[02]已经知道生产用于疫苗和其它目的的活病毒制品的多种方 法。而且还知道为了保持活性而用于实验室或疫苗用途的冷冻、冻干 或其它保存活病毒制品的制剂和方法。
[03]通常，重组病毒以冷冻干燥小糖丸(freeze-dried pellet)保存， 其中含有蔗糖、酪蛋白和/或胶原水解产物的磷酸缓冲生理盐水(PBS)。 然后这些小糖丸在药学上可接受的溶液(例如0.4-0.9％NaCl)中再水 化。然而，却存在与这种制剂有关的重大缺点并且为本领域所知。在 这些缺点中包括使用了动物源性物质、不完全确定的成分、复杂的制 备方法、高成本和不能保持某些所需的病毒特性。
[04]本领域需要适于制备稳定的病毒制品以用于免疫制剂和疫 苗的制剂。需要提供保持病毒所需特性(包括病毒存活力和感染力)的 稳定制剂(stabilizing formulation)，即免疫制剂或疫苗。另外，出于对 有关动物传播疾病的考虑，本领域需要不是由动物类型产品得到的稳 定制剂，还需要提供滴度高、体积小、适于快速冷冻干燥处理的制剂。 本申请提供了这样的制剂及其使用方法。
附图简述
[05]图1.在不同温度下，对液体制剂与本发明一个实施方案的 新的冻干制剂F12(FD)进行的重组病毒制品稳定性比较。在规定时间 测定每种病毒制剂的感染滴度(CCID50)。
发明概述
[06]本发明提供用于保存病毒(例如病毒载体)并且具有各种用 途的稳定制剂，包括免疫制剂和疫苗。在一个实施方案中，本发明制 剂包含糖、防腐剂、分散剂、热稳定剂、缓冲剂和最多3种不同类型 的氨基酸(即1、2或3种不同类型的氨基酸)。在一个实施方案中，本 发明制剂包含3种不同类型的氨基酸。在另一个实施方案中，本发明 制剂包含2种不同类型的氨基酸。在另一个实施方案中，本发明制剂 仅包含一种类型的氨基酸。优选的氨基酸是精氨酸、丙氨酸、丝氨酸 或甘氨酸。另外优选的氨基酸是精氨酸、丝氨酸或甘氨酸。将病毒加 到稳定制剂中，在所需时间内保持可测量的具体特性(例如存活力、感 染力)。优选的制剂在病毒存在的特定条件下保持某些所需的可测量特 性，例如有利的外观和溶解时间，下面将予以描述。本发明的其它实 施方案从所附说明书、实施例和权利要求书来讲是显而易见的。
发明详述
[07]通常，重组病毒(例如禽痘病毒ALVAC)作为冷冻干燥小糖 丸保存，其中含有蔗糖、酪蛋白和/或胶原水解产物的磷酸缓冲生理盐 水(PBS)。然后这些小糖丸在药学上可接受的溶液(例如0.4-0.9％NaCl) 中再水化。然而，却存在与这种制剂有关的重大缺点，而且是本领域 已知的难以克服的困难。因此，本发明所提供的是如下所述的新的稳 定制剂。
[08]本发明提供用于稳定地贮藏和保存病毒的制剂，包括用作表 达载体的重组病毒、免疫制剂和/或疫苗。所述制剂可用于制备、保存 和使用这些病毒的方法中，与现有的制剂相比，制备、保存和使用起 来较为容易，成本较低而且病毒活性没有显著降低。这些制剂可称为 “稳定制剂”，通常包括糖(例如蔗糖或山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、甘 露醇、乳糖)、防腐剂(可以是糖、氨基酸、其它组分)、分散剂(例如聚 乙烯吡咯烷酮40、葡聚糖、PEG)、热稳定剂(例如尿素)、缓冲剂(例 如三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、磷酸钠、乙酸盐、 硼酸盐、Hepes、MOPS、PEG)和一种或多种氨基酸。
[09]本发明制剂中优选包括不超过1、2、3或4种氨基酸。本领 域技术人员应当理解的是，在描述组成时提及的氨基酸不包括在制备 后加到制剂中的病毒、佐剂或其它组分内的氨基酸或者从病毒、佐剂 或其它组分内中释放出的氨基酸。因此，作为制剂组成部分的所述氨 基酸在向制剂中加入病毒或佐剂之前就已存在。
[10]在最优选的实施方案中，本发明制剂中包括单种氨基酸。在 优选的实施方案中，本发明制剂包括精氨酸、丝氨酸或甘氨酸中的至 少一种。在更优选的实施方案中，本发明制剂包含单种氨基酸，该氨 基酸是精氨酸、丝氨酸或甘氨酸。优选本发明制剂中氨基酸的含量约 为100mg/ml以下。更优选本发明制剂中氨基酸的含量为约 90-95mg/ml、约85-90mg/ml、约80-85mg/ml或约80mg/ml。本领域技 术人员可得到各种大量的氨基酸。
