片断是人源、鼠源、嵌合、灵长化或人源化的。
7.权利要求3的用途，其中所述抗体、抗体融合蛋白或其片断 缀合于选自下组的治疗剂：药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼 化合物、光敏剂和放射性核素。
8.权利要求3的用途，进一步包括向所述哺乳动物同时或相继 给药这样的治疗组合物，所述治疗组合物包括药学上可接受的载体 和至少一种抗体、抗体融合蛋白或其片断，其中所述抗体、所述抗 体融合蛋白或其所述片断缀合于至少一种治疗剂。
9.权利要求8的用途，其中任选地与所述缀合抗体、缀合抗体 融合蛋白或其所述片断一起添加非缀合抗体、抗体融合蛋白或其片 断，作为维持治疗以防增生的肿瘤或其它患病细胞靶逃逸。
10.权利要求8或9的用途，其中所述缀合和非缀合的抗体、抗 体融合蛋白或其片断靶向于选自下组的抗原：CD3、CD4、CD5、CD8、 CD11c、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、 CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、 MUC1、腱生蛋白、Ia、HMI.24、HLA-DR以及肿瘤相关抗原。
11.权利要求10的用途，其中所述肿瘤相关抗原是血管内皮抗 原。
12.权利要求10的用途，其中所述哺乳动物选自人和家畜或宠 物。
13.权利要求10的用途，其中所述缀合和非缀合的抗体、抗体 融合蛋白或其片断是人源、鼠源、嵌合、灵长化或人源化的。
14.权利要求10的用途，其中所述抗体、抗体融合蛋白或其片 断缀合于选自下组的治疗剂：药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、 硼化合物、光敏剂和放射性核素。
15.权利要求1的用途，进一步包括向所述哺乳动物同时或相继 给药这样的治疗组合物，所述治疗组合物包括药学上可接受的载体 和包含至少两个抗体或其片断的抗体融合蛋白或其片断。
16.权利要求15的用途，其中任选地与所述抗体融合蛋白或其 片断一起添加非缀合抗体，作为维持治疗以防增生的肿瘤或其它患 病细胞靶逃逸。
17.权利要求15或16的方法，其中所述缀合和非缀合抗体靶向 于选自下组的抗原：CD3、CD4、CD5、CD8、CD11c、CD14、CD15、CD19、 CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、 CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、MUC1、腱生蛋白、Ia、HMI.24、 HLA-DR以及肿瘤相关抗原。
18.权利要求17的用途，其中所述肿瘤相关抗原是血管内皮抗 原。
19.权利要求17的用途，其中所述哺乳动物选自人和家畜或宠 物。
20.权利要求17的用途，其中所述缀合和非缀合的抗体是人源、 鼠源、嵌合、灵长化或人源化的。
21.权利要求17的用途，其中所述抗体缀合于选自下组的治疗 剂：药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光敏剂和放射 性核素。
22.权利要求7的用途，其中所述药物拥有选自下组的药学性 质：抗有丝分裂、烷化、抗代谢物、抗血管生成、细胞凋亡、生物 碱和抗生素剂以及它们的组合。
23.权利要求7的用途，其中所述药物选自下组：氮芥类、氮丙 啶衍生物、烷基磺酸酯类、亚硝基脲类、三氮烯类、叶酸类似物、 蒽环类抗生素、紫杉醇类、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、 抗生素、酶、表鬼臼毒素类、铂配位复合物、长春花生物碱类、取 代的脲、甲肼衍生物、肾上腺皮质阻遏剂、拮抗剂、内皮抑素、紫 杉酚、喜树碱类、阿霉素类及其类似物以及它们的组合。
24.权利要求7的用途，其中所述药物选自下组：环磷酰胺、表 鬼臼毒吡喃葡糖苷、长春新碱、普鲁苄肼、脱氢可的松、亚硝脲氮 芥、阿霉素、氨甲喋呤、博来霉素、地塞米松、丁酸苯酯、薯司他 丁-1、和甲酰四氢叶酸。
25.权利要求7的用途，其中所述毒素选自下组：篦麻毒素、相 思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNase)、Dnase I、葡萄球 菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、 假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
26.权利要求7的用途，其中所述免疫调节剂选自下组：细胞因 子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血生长因子、集落刺激因子 (CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成素、促血小板生成素和它们的 组合。
27.权利要求7的用途，其中所述免疫调节剂基本上由IL-1、 IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、G-CSF、GM-CSF、干扰 素-γ、α、β、或-γ、TNF-α、和“S1因子”组成。
28.权利要求7的用途，其中所述螯合剂选自下组：DTPA、DOTA、 TETA、NOTA以及合适的其上可缀合可检测标记物或细胞毒性剂的 肽。
29.权利要求28的用途，其中所示可检测标记物是荧光分子， 且所述细胞毒性剂是重金属或放射性核素。
30.权利要求26的用途，其中所述淋巴毒素选自下组：肿瘤坏 死因子、造血生长因子、集落刺激因子、干扰素、干细胞生长因子。
31.权利要求7的用途，其中所述光敏剂是发色团或染料。
32.权利要求7的用途，其中
(A)所述放射性核素基本上由于β-粒子发射而衰减，并且选自下 组：P-32、P-33、Sc-47、Fe-59、Cu-64、Cu-67、Se-75、As-77、 Sr-89、Y-90、Mo-99、Rh-105、Pd-109、Ag-111、I-125、I-131、 Pr-142、Pr-143、Pm-149、Sm-153、Tb-161、Ho-166、Er-169、Lu-177、 Re-186、Re-188、Re-189、Ir-194、Au-198、Au-199、Pb-211、Pb-212和Bi-213；
(B)其中所述放射性核素基本上由于俄歇粒子发射而衰减，并且 选自下组：Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、 Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192；或
(C)所述放射性核素基本上由于α-粒子发射而衰减，并且选自下 组：Ac-225、Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、 Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。
33.权利要求7的用途，其中所述治疗剂用于光动力学治疗和中 子俘获操作。
34.权利要求33的用途，其中所述光动力学治疗使用金属复合 物，且所述金属复合物选自下组：锌、铝、镓、镥和钯。
35.权利要求33的用途，其中所述中子俘获操作使用选自B-10、 Gd-157和U-235的放射性核素。
36.权利要求1的用途，其中所述疾病是B细胞相关病、T细胞 相关病或自身免疫病。
37.权利要求37的用途，其中所述B细胞相关病是不活跃形式 的B细胞淋巴瘤、攻击形式的B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、 急性淋巴细胞白血病、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症或多发性骨髓 瘤。
38.权利要求37的用途，其中所述B细胞相关病是人或兽医疾 病。
39.权利要求37的用途，其中所述B细胞相关病是非霍奇金氏 淋巴瘤。
40.权利要求37的用途，其中所述T细胞相关病是人或兽医T 细胞白血病或蕈样肉芽肿病。
41.权利要求37的用途，其中所述自身免疫病选自下组：急性 特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、 西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、 风湿热、多腺综合症、大疱类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、链 球菌感染后的肾炎、结节性红斑、Takayasu′s动脉炎、爱迪生氏病、 类风湿性关节炎、多发性硬化症、结节病、溃疡性结肠炎、多形红 斑、IgA肾病、结节性多发动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综 合征、血栓闭塞性脉管炎、干燥综合症、原发性胆汁性肝硬变、桥 本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮 肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、眶坏死性肉芽肿病、膜性肾病、 肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、 快速渐进性血管球性肾炎、牛皮癣和纤维性肺泡炎。
42.权利要求1的用途，其中患病组织上靶向抗原的比例超过正 常组织，两者之比大于1.6∶1。
43.权利要求1的用途，其中患病组织上靶向抗原的比例超过正 常组织，两者之比为5∶1。
44.权利要求1的用途，其中所述缀合和非缀合的抗体、抗体融 合蛋白或其片断定向于相同或不同的靶标。
45.权利要求1的用途，其中所述缀合和非缀合的抗体、抗体融 合蛋白、或其片断选自下组：完整IgG、F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、 scFvs、双链抗体、三链抗体或四链抗体。
46.权利要求1的用途，其中所述缀合和非缀合的抗体是抗-CD22 单克隆抗体。
47.权利要求1的用途，其中所述缀合和非缀合的抗体是人源化 LL2单克隆抗体。
48.权利要求47的用途，其中所述人源化LL2抗体由钇-90放射 性标记。
49.权利要求46的用途，其中所述抗-CD22单克隆抗体是人的。
50.权利要求44的用途，其中所述缀合抗体是以每剂20-600毫 克蛋白的剂量肠胃外给药的。
51.权利要求44的用途，其中所述缀合抗体是以每剂20-150毫 克蛋白的剂量肠胃外给药的。
52.权利要求44的用途，其中所述缀合抗体是以每剂20-100毫 克蛋白的剂量肠胃外给药的。
53.权利要求46的用途，其中所述哺乳动物接受作为每剂20-150 毫克蛋白的重复肠胃外剂量的所述抗-CD22单克隆抗体。
54.权利要求46的用途，其中所述哺乳动物接受作为每剂20-100 毫克蛋白的重复肠胃外剂量的所述抗-CD22单克隆抗体。
55.一种治疗组合物在制造用于治疗哺乳动物疾病的药物中的用 途，所述治疗组合物包括药学上可接受的载体和与至少一种靶抗原 和治疗剂相结合的多特异性多价抗体、片断或融合蛋白缀合物，其 中并不进行非放射性标记抗体的预先投药，且其中向所述哺乳动物 同时和相继地给药所述治疗组合物。
56.一种治疗组合物在制造用于治疗哺乳动物疾病的药物中的用 途，所述治疗组合物包括：
(A)与至少一种靶抗原相结合的多特异性多价抗体、片断或融合 蛋白；
(B)任选地包括清除剂，以允许所述组合物清除来自循环的非局 限抗体；和
(C)药学有效量的与所述多特异性多价抗体、片断或融合蛋白结 合的治疗缀合物，
其中并不进行非放射性标记抗体的预先投药，且其中向所述哺乳 动物同时和相继地给药所述治疗组合物。
发明领域
本发明涉及用于治疗B细胞相关的恶性瘤、尤其是渐进性非霍奇 金氏淋巴瘤的免疫治疗方法。具体地，本发明涉及用于治疗和诊断 哺乳动物B细胞相关病、T细胞相关病或自身免疫病的方法，所述方 法是通过向所述哺乳动物给药治疗组合物实现的，其中并不进行非 放射性标记抗体的预先投药。
发明背景
B细胞淋巴瘤表达这样的表面抗原，它们业已证明是用单克隆抗 体(Mab)治疗的良好靶标。无论是单独使用(裸抗体)或与化疗联合， 抗体都可与毒素或与放射性核素缀合用于放射性免疫治疗(RAIT)。 放射性标记的抗体在非标记抗体之后(Kaminski，M.S.等，J Clin. Oncol.19：3918-3928，2001)或与之一起(Press，O.W.等，New Engl. J.Med.329：1219-24，1993)给药以改善剂量分布。多数研究者使 用与非标记的鼠源或嵌合抗体相组合的放射性标记的小鼠抗体。从 毒理学角度的观点看，认为放射性标记小鼠抗体是有利的，这是因 为与嵌合抗体相比其半衰期更短。具有更长半衰期的Mab提供放射 性免疫缀合物在血液和骨髓中更长的滞留时间，并且可能因此诱发 更大的毒性。由于抗体本身几乎不诱发毒性，小鼠和嵌合标记抗体 都被用来通过据称是饱和机体内正常细胞和组织上的抗原而改善剂 量分布(参见Kaminski，美国专利No.5,595,721；Wiseman等，Crit. Rev.Oncol.Hemato.39：181-194，2001)。
单克隆抗体在癌症靶向放射性治疗(放射性免疫治疗；RAIT)中的 用途已在血液病如非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)中产生了令人瞩目的临 床效应。目前正研究新策略，以致力于最小化循环放射性核素的系 统毒性以及辐照对肿瘤的致敏。前者是通过预靶向进行的，而后者 是通过与放射性致敏药的联合治疗进行的。见Govindan，S.V等， Current Trends，Pharmaceutical Science and Technology Today 3：90-98，2000。
RAIT的抗肿瘤活性主要地是由于与抗体相连的放射性标记的相 关放射能，其发射持续呈指数规律渐减的低剂量等级的射线，表现 出异质的剂量沉积。有四种放射性标记的抗体产品正朝商业化发 展，以用于非霍奇金氏淋巴瘤的放射性免疫治疗。它们包括131I- tositumomab(BexxarTM)、90Y-ibritumomab tiuxetan(ZevalinTM)、 90Y-epratuzumab(hLL2)和131I-Lym-1。有关这些产品更详细的综述， 见Goldenberg，D.M.，Critical Reviews in Oncology/Hematology 39：195-201，2001，和Goldenberg，D.M.，J.Nucl.Med.43： 693-713，2002。
Bexxar(Corixa Corp.，Seattle，WA)和Zevalin(IDEC-Y2B8； IDEC Pharmaceuticals，San Diego，CA)都是针对表达在正常和恶 性B淋巴细胞表面上的CD20抗原的鼠源单克隆抗体(Mab)。Bexxar 用作为IgG2a鼠源Mab，添有冷性鼠源抗体，而Zevalin的鼠源抗体 被标记，且产品中添加了人鼠嵌合的利妥希玛(RituxanTM，IDEC- Genentech)。两种产品都提供了治疗前的冷性抗体投药，以改善肿 瘤靶向，这涉及输注1小时450mg非标记的Bexxar抗体，和输注 4-6小时450mg的利妥希玛连同Zevalin。两种产品都表现出比裸 抗体更高和更持久的效应，然而，它们也具有剂量限制的毒性，突 出地是骨髓中毒性。Zevalin经食品和药品监督管理局(FDA)批准用 于治疗复发性低级别或转化的B细胞非霍奇金氏淋巴瘤。在这些放 射性标记抗-CD-20Mab之前必需投药冷性抗体，以使得良好的肿瘤 定位成为可能。事实上，当牵涉到预先投药时，特定肿瘤部位上111 铟-Zevalin的特异性定位数从78％跌至15％肿瘤摄入(Wiseman等，同 前)。
Epratuzumab(90Y-epratuzurnab)是针对抗-CD22抗原的人源化 IgG1抗体。该抗原经抗体结合后快速内在化。业已报道裸抗体在滤泡 以及弥漫性的大B细胞淋巴瘤中表现出功效(Leonard，J.P.等， Epratuzumab(hLL2，抗-CD22humanized monoclonal antibody)is an active and well-tolerated therapy for refractory/relapsed diffuse large B-cell non-Hodgkin′s lymphoma(NHL).Blood (Suppl)96：578a[abstr.2482]，2000；Press，O.W.等， Immunotherapy of Non-Hodgkin′s Lymphomas.Hematology(Am.Soc. Hemato.Educ.Program)，p.221-40，2001)。预期Epratuzumab 不会引起人抗-人抗体(HAHA)，这使得它适合于反复投药。小鼠亲代 抗体mLL2由131I标记，且已在多种亚型的B细胞淋巴瘤中表现出功 效(Linden，O.等Clin.Cancer Res.5：3287s-3291s，1999)。内在 化后，131I标记的抗体被脱卤化，且放射性核素由细胞中释放出来。 放射性金属如钇经内在化后保留在细胞内(Sharkey，R.M.，等 Cancer Immnunol.Immunother.44：179-88，1997)。90Y较短的物 理半衰期在某些程度上补偿了epratuzumab较长的半衰期，并提供 了其组合的合理性。
RAIT通常作为单次输注给予。不过，分级途径存在理论上的优 势，因为分级将会更好地处理吸收剂量的异质性问题，如在 O′Donoghue，J.A.，Dosimetric Principles of Targeted Radiotherapy，in Radioimmunotlerapy of Cancer，A.R.Fritzberg (编)，Marcel Dekker，Inc.，p.1-20，New York，Basel，2000中 所概述的那样。也有实验数据支持治疗效应可通过将放射性标记抗 体大的单次给药分割成许多更小的给药得以提高(Schlom，J.等J. Natl.Cancer Inst.82：763-71，1990)。临床上业已利用小鼠抗体 研究了两次输注以及多次输注的途径(DeNardo，G.L.，等Cancer Biother.Radiopharm.13：239-54，1998；Vose，J.M.，等J Clin. Oncol.18：1316-23，2000)。
业已报道了有关CD22抗原表达的肿瘤内可变性。在来自五个患 者的新鲜肿瘤样品中，发现52-89％的淋巴瘤细胞具有抗-CD22 MAb HD6的抗原(Press，O.W.等Cancer Res.49：4906-12，1989)。使 用远程β-辐射源的RAIT的一个所谓的优势在于其在靶细胞附近杀伤 抗原阴性肿瘤细胞的能力。通过在治疗前评估肿瘤细胞的抗原表 达，人们能够研究此概念在使用抗-CD22 90Y-标记的epratuzumab的 RAIT设置下的临床相关性。
