一种纳米颗粒及其制备方法和应用
阅读：163发布：2023-03-10
专利汇可以提供一种纳米颗粒及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及医药技术领域，特别涉及一种纳米颗粒及其制备方法和应用，所述纳米颗粒以层状双羟基复 合金 属 氧 化物作为载体，所述载体负载小干扰RNA和 抗原 表位肽，其中，所述小干扰RNA插入载体中，抗原表位肽 吸附 在所述载体表面。本发明纳米颗粒能够共递送吲哚胺2,3-双加氧酶小干扰RNA和酪 氨 酸酶相关抗原肽2的 水 滑石纳米颗粒，该颗粒具有靶向DC细胞，打破免疫耐受，激活免疫系统，并引起较强的细胞免疫反应的功能，相对于单独使用基于 肿瘤 抗原特异性表位Trp2的 疫苗 或IDO-siRNA，对于黑色素瘤生长的抑制效果显著增强。，下面是一种纳米颗粒及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种纳米颗粒，其特征在于，以层状双羟基复合金属氧化物作为载体，所述载体负载小干扰RNA和抗原表位肽，其中，所述小干扰RNA插入载体中，抗原表位肽吸附在所述载体表面。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述小干扰RNA为吲哚胺2,3-双加氧酶小干扰RNA；
优选地，所述小干扰RNA正义链如SEQ ID NO.1所示，所述小干扰RNA反义链如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述抗原表位肽为酪氨酸酶抗原表位肽、Melan-A/MART-1抗原表位肽、gp100抗原表位肽、鸡卵白蛋白、HER-2/neu肿瘤相关抗原或MUC1抗原肽中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述酪氨酸酶抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种如权利要求1-3中任一项所述的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备双羟基复合金属氧化物；
(2)将步骤(1)制备得到的双羟基复合金属氧化物载体与小干扰RNA混合，混合后静置，得到含有小干扰RNA插层的纳米颗粒；
(3)将步骤(2)制备得到的含有小干扰RNA插层的纳米颗粒与抗原表位肽混合，混合后静置，离心得到所述含有小干扰RNA和抗原表位肽的纳米颗粒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的制备双羟基复合金属氧化物包括如下具体步骤：
将摩尔浓度为0.01-0.1M，优选为0.03M的硝酸镁和摩尔浓度为0.01-0.1M，优选为
0.01M的硝酸铝混合后加入摩尔浓度为0.01-0.1M，优选为0.15M的氢氧化钠溶液中，搅拌
10-20min，优选15min，12000离心1-10min，优选5min，用去碳酸水30℃震荡混匀20-35min，优选30min，转至透析袋透析1-10h，优选5h，再转移到密闭容器中30℃，100-400rpm，优选为
280rpm震荡混悬0.5-3h，优选1h，移至聚四氟乙烯水热釜中100-130℃，优选120℃恒温10-
20h，优选为15h，自然冷却得到双羟基复合金属氧化物。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的小干扰RNA的终浓度为0.01-1μg/μL，优选为0.05-0.5μg/μL，进一步优选为0.08-0.3μg/μL，最优选为0.1μg/μL；
优选地，步骤(2)所述静置的温度为30-45℃，优选为35-40℃，进一步优选为37℃；
优选地，步骤(2)所述静置的时间为10-30min，优选为15-25min，进一步优选为20min。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的抗原表位肽的终浓度为0.1-10μg/μL，优选为0.5-5μg/μL，进一步优选为0.8-3μg/μL，最优选为1μg/μL；
优选地，步骤(3)所述静置的温度为30-45℃，优选为35-40℃，进一步优选为37℃；
优选地，步骤(3)所述静置的时间为20-40min，优选为25-35min，进一步优选为30min；
优选地，步骤(3)所述离心的转速为10000-15000g，优选为11000-13000g，进一步优选为12000；
优选地，步骤(3)所述离心的时间为1-10min，优选为3-8min，进一步优选为5min。