[11]稳定制剂优选作为液体、冷冻干燥制品(freeze-dried preparation)、冻干制品(lyophilized preparation)或其它形式而用于保存 病毒。对于液体，优选液体制剂是药物制剂。冻冷干燥制品或冻干制 品通常使用液体(例如药学上可接受的载体)复原而被转化为液体形 式。药学上可接受的载体可以是例如含有缓冲剂和盐的液体载体(即 PBS)。合适的缓冲剂和盐的实例以及其它类型的药学上可接受的载体 是本领域众所周知的。
[12]在评价用于保存病毒制品具体制剂的适宜性时，本发明制剂 的视觉外观已被确定为适宜性的重要指标。例如，最合适的制剂呈光 滑的白色药层或“块”，在冻干并保存在约-20℃下约52周后不会从 小瓶的边缘皱缩。较不合适的制剂呈“熔融”、“起泡”或其它畸形 形状，并且在贮存后从小瓶边缘皱缩。如以下实验结果所示，光滑的 白色药层与较快的溶解时间有关，这是本文所述制剂的另一个所需特 性。光滑的白色层块与用于稳定地保存病毒的制剂紧密相关。
[13]如上所述，溶解时间是合适制剂的非常重要的特性。优选在 病毒制品冻干后，在约5℃下保存约52周后，本发明制剂在药学上可 接受的载体(例如PBS)中的溶解时间约为20-25秒钟、约15-20秒钟或 优选约15秒钟以内。这就为技术人员提供了现场可快速使用的制剂。
[14]使病毒在稳定制剂中维持不变的温度是适于保存一段时间 后(例如长达约52周)维持病毒/制剂所需状态(例如通过观察外观、溶 解时间、滴度或制品其它特性而确定)的任何温度。制剂通常并最便于 保持在约10℃以下(例如约5℃)的温度下。在某些情况下，本发明制 剂应保持在-20℃下。
[15]对于制剂复原后合适的pH是在保存一段时间(例如长达约 52周)后维持病毒所需状态(例如存活力、感染滴度、溶解时间)的任何 pH。例如，液体制剂理想的pH约为6-9、6-8.5、6.5-8.5、7-8.5、7.5-8.5、 6-8、6.5-8、7-8、7.5-8或7-7.5。优选制剂的pH约为7.5。可将液体 制剂放置(例如保持或保存)在任何合适的容器中。通常，容器包括玻 璃或塑料小瓶或其它贮存容器的形式，或基本上由玻璃或塑料小瓶或 其它贮存容器的形式组成，或由玻璃或塑料小瓶或其它贮存容器的形 式组成。
[16]实施本发明时可使用许多不同的病毒。合适的病毒包括例如 腺病毒、虫媒病毒、星状病毒、噬菌体、肠道病毒、胃肠炎病毒、汉 坦病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、 疱疹病毒(例如EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)和单纯疱疹病毒 (HSV))、流感病毒、诺沃克病毒、脊髓灰质炎病毒、脊椎动物痘病毒 科(Chordopoxviridae)(例如正痘病毒属、痘苗病毒、MVA、NYVAC、 禽痘病毒、金丝雀痘病毒、ALVAC、ALVAC(2)、家禽痘病毒(fowlpox))、 弹状病毒、呼肠孤病毒、鼻病毒、轮状病毒、逆转录病毒、杆状病毒 科(Baculoviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、花椰菜花叶病毒科 (Caulimoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、 黄病毒科(Flaviviridae)、肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、罗达病毒科 (Nodaviridae)、正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、副黏病毒科 (Paramyxoviridae)、乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)、细小病毒科 (Parvoviridae)、藻类DNA病毒科(Phycodnaviridae)、小核糖核酸病毒 科(Picomaviridae)和披膜病毒科(Togaviridae)以及起源于、基于或基本 类似于上述病毒或其它合适病毒的经修饰的病毒。用于实施本发明优 选的病毒是痘病毒，特别是ALVAC。本领域已知的其它合适的病毒 参见例如Fields等，Virology(第34版，Lippincott Williams & Wilkins (2001))。