采取研究以验证剂量分级的理论优势以及所发表的支持它的实 验数据。所述研究旨在利用放射性标记的人源化抗体调查分级RAIT 的可行性。发现在为放射剂量测定之目的用100mg人源化CD22Mab， 即由111In标记的epratuzumab预先投药之后，随后长达2-3周每周 一次高达7.5mCi/m2剂量的90Y标记的epratuzumab的分级剂量，产 生了可耐受且有效的放射性免疫治疗(Linden等，Cancer Biother Radiopharm 2002；17：490[abstract 47]。尽管这些临床研究提 示放射性免疫缀合物的分级疗法是可行的，尚未与给药的单次高剂 量放射性免疫缀合物就安全性和有效性进行过比较。由于用111In的 首次“放射剂量测定”剂量含有100mg抗体，且每次相继注射也含 有此裸抗体剂量，也不可能确定总计至少300mg epratuzumab的这 些剂量是否如引述的涉及CD20抗体的其它研究中所提示的那样，也 作预先投药功效之用。因此，由这些研究不可判断此类放射性免疫 治疗是否必需任何预先投药，特别是用CD22抗体的放射性免疫治 疗。
我们现在发现在本发明中并不象现有技术中所实施的那样，使用 预先投药以饱和正常组织和脾中的抗原性位点，这与其它发表的研 究和Kaminski的美国专利No.5,595,721相反。无疑，此处公开的 本发明证明无需象现有技术中所实施的那样高抗体预先投药。
发明概述
因此，本发明的目的是提供用于治疗哺乳动物疾病的方法，所述 方法是通过给药治疗组合物实现的，其中并不进行非放射性标记抗 体、片断或融合蛋白的预先投药。
本发明的目的也是不仅使上述方法给药简单易行，而且使药物组 合物本身保持治疗活性并具有相似的效应等级，而不会令较高剂量 的裸抗体影响肿瘤。
本发明的目的还是提供在治疗攻击形式的非霍奇金氏淋巴瘤中 表现出更为有效的效应的方法，这不同于现有技术所证明的仅在不 活跃形式的淋巴瘤中表现出功效的方法。
根据本发明的实施方案，这些及其它目的是通过提供用于治疗哺 乳动物疾病的这样的方法实现的，所述方法包括同时或相继地向所 述哺乳动物给药这样的治疗组合物，所述治疗组合物包括药学上可 接受的载体和至少一种缀合的抗体或其片断，或者缀合的抗体融合 蛋白或其片断，其中并不进行非放射性标记抗体、片断或融合蛋白 的预先投药。任选地与所述缀合的抗体、片断或融合蛋白一起添加 非缀合的抗体、片断或融合蛋白，作为维持治疗以防肿瘤细胞靶逃 逸。
在优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗疾病如B细胞相关的 恶性瘤的方法。另外，它也可用于治疗自身免疫病，以及T细胞相 关的恶性瘤。
在另一个优选的实施方案中，本发明缀合和非缀合的抗体、片断 和融合蛋白可靶向于选自下组的抗原：CD3、CD4、CD5、CD8、CD11c、 CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、 CD38、CD40、CD40L、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、Ia、HMI.24、 HLA-DR、腱生蛋白、MUC1以及B细胞肿瘤相关抗原，包括血管内皮 抗原，如血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(P1GF)。在 相关的支脉中，本发明缀合和/或非缀合的抗体、片断或融合蛋白可 以是相同或不同的。另外，这些抗体可以是人源、鼠源、嵌合、类 人灵长化或人源化的。此外，这些抗体、片断或融合蛋白可选自下 组：完整IgG、F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、scFvs、双链抗体、三 链抗体或四链抗体，并且可缀合于至少一种治疗剂。
根据本发明的另一个方面，提供了如上文所述的方法，其中用一 种或多种这样的抗体治疗哺乳动物受试者例如人和家畜或宠物，所 述抗体缀合于选自下组的一种或多种治疗剂：药物、毒素、免疫调 节剂、螯合剂、硼化合物、光敏剂和放射性核素。
又在另一个优选的实施方案中，所述治疗组合物包括所述抗体或 抗体与免疫调节剂组合的融合蛋白。所述融合抗体可包括针对不同 抗原的抗体，以及针对同一抗原不同表位的抗体。
本发明如此设想上述方法，其中缀合和非缀合的抗体是抗-CD22 单克隆抗体，它以每剂20-600毫克蛋白的剂量肠胃外给药，更优选 每剂20-150毫克蛋白，并且最优选每剂20-100毫克蛋白。另外， 所述哺乳动物可按受作为优选每剂20-150毫克蛋白的重复肠胃外剂 量的所述抗-CD22抗体，并且更优选每剂20-100毫克蛋白。重要的 是意识到这样的剂量是作为实际治疗剂量给予的，无论是用于改善 靶向或是用于剂量测定之目的，都无需如以前Juweid等，Clin. Cancer Res.5：3292s-3303s，1999(其中50mg与111In或另一诊 断同位素缀合的CD22 Mab的预先投药是必需的)所实施的那样需要 任何预先投药。这类研究中尚未进行过尝试来评估没有预先投药的 方案下，所述具有不同蛋白剂量抗体的治疗性放射免疫缀合物直接 见效的能力。
在另一个优选的实施方案中，用于治疗哺乳动物疾病的方法包括 向所述哺乳动物给药这样的治疗组合物，其包括药学上可接受的载 体和与至少一种靶抗原和治疗剂相结合的多特异性多价抗体、片断 或融合蛋白缀合物，其中并不进行非放射性标记抗体的预先投药。
又在另一个优选的实施方案中，用于治疗哺乳动物疾病的方法包 括：(a)向所述哺乳动物给药这样的治疗组合物，其包括与至少一种 靶抗原相结合的多特异性多价抗体、片断或融合蛋白；(b)任选地包 括清除剂，以允许所述组合物清除来自循环的非局限抗体；和(c)向 所述哺乳动物给药药学有效量的与所述多特异性多价抗体、片断或 融合蛋白结合的治疗缀合物，且其中并不进行非放射性标记抗体的 预先投药。
本发明的其它目的、特点和优势将会因下列详述的说明和所附的 权利要求而变得显而易见。
优选实施方案的详细说明
除非另行指定，“一”或“一种”意味着“一种或多种”。
1.定义
在以下的说明中，使用了许多术语，并提供以下定义以促进对本 发明的理解。
非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)是指涉及淋巴结、脾、其它器官并且通 常是骨髓的淋巴瘤病家族。有至少30种不同类型的NHL。两种常见 类型为滤泡性(轻度或不活跃)和攻击性弥漫性大细胞(中度或高 度)淋巴瘤。
如本文所述， 抗体是指全长(即天然存在或通过正常的免疫球蛋 白基因片断重组过程形成的)免疫球蛋白分子(如IgG抗体)或免疫球 蛋白分子的免疫学活性(即特异性结合)部分，象抗体片断。
抗体片段是抗体的一部分，如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、 sFv等。无论结构如何，抗体片断与被完整抗体所识别的同一抗原相 结合。例如，抗-CD22单克隆抗体片断与CD22表位相结合。术语”抗 体片断”也包括任何合成或遗传改造的蛋白，它们通过结合特异性 抗原形成复合物而象抗体那样起作用。例如，抗体片断包括分离的 由可变区组成的片断，如由重链和轻链可变区组成的″Fv″片断，其 中轻链和重链可变区通过肽接头相连的重组单链多肽分子(“scFv 蛋白”)，以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。
裸或冷性抗体一般是未与治疗剂缀合(非缀合)的整个抗体。之 所以这样，是因为抗体分子的Fc部分提供了效应器功能，如补体固 定和ADCC(抗体依赖性细胞细胞毒)，该功能使得可能导致细胞裂解 的机制运转起来。不过，有可能Fc部分并非是治疗功能所必需的， 而其它机制如细胞凋亡开始运行。裸抗体也是非放射性标记的抗 体，其包括多克隆和单克隆抗体，以及某些重组抗体，如灵长化类 人、嵌合、人源化或人抗体。
嵌合抗体是这样的重组蛋白，其含有包括互补决定区(CDRs)在内 的源于一个物种抗体(优选为啮齿动物抗体)的可变结构域，而该 抗体分子的恒定结构域源于人抗体的恒定结构域。对于兽医应用， 嵌合抗体的恒定结构域可源于其它物种的恒定结构域，如猫或狗。
人源化抗体是这样的重组蛋白，其中将来白于一个物种抗体如啮 齿动物抗体的CDRs从啮齿动物抗体的重链和轻链可变链上转移到人 重链和轻链可变结构域之中。该抗体分子的恒定结构域源于人抗体 的恒定结构域。
人抗体是由转基因小鼠获得的抗体，该小鼠业已被”改造”以响 应抗原刺激生产特异性人抗体。在这种技术中，将人重链和轻链基 因座的元件引入到衍生自这样的胚胎干细胞系的小鼠株系中，其含 有内源重链和轻链基因座的靶向破坏。该转基因小鼠能够合成特异 于人抗原的人抗体，并且该小鼠可用于生产分泌人抗体的杂交瘤。 用于获得来自转基因小鼠的人抗体的方法由Green等，Nature Genet. 7：13(1994)、Lonberg等，Nature 368：856(1994)以及Taylor 等，Int.Immun.6：579(1994)描述。也可通过基因或染色体转染 法、以及噬菌体展示技术构建全人抗体，所有这些方法都是本领域 公知的。例如参见McCafferty等，Nature 348：552-553(1990)关 于由来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因库在体外生产人 抗体及其片断。在这种技术中，将抗体可变结构域基因框内克隆到 丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片断 展示在噬菌体颗粒的表面。由于该丝状颗粒含有所述噬菌体基因组 的单链DNA拷贝，基于所述抗体功能性质的选择也导致编码表现出 那些性质的抗体的基因的选择。以这种方式，所述噬菌体模拟B细 胞的一些性质。噬菌体展示能够以多种形式进行，有关综述，参见 如Johnson和Chiswell，Current Opinifozlin Structural Biology 3：5564-571(1993)。
人抗体也可由在体外激活的B细胞产生。见美国专利No. 5,567,610和5,229,275，特此将其全文并入作为参考。
治疗剂是与抗体成分分别、同时或相继地给药、或缀合于抗体成 分(即抗体或抗体片断、或亚片断)的分子或原子，并且可用于疾 病的治疗。治疗剂的实例包括抗体、抗体片断、药物、毒素、核酸 酶、激素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光敏剂或染料以及放 射性同位素。
免疫调节剂是如在本发明中所定义的治疗剂，当其存在时，其改 变、抑制或刺激机体的免疫系统。典型地，可用于本发明的免疫调 节剂刺激免疫细胞增殖或在免疫应答级联中变得激活，例如巨噬细 胞、B细胞和/或T细胞。
免疫缀合物是抗体组分与治疗剂或诊断剂的缀合物。所述诊断剂 可包括放射性或非放射性标记、造影剂(例如用于磁共振成象、计 算断层分析或超声)，且所述放射性标记可以是发射γ、β、α、俄歇 电子或正电子的同位素。
表达载体是包含在宿主细胞中表达的基因的DNA分子。典型地， 基因表达处于某些调控元件的控制之下，包括组成型或诱导型启动 子、组织特异性调控元件和增强子。此种基因被表述为是“可操作 地连接于”所述调控元件。
重组宿主可以是含有克隆载体或表达载体的任何原核或真核细 胞。该术语也包括这样的原核或真核细胞以及转基因动物，它们业 已被遗传改造，从而在所述宿主细胞的染色体或基因组中或者宿主 细胞的细胞中含有所克隆的基因。合适的哺乳动物宿主细胞包括骨 髓瘤细胞，如SP2/0细胞和NSO细胞，以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、 杂交瘤细胞系以及可用于表达抗体的其它哺乳动物宿主细胞。同样 尤其可用于表达mAb及其它融合蛋白的是在WO 0063403 A2中公开 的人细胞系PER.C6，与常规的哺乳动物细胞系如CHO、COS、Vero、 Hela、BHK和SP2细胞系相比，其生产2到200倍更多的重组蛋白。 具有修饰的免疫系统的特定转基因动物尤其可用于制备全人抗体。
如本文所用，术语 抗体融合蛋白是重组生产的抗原结合分子，其 中两个或多个相同或不同的单链抗体或者具有相同或不同特异性的 抗体片断区段被连接在一起。融合蛋白的结合价预示着该融合蛋白 对单链抗原或表位具有多少结合臂或位点，即单价、二价、三价或 多价。抗体融合蛋白的多结合价意味着它能够在与抗原的结合中利 用多重相互作用，从而增强对抗原结合的亲抗原性。特异性预示着 抗体融合蛋白能够结合多少抗原或表位；即单特异性、双特异性、 三特异性、多特异性。运用这些定义，天然抗体如IgG是双价的， 因为它有两个结合臂，但它是单特异性的，因为它结合一个表位。 单特异性多价融合蛋白对表位具有不止一个结合位点，但仅与一个 表位结合，例如具有与同一抗原反应的两个结合位点的双链抗体。 所述融合蛋白可包括单个抗体组分，不同抗体组分的多价或多特异 性组合，或者同一抗体组分的多个拷贝。所述融合蛋白可额外包括 抗体或抗体片断和治疗剂。适用于此类融合蛋白的治疗剂的实例包 括免疫调节剂(“抗体-免疫调节剂融合蛋白”)和毒素(“抗体- 毒素融合蛋白“)。一种优选的毒素包括核糖核酸酶(RNase)，优选 为重组RNase。
多特异性抗体是能够同时与具有不同结构的至少两个靶标结合 的抗体，如结合两个不同抗原、同一抗原上的两个不同表位、或者 半抗原和/或抗原或表位。一种特异性将是针对B细胞、T细胞、髓 细胞、血浆细胞和肥大细胞抗原或表位的。另一种特异性可以是针 对同一细胞类型上的不同抗原的，如CD3、CD4、CD5、CD8、CDllc、 CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD 33、CD37、 CD38、CD40、CD40L、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、Ia、HMI.24、 HLA-DR、腱生蛋白、MUC1以及B细胞肿瘤相关抗原，包括血管内皮 抗原，如VEGF和P1GF。多特异性多价抗体是具有不止一个结合位点 的构建体，且所述结合位点具有不同的特异性。例如双链抗体，其 中一个结合位点与一种抗原反应，而另一个则与另一种抗原反应。
双特异性抗体是能够同时与具有不同结构的两个靶标结合的抗 体。双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片断(bsFab)具有至少一个 与例如B细胞、T细胞、髓细胞、血浆细胞和肥大细胞抗原或表位特 异性结合的臂，以及至少一个与带有治疗剂或诊断剂的可靶向缀合 物特异性结合的其它臂。许多双特异性融合蛋白可利用分子改造生 产。在一种形式中，双特异性融合蛋白是单价的，例如，由具有针 对一种抗原的单个结合位点的scFv和具有针对第二抗原的单个结合 位点的Fab片断组成。在另一种形式中，双特异性融合蛋白是二价 的，例如，由具有针对一种抗原的结合位点的IgG和具有针对第二 抗原的两个结合位点的两个scFv组成。
犬源化或猫源化抗体是这样的重组蛋白，其中业已将啮齿动物 (或另一物种)单克隆抗体的互补决定区从啮齿动物(或另一物种) 免疫球蛋白的重链和轻链可变结构域分别转移到狗或猫免疫球蛋白 的可变结构域中。
类人灵长化抗体是这样的重组蛋白，其中业已将类人灵长动物 (如猴子)单克隆抗体的互补决定区从啮齿动物(或另一物种)免 疫球蛋白的重链和轻链可变结构域转移到类人灵长动物免疫球蛋白 的可变结构域中。
家畜动物包括大动物如马、牛、绵羊、山羊、美洲驼、羊驼和猪， 以及宠物。在优选的实施方案中，家畜动物为马。
宠物包括作为宠物饲养的动物。这些主要地是狗和猫，尽管小啮 齿动物如豚鼠、仓鼠、大鼠和雪貂也包括在内，正象类人灵长动物 如猴子那样。在优选的实施方案中，宠物是狗或猫。
术语“清除剂“是指结合靶向成分的结合位点的抗体，其中所述 靶向成分可以是抗体、抗原结合抗体片断或非抗体靶向成分。在更 为优选的方法中，清除剂是单克隆抗体，为第一步中所用缀合物的 单克隆抗体的抗独特型，如美国申请流水号No.08/486,166中所述 的那样。在另一个优选的实施方案中，清除剂被多个糖残基如半乳 糖取代，这允许所述清除剂能够通过肝中的脱唾液酸糖蛋白受体很 快地从循环中清除。
2.包括嵌合、人源化和人抗体在内的单克隆抗体的制备
单克隆抗体(MAbs)是针对特定抗原的同种抗体群，且所述抗体仅 包括一种类型的抗原结合位点，并仅与抗原决定簇上的一个表位结 合。
针对特定抗原的啮齿动物单克隆抗体可通过本领域技术人员公 知的方法获得。例如，参见Kohler和Milstein，Nature 256：495 (1975)，以及Coligan等(编)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY， VOL.1，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley & Sons 1991)[以下称作 ″Coligan″]。简要地，单克隆抗体可这样获得，即用包括抗原的组 合物注射小鼠，通过移取血清样品验证抗体生产的存在，取出脾脏 以获得B淋巴细胞，使所述B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂 交瘤，克隆所述杂交瘤，选择产生针对所述抗原的抗体的阳性克隆， 培养产生针对所述抗原的抗体的所述克隆，并从所述杂交瘤培养物 中分离所述抗体。
MAbs可通过许多充分建立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯 化。此类分离技术包括蛋白A琼脂糖亲和层析，大小排阻层析，以 及离子交换层析。例如，参见Coligan第2.7.1-2.7.12页及第 2.9.1-2.9.3.页。也参见Baines等，″Purification of Immunoglobulin G(IgG)，″in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，VOL. 10，pages 79-104(The Humana Press，Inc.1992)。
在初次引起针对免疫原的抗体后，可对抗体进行测序并随后通过 重组技术制备。鼠源抗体和抗体片断的人源化和嵌合是本领域技术 人员众所周知的。例如，人源化单克隆抗体是这样产生的，即将小 鼠互补决定区从小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变链上转移到人可变 结构域中，然后取代鼠源对应物框架区中的人残基。使用衍生自人 源化单克隆抗体的抗体组分避免了与鼠源恒定区免疫原性相关的潜 在问题。
例如，用于克隆鼠源免疫球蛋白可变结构域的一般技术由 Orlandi等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 86：3833(1989)的出版 予以描述，特此将其全文并入作为参考。用于构建嵌合抗体的技术 是本领域技术人员众所周知的。作为举例，Leung等，Hybridoma 13：469(1994)描述了他们是如何通过将编码抗-CD22抗体LL2单克 隆抗体Vκ和VH结构域的DNA序列与相应的人κ和IgG1恒定区结构域 组合生产LL2嵌合体的。该出版物也分别提供了LL2轻链和重链可 变区Vκ和VH的核苷酸序列。例如，用于生产人源化MAbs的技术由 Jones等，Nature 321：522(1986)，Riechmann等，Nature 332：323 (1988)，Verhoeyen等，Science 239：1534(1988)，Carter等，Proc. Natl Acad.Sci.USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech. 12：437(1992)以及Singer等，J.Immun.150：2844(1993)描述， 特此将其中每一篇都并入作为参考。