8.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括如权利要求1-3中任一项所述的纳米颗粒；
优选地，所述疫苗还包括药学上可接受的载体和油包水乳液。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米颗粒或如权利要求8所述的疫苗在制备靶向肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤和/或乳腺癌。
一种纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 酪氨酸酶相关抗原肽2(Trp2)是一种肿瘤特异性抗原表位，通过将其制备成疫苗可以有效抑制黑色素瘤的生长。Trp2是由9个氨基酸组成的小分子多肽，序列短，免疫原性
弱，难以引起有效的毒性T细胞反应。因此通常使用载体来加强Trp2的免疫原性。树突状细
胞中IDO基因的过表达可导致其下游产物IL-12和TGF-β水平的升高，这些细胞因子是造成
机体免疫耐受的重要因素。吲哚胺2,3-双加氧酶小干扰RNA(IDO siRNA)与IDO基因转录产
物mRNA相互作用可使靶细胞中IDO基因沉默。通过靶向递送IDO siRNA至树突状细胞，使细
胞中IDO基因沉默，可以在一定程度上打破机体免疫耐受，激活细胞免疫系统，抑制肿瘤生
长。
弱，难以引起有效的毒性T细胞反应。因此通常使用载体来加强Trp2的免疫原性。树突状细
胞中IDO基因的过表达可导致其下游产物IL-12和TGF-β水平的升高，这些细胞因子是造成
机体免疫耐受的重要因素。吲哚胺2,3-双加氧酶小干扰RNA(IDO siRNA)与IDO基因转录产
物mRNA相互作用可使靶细胞中IDO基因沉默。通过靶向递送IDO siRNA至树突状细胞，使细
胞中IDO基因沉默，可以在一定程度上打破机体免疫耐受，激活细胞免疫系统，抑制肿瘤生
长。
[0003] 用于上述药物靶向递送的载体包括脂质体，阳离子纳米颗粒等。“Q.Zeng,H.Jiang,T.Wang,Z.Zhang,T.Gong,X.Sun,Cationic micelle delivery of Trp2 peptide
for efficient lymphatic draining and enhanced cytotoxic T-lymphocyte
responses,Journal of controlled release 200(2015)1-12.”Zeng等人应用聚乙烯亚
胺/硬脂酸阳离子复合纳米颗粒包埋Trp2制备得到纳米颗粒疫苗，可有效抑制黑色素瘤的
生长。“D.Chen,J.Koropatnick,Targeted siRNA Silencing of Indoleamine 2,3-
Dioxygenase in Antigen-presenting Cells Using Mannose-conjugated Liposomes:A
Novel Strategy for Treatment of Melanoma.,J Immunother 37(2014)123-134.”Chen
等人利用甘露糖修饰的脂质体包埋IDO-siRNA制备的纳米颗粒，可靶向递送至树突状细胞。
这些载体均存在制备成本高，大规模生产困难或生物毒性较大等缺点。廉价、易制备、生物
相容性高的疫苗载体则具有较好的应用前景。
for efficient lymphatic draining and enhanced cytotoxic T-lymphocyte
responses,Journal of controlled release 200(2015)1-12.”Zeng等人应用聚乙烯亚
胺/硬脂酸阳离子复合纳米颗粒包埋Trp2制备得到纳米颗粒疫苗，可有效抑制黑色素瘤的
生长。“D.Chen,J.Koropatnick,Targeted siRNA Silencing of Indoleamine 2,3-
Dioxygenase in Antigen-presenting Cells Using Mannose-conjugated Liposomes:A
Novel Strategy for Treatment of Melanoma.,J Immunother 37(2014)123-134.”Chen
等人利用甘露糖修饰的脂质体包埋IDO-siRNA制备的纳米颗粒，可靶向递送至树突状细胞。
这些载体均存在制备成本高，大规模生产困难或生物毒性较大等缺点。廉价、易制备、生物
相容性高的疫苗载体则具有较好的应用前景。
[0004] 近年来，应用层状双羟基复合金属氧化物(LDH，水滑石)进行生物药物递送的研究得到了广泛关注。LDH带有正电荷，具有高的比表面积，具有内涵体逃逸能力，较好的离子交换能力和层间阴离子可交换性等特性。携带负电荷的生物分子，如RNA在一定条件下通过插