[17]在某些实施方案中，重组病毒在其基因组内含有编码抗原或 免疫原的核酸序列，因此该病毒可用于免疫制剂或疫苗。术语“重组 病毒”是指不是病毒基因组天然部分的异源基因插入到病毒基因组的 任何病毒。免疫制剂是这样一种制剂，即在给予宿主时，产生针对由 病毒编码的抗原或免疫原或者对由病毒编码的抗原或免疫原起反应 的免疫应答。这种免疫应答对宿主可能有或者没有保护作用，或者可 能或不能为宿主提供免疫力。疫苗是引起宿主产生针对由宿主编码的 抗原或免疫原或者对由宿主编码的抗原或免疫原起反应的保护性免 疫应答的制剂。可用本领域技术人员可采用的多种技术中的任一种来 测定免疫应答，这些技术包括但不限于ELISA、BIACORE、 DOT-BLOT、免疫扩散技术。
[18]在某些情况下，重组病毒可编码一种或多种肿瘤抗原 (“TA”)。肿瘤抗原包括肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异性抗原(TSA)， 其中癌细胞是抗原的来源。肿瘤相关抗原是在肿瘤细胞表面上表达的 量比正常细胞中所观察的量高的抗原，或者是胎儿发育期间在正常细 胞中表达的抗原。TSA是肿瘤细胞独特的抗原，不在正常细胞中表达。 肿瘤抗原还包括TAA或TSA、其抗原片段和保持其抗原性的修饰形 式。肿瘤抗原通常根据肿瘤抗原的表达模式、功能或遗传来源分为以 下五类：肿瘤/睾丸(CT)抗原(例如MAGE、NY-ESO-1)；黑素细胞分 化抗原(例如Melan A/MART-1、酪氨酸酶，gp100)；突变抗原(例如 MUM-1、p53、CDK-4)；过量表达的“自身”抗原(例如HER-2/neu、 p53)；和病毒抗原(例如HPV、EBV)。为了实施本发明，合适的肿瘤 抗原是在给予肿瘤抗原的宿主中诱导或提高抗肿瘤免疫应答的任何 肿瘤抗原。合适的肿瘤抗原包括例如gp100(Cox等，Science， 264：716-719(1994))、MART-1/Melan A(Kawakami等，J.Exp.Med.， 180：347-352(1994))、gp75(TRP-1)(Wang等，J.Exp.Med.， 186：1131-1140(1996))、酪氨酸酶(Wolfel等，Eur.J.Immunol.， 24：759-764(1994)；WO 200175117；WO 200175016；WO 200175007)、 NY-ESO-1(WO 98/14464；WO 99/18206)、黑素瘤蛋白聚糖(Hellstrom 等，J.Immunol.，130：1467-1472(1983))、MAGE家族抗原(例如 MAGE-1、2、3、4、6和12；Van der Bruggen等，Science，254：1643-1647 (1991)；美国专利第6,235,525号)、BAGE家族抗原(Boel等，Immunity， 2：167-175(1995))、GAGE家族抗原(例如GAGE-1、GAGE-2；Van den Eynde等，J.Exp.Med.，182：689-698(1995)；美国专利第6,013,765号)、 RAGE家族抗原(例如RAGE-1；Gaugler等，Immunogenetics，44：323-330 (1996)；美国专利第5,939,526号)、N-乙酰葡糖胺转移酶-V(Guilloux 等，J.Exp.Med.，183：1173-1183(1996))、p15(Robbins等，J.Immunol. 154：5944-5950(1995))、β-联蛋白(Robbins等，J.Exp.Med.， 183：1185-1192(1996))、MUM-1(Coulie等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 92：7976-7980(1995))、细胞周期蛋白依赖性激酶-4(CDK4)(Wolfel等， Science，269：1281-1284(1995))、p21-ras(Fossum等，Int.J.Cancer， 56：40-45(1994))、BCR-abl(Bocchia等，Blood，85：2680-2684(1995))、 p53(Theobald等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：11993-11997(1995))、 p185 HER2/neu(erb-B1；Fisk等，J.Exp.Med.