嵌合抗体是这样的重组蛋白，其含有包括源于一个物种动物如啮 齿动物抗体CDRs在内的可变结构域，而该抗体分子的其余部分即恒 定结构域源于人抗体。因此，嵌合单克隆抗体也可以通过用一个或 多个不同的人FR替换嵌合mAb可变结构域中鼠源FR序列而人源化。 具体地，将小鼠CDRs从小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变链转移到人 抗体相应的可变结构域之中。由于简单地将小鼠CDRs转移到人FRs 中通常导致抗体亲和力的下降或者甚至丧失，可能需要附加的修饰 以恢复鼠源抗体的原始亲和力。这可通过用其鼠源对应物替换FR区 中的一个或多个某些人残基实现，以获得对其表位持有良好结合亲 和力的抗体。例如，参见Tempest等，Biotechnology 9：266(1991) 和Verhoeyen等，Science 239：1534(1988)。此外，可通过CDRs 的诱变提高人源化、嵌合及人MAbs对特定表位的亲和力，从而更低 剂量的抗体可能象诱变前更高剂量的较低亲和力MAb一样有效。例 如参见WO0029584A1。
用于生产本发明抗体的另一种方法是通过在转基因家畜的乳汁 中生产。参见如Colman，A.，Biochem.Soc.Symp.，63：141-147， 1998；美国专利5,827,690，特此将两篇都全文并入作为参考。制备 两个DNA构建体，它们分别含有编码成对免疫球蛋白重链和轻链的 DNA区段。将DNA区段克隆到含优选在哺乳动物上皮细胞中表达的启 动子序列的表达载体中。实例包括但不限于来自兔、奶牛和绵羊酪 蛋白基因、奶牛α-乳球蛋白基因、绵羊β-乳球蛋白基因以及小鼠乳 清酸性蛋白基因的启动子。优选地，插入片断在其3′侧侧接来自乳 腺特异性基因的同源基因组序列。这提供了多聚腺苷酰化位点和转 录本稳定序列。将所述表达盒共注射到受精的哺乳动物卵的前核 中，然后将其植入到受体雌兽的子宫之中，并使之受孕。生产后， 通过Southern分析筛选子代中两种转基因的存在。为使抗体存在， 重链和轻链基因都必需在同一细胞中同时表达。利用本领域公知的 标准免疫学方法分析来自转基因雌兽的乳汁中抗体或抗体片断的存 在及功能。抗体可利用本领域公知的标准方法从乳汁中纯化。
本发明的全人抗体，即人抗-CD20 MAbs或者其它用于与人源化、 嵌合或人抗-CD20抗体联合治疗的人抗体如抗-CD19、抗-CD22、抗- CD21或抗-CD23 MAbs可由转基因非人动物获得。参见如Mendez等， Nature Genetics 15：146-156(1997)；美国专利No.5,633,425, 特此将这两篇都全文并入作为参考。例如，可从持有人免疫球蛋白 基因座的转基因小鼠中回收人抗体。所述小鼠的体液免疫系统是通 过失活内源免疫球蛋白基因并引入人免疫球蛋白基因座而被人源化 的。人免疫球蛋白基因座极为复杂，且包括大量不连续的区段，总 计占据人基因组的几乎0.2％。为确保该转基因小鼠能够生产足够的 抗体库，必需将大部分人重链和轻链基因座引入到小鼠基因组中。 这是以始于在种系构型中含有人重链或轻链免疫球蛋白基因座的酵 母人工染色体(YACs)的形成的逐步过程实现的。由于每一个插入物 大小约为1Mb，YAC的构建需要免疫球蛋白基因座重叠片断的同源 重组。介由含YAC的酵母球芽与小鼠胚胎干细胞的融合，将一个含 重链基因座，而一个含轻链基因座的两个YACs单独地引入到小鼠 中。然后将胚胎干细胞克隆微注射到小鼠胚泡中。筛选所得的嵌合 雄兽通过其种系传递YAC的能力，并与鼠源抗体生产缺陷的小鼠进 行育种。一种含有人重链基因座而另一种含有人轻链基因座的两种 转基因株系的育种，创建了响应免疫生产人抗体的子代。
此外，最近用于生产双特异性mAbs的方法包括改造的具有额外 的半胱氨酸残基的重组mAbs，从而它们比更为常见的免疫球蛋白同 种型更加强烈地交联。参见如FitzGerald等，Protein Eng.10(10)： 1221-1225，1997。另一种途径是改造连接了两个或多个不同单链抗 体或具有所选的双重特异性抗体片断区段的融合蛋白。参见如 Coloma等，Nature Biotech.15：159-163，1997。许多双特异性融 合蛋白可利用分子工程产生。在一种形式中，所述双特异性融合蛋 白是单价的，例如，由具有针对一种抗原的单个结合位点的scFv和 具有针对第二抗原的单个结合位点的Fab片断组成。在另一种形式 中，所述双特异性融合蛋白是二价的，例如，由具有针对一种抗原 的结合两个位点的IgG和具有针对第二抗原的两个结合位点的两个 scFv组成。
连接了两个或多个不同单链抗体或抗体片断的双特异性融合蛋 白是以类似的方式生产的。可利用重组法生产融合蛋白。例如，可 生产包含源于人源化单克隆抗-CD20抗体的Fab片断和源于鼠源抗- diDTPA的scFv的融合蛋白。柔性接头如GGGS将所述scFv连接于抗 -CD20抗体重链的恒定区上。备选地，所述scFv可连接于另一人源 化抗体轻链的恒定区上。通过PCR反应将对于重链Fd与所述scFv 框内连接所必需的合适的接头序列引入到VL和VK结构域中。然后 将编码所述scFv的DNA片断连到含编码CH1结构域的DNA序列的阶 段载体中。切下所得的scFv-CH1构建体，并连到含编码抗-CD20抗 体VH区的DNA序列的载体中。所得的载体可用于转染合适的宿主细 胞，如哺乳动物细胞用于表达所述双特异性融合蛋白。
此类双价和双特异性抗体的实例见于2002年8月1日递交的美 国专利申请60/399,707、2002年3月1日递交的60/360,229、2002 年6月14日递交的60/388,314以及2002年4月5日递交的 10/116,116，特此将它们全都并入作为参考。
3.抗体片断的生产
识别特定表位的抗体片断可通过已知的技术产生。所述抗体片断 是抗体的抗原结合部分，如如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、sFv等。其 它抗体片断包括但不限于：F(ab)′2片断，其可通过胃蛋白酶消化抗 体分子生产，以及Fab′片断，其可通过还原F(ab)′2片断的二硫桥产 生。备选地，可构建Fab′表达文库(Huse等，1989，Science 246： 1274-1281)以允许快速且容易地鉴定具有期望特异性的单克隆Fab′ 片断。本发明涵盖抗体和抗体片断。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。所述VL和VH 结构域结合以形成靶结合位点。这两个结构域进一步通过肽接头(L) 共价连接。scFv分子或者被表示为VL-L-VH，如果VL结构域是所述 scFv分子的N-端部分的话，或者被表示为VH-L-VL，如果VH结构域 是所述scFv分子的N-端部分的话。用于制备scFv分子和设计合适 的肽接头的方法描述在美国专利No.4,704,692、美国专利No. 4,946,778、R.Raag和M.Whitlow，″Single Chain Fvs.″FASEB 9： 73-80(1995)以及R.E.Bird和B.W.Walker，Single Chain Antibody Variable Regions，TIBTECH 9：132-137(1991)中。特 此将这些参考文献并入作为参考。
抗体片断可通过全长抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌(E. coli)或另一宿主中表达编码该片断的DNA制备。抗体片断可通过 常规方法通过全长抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化获得。例如， 抗体片断可通过用胃蛋白酶酶切抗体生产，以提供表示为F(ab′)2 的5S片断。该片断可进一步使用硫醇还原剂切割，并且任选地使用 因二硫键切割产生的巯基的封闭基团，以生产3.5S的Fab′单价片 断。备选地，利用木瓜蛋白酶酶切直接产生两个单价Fab片断和一 Fc片断。例如，这些方法由Goldenberg美国专利No.4,036,945和 4,331,647及其中所含的参考文献描述，特此将所述专利全文并入作 为参考。同研，参见Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89： 230(1960)；Porter，Biochem.J 73：119(1959)，Edelman等，in METHODS IN ENZYMOLOGY，Volume 1，p.422(Academic Press1967) 以及Coligan第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
另一种形式的抗体片断是编码单链互补决定区(CDR)的肽。CDR是 抗体可变区中在结构上与抗体与之结合的表位互补的区段，并且比 可变区的其余部分更为可变。因此，CDR有时被称之为高变区。一个 可变区包含三个CDRs。CDR肽可通过构建编码目的抗体CDR的基因 获得。例如，此类基因通过利用聚合酶链式反应由抗体生产细胞的 RNA合成可变区来制备。例如，参见Larrick等，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：106(1991)； Courtenay-Luck，″Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，″in MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION， ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等(编)，第 166-179页(Cambridge University Press 1995)以及Ward 等，″Genetic Manipulation and Expression of Antibodies，″in MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等 (编)，第137-185页(Wiley-Liss，Inc.1995)。
也可以使用其它切割抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻链 -重链片断，进一步切割片断，或者其它酶促、化学或基因技术，只 要所述片断结合被完整抗体所识别的抗原即可。
4.多特异性和多价抗体
本文所述的具有相同特异性的抗体以及用于联合治疗的具有不 同特异性的其它那些抗体，也可制备为多特异性抗体(包括至少一 个针对CD20表位或抗原的结合位点和至少一个针对CD20上另一表 位或另一抗原的结合位点)和多价抗体(包括多个针对同一表位或 抗原的结合位点)。
本发明提供了双特异性抗体或抗体片断，其具有至少一个特异性 结合靶向的细胞标志的结合区，和至少另一个特异性结合可靶向缀 合物的结合区。可靶向缀合物包括载体部分，其包含或带有至少一 个被所述双特异性抗体或抗体片断的至少一个结合区所识别的表 位。
许多重组方法可用于生产如上文所述的双特异性抗体和抗体片 断。
本发明也设想多价抗体。该多价靶结合蛋白是通过第一和第二多 肽的结合构建的。所述第一多肽包括第一单链Fv分子，共价连接于 第一免疫球蛋白样结构域，其优选是免疫球蛋白轻链可变区结构 域。所述第二多肽包括包括第二单链Fv分子，共价连接于第二免疫 球蛋白样结构域，其优选是免疫球蛋白重链可变区结构域。每一个 所述第一和第二单链Fv分子都形成了靶结合位点，且所述第一和第 二免疫球蛋白样结构域结合起来以形成第三靶结合位点。
具有VL-L-VH构型(其中L为接头)的单链Fv分子可与具有 VH-L-VL构型的另一单链Fv分子结合以形成二价二聚体。在这种情 况下，第一Fv分子的VL结构域和第二Fv分子的VH结构域结合以 形成一个靶结合位点，而第一Fv分子的VH结构域和第二Fv分子的 VL结构域结合以形成另一个靶结合位点。
本发明的另一个实施方案是双特异性三价靶向蛋白，其包括非共 价结合的两个异源多肽链以形成三个结合位点，其中两个对一个靶 标具有亲和力，而第三个对半抗原具有亲和力，所述半抗原可制备 并连接于载体上用作为诊断和/或治疗剂。优选地，所述结合蛋白具 有两个相似的抗原结合位点和一个不同的抗原结合位点。所述双特 异性三价靶向剂具有两个不同的scFvs，一个scFv含有来自一个抗 体的两个VH结构域，通过短接头连接于另一抗体的VL结构域，而第 二个scFv含有来自第一抗体的两个VL结构域，通过短接头连接于另 一抗体的VH结构域。用于产生来自VH和VL结构域的多价多特异性试 剂的方法条件是由宿主生物体中的DNA质粒合成的个体链完全是由 VH结构域(VH链)或完全是由VL结构域(VL链)以这种方式构成的， 从而可通过一个VH链与一个VL链的非共价结合生产任何多价和多特 异性的试剂。例如，为形成三价三特异性试剂，所述VH链将包括三 个VH结构域的氨基酸序列，每一个都来自具有不同特异性的抗体， 通过具有可变长度的肽接头接合起来，而VL链将包括互补的VL结构 域，通过类似于VH链所用的肽接头接合起来。由于抗体的VH和VL结 构域以反平行方式结合，本发明优选的方法以VH链的VH结构域相反 的次序安置VL链的VL结构域。
5.双链抗体、三链抗体和四链抗体
本发明的抗体也可用于制备功能性双特异性单链抗体(bscAb)， 也称之为双链抗体，并且可利用重组方法在哺乳动物细胞中生产。 参见如Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.，92：7021-7025，1995， 特此并入。例如，bscAb是利用重组方法介由甘氨酸-丝氨酸接头接 合两个单链Fv片断生产的。两目的抗体的V轻链(VL)和V重链(VH) 结构域是利用标准PCR方法分离的。然后将由各杂交瘤获得的VL和 VH cDNA接合起来以在两步融合PCR中形成单链片断。第一PCR步骤 引入(Gly4-Ser1)3接头，而第二步骤将VL和VH扩增子接合起来。然后 将各单链分子克隆到细菌表达载体中。继扩增后，切下单链分子中 的一个，并亚克隆到含第二单链目的分子的另一载体中。将所得的 bscAb片断亚克隆到真核表达载体中。功能性蛋白的表达可通过将载 体转染到中国仓鼠卵巢细胞中获得。以类似的方式制备双特异性融 合蛋白。双特异性单链抗体和双特异性融合蛋白包括在本发明的范 围之内。
例如，人源化、嵌合或人抗-CD22单克隆抗体可用于生产抗原特 异性双链抗体、三链抗体和四链抗体。单特异性双链抗体、三链抗 体和四链抗体选择性地结合靶向的抗原，并且随着分子上结合位点 数目的增加，对靶细胞的亲和力增大，并在期望位置上观察到更长 的滞留时间。对于双链抗体，利用了包括通过五氨基酸残基接头连 接于人源化CD22Mab的Vκ多肽的人源化CD22MAb的VH多肽的两条 链。每条链形成人源化CD22双链抗体的一半。在三链抗体的情况下， 利用了包括不通过接头连接于人源化CD22Mab的Vκ多肽的人源化 CD22MAb的VH多肽的三条链。每条链形成hCD22三链抗体的三分之 一。
本文所述双特异性双链抗体优选的用途是用于预靶向CD22阳性 肿瘤，用于随后特异性递送诊断或治疗剂。这些双链抗体选择性地 结合靶向的抗原，允许增大的亲和力和期望位置上更长的滞留时 间。而且，非抗原结合的双链抗体被很快地从机体中清除，并且正 常组织的暴露被最小化。所述诊断和治疗剂可包括同位素、药物、 毒素、细胞因子、激素、生长因子、缀合物、放射性核素和金属。 例如，钆金属被用于磁共振成像(MRI)。放射性核素的实例有225AC、 18F、68Ga、67Ga、90Y、86Y、111In、131I、125I、123I、99mTc、94mTc、186Re、 188Re、177Lu、62Cu、64Cu、67Cu、212Bi、213Bi、32p、11C、13N、15O、76Br和211At。其它放射性核素作为诊断和治疗剂也是可获得的，特别是 处于60到4,000keV能量区的那些。
更为最近地，也业已报道过具有双重特异性的四价串连双链抗体 (称作tandab)(Cochlovius等，Cancer Research(2000) 60：4336-4341)。所述双特异性tandab是两个完全相同的多肽的二 聚体，各自含有两不同抗体的四个可变结构域(VH1、VL1、VH2、VL2)， 它们在自结合时以促进形成针对两不同特异性中每一个的两个潜在 的结合位点的取向连接。
6.缀合的多价和多特异性抗体
在本发明的另一个实施方案中，是缀合的多价抗体。可将附加的 氨基酸残基添至第一或第二多肽的N-或C-端。所述附加的氨基酸残 基可包括肽标签、信号肽、细胞因子、酶(例如前药激活酶)、激素、 肽毒素如假单胞菌外毒素、肽药物、细胞毒性蛋白或其它功能蛋白。 如本文所用，功能蛋白是具有生物学功能的蛋白。
在一个实施方案中，药物、毒素、放射性化合物、酶、激素、细 胞毒性蛋白、螯合剂、细胞因子及其它功能性试剂可缀合于多价靶 结合蛋白，优选是通过共价连接到所述多价靶结合蛋白氨基酸残基 的侧链上，例如胺、羧基、苯基、硫醇或羟基基团。多种常规的接 头可用于此目的，例如，二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、二(羟基琥珀 酰亚胺)酯、碳化二亚胺、马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛 等。试剂与所述多价蛋白的缀合优选并不显著影响蛋白对其靶标的 结合特异性或亲和力。如本文所用，功能性试剂是具有生物学功能 的试剂。优选的功能性试剂是细胞毒性剂。
又在其它实施方案中，双特异性抗体指导的治疗剂或前药向体内 靶标的递送可与放射性核素的双特异性抗体递送联合，从而实现化 学治疗和放射性免疫治疗的联合。每一种治疗都可缀合于可靶向的 缀合物并同时给药，或者所述核素可作为第一可靶向缀合物的一部 分给予，而药物在稍后的步骤中作为第二可靶向缀合物的一部分给 予。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂可缀合于聚合物载体，且所述 聚合物载体可随后缀合于所述多价靶结合蛋白。有关此法，参见 Ryser等，Proc.Natl.Acad Sci.USA，75：3867-3870(1978)，美 国专利No.4,699,784和美国专利No.4,046,722，特此将其并入作 为参考。缀合优选并不显著影响所述多价结合单比的结合特异性或 亲和力。
7.类人灵长化、人源化、嵌合及人抗体用于治疗和诊断的用途
根据本发明，类人灵长化、人源化、嵌合及人单克隆抗体即本文 所述的抗-CD20MAbs及其它MAbs，适合用于治疗方法和诊断方法 中。因此，本发明设想单独作为裸抗体给药本发明的类人灵长化、 人源化、嵌合及人抗体，或者作为多模式治疗根据投药方案临时性 地给药，但并不与治疗剂缀合。裸抗-CD20MAbs的功效可通过用一 种或多种其它裸抗体补充裸抗体得以增强，即针对特定抗原的 MAbs，如CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、 CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、 CD80、CD126、B7、Ia、HM1.24、腱生蛋白、MUC1或HLA-DR，以及 用抗血管生成抗体(如VEGF和P1GF抗体)连同一种或多种抗-CD20免 疫缀合物，或者用与包括药物、毒素、免疫调节剂、激素、治疗性 放射性核素等在内的治疗剂缀合的针对所述这些抗原的抗体，连同 一种或多种包括药物、毒素、免疫调节剂、激素、治疗性放射性核 素等在内的治疗剂，同时地或相继地或根据处方的投药方案与所述 MAbs一起给药。优选的B细胞抗原包括等同于人CD19、CD20、CD21、 CD22、CD23、CD46、CD52、CD74、CD80和CD5抗原的那些。优选的T 细胞抗原包括等同于人CD4、CD8和CD25(IL-2受体)抗原的那些。 HLA-DR抗原的等同物可用于治疗B细胞和T细胞两种紊乱。特别优 选的B细胞抗原是等同于人CD19、CD22、CD21、CD23、CD74、CD80 和HLA-DR抗原的那些。特别优选的T细胞抗原是等同于人CD4、CD8 和CD25抗原的那些。CD46是癌细胞表面上阻断补体依赖性溶解(CDC) 的抗原。