层的方式进入LDH层间，但对颗粒表面电荷性质影响较小，从而使LDH纳米颗粒仍然具有在
颗粒表面吸附负电荷分子的能力，为构建IDO-siRNA和Trp2共递送纳米颗粒提供了结构基
础。
层的方式进入LDH层间，但对颗粒表面电荷性质影响较小，从而使LDH纳米颗粒仍然具有在
颗粒表面吸附负电荷分子的能力，为构建IDO-siRNA和Trp2共递送纳米颗粒提供了结构基
础。
发明内容
[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米颗粒及其制备方法和应用，具体涉及共递送小干扰RNA和肿瘤相关抗原表位的水滑石纳米颗粒的制备及其应用，所
述纳米颗粒是一种兼有打破肿瘤免疫耐受与肿瘤抗原免疫特性的复合型肿瘤免疫治疗制
剂。
述纳米颗粒是一种兼有打破肿瘤免疫耐受与肿瘤抗原免疫特性的复合型肿瘤免疫治疗制
剂。
[0006] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 一方面，本发明提供一种纳米颗粒，以层状双羟基复合金属氧化物作为载体，所述载体负载小干扰RNA和抗原表位肽，其中，所述小干扰RNA插入载体中，抗原表位肽吸附在所
述载体表面。
述载体表面。
[0008] 本发明中，所述纳米颗粒化学式为抗原表位肽/LDH/IDO-siRNA，游离的抗原表位肽或IDO-siRNA在体内不稳定易降解，且难以被细胞有效吞噬，通过使用所述纳米颗粒，抗
原表位肽和IDO-siRNA可同时被呈递至细胞内发挥协同作用，其具体机制如下：所述纳米颗
粒经网格蛋白介导途径被树突状细胞吞噬后形成内涵体，在内涵体酸化过程中，水滑石发
生溶解，随后细胞内离子浓度升高，水分子内流从而导致内涵体破裂。同时，由水滑石所负
载的IDO-siRNA与抗原表位肽在内涵体中释放，当内涵体破裂时，这些药物同时进入细胞质
中产生协同作用：一方面，IDO-siRNA通过作用于IDO mRNA沉默树突状细胞中IDO基因的表
达，抑制由IDO基因过表达导致的树突状细胞向免疫耐受性细胞的分化，从而有效提呈抗原
表位并促进T细胞增殖活化；另一方面，肿瘤抗原表位进入细胞质中与MHC I类分子结合并
被提呈至细胞表面，激发Th1免疫反应的产生。简单来说，IDO-siRNA维持树突状细胞提呈肿
瘤抗原表位的功能，抑制免疫耐受的发生，从而确保肿瘤抗原表位得以提呈并激活细胞免
疫。
原表位肽和IDO-siRNA可同时被呈递至细胞内发挥协同作用，其具体机制如下：所述纳米颗
粒经网格蛋白介导途径被树突状细胞吞噬后形成内涵体，在内涵体酸化过程中，水滑石发
生溶解，随后细胞内离子浓度升高，水分子内流从而导致内涵体破裂。同时，由水滑石所负
载的IDO-siRNA与抗原表位肽在内涵体中释放，当内涵体破裂时，这些药物同时进入细胞质
中产生协同作用：一方面，IDO-siRNA通过作用于IDO mRNA沉默树突状细胞中IDO基因的表
达，抑制由IDO基因过表达导致的树突状细胞向免疫耐受性细胞的分化，从而有效提呈抗原
表位并促进T细胞增殖活化；另一方面，肿瘤抗原表位进入细胞质中与MHC I类分子结合并
被提呈至细胞表面，激发Th1免疫反应的产生。简单来说，IDO-siRNA维持树突状细胞提呈肿
瘤抗原表位的功能，抑制免疫耐受的发生，从而确保肿瘤抗原表位得以提呈并激活细胞免
疫。
[0009] 根据本发明，所述小干扰RNA(IDO-siRNA)为吲哚胺2,3-双加氧酶小干扰RNA。
[0010] 优选地，所述小干扰RNA正义链如SEQ ID NO.1所示，所述小干扰RNA反义链如SEQ ID NO.2所示。
[0011] 核酸序列如下：
[0012] 正义链(SEQ ID NO.1)：5’-GGGCUUCUUCCUCGUCUCUTT-3’；
[0013] 反义链(SEQ ID NO.2)：5’-AGAGACGAGGAA GAAGCCCTT-3’.
[0014] 优选地，所述抗原表位肽为酪氨酸酶抗原表位肽、Melan-A/MART-1抗原表位肽、gp100抗原表位肽、鸡卵白蛋白、HER-2/neu肿瘤相关抗原或MUC1抗原肽中的任意一种或至
少两种的组合。
少两种的组合。
[0015] 本发明中，所述酪氨酸酶抗原表位肽、Melan-A/MART-1抗原表位肽、gp100抗原表位肽、鸡卵白蛋白这几个抗原表位肽主要针对黑色素瘤，所述HER-2/neu肿瘤相关抗原和
MUC1抗原肽主要针对乳腺癌。
MUC1抗原肽主要针对乳腺癌。
[0016] 优选地，所述酪氨酸酶抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述氨基酸序列(SEQ ID NO.3)为SVYDFFVWL.