，181：2109-2117(1995))、 表皮生长因子受体(EGFR)(Harris等，Breast Cancer Res.Treat，29：1-2 (1994))、癌胚抗原(CEA)(Kwong等，J.Natl.Cancer Inst.，85：982-990 (1995)、美国专利号5,756,103、5,274,087、5,571,710、6,071,716、 5,698,530、6,045,802、EP 263933、EP 346710和EP 784483)；癌相关 突变型黏蛋白(carcinoma-associated mutated mucin，例如MUC-1基因 产物；Jerome等，J.Immunol.，151：1654-1662(1993))；EBV的EBNA 基因产物(例如EBNA-1；Rickinson等，Cancer Surveys，13：53-80 (1992))；人乳头瘤病毒的E7、E6蛋白(Ressing等，J.Immunol.， 154：5934-5943(1995))；前列腺特异性抗原(PSA；Xue等，The Prostate， 30：73-78(1997))；前列腺特异性膜抗原(PSMA；Israeli等，Cancer Res.， 54：1807-1811(1994))；独特型表位(idiotypic epitope)或独特型抗原，例 如免疫球蛋白独特型或T细胞受体独特型(Chen等，J.Immunol.， 153：4775-4787(1994))；KSA(美国专利第5,348,887号)、驱动蛋白2 (Dietz等，Biochem Biophys Res Commun 2000年9月7日； 275(3)：731-8)、HIP-55、TCF β-1抗凋亡因子(Toomey等，Br J Biomed Sci 2001；58(3)：177-83)、肿瘤蛋白D52(Bryne J.A.等，Genomics， 35：523-532(1996))、H1FT、NY-BR-1(WO 01/47959)、NY-BR-62、 NY-BR-75、NY-BR-85、NY-BR-87，NY-BR-96(Scanlan，M.Serologic and Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens(鉴定人类肿瘤抗原的血清学和生物信息学方法)，载于 Cancer Vaccines 2000，Cancer Research Institute，New York，NY)、 BCY1、BFA4、BCA4和BFY3，包括“野生型”(即由天然存在的基 因组正常编码的抗原)、修饰形式、突变形式以及其它片段及其衍生物。 这些肿瘤抗原的任一种都可单独使用或者与一种或多种其它肿瘤抗 原共免疫方案联用。
[19]在其它情况下，重组病毒可编码源自致病生物的抗原或免疫 原。示例性的传染病病原体包括细菌、病毒、真菌、寄生物等。具体 示例性的病原体包括芽孢杆菌(Bacillus spp.)(例如炭疽芽孢杆菌(B. anthracis))、博德特氏菌(Bordetella spp.)(例如支气管炎博德特氏菌(B. brochiseptica)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)、百日咳博德特 氏菌(B.pertussis))、疏螺旋体属(Borellia)(例如布氏疏螺旋体(B. burgdorferi))、布鲁氏菌(Brucella spp.)、弯曲杆菌(Campylobacter spp.)、 衣原体(Chlamydia spp.)(例如沙眼衣原体(C.trachomatis))、梭菌 (Clostridium spp.)(例如肉毒梭菌(Clostridium botulinum))、棒杆菌属 (Corynebacterium)(例如白喉棒杆菌(C.diphtheria))、肠杆菌 (Enterobacter spp.)