此外，本发明设想给药免疫缀合物用于B细胞淋巴瘤及其它疾病 或紊乱的治疗用途。如本文所述的免疫缀合物是包含抗体组分和治 疗剂的分子，包括可能带有所述治疗剂的肽。免疫缀合物保留了抗 体组分的免疫反应性，也就是说，所述抗体成分在缀合后具有如缀 合前大约相同或稍微下降的结合同源抗原的能力。
同样，本发明设想给药免疫缀合物用于髓样白血病的治疗用途， 其中靶向的是CD33、CD45、CD66及其它粒细胞相关抗原。
广泛多样的治疗试剂可有利地缀合于本发明的抗体。此处所述的 治疗剂是那些也可用于与上文所述裸抗体分别地给药的试剂。例 如，治疗剂包括化疗药物如长春花生物碱类、蒽环类抗生素、表鬼 臼毒素类、紫杉醇类、抗代谢物、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、 抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和细胞调亡剂，特别是阿霉素、氨甲 喋呤、紫杉酚、CPT-11、喜树碱类、以及其它形式的这样那样的抗 癌剂等。其它可用的用于制备免疫缀合物和抗体融合蛋白的癌症化 疗药物包括氮芥类、烷基磺酸酯类、亚硝基脲类、三氮烯类、叶酸 类似物、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位复合物， 包括奥沙利铂、激素等。合适的化疗剂描述在REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack Publishing Co.，1995) 和GOODMAN AND GILMAN′S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第7版(MacMillan Publishing Co.，1985)以及这 些出版物的修订版中。其它合适的化疗剂如实验性药物是本领域技 术人员公知的。
另外，有螯合剂如DTPA、DOTA、TETA或NOTA或合适的肽，其上 可缀合可检测标记物如荧光分子，或者细胞毒性剂如重金属或放射 性核素。例如，治疗上可用的免疫缀合物可通过将光敏剂或染料缀 合于抗体组分上获得。荧光组合物如荧光色素及其它发色团，或者 染料如对可见光敏感的卟啉，业已通过将合适的光线引导到病变处 而用于检测和治疗病变。在治疗中，这已被称为光辐射、光线疗法 或光动力学疗法(Jori等(编)，PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh， Chem.Britain 22：430(1986))。而且，单克隆抗体业已与光活化 染料偶联用于实现光线疗法。Mew等，J.Immunol130：1473(1983)； 同作者，Cancer Res.45：4380(1985)；Oseroff等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 83：8744(1986)；同作者，Photochem.Photobiol.46： 83(1987)；Hasan等，Prog Clin.Biol.Res.288：471(1989)； Tatsuta等，Lasers Surg Med.9：422(1989)；Pelegrin等，Cancer 67：2529(1991)。然而，这些早期的研究并未包括内窥镜治疗应用 的用途，特别是抗体片断或亚片断的使用。从而，本发明设想了包 含光敏剂或染料的免疫缀合物的治疗用途。
毒素如假单胞菌外毒素也可络合于或构成本发明抗-CD20抗体抗 体融合蛋白的治疗剂部分。在此类缀合物或其它融合蛋白的制备中 适合采用的其它毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶 (RNase)、DNase I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多 花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。例 如，参见Pastan等，Cell 47：641(1986)和Goldenberg，CA-A Cancer Journalfor Clinicians 44：43(1994)。适合用于本发明的另外的 毒素是本领域技术人员公知的，并在美国专利6,077,499中公开， 特此将其全文并入作为参考。
免疫调节剂如细胞因子也可缀合于或构成抗体融合蛋白的治疗 剂部分，或者与本发明的人源化抗-CD20或其它淋巴瘤抗体一起给 药。用于本发明的合适的细胞因子包括但不限于：干扰素和白介素， 如下文所述。
8.免疫缀合物的制备
本发明的任何抗体或抗体融合蛋白可与一种或多种治疗剂缀 合。一般地，是一种治疗剂连接于各抗体或抗体片断，但不止一种 治疗剂可连接于同一抗体或抗体片断上。本发明的抗体融合蛋白包 括两个或多个抗体或其片断，且构成该融合蛋白的每个抗体可含有 一治疗剂。另外，抗体融合蛋白的一个或多个抗体可连接有不止一 种治疗剂。此外，所述治疗剂无需相同，但是可以是不同的治疗剂。 例如，人们可将药物和放射性同位素连接于同一融合蛋白。尤其是， IgG可用131I放射性标记，并连接到药物上。可将所述131I掺入到所 述IgG的酪氨酸中，并将药物连接于IgG赖氨酸的ε氨基上。也可将 所述治疗剂连接于还原的SH基团，以及糖侧链。
本发明的双特异性抗体可用于预靶向方法，并提供了向受试者递 送两种治疗剂的优选方式。美国流水号No.09/382,186公开了利用 双特异性抗体预靶向的方法，其中所述双特异性抗体由125I标记，并 递送给受试者，接着是由99mTc标记的二价肽。所述递送导致出色的 有关125I和99mTc的肿瘤/正常组织比，从而证明了两种诊断性放射性 同位素的实用性。可利用已知治疗剂的任意组合标记所述抗体和抗 体融合蛋白。所述mAb缀合物抗体组分的结合特异性、所述治疗剂 或诊断剂的功效、以及所述抗体Fc部分的效应器活性，可通过所述 缀合物的标准试验确定。
治疗剂可介由二硫键的形成连接在还原抗体组分的铰链区。作为 备选方案，可利用杂双功能交联接头将此类肽连接于所述抗体组 分，如N-琥珀酰3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)。Yu等，Int.J. Cancer 56：244(1994)。用于此类缀合的一般技术是本领域众所周 知的。参见如Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press，1991)；Upeslacis等，″Modification of Antibodies by Chemical Methods，″in MONOCLONAL ANTIBODIES： PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等(编)，第187-230页 (Wiley-Liss，Inc.，1995)；Price，″Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，″in MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等(编)，第60-84页(Cambridge University Press，1995)。备选地，所述治疗剂可介由糖成分追合作抗体的Fc 区之中。所述糖基团可用于增大结合于硫醇基团的同一肽的荷载， 或者所述糖成分可用于结合不同的肽。
介由抗体糖成分将肽缀合于抗体组分的方法是本领域技术人员 众所周知的。例如，参见Shih等，Int.J Cancer 41：832(1988)； Shih等，Int.J.Cancer 46：1101(1990)；以及Shih等，美国专 利No.5,057,313，特此将它们全部全文并入作为参考。一般方法 涉及使具有氧化糖部分的抗体组分与具有至少一个游离胺官能团且 荷载了多个肽的载体聚合物反应。所述反应产生了最初的希夫碱(亚 胺)链键，这可通过还原为仲胺稳定化，以形成终缀合物。
如果用作为免疫缀合物抗体组分的抗体是抗体片断，则Fc区消 失。不过，有可能向全长抗体或抗体片断的轻链可变区中引入糖成 分。例如，参见Leung等，J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen 等，美国专利No.5,443,953(1995)，Leung等，美国专利No. 6,254,868，特此将它们全部全文并入作为参考。利用所述改造的糖 成分连接所述治疗或诊断剂。
9.药学上可接受的载体
所述待递送给受试者的类人灵长化、人源化、嵌合或人放射性标 记抗体可仅由mAb、免疫缀合物、融合蛋白组成，或者可包括一种 或多种药学上合适的载体、一种或多种附加成分、或者这些物质的 某些组合。
本发明的免疫缀合物抗体可根据制备药学上可用组合物的已知 方法配制，由此所述免疫缀合物或裸抗体在混合物与药学上合适的 载体混合。无菌磷酸缓冲盐溶液是药学上合适载体的一个实例。其 它合适的载体是本领域技术人员众所周知的。例如，参见Ansel等， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5 版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(编)，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)，以及它们的修订版。
可配制本发明的免疫缀合物和裸抗体用于肠胃外应用，如静脉内 给药，例如介由丸剂注射和连续输注。注射用制剂可提供为单位剂 量的形式，例如，在安瓿瓶中，和在多剂量容器中，添有防腐剂。 所述组合物可采取诸如悬液、溶液或处于油或水性载体中的乳剂形 式，并且可含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，所 述活性成分可以是散剂形式，以在用前与合适的载体如无菌无热原 的水重构。
可采用另外的制药方法以控制治疗性缀合物或裸抗体的作用持 续时间。缓释剂可通过使用聚合物络合或吸收所述免疫缀合物或裸 抗体制备。例如，生物可相容的聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯 酯)基质以及硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物基质。Sherwood 等，Bio/Technology 10：1446(1992)。免疫缀合物或抗体由此基质 的释放速率取决于所述免疫缀合物或抗体的分子量、基质内免疫缀 合物、抗体的量、以及分散颗粒的大小。Salizman等，Biophys.J. 55：163(1989)；Sherwood等，同上。其它固体剂量形式在描述在 Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS， 第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(编)，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)以及它们的修订版中。
所述免疫缀合物、抗体融合蛋白或裸抗体也可皮下或者甚至通过 其它肠胃外路径向哺乳动物给药。而且，所述给药可以是通过连续 输注或者通过单次或多个丸剂。一般而言，人用给药的免疫缀合物、 融合蛋白或裸抗体的剂量将根据诸如患者的年龄、体重、身高、性 别、一般医学状况和以前的病史的因素而变。典型地，期望为受体 提供剂量在从大约1mg/kg到20mg/kg范围内的免疫缀合物、抗体 融合蛋白或裸抗体作为单次静脉内输注，尽管视情形而定，也可给 药更低或更高的剂量。该剂量可视需要而重复，例如，每周一次共 4-10周，优选每周一次共8周，并且更优选每周一次共4周。也可 以不太频繁地给予，例如每隔一周持续数月。所述剂量可通过多种 肠胃外路径给予，并适当地调整剂量和回程。
出于治疗目的，向哺乳动物给药治疗有效量的免疫缀合物、融合 蛋白或裸抗体。本发明合适的受试者通常是人，尽管也考虑非人动 物受试者。如果所给药的量具有生理学显著意义的，则抗体制剂被 表述为是以“治疗有效量”给药的。如果其存在导致受体哺乳动物 生理学上可检测的变化，则该制剂具有生理学显著意义。尤其是， 如果其存在激发了抗肿瘤应答或缓和了自身免疫病状态的体征和症 状，则本发明的抗体制剂具有生理学显著意义。生理学显著意义的 功效也可以是在受体哺乳动物中激发体液和/或细胞免疫应答。
10.治疗方法
本发明设想使用本发明的抗体作为用于治疗疾病如B细胞相关恶 性病、T细胞恶性病或另一淋巴瘤类型的主要组合物。另外，它也可 用于治疗自身免疫病。尤其是，本文所述的组合物尤其可用于治疗 多种自身免疫病以及不活跃形式的B细胞淋巴瘤、攻击形式的B细 胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、以及瓦尔 登斯特伦氏巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤。同样，可治疗T细胞病 如T细胞白血病或蕈样肉芽肿病。例如，人源化抗-CD22抗体组分和 免疫缀合物可用于治疗不活跃和攻击形式的两种非霍奇金氏淋巴 瘤。自身免疫病选自下组：急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特 发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、 系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺综合症、大疱类天疱 疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后的肾炎、结节性红斑、 Takayasu′s动脉炎、爱迪生氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、 结节病、溃疡性结肠炎、多形红斑、IgA肾病、结节性多发动脉炎、 强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、干燥综 合症、原发性胆汁性肝硬变、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮 病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、 眶坏死性肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细 胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、快速渐进性血管球性肾炎、牛皮癣 和纤维性肺泡炎。
用于治疗的组合物含有至少一种单独的或与其它抗体联合的人 源化、嵌合或人单克隆抗体，如其它人源化、嵌合或人抗体、治疗 剂或免疫调节剂。尤其是，也设想与全人抗体的联合治疗，且是通 过如上文所述的方法生产的。
缀合于相同或不同表位或抗原的抗体也可与一个或多个本发明 的抗体混合。例如，人源化、嵌合或人缀合抗-CD22抗体可与另一类 人灵长化、人源化、嵌合或人缀合抗-CD22混合，而类人灵长化、人 源化、嵌合或人缀合抗-CD22抗体可与抗-CD22免疫缀合物混合。备 选地，可与不同的淋巴瘤相关抗体进行各种这样的混合，如上文所 述的那样。类人灵长化、人源化、嵌合或人CD22抗体与毒素或免疫 调节剂的融合蛋白，或者至少两个不同B细胞抗体的融合蛋白(如 CD20和CD22 mAb)也可用于本发明之中。许多不同的抗体混合物， 靶向与B细胞或其它淋巴瘤或自身免疫病相关的至少两个不同的抗 原，如上文早已列举的那样，可构建为与治疗剂或免疫调节剂部分 缀合，或者仅仅是与另一治疗剂如细胞毒性药物混合，或者具有射 线。
如本文所用，术语“免疫调节剂”包括细胞因子，干细胞生长因 子，淋巴毒素，如肿瘤坏死因子(TNF)，和造血生长因子，例如白介 素(如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12和IL-18)， 集落刺激因子(如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集 落刺激因子(GM-CSF))，干扰素(如干扰素α、β和γ)，命名为“S1因 子”的干细胞生长因子，促红细胞生成素以及促血小板生成素。合 适的免疫调节剂成分的实例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、 干扰素-γ、TNF-α等。备选地，受试者可接受缀合的抗-CD20抗体和 单独给药的细胞因子，其可在裸或缀合的抗-CD20抗体给药之前、同 时或之后给药。如前文所讨论的那样，所述抗-CD22抗体也可缀合于 免疫调节剂。所述免疫调节剂也可缀合于杂交抗体或杂交抗体片断 或亚片断(单链结合蛋白或sFv′s)，它们包括与不同抗原结合的一个 或多个抗体或亚片断。
本发明的多模式治疗还包括用缀合的抗-CD22抗体免疫治疗，补 充给药融合蛋白形式的或作为免疫缀合物的抗-CD20、抗-CD19、抗 -CD21、抗-CD74、抗-CD80、抗-CD23、抗-CD46或HLA-DR(包括不 变链)抗体。这些抗体包括多克隆、单克隆、灵长化类人、嵌合、人 或人源化抗体，其识别这些抗原决定簇上的至少一个表位。抗-CD19 和抗-CD22抗体是本领域技术人员公知的。例如，参见Ghetie等， Cancer Res.48：2610(1988)；Helcman等，Cancer Immunol. hnynunother.32：364(1991)；Longo，Curr.Opin.Oncol.8：353 (1996)以及美国专利No.5,798,554和6,187,287，特此全文并入作 为参考。
在另一种形式的多模式治疗中，受试者接受缀合的抗体和/或免 疫缀合物，联合标准的癌症化疗。例如，″CVB″(1.5g/m2环磷酰胺、 200-400mg/m2依托泊甙和150-200mg/m2亚硝脲氮芥)是用于治疗非 霍奇金氏淋巴瘤的方案。Patti等，Eur.J.Haematol.51：18 (1993)。其它合适的化疗方案组合是本领域技术人员众所周知的。 例如，参见Freedman等，″Non-Hodgkin′s Lymphomas，″in CANCER MEDICINE，第2卷，第3版，Holland等(编)，第2028-2068页(Lea & Febiger 1993)。作为举例说明，用于治疗中度非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)的第一代化疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、甲基 苄肼和脱氢可的松)以及CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和脱氢 可的松)。可用的第二代化疗方案是m-BACOD(氨甲喋呤、博莱霉素、 阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰四氢叶酸)，而合适 的第三代方案是MACOP-B(氨甲喋呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、 脱氢可的松、博莱霉素和甲酰四氢叶酸)。另外可用的药物包括丁酸 苯酯和薯司他丁-1。在优选的多模式治疗中，化疗药物和细胞因子 都与根据本发明的抗体、免疫缀合物或融合蛋白共给药。所述细胞 因子、化疗药物以及抗体或免疫缀合物可以任何次序或一起给药。