、埃希氏菌(Escherichia spp.)(例如大肠杆菌(E. coli))、嗜血菌(Haemophilus spp.)(例如流感嗜血菌(H.influenzae))、螺 杆菌(Helicobacter spp.)(例如幽门螺杆菌(H.pylori))、克雷伯氏菌 (Klebsiella spp.)、军团菌(Legionella spp.)、李斯特氏菌(Listeria spp.)、 分枝杆菌(Mycobacterium spp.)(例如结核分枝杆菌(M.tubercolosis))、 枝原体(Mycoplasma spp.)、奈瑟氏球菌(Neisseria spp.)(例如脑膜炎奈 瑟氏球菌(N.meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(N.gonnorhoeae))、诺卡氏 菌(Nocardia spp.)、巴斯德氏菌(Pasteurella spp.)、变形菌(Proteus spp.)、 立克次氏体(Rickettsia spp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)(例如肠炎沙门 氏菌(S.entiriditis)、伤寒沙门氏菌(S.typhi))、志贺氏菌(Shigella spp.) (例如弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri))、葡萄球菌(Staphylococcus spp.) (例如金黄色葡萄球菌(S.aureus))、链球菌(Streptococcus spp.)(例如肺 炎链球菌(S.pneumoniae))、弧菌(Vibrio spp.)(例如霍乱弧菌(V. cholerea))、冠状病毒、CMV、登革热病毒、埃博拉病毒、EBV、肝炎 病毒(例如甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎)、疱疹病毒、HIV、流 感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、乳头瘤病毒(人)、痘病毒(例如痘苗 病毒、天花病毒)、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、RSV、西尼罗病毒、 黄热病病毒、曲霉(Aspergillus spp.)、芽生菌(Blastomyces spp.)、念珠 菌(Candida spp.)、球孢子菌(Coccidioides spp.)、隐球菌(Cryptococcus spp.)、组织胞浆菌(Histoplasma spp.)、球虫(Coccidia spp.)、隐孢子虫 (Cryptosporidum spp.)、内阿米巴(Entamoeba spp.)(例如溶组织内阿米 巴(E.histolytica))、贾第鞭毛虫(Giardia spp.)(例如兰氏贾第鞭毛虫 (Giardia lamblia))、利什曼原虫(Leshmania spp.)、疟原虫(Plasmodium spp.)、血吸虫(Schistosoma spp.)、弓形虫(Toxoplasma spp.)(例如鼠弓 形虫(Toxoplasma gondii))、旋毛虫(Trichinella spp.)和锥虫 (Trypanosoma spp.)等等。
[20]在某些实施方案中，本发明的免疫原性制剂或疫苗可与一种 或多种佐剂联合给予以加强免疫应答。示例性的佐剂见下表1：
[21]表1-免疫佐剂的类型

[22]在下面的实施例中对本发明作进一步的描述。实施例仅用于 说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
[23]病毒稳定制剂-材料