可用作为治疗剂、基本上由于β-粒子发射而衰减的放射性核素包 括但不限于：Ac-225、P-32、P-33、Sc-47、Fe-59、Cu-64、Cu-67、 Se-75、As-77、Sr-89、Y-90、Mo-99、Rh-105、Pd-109、Ag-111、 I-125、I-131、Pr-142、Pr-143、Pm-149、Sm-153、Tb-161、Ho-166、 Er-169、Lu-177、Re-186、Re-188、Re-189、Ir-194、Au-198、Au-199、 Pb-211、Pb-212和Bi-213。可用的β-粒子发射核素的最大衰减能优 选为20-5,000keV，更优选为100-4,000keV，并且最优选为500- 2,500keV。
可用作为治疗剂、基本上由于俄歇发射粒子而衰减的放射性核素 包括但不限于：Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、 In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。这些放射性 核素的最大衰减能优选小于1,000keV，更优选小于100keV，并且 最优选小于70keV。
可用作为治疗剂、基本上由于α-粒子的产生而衰减的放射性核素 包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、 Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。可用的α-粒 子发射放射性核素的衰减能优选为2,000-9,000keV，更优选为 3,000-8,000keV，并且最优选为4,000-7,000keV。
可用于基于种子俘获操作的疗法的放射性核素包括但不限于： B-10、Gd-157和U-235。
本发明的实施方案可进一步通过详细显示本发明方方面面的实 施例举例说明。这些实施例举例说明了本发明的具体要素，而不应 当阐释为限制其范围。
实施例
抗体
Epratuzumab为人源化的LL2抗体，并由Immunomedics Inc.， Morris Plains，NJ研发。人源化过程用人IgG1序列替换了约95％的 鼠源Ig序列。Epratuzumab一经结合于CD22抗原的B表位就被内在 化(Stein，R.等，Cancer Immunol.Imnaunother.37(5)：293- 8，1993)，该表位对应于第三Ig结构域(Kehrl，J.H.B6 CD22 Workshop Panel Report，in Leubocyte Typing V.White Cell Differentiation Antigens.，S.F.Schlossman(编)，Oxford University Press，p.523-5，1995)。在5分钟之后观察到体外内 在化，并报道在5小时后发生多达50％抗原的再表达(Shih，L.B. 等Int J Cancer 56(4)：538-45，1994)。
人源化抗-CD20抗体hA20业已由Immunomedics，Inc.，Morris Plains，NJ研发。该Mab结合CD20，并与嵌合抗-CD20MAb利妥希 玛相反，它是比嵌合形式具有更少鼠源蛋白的CDR移植MAb。所述 hA20 MAb具有IgG1(κ)恒定区和与epratuzumab CD22人源化MAb 相同的人V框架区。将hA20的CDR移植VH和Vk链的基因插入到基 于DHFR扩增表达系统的pdHL2质粒载体中，并转染到Sp2/0鼠骨髓 瘤细胞系中以产生hA20生产克隆。分子表征证明hA20在其CDRs中 类似于利妥希玛，除了在VH区中有一个氨基酸的差异以外。然而， 由于包含更多的人构建体，hA20的VH和Vk框架区中存在着差异。 该hA20抗体似乎竞争利妥希玛对多种淋巴瘤细胞的结合，并且具有 与利妥希玛相似的解离常数，以及相似的体外和体内抗表达CD20的 人淋巴瘤细胞系的效应。
非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的治疗
呈IV期弥漫性大细胞NHL的66岁老人，在前两年给予的3疗程 化疗之后复发。向他给予两次90Y-DOTA-epratuzumab(依照Govinden 标记，同前)注射的剂量，相隔一周，每次通过静脉内输注给药7.5 mCi/m2 90Y连同总剂量30mg的抗体蛋白。六周后，他的颈淋巴结和 他的脾肿大似乎已显著减小，且患者症状上得到改善，并返回专职 工作。由于他并未完全缓解，制定了涉及epratuzumab(360mg/m2) 和hA20(250mg/m2)联合的继续治疗，隔周给予，总计4次输注， 然后12周之后重复所述联合抗体治疗疗程。在结束裸CD22和CD20 抗体联合的第二治疗疗程后三个月，通过放射线扫描或骨髓生检， 患者无疾病迹象，因而认为是完全应答。在3个月后的下一个评价 中，他仍处于疾病的完全缓解之中。
T细胞白血病的治疗
向对在前的化疗顽固且具有晚期T细胞白血病的患者给予与20 mCi 90Y-DOTA缀合的50mg抗-CD25人源化Mab的输注，一周后接 着给予剂量为200mg/m2的CD25Mab(抗-TAC人源化抗体)输注。四 周后，他的血液计数和骨髓生检显示了疾病的部分缓解。
顽固性类风湿性关节炎的治疗
患者呈严重晚期类风湿性关节炎，影响了许多关节，但尤其是他 的膝盖，现对化疗顽固，用剂量为10mCi/m2由90Y标记的总计50mg 的CD4和CD20人源化Mabs混合物单次输注治疗。两周后，向他给 予由100mg CD4和250mg CD20抗体组成的裸人源化抗体剂量，并 在两周后再这样重复一次。缓和感觉到其关节炎的缓解，特别是膝 盖，并且4周后，能够更好地步行甚至是爬楼梯，其医师几乎没记 录关节炎症。三个月后，重复该治疗疗程，涉及一次放射性标记抗 体混合物的输注，接着是两次裸CD4和CD20抗体的输注，并在6周 后重新评价患者。医师注意到显著的改善，从而患者见证了仅最小 的疼痛和其肢体颇为更佳的运动性。
尽管前述内容涉及特定的优选实施方案，人们将会理解本发明并 不局限于此。本领域普通技术人员将会想到可对所公开的实施方案 进行各种改进，并且此类改进旨在落入本发明由如下实施方案所定 义的范围之内。
特此将本说明书中所引述的所有出版物和专利申请及专利全文 并入作为参考。
单克隆抗体在癌症靶向放射性治疗(放射性免疫治疗；RAIT)中的 用途已在血液病如非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)中产生了令人瞩目的临 床效应。目前正研究新策略，以致力于最小化循环放射性核素的系 统毒性以及辐照对肿瘤的致敏。前者是通过预靶向进行的，而后者 是通过与放射性致敏药的联合治疗进行的。见Govindan，S.V等， Current Trends，Pharmaceutical Science and Technology Today 3：90-98，2000。
RAIT的抗肿瘤活性主要地是由于与抗体相连的放射性标记的相 关放射能，其发射持续呈指数规律渐减的低剂量等级的射线，表现 出异质的剂量沉积。有四种放射性标记的抗体产品正朝商业化发 展，以用于非霍奇金氏淋巴瘤的放射性免疫治疗。它们包括131I- tositumomab(BexxarTM)、90Y-ibritumomab tiuxetan(ZevalinTM)、 90Y-epratuzumab(hLL2)和131I-Lym-1。有关这些产品更详细的综述， 见Goldenberg，D.M.，Critical Reviews in Oncology/Hematology 39：195-201，2001，和Goldenberg，D.M.，J.Nucl.Med.43： 693-713，2002。
Bexxar(Corixa Corp.，Seattle，WA)和Zevalin(IDEC-Y2B8； IDEC Pharmaceuticals，San Diego，CA)都是针对表达在正常和恶 性B淋巴细胞表面上的CD20抗原的鼠源单克隆抗体(Mab)。Bexxar 用作为IgG2a鼠源Mab，添有冷性鼠源抗体，而Zevalin的鼠源抗体 被标记，且产品中添加了人鼠嵌合的利妥希玛(RituxanTM，IDEC- Genentech)。两种产品都提供了治疗前的冷性抗体投药，以改善肿 瘤靶向，这涉及输注1小时450mg非标记的Bexxar抗体，和输注 4-6小时450mg的利妥希玛连同Zevalin。两种产品都表现出比裸 抗体更高和更持久的效应，然而，它们也具有剂量限制的毒性，突 出地是骨髓中毒性。Zevalin经食品和药品监督管理局(FDA)批准用 于治疗复发性低级别或转化的B细胞非霍奇金氏淋巴瘤。在这些放 射性标记抗-CD-20Mab之前必需投药冷性抗体，以使得良好的肿瘤 定位成为可能。事实上，当牵涉到预先投药时，特定肿瘤部位上111 铟-Zevalin的特异性定位数从78％跌至15％肿瘤摄入(Wiseman等，同 前)。
Epratuzumab(90Y-epratuzurnab)是针对抗-CD22抗原的人源化 IgG1抗体。该抗原经抗体结合后快速内在化。业已报道裸抗体在滤泡 以及弥漫性的大B细胞淋巴瘤中表现出功效(Leonard，J.P.等， Epratuzumab(hLL2，抗-CD22humanized monoclonal antibody)is an active and well-tolerated therapy for refractory/relapsed diffuse large B-cell non-Hodgkin′s lymphoma(NHL).Blood (Suppl)96：578a[abstr.2482]，2000；Press，O.W.等， Immunotherapy of Non-Hodgkin′s Lymphomas.Hematology(Am.Soc. Hemato.Educ.Program)，p.221-40，2001)。预期Epratuzumab 不会引起人抗-人抗体(HAHA)，这使得它适合于反复投药。小鼠亲代 抗体mLL2由131I标记，且已在多种亚型的B细胞淋巴瘤中表现出功 效(Linden，O.等Clin.Cancer Res.5：3287s-3291s，1999)。内在 化后，131I标记的抗体被脱卤化，且放射性核素由细胞中释放出来。 放射性金属如钇经内在化后保留在细胞内(Sharkey，R.M.，等 Cancer Immnunol.Immunother.44：179-88，1997)。90Y较短的物 理半衰期在某些程度上补偿了epratuzumab较长的半衰期，并提供 了其组合的合理性。
RAIT通常作为单次输注给予。不过，分级途径存在理论上的优 势，因为分级将会更好地处理吸收剂量的异质性问题，如在 O′Donoghue，J.A.，Dosimetric Principles of Targeted Radiotherapy，in Radioimmunotlerapy of Cancer，A.R.Fritzberg (编)，Marcel Dekker，Inc.，p.1-20，New York，Basel，2000中 所概述的那样。也有实验数据支持治疗效应可通过将放射性标记抗 体大的单次给药分割成许多更小的给药得以提高(Schlom，J.等J. Natl.Cancer Inst.82：763-71，1990)。临床上业已利用小鼠抗体 研究了两次输注以及多次输注的途径(DeNardo，G.L.，等Cancer Biother.Radiopharm.13：239-54，1998；Vose，J.M.，等J Clin. Oncol.18：1316-23，2000)。
业已报道了有关CD22抗原表达的肿瘤内可变性。在来自五个患 者的新鲜肿瘤样品中，发现52-89％的淋巴瘤细胞具有抗-CD22 MAb HD6的抗原(Press，O.W.等Cancer Res.49：4906-12，1989)。使 用远程β-辐射源的RAIT的一个所谓的优势在于其在靶细胞附近杀伤 抗原阴性肿瘤细胞的能力。通过在治疗前评估肿瘤细胞的抗原表 达，人们能够研究此概念在使用抗-CD22 90Y-标记的epratuzumab的 RAIT设置下的临床相关性。
采取研究以验证剂量分级的理论优势以及所发表的支持它的实 验数据。所述研究旨在利用放射性标记的人源化抗体调查分级RAIT 的可行性。发现在为放射剂量测定之目的用100mg人源化CD22Mab， 即由111In标记的epratuzumab预先投药之后，随后长达2-3周每周 一次高达7.5mCi/m2剂量的90Y标记的epratuzumab的分级剂量，产 生了可耐受且有效的放射性免疫治疗(Linden等，Cancer Biother Radiopharm 2002；17：490[abstract 47]。尽管这些临床研究提 示放射性免疫缀合物的分级疗法是可行的，尚未与给药的单次高剂 量放射性免疫缀合物就安全性和有效性进行过比较。由于用111In的 首次“放射剂量测定”剂量含有100mg抗体，且每次相继注射也含 有此裸抗体剂量，也不可能确定总计至少300mg epratuzumab的这 些剂量是否如引述的涉及CD20抗体的其它研究中所提示的那样，也 作预先投药功效之用。因此，由这些研究不可判断此类放射性免疫 治疗是否必需任何预先投药，特别是用CD22抗体的放射性免疫治 疗。
我们现在发现在本发明中并不象现有技术中所实施的那样，使用 预先投药以饱和正常组织和脾中的抗原性位点，这与其它发表的研 究和Kaminski的美国专利No.5,595,721相反。无疑，此处公开的 本发明证明无需象现有技术中所实施的那样高抗体预先投药。
发明概述
因此，本发明的目的是提供用于治疗哺乳动物疾病的方法，所述 方法是通过给药治疗组合物实现的，其中并不进行非放射性标记抗 体、片断或融合蛋白的预先投药。
本发明的目的也是不仅使上述方法给药简单易行，而且使药物组 合物本身保持治疗活性并具有相似的效应等级，而不会令较高剂量 的裸抗体影响肿瘤。
本发明的目的还是提供在治疗攻击形式的非霍奇金氏淋巴瘤中 表现出更为有效的效应的方法，这不同于现有技术所证明的仅在不 活跃形式的淋巴瘤中表现出功效的方法。
根据本发明的实施方案，这些及其它目的是通过提供用于治疗哺 乳动物疾病的这样的方法实现的，所述方法包括同时或相继地向所 述哺乳动物给药这样的治疗组合物，所述治疗组合物包括药学上可 接受的载体和至少一种缀合的抗体或其片断，或者缀合的抗体融合 蛋白或其片断，其中并不进行非放射性标记抗体、片断或融合蛋白 的预先投药。任选地与所述缀合的抗体、片断或融合蛋白一起添加 非缀合的抗体、片断或融合蛋白，作为维持治疗以防肿瘤细胞靶逃 逸。
在优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗疾病如B细胞相关的 恶性瘤的方法。另外，它也可用于治疗自身免疫病，以及T细胞相 关的恶性瘤。
在另一个优选的实施方案中，本发明缀合和非缀合的抗体、片断 和融合蛋白可靶向于选自下组的抗原：CD3、CD4、CD5、CD8、CD11c、 CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、 CD38、CD40、CD40L、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、Ia、HMI.24、 HLA-DR、腱生蛋白、MUC1以及B细胞肿瘤相关抗原，包括血管内皮 抗原，如血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(P1GF)。在 相关的支脉中，本发明缀合和/或非缀合的抗体、片断或融合蛋白可 以是相同或不同的。另外，这些抗体可以是人源、鼠源、嵌合、类 人灵长化或人源化的。此外，这些抗体、片断或融合蛋白可选自下 组：完整IgG、F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、scFvs、双链抗体、三 链抗体或四链抗体，并且可缀合于至少一种治疗剂。
根据本发明的另一个方面，提供了如上文所述的方法，其中用一 种或多种这样的抗体治疗哺乳动物受试者例如人和家畜或宠物，所 述抗体缀合于选自下组的一种或多种治疗剂：药物、毒素、免疫调 节剂、螯合剂、硼化合物、光敏剂和放射性核素。
又在另一个优选的实施方案中，所述治疗组合物包括所述抗体或 抗体与免疫调节剂组合的融合蛋白。所述融合抗体可包括针对不同 抗原的抗体，以及针对同一抗原不同表位的抗体。
本发明如此设想上述方法，其中缀合和非缀合的抗体是抗-CD22 单克隆抗体，它以每剂20-600毫克蛋白的剂量肠胃外给药，更优选 每剂20-150毫克蛋白，并且最优选每剂20-100毫克蛋白。另外， 所述哺乳动物可按受作为优选每剂20-150毫克蛋白的重复肠胃外剂 量的所述抗-CD22抗体，并且更优选每剂20-100毫克蛋白。重要的 是意识到这样的剂量是作为实际治疗剂量给予的，无论是用于改善 靶向或是用于剂量测定之目的，都无需如以前Juweid等，Clin. Cancer Res.5：3292s-3303s，1999(其中50mg与111In或另一诊 断同位素缀合的CD22 Mab的预先投药是必需的)所实施的那样需要 任何预先投药。这类研究中尚未进行过尝试来评估没有预先投药的 方案下，所述具有不同蛋白剂量抗体的治疗性放射免疫缀合物直接 见效的能力。
在另一个优选的实施方案中，用于治疗哺乳动物疾病的方法包括 向所述哺乳动物给药这样的治疗组合物，其包括药学上可接受的载 体和与至少一种靶抗原和治疗剂相结合的多特异性多价抗体、片断 或融合蛋白缀合物，其中并不进行非放射性标记抗体的预先投药。
又在另一个优选的实施方案中，用于治疗哺乳动物疾病的方法包 括：(a)向所述哺乳动物给药这样的治疗组合物，其包括与至少一种 靶抗原相结合的多特异性多价抗体、片断或融合蛋白；(b)任选地包 括清除剂，以允许所述组合物清除来自循环的非局限抗体；和(c)向 所述哺乳动物给药药学有效量的与所述多特异性多价抗体、片断或 融合蛋白结合的治疗缀合物，且其中并不进行非放射性标记抗体的 预先投药。
本发明的其它目的、特点和优势将会因下列详述的说明和所附的 权利要求而变得显而易见。
优选实施方案的详细说明
除非另行指定，“一”或“一种”意味着“一种或多种”。
1.定义
在以下的说明中，使用了许多术语，并提供以下定义以促进对本 发明的理解。
非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)是指涉及淋巴结、脾、其它器官并且通 常是骨髓的淋巴瘤病家族。有至少30种不同类型的NHL。两种常见 类型为滤泡性(轻度或不活跃)和攻击性弥漫性大细胞(中度或高 度)淋巴瘤。
如本文所述， 抗体是指全长(即天然存在或通过正常的免疫球蛋 白基因片断重组过程形成的)免疫球蛋白分子(如IgG抗体)或免疫球 蛋白分子的免疫学活性(即特异性结合)部分，象抗体片断。
抗体片段是抗体的一部分，如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、 sFv等。无论结构如何，抗体片断与被完整抗体所识别的同一抗原相 结合。例如，抗-CD22单克隆抗体片断与CD22表位相结合。术语”抗 体片断”也包括任何合成或遗传改造的蛋白，它们通过结合特异性 抗原形成复合物而象抗体那样起作用。例如，抗体片断包括分离的 由可变区组成的片断，如由重链和轻链可变区组成的″Fv″片断，其 中轻链和重链可变区通过肽接头相连的重组单链多肽分子(“scFv 蛋白”)，以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。