[24]下述实验将使用下列化学试剂、滤膜和小瓶：尿素(批号 101K0040 Sigma)；L-丙氨酸粉(批号042K0900 Sigma)；MSG(批号 91K0096 Sigma)；L-精氨酸粉(批号42K0183 Sigma)；EAA(批号 3065605 Gibco)；甘氨酸粉(批号32K2502 Sigma)；Tris(批号73378B BioRad)；L-丝氨酸粉(批号111K0883 Sigma)；D-甘露醇(批号22K0111 Sigma)；NEAA(批号3065603 Gibco)；NaCl(BDH批号 12833/MO89160)；浓HCl(批号299102 BDH)；蔗糖(批号51K0026)； 蔗糖(批号022K0065 Sigma、批号K27819853/0076535B Merck kGAA)； PVP40(批号120K0117、批号71K0064 Sigma)；山梨糖醇(批号51K0005 Sigma、批号042K01351 Sigma)；谷氨酸(批号91K0096 Sigma)；小瓶 (BV0030，3ml白色管形玻璃小瓶)；塞子(3101820，13mm V-324432/50 Gray Butyl Serum塞子，不含乳胶)；封铅(CS0001，13mm一条铝封)； 滤膜0.2μm(批号476291 NalgeneAC，批号M2MN00586 ZapCap)。 编码HIV抗原gp120的ALVAC病毒vCP307(批号PX-0246与批号 PX-0230)用于下述实验的示例性病毒。
[25]方法-pH
[26]由于冷冻干燥和保存等操作可能改变pH，测定ALVAC冷 冻干燥制剂的pH对于衡量稳定性十分重要。pH计(VWR科技产品 SB301，Symphony)用标准pH缓冲液(Orion应用溶液，pH缓冲剂7.00、 10.01和4.01)校正，它包括了预期的pH样品范围。将部分新鲜样品 放入试管中，将电极浸入试管中。当数字显示器显出恒定读数时，就 记录读数至两位小数。
[27]摩尔渗透压浓度
[28]摩尔渗透压浓度是水溶液的总溶质浓度。渗透压计测量的是 不考虑分子量或离子电荷的溶质颗粒数。本项研究采用依赖于冰点降 低以测量摩尔渗透压浓度的Advanced Micro-Osmometer 3300型微渗 透压计。渗透压计按照生产说明书用50mOsm/kg和850mOsm/kg标准 曲线校正。通过运行Clinitrol 290参比溶液来检验标准曲线。将20μl 样品加到柱塞中，并插入渗透压计样品口以进行测量。当数字显示器 显示恒定读数时，记录读数。
[29]残留水分
[30]残留水分(RM)是在最初干燥后保留在冷冻干燥产品中结合 水的含量。本项研究所使用的用于测试残留水分的卡尔·费歇尔技术 (Karl Fisher Technique)，通过容量滴定来测定含水量。所测量的是残 留水分占干产品总重量的重量百分比。残留水分是稳定性指标，因为 保存期间暴露在湿气中会使产品不稳定。欧洲药典(第V版)推荐的残 留水分为3％以下。这样的残留水分有助于避免微生物生长并防止化 学降解和物理降解。卡尔·费歇尔库仑法(Karl Fisher Coulometric Method)与设计用来用电流测定法测定终点的CA-06型自动滴定系统 (Mitsubishi公司)联用的试验方法一起使用。在相对湿度保持在15％以 下的干燥箱内用五氧化二磷进行操作，干风恒流～5ml/分钟，温度范围 20-25℃。用置于干燥箱内的Sartorius天平称重。
[31]感染滴度(CCID50)
[32]CCID50是用于测定病毒滴度(感染力)的技术，在本研究的情 况下，是测定冷冻干燥ALVAC制剂溶解后的滴度。滴度用感染50％ 给定批次接种的细胞培养物所需要的病毒稀释量表示。该测定法依赖 于细胞致死病毒颗粒(能够引起致细胞病变效应(CPE)的病毒)的存在 和检出。通常在96孔板中，使宿主细胞生长至汇合的健康单层培养 物，向其中加入等量的病毒稀释液。孵育时，病毒进行复制，释放出 子代病毒体，这些病毒体反过来再感染健康细胞。在一段时间内发生 致细胞病变效应，记录各孔是否存在CPE。随着每次稀释孔数目的增 加，该方法变得更加准确。本项试验对测定保存期间减毒ALVAC病 毒活性的损失是至关重要的。
[33]按照标准化操作规程(SOP)编号22 PD-039 v.1.0，在96孔板 上连续滴定ALVAC病毒冷冻干燥产品的样品。将QT35(鹌鹑)细胞悬 液加到各96孔板中。在36℃±1℃下孵育6天后，统计出现致细胞病 变效应(CPE)的孔。用最小二乘方法计算产品中病毒的浓度，用50％ 感染量/ml产品的数值表示。
[34]冷冻干燥操作过程
[35]冻干法是一种脱水技术，其中通过将湿的物质冷冻后将所得 冰在真空下通过升华过程(无需熔融)蒸发，达到干燥状态。这一过程 常规分为三个阶段：预冷冻、一级干燥或升华干燥及二级干燥或解吸 干燥。基于ALVAC表达载体的24小时冷冻干燥操作过程按下表2 概述方法进行：
[36]表2-冷冻干燥机操作过程
  步骤   参数  编程取值   冷冻(3小时)   加样温度   冷冻结束时的温度  5℃  -40℃   升华干燥(一级干燥)   (16小时，30分钟)   压力   降至层架温度(shelf temperature)   的时间   层架温度   持续时间   升至层架温度的时间  70μBar    1小时  -17℃  13小时  2小时，30分钟   解吸干燥(二级干燥)   (4小时)   层架温度   复原有效真空的产品温度  45℃  25℃   加塞   氮气氛下  氮气氛下
[37]对稳定制剂的各种组分，例如氨基酸、糖(蔗糖、山梨糖醇、 甘露醇)和聚合物(聚乙烯吡咯烷酮(PVP))对不同稳定制剂的贡献进行 了定性和定量评价。组分和浓度见表3。然后用以下实验评价制剂稳 定性：外观、溶解时间、溶解后外观、氢离子浓度负幂指数(pH)、残 留水分和感染力(CCID50)。
[38]每种稳定制剂都在层流条件下制备。对于每种制剂，调节各 制剂的pH至约7.2和约7.4之间。各制剂经过0.2μm聚二氟乙烯(PVDF) 一次性滤膜过滤、贴标签、指定批号后，在5℃保存直到冻干。
[39]在冷冻干燥前一天，将病毒ALVAC粗品(溶于10mM Tris (pH 9.0)缓冲溶液)在30℃±2℃水浴中融化。对粗品进行2次稀释(1/2 和1/6)以制备120ml最终的散装产品(FBP)。用浓的稳定制剂制备第一 稀释液，用稳定制剂与注射用水(WFI)按1∶2稀释制备第二稀释液。
[40]准备进行包括许多步骤的冷冻干燥法。首先，用3ml US玻 璃小瓶在隔离区中装入0.3ml FBP，每批制剂装400个小瓶。第二， 将所有小瓶装到4个不同层架的托盘中，新配的冷冻干燥稳定制剂 PO6和PO7用作对照。为了防止挤压，每个盘都位于每个层架的中间， 并留有空间以避免层架之间相互接触。将装有温差电偶的小瓶放在冷 冻室的前方，以便能够监测产品的温度。最后，进行适当的24小时 ALVAC冻干操作过程(见材料与方法)。
[41]运行之后，取出小瓶，盖上PVC(Poly-Vinyl-Carbon)塞子并 用铝盖(Alu-Alu cap)加盖密封。在取出小瓶时，从托盘边缘、中部、 前后方观察小瓶冻干块的均匀性。分析冻干机图表以确保操作过程所 进行的每个步骤都没有遇到问题。然后将小瓶保存于-20℃以备进一步 取样和测定。
[42]用实时和加速稳定性研究，对制剂对冻干蛋白质稳定性的作 用进行了研究。每次实验在不同时间点和不同温度下(-20℃、2-8℃、 35-39℃，第1-6周、第8周、第12周、第26周和第52周)进行，每 一批取5个样品进行分析。记录每个样品的下列特性：冻干物 (Lyophilizate)的外观、溶解时间、溶解后的外观、pH和感染滴度 (CCID50)。
[43]然后用具有最适特性的制剂进一步进行稳定性研究。每次实 验在不同时间点和不同温度下(-20℃、2-8℃、37℃和45℃，分别在第 0天、第3天、第7天、第11天、第14天、第21天、第25天、第 28天、第35天、第56天、第84天、第182天和第364天)进行，每 批取4-6个样品进行分析。然后记录每个样品的以下特性：冻干物的 外观、溶解时间、溶解后的外观、pH、残留水分和感染滴度(CCID50)。 对于对照、F12(n＝6)，在第45周时增加额外的观察点。
[44]冷冻干燥ALVAC制剂F12的最终稳定性研究(较早前研究 样品的额外时间点)，在23-27℃下，用一套小瓶在第1周、第3周、 第5周、第8周和第12周进行(n＝6)。然后评价制剂的感染滴度 (CCID50)、pH、复原时间、外观和摩尔渗透压浓度。
[45]稳定制剂
[46]开发出几种新的稳定制剂并进行了试验。每种制剂所包括的 组分见表3。应当理解的是，当将PVP40加到制剂中时，要特别注意。 搅拌速度在特定时间内应当增加，然后当PVP40溶解时应降低。如果 速度不增加的话，通常会出现不需要的聚集体。混合的时间和速度取 决于所制备的体积，正如本领域技术人员所了解的一样。