裸或冷性抗体一般是未与治疗剂缀合(非缀合)的整个抗体。之 所以这样，是因为抗体分子的Fc部分提供了效应器功能，如补体固 定和ADCC(抗体依赖性细胞细胞毒)，该功能使得可能导致细胞裂解 的机制运转起来。不过，有可能Fc部分并非是治疗功能所必需的， 而其它机制如细胞凋亡开始运行。裸抗体也是非放射性标记的抗 体，其包括多克隆和单克隆抗体，以及某些重组抗体，如灵长化类 人、嵌合、人源化或人抗体。
嵌合抗体是这样的重组蛋白，其含有包括互补决定区(CDRs)在内 的源于一个物种抗体(优选为啮齿动物抗体)的可变结构域，而该 抗体分子的恒定结构域源于人抗体的恒定结构域。对于兽医应用， 嵌合抗体的恒定结构域可源于其它物种的恒定结构域，如猫或狗。
人源化抗体是这样的重组蛋白，其中将来白于一个物种抗体如啮 齿动物抗体的CDRs从啮齿动物抗体的重链和轻链可变链上转移到人 重链和轻链可变结构域之中。该抗体分子的恒定结构域源于人抗体 的恒定结构域。
人抗体是由转基因小鼠获得的抗体，该小鼠业已被”改造”以响 应抗原刺激生产特异性人抗体。在这种技术中，将人重链和轻链基 因座的元件引入到衍生自这样的胚胎干细胞系的小鼠株系中，其含 有内源重链和轻链基因座的靶向破坏。该转基因小鼠能够合成特异 于人抗原的人抗体，并且该小鼠可用于生产分泌人抗体的杂交瘤。 用于获得来自转基因小鼠的人抗体的方法由Green等，Nature Genet. 7：13(1994)、Lonberg等，Nature 368：856(1994)以及Taylor 等，Int.Immun.6：579(1994)描述。也可通过基因或染色体转染 法、以及噬菌体展示技术构建全人抗体，所有这些方法都是本领域 公知的。例如参见McCafferty等，Nature 348：552-553(1990)关 于由来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因库在体外生产人 抗体及其片断。在这种技术中，将抗体可变结构域基因框内克隆到 丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片断 展示在噬菌体颗粒的表面。由于该丝状颗粒含有所述噬菌体基因组 的单链DNA拷贝，基于所述抗体功能性质的选择也导致编码表现出 那些性质的抗体的基因的选择。以这种方式，所述噬菌体模拟B细 胞的一些性质。噬菌体展示能够以多种形式进行，有关综述，参见 如Johnson和Chiswell，Current Opinifozlin Structural Biology 3：5564-571(1993)。
人抗体也可由在体外激活的B细胞产生。见美国专利No. 5,567,610和5,229,275，特此将其全文并入作为参考。
治疗剂是与抗体成分分别、同时或相继地给药、或缀合于抗体成 分(即抗体或抗体片断、或亚片断)的分子或原子，并且可用于疾 病的治疗。治疗剂的实例包括抗体、抗体片断、药物、毒素、核酸 酶、激素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光敏剂或染料以及放 射性同位素。
免疫调节剂是如在本发明中所定义的治疗剂，当其存在时，其改 变、抑制或刺激机体的免疫系统。典型地，可用于本发明的免疫调 节剂刺激免疫细胞增殖或在免疫应答级联中变得激活，例如巨噬细 胞、B细胞和/或T细胞。
免疫缀合物是抗体组分与治疗剂或诊断剂的缀合物。所述诊断剂 可包括放射性或非放射性标记、造影剂(例如用于磁共振成象、计 算断层分析或超声)，且所述放射性标记可以是发射γ、β、α、俄歇 电子或正电子的同位素。
表达载体是包含在宿主细胞中表达的基因的DNA分子。典型地， 基因表达处于某些调控元件的控制之下，包括组成型或诱导型启动 子、组织特异性调控元件和增强子。此种基因被表述为是“可操作 地连接于”所述调控元件。
重组宿主可以是含有克隆载体或表达载体的任何原核或真核细 胞。该术语也包括这样的原核或真核细胞以及转基因动物，它们业 已被遗传改造，从而在所述宿主细胞的染色体或基因组中或者宿主 细胞的细胞中含有所克隆的基因。合适的哺乳动物宿主细胞包括骨 髓瘤细胞，如SP2/0细胞和NSO细胞，以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、 杂交瘤细胞系以及可用于表达抗体的其它哺乳动物宿主细胞。同样 尤其可用于表达mAb及其它融合蛋白的是在WO 0063403 A2中公开 的人细胞系PER.C6，与常规的哺乳动物细胞系如CHO、COS、Vero、 Hela、BHK和SP2细胞系相比，其生产2到200倍更多的重组蛋白。 具有修饰的免疫系统的特定转基因动物尤其可用于制备全人抗体。
如本文所用，术语 抗体融合蛋白是重组生产的抗原结合分子，其 中两个或多个相同或不同的单链抗体或者具有相同或不同特异性的 抗体片断区段被连接在一起。融合蛋白的结合价预示着该融合蛋白 对单链抗原或表位具有多少结合臂或位点，即单价、二价、三价或 多价。抗体融合蛋白的多结合价意味着它能够在与抗原的结合中利 用多重相互作用，从而增强对抗原结合的亲抗原性。特异性预示着 抗体融合蛋白能够结合多少抗原或表位；即单特异性、双特异性、 三特异性、多特异性。运用这些定义，天然抗体如IgG是双价的， 因为它有两个结合臂，但它是单特异性的，因为它结合一个表位。 单特异性多价融合蛋白对表位具有不止一个结合位点，但仅与一个 表位结合，例如具有与同一抗原反应的两个结合位点的双链抗体。 所述融合蛋白可包括单个抗体组分，不同抗体组分的多价或多特异 性组合，或者同一抗体组分的多个拷贝。所述融合蛋白可额外包括 抗体或抗体片断和治疗剂。适用于此类融合蛋白的治疗剂的实例包 括免疫调节剂(“抗体-免疫调节剂融合蛋白”)和毒素(“抗体- 毒素融合蛋白“)。一种优选的毒素包括核糖核酸酶(RNase)，优选 为重组RNase。
多特异性抗体是能够同时与具有不同结构的至少两个靶标结合 的抗体，如结合两个不同抗原、同一抗原上的两个不同表位、或者 半抗原和/或抗原或表位。一种特异性将是针对B细胞、T细胞、髓 细胞、血浆细胞和肥大细胞抗原或表位的。另一种特异性可以是针 对同一细胞类型上的不同抗原的，如CD3、CD4、CD5、CD8、CDllc、 CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD 33、CD37、 CD38、CD40、CD40L、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、Ia、HMI.24、 HLA-DR、腱生蛋白、MUC1以及B细胞肿瘤相关抗原，包括血管内皮 抗原，如VEGF和P1GF。多特异性多价抗体是具有不止一个结合位点 的构建体，且所述结合位点具有不同的特异性。例如双链抗体，其 中一个结合位点与一种抗原反应，而另一个则与另一种抗原反应。
双特异性抗体是能够同时与具有不同结构的两个靶标结合的抗 体。双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片断(bsFab)具有至少一个 与例如B细胞、T细胞、髓细胞、血浆细胞和肥大细胞抗原或表位特 异性结合的臂，以及至少一个与带有治疗剂或诊断剂的可靶向缀合 物特异性结合的其它臂。许多双特异性融合蛋白可利用分子改造生 产。在一种形式中，双特异性融合蛋白是单价的，例如，由具有针 对一种抗原的单个结合位点的scFv和具有针对第二抗原的单个结合 位点的Fab片断组成。在另一种形式中，双特异性融合蛋白是二价 的，例如，由具有针对一种抗原的结合位点的IgG和具有针对第二 抗原的两个结合位点的两个scFv组成。
犬源化或猫源化抗体是这样的重组蛋白，其中业已将啮齿动物 (或另一物种)单克隆抗体的互补决定区从啮齿动物(或另一物种) 免疫球蛋白的重链和轻链可变结构域分别转移到狗或猫免疫球蛋白 的可变结构域中。
类人灵长化抗体是这样的重组蛋白，其中业已将类人灵长动物 (如猴子)单克隆抗体的互补决定区从啮齿动物(或另一物种)免 疫球蛋白的重链和轻链可变结构域转移到类人灵长动物免疫球蛋白 的可变结构域中。
家畜动物包括大动物如马、牛、绵羊、山羊、美洲驼、羊驼和猪， 以及宠物。在优选的实施方案中，家畜动物为马。
宠物包括作为宠物饲养的动物。这些主要地是狗和猫，尽管小啮 齿动物如豚鼠、仓鼠、大鼠和雪貂也包括在内，正象类人灵长动物 如猴子那样。在优选的实施方案中，宠物是狗或猫。
术语“清除剂“是指结合靶向成分的结合位点的抗体，其中所述 靶向成分可以是抗体、抗原结合抗体片断或非抗体靶向成分。在更 为优选的方法中，清除剂是单克隆抗体，为第一步中所用缀合物的 单克隆抗体的抗独特型，如美国申请流水号No.08/486,166中所述 的那样。在另一个优选的实施方案中，清除剂被多个糖残基如半乳 糖取代，这允许所述清除剂能够通过肝中的脱唾液酸糖蛋白受体很 快地从循环中清除。
2.包括嵌合、人源化和人抗体在内的单克隆抗体的制备
单克隆抗体(MAbs)是针对特定抗原的同种抗体群，且所述抗体仅 包括一种类型的抗原结合位点，并仅与抗原决定簇上的一个表位结 合。
针对特定抗原的啮齿动物单克隆抗体可通过本领域技术人员公 知的方法获得。例如，参见Kohler和Milstein，Nature 256：495 (1975)，以及Coligan等(编)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY， VOL.1，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley & Sons 1991)[以下称作 ″Coligan″]。简要地，单克隆抗体可这样获得，即用包括抗原的组 合物注射小鼠，通过移取血清样品验证抗体生产的存在，取出脾脏 以获得B淋巴细胞，使所述B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂 交瘤，克隆所述杂交瘤，选择产生针对所述抗原的抗体的阳性克隆， 培养产生针对所述抗原的抗体的所述克隆，并从所述杂交瘤培养物 中分离所述抗体。
MAbs可通过许多充分建立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯 化。此类分离技术包括蛋白A琼脂糖亲和层析，大小排阻层析，以 及离子交换层析。例如，参见Coligan第2.7.1-2.7.12页及第 2.9.1-2.9.3.页。也参见Baines等，″Purification of Immunoglobulin G(IgG)，″in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，VOL. 10，pages 79-104(The Humana Press，Inc.1992)。
在初次引起针对免疫原的抗体后，可对抗体进行测序并随后通过 重组技术制备。鼠源抗体和抗体片断的人源化和嵌合是本领域技术 人员众所周知的。例如，人源化单克隆抗体是这样产生的，即将小 鼠互补决定区从小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变链上转移到人可变 结构域中，然后取代鼠源对应物框架区中的人残基。使用衍生自人 源化单克隆抗体的抗体组分避免了与鼠源恒定区免疫原性相关的潜 在问题。
例如，用于克隆鼠源免疫球蛋白可变结构域的一般技术由 Orlandi等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 86：3833(1989)的出版 予以描述，特此将其全文并入作为参考。用于构建嵌合抗体的技术 是本领域技术人员众所周知的。作为举例，Leung等，Hybridoma 13：469(1994)描述了他们是如何通过将编码抗-CD22抗体LL2单克 隆抗体Vκ和VH结构域的DNA序列与相应的人κ和IgG1恒定区结构域 组合生产LL2嵌合体的。该出版物也分别提供了LL2轻链和重链可 变区Vκ和VH的核苷酸序列。例如，用于生产人源化MAbs的技术由 Jones等，Nature 321：522(1986)，Riechmann等，Nature 332：323 (1988)，Verhoeyen等，Science 239：1534(1988)，Carter等，Proc. Natl Acad.Sci.USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech. 12：437(1992)以及Singer等，J.Immun.150：2844(1993)描述， 特此将其中每一篇都并入作为参考。
嵌合抗体是这样的重组蛋白，其含有包括源于一个物种动物如啮 齿动物抗体CDRs在内的可变结构域，而该抗体分子的其余部分即恒 定结构域源于人抗体。因此，嵌合单克隆抗体也可以通过用一个或 多个不同的人FR替换嵌合mAb可变结构域中鼠源FR序列而人源化。 具体地，将小鼠CDRs从小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变链转移到人 抗体相应的可变结构域之中。由于简单地将小鼠CDRs转移到人FRs 中通常导致抗体亲和力的下降或者甚至丧失，可能需要附加的修饰 以恢复鼠源抗体的原始亲和力。这可通过用其鼠源对应物替换FR区 中的一个或多个某些人残基实现，以获得对其表位持有良好结合亲 和力的抗体。例如，参见Tempest等，Biotechnology 9：266(1991) 和Verhoeyen等，Science 239：1534(1988)。此外，可通过CDRs 的诱变提高人源化、嵌合及人MAbs对特定表位的亲和力，从而更低 剂量的抗体可能象诱变前更高剂量的较低亲和力MAb一样有效。例 如参见WO0029584A1。
用于生产本发明抗体的另一种方法是通过在转基因家畜的乳汁 中生产。参见如Colman，A.，Biochem.Soc.Symp.，63：141-147， 1998；美国专利5,827,690，特此将两篇都全文并入作为参考。制备 两个DNA构建体，它们分别含有编码成对免疫球蛋白重链和轻链的 DNA区段。将DNA区段克隆到含优选在哺乳动物上皮细胞中表达的启 动子序列的表达载体中。实例包括但不限于来自兔、奶牛和绵羊酪 蛋白基因、奶牛α-乳球蛋白基因、绵羊β-乳球蛋白基因以及小鼠乳 清酸性蛋白基因的启动子。优选地，插入片断在其3′侧侧接来自乳 腺特异性基因的同源基因组序列。这提供了多聚腺苷酰化位点和转 录本稳定序列。将所述表达盒共注射到受精的哺乳动物卵的前核 中，然后将其植入到受体雌兽的子宫之中，并使之受孕。生产后， 通过Southern分析筛选子代中两种转基因的存在。为使抗体存在， 重链和轻链基因都必需在同一细胞中同时表达。利用本领域公知的 标准免疫学方法分析来自转基因雌兽的乳汁中抗体或抗体片断的存 在及功能。抗体可利用本领域公知的标准方法从乳汁中纯化。
本发明的全人抗体，即人抗-CD20 MAbs或者其它用于与人源化、 嵌合或人抗-CD20抗体联合治疗的人抗体如抗-CD19、抗-CD22、抗- CD21或抗-CD23 MAbs可由转基因非人动物获得。参见如Mendez等， Nature Genetics 15：146-156(1997)；美国专利No.5,633,425, 特此将这两篇都全文并入作为参考。例如，可从持有人免疫球蛋白 基因座的转基因小鼠中回收人抗体。所述小鼠的体液免疫系统是通 过失活内源免疫球蛋白基因并引入人免疫球蛋白基因座而被人源化 的。人免疫球蛋白基因座极为复杂，且包括大量不连续的区段，总 计占据人基因组的几乎0.2％。为确保该转基因小鼠能够生产足够的 抗体库，必需将大部分人重链和轻链基因座引入到小鼠基因组中。 这是以始于在种系构型中含有人重链或轻链免疫球蛋白基因座的酵 母人工染色体(YACs)的形成的逐步过程实现的。由于每一个插入物 大小约为1Mb，YAC的构建需要免疫球蛋白基因座重叠片断的同源 重组。介由含YAC的酵母球芽与小鼠胚胎干细胞的融合，将一个含 重链基因座，而一个含轻链基因座的两个YACs单独地引入到小鼠 中。然后将胚胎干细胞克隆微注射到小鼠胚泡中。筛选所得的嵌合 雄兽通过其种系传递YAC的能力，并与鼠源抗体生产缺陷的小鼠进 行育种。一种含有人重链基因座而另一种含有人轻链基因座的两种 转基因株系的育种，创建了响应免疫生产人抗体的子代。
此外，最近用于生产双特异性mAbs的方法包括改造的具有额外 的半胱氨酸残基的重组mAbs，从而它们比更为常见的免疫球蛋白同 种型更加强烈地交联。参见如FitzGerald等，Protein Eng.10(10)： 1221-1225，1997。另一种途径是改造连接了两个或多个不同单链抗 体或具有所选的双重特异性抗体片断区段的融合蛋白。参见如 Coloma等，Nature Biotech.15：159-163，1997。许多双特异性融 合蛋白可利用分子工程产生。在一种形式中，所述双特异性融合蛋 白是单价的，例如，由具有针对一种抗原的单个结合位点的scFv和 具有针对第二抗原的单个结合位点的Fab片断组成。在另一种形式 中，所述双特异性融合蛋白是二价的，例如，由具有针对一种抗原 的结合两个位点的IgG和具有针对第二抗原的两个结合位点的两个 scFv组成。
连接了两个或多个不同单链抗体或抗体片断的双特异性融合蛋 白是以类似的方式生产的。可利用重组法生产融合蛋白。例如，可 生产包含源于人源化单克隆抗-CD20抗体的Fab片断和源于鼠源抗- diDTPA的scFv的融合蛋白。柔性接头如GGGS将所述scFv连接于抗 -CD20抗体重链的恒定区上。备选地，所述scFv可连接于另一人源 化抗体轻链的恒定区上。通过PCR反应将对于重链Fd与所述scFv 框内连接所必需的合适的接头序列引入到VL和VK结构域中。然后 将编码所述scFv的DNA片断连到含编码CH1结构域的DNA序列的阶 段载体中。切下所得的scFv-CH1构建体，并连到含编码抗-CD20抗 体VH区的DNA序列的载体中。所得的载体可用于转染合适的宿主细 胞，如哺乳动物细胞用于表达所述双特异性融合蛋白。
此类双价和双特异性抗体的实例见于2002年8月1日递交的美 国专利申请60/399,707、2002年3月1日递交的60/360,229、2002 年6月14日递交的60/388,314以及2002年4月5日递交的 10/116,116，特此将它们全都并入作为参考。
3.抗体片断的生产
识别特定表位的抗体片断可通过已知的技术产生。所述抗体片断 是抗体的抗原结合部分，如如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、sFv等。其 它抗体片断包括但不限于：F(ab)′2片断，其可通过胃蛋白酶消化抗 体分子生产，以及Fab′片断，其可通过还原F(ab)′2片断的二硫桥产 生。备选地，可构建Fab′表达文库(Huse等，1989，Science 246： 1274-1281)以允许快速且容易地鉴定具有期望特异性的单克隆Fab′ 片断。本发明涵盖抗体和抗体片断。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。所述VL和VH 结构域结合以形成靶结合位点。这两个结构域进一步通过肽接头(L) 共价连接。scFv分子或者被表示为VL-L-VH，如果VL结构域是所述 scFv分子的N-端部分的话，或者被表示为VH-L-VL，如果VH结构域 是所述scFv分子的N-端部分的话。用于制备scFv分子和设计合适 的肽接头的方法描述在美国专利No.4,704,692、美国专利No. 4,946,778、R.Raag和M.Whitlow，″Single Chain Fvs.″FASEB 9： 73-80(1995)以及R.E.Bird和B.W.Walker，Single Chain Antibody Variable Regions，TIBTECH 9：132-137(1991)中。特 此将这些参考文献并入作为参考。