[47]实验结果
[48]冻干物的外观
[49]保存于-20℃和5℃52周后，对不同制剂冻干物的外观进行 评价。第一批实验中制剂F9、F10、F11和F12冻干块的外观符合所 要求的规格(光滑，白色药层，不从小瓶边缘皱缩)。这些所需要的“冻 干块”外观规格表明，该制剂能够通过保护病毒和其周围环境避免塌 陷或熔融，从而保持病毒的理化完整性。冻干块的塌陷可能由过激的 冻干过程或保存条件(例如长期保存或高温)所致。已经确定具有合适 冻干块外观的制剂提供适于病毒稳定性的环境。还已经确定的是之前 所使用的20种必需氨基酸和非必需氨基酸的混合物可用高浓度的L- 精氨酸、L-丙氨酸、丝氨酸和/或甘氨酸替换而又不影响冻干物的结构 外观。
[50]其它几种制剂出现起泡/熔融，从小瓶边缘皱缩，而且呈不 均匀的外观(即不是光滑的白色药层)；就这一点而言，这些因为不符 合外观标准而不予采用。如下所述，这种外观与溶解时间不需要的增 加有关。这些不被采用制剂的每一种都缺少分散剂(即聚乙烯吡咯烷酮 (PVP40)、山梨糖醇)，因此表明这些组分对冻干块结构的重大影响。 对于这些出现松散或从小瓶边缘皱缩的制剂，冻干块根据外观标准也 不予采用。
[51]溶解时间、溶解后的外观、pH和摩尔渗透压浓度
[52]在-20℃和5℃下保存52周后，与其它在15秒钟以内溶解的 稳定制剂(F10-12)相比，制剂F9的溶解时间略有增加。每支小瓶用1ml NaCl 0.4％复原，手工混合直到整个冻干块溶解。结果表明加入PVP40 对最终产品的溶解时间有着积极作用。对于保存在胁迫条件(35-37℃) 下的那些样品，所有制剂的溶解时间都有相当的增加，从15秒钟至 超过1分钟不等。此外，如果冻干块外观出现熔融，则产品粘在小瓶 上，使冻干物复原变得困难。
[53]对于所有试验条件下的所有制剂，pH在7.5±0.5单位之间 时保持稳定。
[54]对于制剂F12，摩尔渗透压浓度范围为350±100mOsm/kg。
[55]残留水分(RM)
[56]制剂F12的残留水分结果＜3％，符合欧洲药典(第V版)的建 议。未对其它制剂进行实验。
[57]表4-残留水分-制剂F12

[58]感染滴度
[59]活性下降超过约10-20％时被视为病毒活性显著下降。所有 制剂似乎都在-20℃和2-8℃保存52周后保持感染滴度不变，同时未观 察到明显损失。所有被测制剂与对照相似，证实了该方法的精确性(± 0.3log 10CCID50/ml)。在胁迫条件下，在35-37℃下保存整整8周时， 对照和被测制剂的感染滴度均保持不变。
[60]液体制剂与冷冻干燥制剂的稳定性
[61]根据上述结果，选择F12(冷冻干燥)与液体制剂(ALVAC的 10mM Tris-HCl溶液、0.9％NaCl，pH9.0)进行比较。将这些制剂与“实 时”(2-8℃)和在胁迫或加速条件(23-25℃和35-39℃)下的制剂进行滴 度稳定性比较，并且与对照条件(-70℃和-20℃)进行比较。这两种制剂 都用相同体积和相同含量的ALVAC经澄清的收获物制备。用CCID50 测定法测定滴度。如图1所示，在2-8℃(以及对照温度-20℃和-70℃) 下冷冻干燥的F12显示与液体制剂相似的滴度，在25℃和37℃下， 冷冻干燥制剂F12的滴度优于液体制剂的滴度。已知事实是F12是冷 冻干燥制剂，是一种本领域技术人员优选的制剂形式，因此可以得出 结论，F12优于以前可获得的液体制剂。
[62]本文所述研究中，分散剂(例如PVP40和/或山梨糖醇)是保 持冷冻干燥制剂外观(即“冻干块”)必不可少的，是所需溶解性质的 功能上可预测的成分。另外，显而易见的是以前所使用的20种必需 氨基酸和非必需氨基酸的混合物可用高浓度的L-精氨酸、L-丙氨酸、 丝氨酸和/或甘氨酸替换，在维持感染滴度不变化的情况下不会影响冻 干物的结构外观。这是尤其重要的，因为简化了制剂制备过程并降低 了随之而发生的费用。基于感染滴度数据的结果并不表示各种制剂之 间的任何显著差异。所有制剂都能够在2-8℃52周维持感染滴度不变。
[63]虽然按照优选的实施方案对本发明进行了描述，但是要理解 的是本领域技术人员可加以改变和修改。因此，所附权利要求书涵盖 了所有落入本发明要求保护范围内的这些等同变化。