抗体片断可通过全长抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌(E. coli)或另一宿主中表达编码该片断的DNA制备。抗体片断可通过 常规方法通过全长抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化获得。例如， 抗体片断可通过用胃蛋白酶酶切抗体生产，以提供表示为F(ab′)2 的5S片断。该片断可进一步使用硫醇还原剂切割，并且任选地使用 因二硫键切割产生的巯基的封闭基团，以生产3.5S的Fab′单价片 断。备选地，利用木瓜蛋白酶酶切直接产生两个单价Fab片断和一 Fc片断。例如，这些方法由Goldenberg美国专利No.4,036,945和 4,331,647及其中所含的参考文献描述，特此将所述专利全文并入作 为参考。同研，参见Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89： 230(1960)；Porter，Biochem.J 73：119(1959)，Edelman等，in METHODS IN ENZYMOLOGY，Volume 1，p.422(Academic Press1967) 以及Coligan第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
另一种形式的抗体片断是编码单链互补决定区(CDR)的肽。CDR是 抗体可变区中在结构上与抗体与之结合的表位互补的区段，并且比 可变区的其余部分更为可变。因此，CDR有时被称之为高变区。一个 可变区包含三个CDRs。CDR肽可通过构建编码目的抗体CDR的基因 获得。例如，此类基因通过利用聚合酶链式反应由抗体生产细胞的 RNA合成可变区来制备。例如，参见Larrick等，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：106(1991)； Courtenay-Luck，″Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，″in MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION， ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等(编)，第 166-179页(Cambridge University Press 1995)以及Ward 等，″Genetic Manipulation and Expression of Antibodies，″in MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等 (编)，第137-185页(Wiley-Liss，Inc.1995)。
也可以使用其它切割抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻链 -重链片断，进一步切割片断，或者其它酶促、化学或基因技术，只 要所述片断结合被完整抗体所识别的抗原即可。
4.多特异性和多价抗体
本文所述的具有相同特异性的抗体以及用于联合治疗的具有不 同特异性的其它那些抗体，也可制备为多特异性抗体(包括至少一 个针对CD20表位或抗原的结合位点和至少一个针对CD20上另一表 位或另一抗原的结合位点)和多价抗体(包括多个针对同一表位或 抗原的结合位点)。
本发明提供了双特异性抗体或抗体片断，其具有至少一个特异性 结合靶向的细胞标志的结合区，和至少另一个特异性结合可靶向缀 合物的结合区。可靶向缀合物包括载体部分，其包含或带有至少一 个被所述双特异性抗体或抗体片断的至少一个结合区所识别的表 位。
许多重组方法可用于生产如上文所述的双特异性抗体和抗体片 断。
本发明也设想多价抗体。该多价靶结合蛋白是通过第一和第二多 肽的结合构建的。所述第一多肽包括第一单链Fv分子，共价连接于 第一免疫球蛋白样结构域，其优选是免疫球蛋白轻链可变区结构 域。所述第二多肽包括包括第二单链Fv分子，共价连接于第二免疫 球蛋白样结构域，其优选是免疫球蛋白重链可变区结构域。每一个 所述第一和第二单链Fv分子都形成了靶结合位点，且所述第一和第 二免疫球蛋白样结构域结合起来以形成第三靶结合位点。
具有VL-L-VH构型(其中L为接头)的单链Fv分子可与具有 VH-L-VL构型的另一单链Fv分子结合以形成二价二聚体。在这种情 况下，第一Fv分子的VL结构域和第二Fv分子的VH结构域结合以 形成一个靶结合位点，而第一Fv分子的VH结构域和第二Fv分子的 VL结构域结合以形成另一个靶结合位点。
本发明的另一个实施方案是双特异性三价靶向蛋白，其包括非共 价结合的两个异源多肽链以形成三个结合位点，其中两个对一个靶 标具有亲和力，而第三个对半抗原具有亲和力，所述半抗原可制备 并连接于载体上用作为诊断和/或治疗剂。优选地，所述结合蛋白具 有两个相似的抗原结合位点和一个不同的抗原结合位点。所述双特 异性三价靶向剂具有两个不同的scFvs，一个scFv含有来自一个抗 体的两个VH结构域，通过短接头连接于另一抗体的VL结构域，而第 二个scFv含有来自第一抗体的两个VL结构域，通过短接头连接于另 一抗体的VH结构域。用于产生来自VH和VL结构域的多价多特异性试 剂的方法条件是由宿主生物体中的DNA质粒合成的个体链完全是由 VH结构域(VH链)或完全是由VL结构域(VL链)以这种方式构成的， 从而可通过一个VH链与一个VL链的非共价结合生产任何多价和多特 异性的试剂。例如，为形成三价三特异性试剂，所述VH链将包括三 个VH结构域的氨基酸序列，每一个都来自具有不同特异性的抗体， 通过具有可变长度的肽接头接合起来，而VL链将包括互补的VL结构 域，通过类似于VH链所用的肽接头接合起来。由于抗体的VH和VL结 构域以反平行方式结合，本发明优选的方法以VH链的VH结构域相反 的次序安置VL链的VL结构域。
5.双链抗体、三链抗体和四链抗体
本发明的抗体也可用于制备功能性双特异性单链抗体(bscAb)， 也称之为双链抗体，并且可利用重组方法在哺乳动物细胞中生产。 参见如Mack等，Proc.Natl.Acad.Sci.，92：7021-7025，1995， 特此并入。例如，bscAb是利用重组方法介由甘氨酸-丝氨酸接头接 合两个单链Fv片断生产的。两目的抗体的V轻链(VL)和V重链(VH) 结构域是利用标准PCR方法分离的。然后将由各杂交瘤获得的VL和 VH cDNA接合起来以在两步融合PCR中形成单链片断。第一PCR步骤 引入(Gly4-Ser1)3接头，而第二步骤将VL和VH扩增子接合起来。然后 将各单链分子克隆到细菌表达载体中。继扩增后，切下单链分子中 的一个，并亚克隆到含第二单链目的分子的另一载体中。将所得的 bscAb片断亚克隆到真核表达载体中。功能性蛋白的表达可通过将载 体转染到中国仓鼠卵巢细胞中获得。以类似的方式制备双特异性融 合蛋白。双特异性单链抗体和双特异性融合蛋白包括在本发明的范 围之内。
例如，人源化、嵌合或人抗-CD22单克隆抗体可用于生产抗原特 异性双链抗体、三链抗体和四链抗体。单特异性双链抗体、三链抗 体和四链抗体选择性地结合靶向的抗原，并且随着分子上结合位点 数目的增加，对靶细胞的亲和力增大，并在期望位置上观察到更长 的滞留时间。对于双链抗体，利用了包括通过五氨基酸残基接头连 接于人源化CD22Mab的Vκ多肽的人源化CD22MAb的VH多肽的两条 链。每条链形成人源化CD22双链抗体的一半。在三链抗体的情况下， 利用了包括不通过接头连接于人源化CD22Mab的Vκ多肽的人源化 CD22MAb的VH多肽的三条链。每条链形成hCD22三链抗体的三分之 一。
本文所述双特异性双链抗体优选的用途是用于预靶向CD22阳性 肿瘤，用于随后特异性递送诊断或治疗剂。这些双链抗体选择性地 结合靶向的抗原，允许增大的亲和力和期望位置上更长的滞留时 间。而且，非抗原结合的双链抗体被很快地从机体中清除，并且正 常组织的暴露被最小化。所述诊断和治疗剂可包括同位素、药物、 毒素、细胞因子、激素、生长因子、缀合物、放射性核素和金属。 例如，钆金属被用于磁共振成像(MRI)。放射性核素的实例有225AC、 18F、68Ga、67Ga、90Y、86Y、111In、131I、125I、123I、99mTc、94mTc、186Re、 188Re、177Lu、62Cu、64Cu、67Cu、212Bi、213Bi、32p、11C、13N、15O、76Br和211At。其它放射性核素作为诊断和治疗剂也是可获得的，特别是 处于60到4,000keV能量区的那些。
更为最近地，也业已报道过具有双重特异性的四价串连双链抗体 (称作tandab)(Cochlovius等，Cancer Research(2000) 60：4336-4341)。所述双特异性tandab是两个完全相同的多肽的二 聚体，各自含有两不同抗体的四个可变结构域(VH1、VL1、VH2、VL2)， 它们在自结合时以促进形成针对两不同特异性中每一个的两个潜在 的结合位点的取向连接。
6.缀合的多价和多特异性抗体
在本发明的另一个实施方案中，是缀合的多价抗体。可将附加的 氨基酸残基添至第一或第二多肽的N-或C-端。所述附加的氨基酸残 基可包括肽标签、信号肽、细胞因子、酶(例如前药激活酶)、激素、 肽毒素如假单胞菌外毒素、肽药物、细胞毒性蛋白或其它功能蛋白。 如本文所用，功能蛋白是具有生物学功能的蛋白。
在一个实施方案中，药物、毒素、放射性化合物、酶、激素、细 胞毒性蛋白、螯合剂、细胞因子及其它功能性试剂可缀合于多价靶 结合蛋白，优选是通过共价连接到所述多价靶结合蛋白氨基酸残基 的侧链上，例如胺、羧基、苯基、硫醇或羟基基团。多种常规的接 头可用于此目的，例如，二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、二(羟基琥珀 酰亚胺)酯、碳化二亚胺、马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛 等。试剂与所述多价蛋白的缀合优选并不显著影响蛋白对其靶标的 结合特异性或亲和力。如本文所用，功能性试剂是具有生物学功能 的试剂。优选的功能性试剂是细胞毒性剂。
又在其它实施方案中，双特异性抗体指导的治疗剂或前药向体内 靶标的递送可与放射性核素的双特异性抗体递送联合，从而实现化 学治疗和放射性免疫治疗的联合。每一种治疗都可缀合于可靶向的 缀合物并同时给药，或者所述核素可作为第一可靶向缀合物的一部 分给予，而药物在稍后的步骤中作为第二可靶向缀合物的一部分给 予。
在另一个实施方案中，细胞毒性剂可缀合于聚合物载体，且所述 聚合物载体可随后缀合于所述多价靶结合蛋白。有关此法，参见 Ryser等，Proc.Natl.Acad Sci.USA，75：3867-3870(1978)，美 国专利No.4,699,784和美国专利No.4,046,722，特此将其并入作 为参考。缀合优选并不显著影响所述多价结合单比的结合特异性或 亲和力。
7.类人灵长化、人源化、嵌合及人抗体用于治疗和诊断的用途
根据本发明，类人灵长化、人源化、嵌合及人单克隆抗体即本文 所述的抗-CD20MAbs及其它MAbs，适合用于治疗方法和诊断方法 中。因此，本发明设想单独作为裸抗体给药本发明的类人灵长化、 人源化、嵌合及人抗体，或者作为多模式治疗根据投药方案临时性 地给药，但并不与治疗剂缀合。裸抗-CD20MAbs的功效可通过用一 种或多种其它裸抗体补充裸抗体得以增强，即针对特定抗原的 MAbs，如CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD21、CD22、CD23、 CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、 CD80、CD126、B7、Ia、HM1.24、腱生蛋白、MUC1或HLA-DR，以及 用抗血管生成抗体(如VEGF和P1GF抗体)连同一种或多种抗-CD20免 疫缀合物，或者用与包括药物、毒素、免疫调节剂、激素、治疗性 放射性核素等在内的治疗剂缀合的针对所述这些抗原的抗体，连同 一种或多种包括药物、毒素、免疫调节剂、激素、治疗性放射性核 素等在内的治疗剂，同时地或相继地或根据处方的投药方案与所述 MAbs一起给药。优选的B细胞抗原包括等同于人CD19、CD20、CD21、 CD22、CD23、CD46、CD52、CD74、CD80和CD5抗原的那些。优选的T 细胞抗原包括等同于人CD4、CD8和CD25(IL-2受体)抗原的那些。 HLA-DR抗原的等同物可用于治疗B细胞和T细胞两种紊乱。特别优 选的B细胞抗原是等同于人CD19、CD22、CD21、CD23、CD74、CD80 和HLA-DR抗原的那些。特别优选的T细胞抗原是等同于人CD4、CD8 和CD25抗原的那些。CD46是癌细胞表面上阻断补体依赖性溶解(CDC) 的抗原。
此外，本发明设想给药免疫缀合物用于B细胞淋巴瘤及其它疾病 或紊乱的治疗用途。如本文所述的免疫缀合物是包含抗体组分和治 疗剂的分子，包括可能带有所述治疗剂的肽。免疫缀合物保留了抗 体组分的免疫反应性，也就是说，所述抗体成分在缀合后具有如缀 合前大约相同或稍微下降的结合同源抗原的能力。
同样，本发明设想给药免疫缀合物用于髓样白血病的治疗用途， 其中靶向的是CD33、CD45、CD66及其它粒细胞相关抗原。
广泛多样的治疗试剂可有利地缀合于本发明的抗体。此处所述的 治疗剂是那些也可用于与上文所述裸抗体分别地给药的试剂。例 如，治疗剂包括化疗药物如长春花生物碱类、蒽环类抗生素、表鬼 臼毒素类、紫杉醇类、抗代谢物、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、 抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和细胞调亡剂，特别是阿霉素、氨甲 喋呤、紫杉酚、CPT-11、喜树碱类、以及其它形式的这样那样的抗 癌剂等。其它可用的用于制备免疫缀合物和抗体融合蛋白的癌症化 疗药物包括氮芥类、烷基磺酸酯类、亚硝基脲类、三氮烯类、叶酸 类似物、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位复合物， 包括奥沙利铂、激素等。合适的化疗剂描述在REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack Publishing Co.，1995) 和GOODMAN AND GILMAN′S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第7版(MacMillan Publishing Co.，1985)以及这 些出版物的修订版中。其它合适的化疗剂如实验性药物是本领域技 术人员公知的。
另外，有螯合剂如DTPA、DOTA、TETA或NOTA或合适的肽，其上 可缀合可检测标记物如荧光分子，或者细胞毒性剂如重金属或放射 性核素。例如，治疗上可用的免疫缀合物可通过将光敏剂或染料缀 合于抗体组分上获得。荧光组合物如荧光色素及其它发色团，或者 染料如对可见光敏感的卟啉，业已通过将合适的光线引导到病变处 而用于检测和治疗病变。在治疗中，这已被称为光辐射、光线疗法 或光动力学疗法(Jori等(编)，PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh， Chem.Britain 22：430(1986))。而且，单克隆抗体业已与光活化 染料偶联用于实现光线疗法。Mew等，J.Immunol130：1473(1983)； 同作者，Cancer Res.45：4380(1985)；Oseroff等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 83：8744(1986)；同作者，Photochem.Photobiol.46： 83(1987)；Hasan等，Prog Clin.Biol.Res.288：471(1989)； Tatsuta等，Lasers Surg Med.9：422(1989)；Pelegrin等，Cancer 67：2529(1991)。然而，这些早期的研究并未包括内窥镜治疗应用 的用途，特别是抗体片断或亚片断的使用。从而，本发明设想了包 含光敏剂或染料的免疫缀合物的治疗用途。
毒素如假单胞菌外毒素也可络合于或构成本发明抗-CD20抗体抗 体融合蛋白的治疗剂部分。在此类缀合物或其它融合蛋白的制备中 适合采用的其它毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶 (RNase)、DNase I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、多 花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。例 如，参见Pastan等，Cell 47：641(1986)和Goldenberg，CA-A Cancer Journalfor Clinicians 44：43(1994)。适合用于本发明的另外的 毒素是本领域技术人员公知的，并在美国专利6,077,499中公开， 特此将其全文并入作为参考。
免疫调节剂如细胞因子也可缀合于或构成抗体融合蛋白的治疗 剂部分，或者与本发明的人源化抗-CD20或其它淋巴瘤抗体一起给 药。用于本发明的合适的细胞因子包括但不限于：干扰素和白介素， 如下文所述。
8.免疫缀合物的制备
本发明的任何抗体或抗体融合蛋白可与一种或多种治疗剂缀 合。一般地，是一种治疗剂连接于各抗体或抗体片断，但不止一种 治疗剂可连接于同一抗体或抗体片断上。本发明的抗体融合蛋白包 括两个或多个抗体或其片断，且构成该融合蛋白的每个抗体可含有 一治疗剂。另外，抗体融合蛋白的一个或多个抗体可连接有不止一 种治疗剂。此外，所述治疗剂无需相同，但是可以是不同的治疗剂。 例如，人们可将药物和放射性同位素连接于同一融合蛋白。尤其是， IgG可用131I放射性标记，并连接到药物上。可将所述131I掺入到所 述IgG的酪氨酸中，并将药物连接于IgG赖氨酸的ε氨基上。也可将 所述治疗剂连接于还原的SH基团，以及糖侧链。
本发明的双特异性抗体可用于预靶向方法，并提供了向受试者递 送两种治疗剂的优选方式。美国流水号No.09/382,186公开了利用 双特异性抗体预靶向的方法，其中所述双特异性抗体由125I标记，并 递送给受试者，接着是由99mTc标记的二价肽。所述递送导致出色的 有关125I和99mTc的肿瘤/正常组织比，从而证明了两种诊断性放射性 同位素的实用性。可利用已知治疗剂的任意组合标记所述抗体和抗 体融合蛋白。所述mAb缀合物抗体组分的结合特异性、所述治疗剂 或诊断剂的功效、以及所述抗体Fc部分的效应器活性，可通过所述 缀合物的标准试验确定。
治疗剂可介由二硫键的形成连接在还原抗体组分的铰链区。作为 备选方案，可利用杂双功能交联接头将此类肽连接于所述抗体组 分，如N-琥珀酰3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)。Yu等，Int.J. Cancer 56：244(1994)。用于此类缀合的一般技术是本领域众所周 知的。参见如Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press，1991)；Upeslacis等，″Modification of Antibodies by Chemical Methods，″in MONOCLONAL ANTIBODIES： PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等(编)，第187-230页 (Wiley-Liss，Inc.，1995)；Price，″Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，″in MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等(编)，第60-84页(Cambridge University Press，1995)。备选地，所述治疗剂可介由糖成分追合作抗体的Fc 区之中。所述糖基团可用于增大结合于硫醇基团的同一肽的荷载， 或者所述糖成分可用于结合不同的肽。
介由抗体糖成分将肽缀合于抗体组分的方法是本领域技术人员 众所周知的。例如，参见Shih等，Int.J Cancer 41：832(1988)； Shih等，Int.J.Cancer 46：1101(1990)；以及Shih等，美国专 利No.5,057,313，特此将它们全部全文并入作为参考。一般方法 涉及使具有氧化糖部分的抗体组分与具有至少一个游离胺官能团且 荷载了多个肽的载体聚合物反应。所述反应产生了最初的希夫碱(亚 胺)链键，这可通过还原为仲胺稳定化，以形成终缀合物。
如果用作为免疫缀合物抗体组分的抗体是抗体片断，则Fc区消 失。不过，有可能向全长抗体或抗体片断的轻链可变区中引入糖成 分。例如，参见Leung等，J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen 等，美国专利No.5,443,953(1995)，Leung等，美国专利No. 6,254,868，特此将它们全部全文并入作为参考。利用所述改造的糖 成分连接所述治疗或诊断剂。
9.药学上可接受的载体
所述待递送给受试者的类人灵长化、人源化、嵌合或人放射性标 记抗体可仅由mAb、免疫缀合物、融合蛋白组成，或者可包括一种 或多种药学上合适的载体、一种或多种附加成分、或者这些物质的 某些组合。
本发明的免疫缀合物抗体可根据制备药学上可用组合物的已知 方法配制，由此所述免疫缀合物或裸抗体在混合物与药学上合适的 载体混合。无菌磷酸缓冲盐溶液是药学上合适载体的一个实例。其 它合适的载体是本领域技术人员众所周知的。例如，参见Ansel等， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5 版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(编)，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)，以及它们的修订版。
可配制本发明的免疫缀合物和裸抗体用于肠胃外应用，如静脉内 给药，例如介由丸剂注射和连续输注。注射用制剂可提供为单位剂 量的形式，例如，在安瓿瓶中，和在多剂量容器中，添有防腐剂。 所述组合物可采取诸如悬液、溶液或处于油或水性载体中的乳剂形 式，并且可含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，所 述活性成分可以是散剂形式，以在用前与合适的载体如无菌无热原 的水重构。
可采用另外的制药方法以控制治疗性缀合物或裸抗体的作用持 续时间。缓释剂可通过使用聚合物络合或吸收所述免疫缀合物或裸 抗体制备。例如，生物可相容的聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯 酯)基质以及硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物基质。Sherwood 等，Bio/Technology 10：1446(1992)。免疫缀合物或抗体由此基质 的释放速率取决于所述免疫缀合物或抗体的分子量、基质内免疫缀 合物、抗体的量、以及分散颗粒的大小。Salizman等，Biophys.J. 55：163(1989)；Sherwood等，同上。其它固体剂量形式在描述在 Ansel等，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS， 第5版(Lea & Febiger 1990)，和Gennaro(编)，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)以及它们的修订版中。
所述免疫缀合物、抗体融合蛋白或裸抗体也可皮下或者甚至通过 其它肠胃外路径向哺乳动物给药。而且，所述给药可以是通过连续 输注或者通过单次或多个丸剂。一般而言，人用给药的免疫缀合物、 融合蛋白或裸抗体的剂量将根据诸如患者的年龄、体重、身高、性 别、一般医学状况和以前的病史的因素而变。典型地，期望为受体 提供剂量在从大约1mg/kg到20mg/kg范围内的免疫缀合物、抗体 融合蛋白或裸抗体作为单次静脉内输注，尽管视情形而定，也可给 药更低或更高的剂量。该剂量可视需要而重复，例如，每周一次共 4-10周，优选每周一次共8周，并且更优选每周一次共4周。也可 以不太频繁地给予，例如每隔一周持续数月。所述剂量可通过多种 肠胃外路径给予，并适当地调整剂量和回程。
出于治疗目的，向哺乳动物给药治疗有效量的免疫缀合物、融合 蛋白或裸抗体。本发明合适的受试者通常是人，尽管也考虑非人动 物受试者。如果所给药的量具有生理学显著意义的，则抗体制剂被 表述为是以“治疗有效量”给药的。如果其存在导致受体哺乳动物 生理学上可检测的变化，则该制剂具有生理学显著意义。尤其是， 如果其存在激发了抗肿瘤应答或缓和了自身免疫病状态的体征和症 状，则本发明的抗体制剂具有生理学显著意义。生理学显著意义的 功效也可以是在受体哺乳动物中激发体液和/或细胞免疫应答。
10.治疗方法
本发明设想使用本发明的抗体作为用于治疗疾病如B细胞相关恶 性病、T细胞恶性病或另一淋巴瘤类型的主要组合物。另外，它也可 用于治疗自身免疫病。尤其是，本文所述的组合物尤其可用于治疗 多种自身免疫病以及不活跃形式的B细胞淋巴瘤、攻击形式的B细 胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、以及瓦尔 登斯特伦氏巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤。同样，可治疗T细胞病 如T细胞白血病或蕈样肉芽肿病。例如，人源化抗-CD22抗体组分和 免疫缀合物可用于治疗不活跃和攻击形式的两种非霍奇金氏淋巴 瘤。自身免疫病选自下组：急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特 发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、 系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺综合症、大疱类天疱 疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后的肾炎、结节性红斑、 Takayasu′s动脉炎、爱迪生氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、 结节病、溃疡性结肠炎、多形红斑、IgA肾病、结节性多发动脉炎、 强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、干燥综 合症、原发性胆汁性肝硬变、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮 病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、 眶坏死性肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细 胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、快速渐进性血管球性肾炎、牛皮癣 和纤维性肺泡炎。
用于治疗的组合物含有至少一种单独的或与其它抗体联合的人 源化、嵌合或人单克隆抗体，如其它人源化、嵌合或人抗体、治疗 剂或免疫调节剂。尤其是，也设想与全人抗体的联合治疗，且是通 过如上文所述的方法生产的。
缀合于相同或不同表位或抗原的抗体也可与一个或多个本发明 的抗体混合。例如，人源化、嵌合或人缀合抗-CD22抗体可与另一类 人灵长化、人源化、嵌合或人缀合抗-CD22混合，而类人灵长化、人 源化、嵌合或人缀合抗-CD22抗体可与抗-CD22免疫缀合物混合。备 选地，可与不同的淋巴瘤相关抗体进行各种这样的混合，如上文所 述的那样。类人灵长化、人源化、嵌合或人CD22抗体与毒素或免疫 调节剂的融合蛋白，或者至少两个不同B细胞抗体的融合蛋白(如 CD20和CD22 mAb)也可用于本发明之中。许多不同的抗体混合物， 靶向与B细胞或其它淋巴瘤或自身免疫病相关的至少两个不同的抗 原，如上文早已列举的那样，可构建为与治疗剂或免疫调节剂部分 缀合，或者仅仅是与另一治疗剂如细胞毒性药物混合，或者具有射 线。
如本文所用，术语“免疫调节剂”包括细胞因子，干细胞生长因 子，淋巴毒素，如肿瘤坏死因子(TNF)，和造血生长因子，例如白介 素(如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12和IL-18)， 集落刺激因子(如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集 落刺激因子(GM-CSF))，干扰素(如干扰素α、β和γ)，命名为“S1因 子”的干细胞生长因子，促红细胞生成素以及促血小板生成素。合 适的免疫调节剂成分的实例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、 干扰素-γ、TNF-α等。备选地，受试者可接受缀合的抗-CD20抗体和 单独给药的细胞因子，其可在裸或缀合的抗-CD20抗体给药之前、同 时或之后给药。如前文所讨论的那样，所述抗-CD22抗体也可缀合于 免疫调节剂。所述免疫调节剂也可缀合于杂交抗体或杂交抗体片断 或亚片断(单链结合蛋白或sFv′s)，它们包括与不同抗原结合的一个 或多个抗体或亚片断。
本发明的多模式治疗还包括用缀合的抗-CD22抗体免疫治疗，补 充给药融合蛋白形式的或作为免疫缀合物的抗-CD20、抗-CD19、抗 -CD21、抗-CD74、抗-CD80、抗-CD23、抗-CD46或HLA-DR(包括不 变链)抗体。这些抗体包括多克隆、单克隆、灵长化类人、嵌合、人 或人源化抗体，其识别这些抗原决定簇上的至少一个表位。抗-CD19 和抗-CD22抗体是本领域技术人员公知的。例如，参见Ghetie等， Cancer Res.48：2610(1988)；Helcman等，Cancer Immunol. hnynunother.32：364(1991)；Longo，Curr.Opin.Oncol.8：353 (1996)以及美国专利No.5,798,554和6,187,287，特此全文并入作 为参考。
在另一种形式的多模式治疗中，受试者接受缀合的抗体和/或免 疫缀合物，联合标准的癌症化疗。例如，″CVB″(1.5g/m2环磷酰胺、 200-400mg/m2依托泊甙和150-200mg/m2亚硝脲氮芥)是用于治疗非 霍奇金氏淋巴瘤的方案。Patti等，Eur.J.Haematol.51：18 (1993)。其它合适的化疗方案组合是本领域技术人员众所周知的。 例如，参见Freedman等，″Non-Hodgkin′s Lymphomas，″in CANCER MEDICINE，第2卷，第3版，Holland等(编)，第2028-2068页(Lea & Febiger 1993)。作为举例说明，用于治疗中度非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)的第一代化疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、甲基 苄肼和脱氢可的松)以及CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和脱氢 可的松)。可用的第二代化疗方案是m-BACOD(氨甲喋呤、博莱霉素、 阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰四氢叶酸)，而合适 的第三代方案是MACOP-B(氨甲喋呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、 脱氢可的松、博莱霉素和甲酰四氢叶酸)。另外可用的药物包括丁酸 苯酯和薯司他丁-1。在优选的多模式治疗中，化疗药物和细胞因子 都与根据本发明的抗体、免疫缀合物或融合蛋白共给药。所述细胞 因子、化疗药物以及抗体或免疫缀合物可以任何次序或一起给药。
可用作为治疗剂、基本上由于β-粒子发射而衰减的放射性核素包 括但不限于：Ac-225、P-32、P-33、Sc-47、Fe-59、Cu-64、Cu-67、 Se-75、As-77、Sr-89、Y-90、Mo-99、Rh-105、Pd-109、Ag-111、 I-125、I-131、Pr-142、Pr-143、Pm-149、Sm-153、Tb-161、Ho-166、 Er-169、Lu-177、Re-186、Re-188、Re-189、Ir-194、Au-198、Au-199、 Pb-211、Pb-212和Bi-213。可用的β-粒子发射核素的最大衰减能优 选为20-5,000keV，更优选为100-4,000keV，并且最优选为500- 2,500keV。
可用作为治疗剂、基本上由于俄歇发射粒子而衰减的放射性核素 包括但不限于：Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、 In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。这些放射性 核素的最大衰减能优选小于1,000keV，更优选小于100keV，并且 最优选小于70keV。
可用作为治疗剂、基本上由于α-粒子的产生而衰减的放射性核素 包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、 Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。可用的α-粒 子发射放射性核素的衰减能优选为2,000-9,000keV，更优选为 3,000-8,000keV，并且最优选为4,000-7,000keV。
可用于基于种子俘获操作的疗法的放射性核素包括但不限于： B-10、Gd-157和U-235。
本发明的实施方案可进一步通过详细显示本发明方方面面的实 施例举例说明。这些实施例举例说明了本发明的具体要素，而不应 当阐释为限制其范围。
实施例
抗体
Epratuzumab为人源化的LL2抗体，并由Immunomedics Inc.， Morris Plains，NJ研发。人源化过程用人IgG1序列替换了约95％的 鼠源Ig序列。Epratuzumab一经结合于CD22抗原的B表位就被内在 化(Stein，R.等，Cancer Immunol.Imnaunother.37(5)：293- 8，1993)，该表位对应于第三Ig结构域(Kehrl，J.H.B6 CD22 Workshop Panel Report，in Leubocyte Typing V.White Cell Differentiation Antigens.，S.F.Schlossman(编)，Oxford University Press，p.523-5，1995)。在5分钟之后观察到体外内 在化，并报道在5小时后发生多达50％抗原的再表达(Shih，L.B. 等Int J Cancer 56(4)：538-45，1994)。
人源化抗-CD20抗体hA20业已由Immunomedics，Inc.，Morris Plains，NJ研发。该Mab结合CD20，并与嵌合抗-CD20MAb利妥希 玛相反，它是比嵌合形式具有更少鼠源蛋白的CDR移植MAb。所述 hA20 MAb具有IgG1(κ)恒定区和与epratuzumab CD22人源化MAb 相同的人V框架区。将hA20的CDR移植VH和Vk链的基因插入到基 于DHFR扩增表达系统的pdHL2质粒载体中，并转染到Sp2/0鼠骨髓 瘤细胞系中以产生hA20生产克隆。分子表征证明hA20在其CDRs中 类似于利妥希玛，除了在VH区中有一个氨基酸的差异以外。然而， 由于包含更多的人构建体，hA20的VH和Vk框架区中存在着差异。 该hA20抗体似乎竞争利妥希玛对多种淋巴瘤细胞的结合，并且具有 与利妥希玛相似的解离常数，以及相似的体外和体内抗表达CD20的 人淋巴瘤细胞系的效应。
非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的治疗
呈IV期弥漫性大细胞NHL的66岁老人，在前两年给予的3疗程 化疗之后复发。向他给予两次90Y-DOTA-epratuzumab(依照Govinden 标记，同前)注射的剂量，相隔一周，每次通过静脉内输注给药7.5 mCi/m2 90Y连同总剂量30mg的抗体蛋白。六周后，他的颈淋巴结和 他的脾肿大似乎已显著减小，且患者症状上得到改善，并返回专职 工作。由于他并未完全缓解，制定了涉及epratuzumab(360mg/m2) 和hA20(250mg/m2)联合的继续治疗，隔周给予，总计4次输注， 然后12周之后重复所述联合抗体治疗疗程。在结束裸CD22和CD20 抗体联合的第二治疗疗程后三个月，通过放射线扫描或骨髓生检， 患者无疾病迹象，因而认为是完全应答。在3个月后的下一个评价 中，他仍处于疾病的完全缓解之中。
T细胞白血病的治疗
向对在前的化疗顽固且具有晚期T细胞白血病的患者给予与20 mCi 90Y-DOTA缀合的50mg抗-CD25人源化Mab的输注，一周后接 着给予剂量为200mg/m2的CD25Mab(抗-TAC人源化抗体)输注。四 周后，他的血液计数和骨髓生检显示了疾病的部分缓解。
顽固性类风湿性关节炎的治疗
患者呈严重晚期类风湿性关节炎，影响了许多关节，但尤其是他 的膝盖，现对化疗顽固，用剂量为10mCi/m2由90Y标记的总计50mg 的CD4和CD20人源化Mabs混合物单次输注治疗。两周后，向他给 予由100mg CD4和250mg CD20抗体组成的裸人源化抗体剂量，并 在两周后再这样重复一次。缓和感觉到其关节炎的缓解，特别是膝 盖，并且4周后，能够更好地步行甚至是爬楼梯，其医师几乎没记 录关节炎症。三个月后，重复该治疗疗程，涉及一次放射性标记抗 体混合物的输注，接着是两次裸CD4和CD20抗体的输注，并在6周 后重新评价患者。医师注意到显著的改善，从而患者见证了仅最小 的疼痛和其肢体颇为更佳的运动性。
尽管前述内容涉及特定的优选实施方案，人们将会理解本发明并 不局限于此。本领域普通技术人员将会想到可对所公开的实施方案 进行各种改进，并且此类改进旨在落入本发明由如下实施方案所定 义的范围之内。
特此将本说明书中所引述的所有出版物和专利申请及专利全文 并入作为参考。
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