[0017] 第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
[0018] (1)制备双羟基复合金属氧化物；
[0019] (2)将步骤(1)制备得到的双羟基复合金属氧化物载体与小干扰RNA混合，混合后静置，得到含有小干扰RNA插层的纳米颗粒；
[0020] (3)将步骤(2)制备得到的含有小干扰RNA插层的纳米颗粒与抗原表位肽混合，混合后静置，离心得到所述含有小干扰RNA和抗原表位肽的纳米颗粒。
[0021] 根据本发明，步骤(1)所述的制备双羟基复合金属氧化物为本领域的常规技术手段，本领域技术人员可以根据需要调整合成的各个条件，本发明的制备双羟基复合金属氧
化物包括如下具体步骤：
化物包括如下具体步骤：
[0022] 将摩尔浓度为0.01-0.1M，优选为0.03M的硝酸镁和摩尔浓度为0.01-0.1M，优选为0.01M的硝酸铝混合后加入摩尔浓度为0.01-0.1M，优选为0.15M的氢氧化钠溶液中，搅拌
10-20min，优选15min，12000离心1-10min，优选5min，用去碳酸水30℃震荡混匀20-35min，优选30min，转至透析袋透析1-10h，优选5h，再转移到密闭容器中30℃，100-400rpm，优选为
280rpm震荡混悬0.5-3h，优选1h，移至聚四氟乙烯水热釜中100-130℃，优选120℃恒温10-
20h，优选为15h，自然冷却得到双羟基复合金属氧化物。
10-20min，优选15min，12000离心1-10min，优选5min，用去碳酸水30℃震荡混匀20-35min，优选30min，转至透析袋透析1-10h，优选5h，再转移到密闭容器中30℃，100-400rpm，优选为
280rpm震荡混悬0.5-3h，优选1h，移至聚四氟乙烯水热釜中100-130℃，优选120℃恒温10-
20h，优选为15h，自然冷却得到双羟基复合金属氧化物。
[0023] 优选为，制备双羟基复合金属氧化物包括如下具体步骤：
[0024] 将10mL 0.03M硝酸镁与0.01M硝酸铝混合液快速加入40mL 0.15M NaOH溶液中，室温下快速搅拌15min后，在12000g下离心5min。所得产物用去碳酸水重悬后，在30℃下震荡
混悬30min，所得悬液转移至透析袋，在密闭容器中使用100倍悬液体积的去碳酸水在室温
下透析5h。随后悬液转移至密闭容器中，在30℃，280rpm下震荡混悬1h后转移至100mL聚四
氟乙烯水热釜(加样体积为50％)，在120℃下恒温15h，自然冷却。
混悬30min，所得悬液转移至透析袋，在密闭容器中使用100倍悬液体积的去碳酸水在室温
下透析5h。随后悬液转移至密闭容器中，在30℃，280rpm下震荡混悬1h后转移至100mL聚四
氟乙烯水热釜(加样体积为50％)，在120℃下恒温15h，自然冷却。
[0025] 优选地，步骤(2)所述的小干扰RNA的终浓度为0.01-1μg/μL，例如可以是0.01μg/μL、0.02μg/μL、0.0.3μg/μL、0.05μg/μL、0.06μg/μL、0.08μg/μL、0.1μg/μL、0.12μg/μL、0.15μg/μL、0.2μg/μL、0.3μg/μL、0.4μg/μL、0.5μg/μL、0.6μg/μL、0.7μg/μL、0.8μg/μL、0.9μg/μL或1μg/μL，优选为0.05-0.5μg/μL，进一步优选为0.08-0.3μg/μL，最优选为0.1μg/μL。
[0026] 优选地，步骤(2)所述静置的温度为30-45℃，优选为35-40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、45℃，进一步优选为37℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述
范围包括的具体点值。
范围包括的具体点值。
[0027] 优选地，步骤(2)所述静置的时间为10-30min，例如可以是10min、11min、12min、13min、15min、16min、18min、20min、22min、23min、25min、26min、28min、30min，优选为15-
25min，进一步优选为20min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，
本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
25min，进一步优选为20min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，
本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
[0028] 优选地，步骤(3)所述的抗原表位肽的终浓度为0.1-10μg/μL，例如可以是0.1μg/μL、0.2μg/μL、0.3μg/μL、0.5μg/μL、0.6μg/μL、0.8μg/μL、0.9μg/μL、1μg/μL、1.2μg/μL、1.5μg/μL、2μg/μL、3μg/μL、4μg/μL、5μg/μL、6μg/μL、7μg/μL、8μg/μL、9μg/μL或10μg/μL，优选为0.5-5μg/μL，进一步优选为0.8-3μg/μL，最优选为1μg/μL，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
[0029] 优选地，步骤(3)所述静置的温度为30-45℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、45℃，优选为35-40℃，进一步优选为
37℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所
述范围包括的具体点值。
37℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所
述范围包括的具体点值。
[0030] 优选地，步骤(3)所述静置的时间为20-40min，例如可以是10min、11min、12min、13min、15min、16min、18min、20min、22min、23min、25min、26min、28min、30min、31min、
33min、35min、36min、38min、40min，优选为25-35min，进一步优选为30min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点
值。
33min、35min、36min、38min、40min，优选为25-35min，进一步优选为30min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点
值。
[0031] 优选地，步骤(3)所述离心的转速为10000-15000g，例如可以是10000g、11000g、12000g、13000g、14000g或15000g，优选为11000-13000g，进一步优选为12000，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具
体点值。
体点值。
[0032] 优选地，步骤(3)所述离心的时间为1-10min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min，优选为3-8min，进一步优选为5min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点
值。
值。
[0033] 第三方面，本发明提供一种疫苗，所述疫苗包括如第一方面所述的纳米颗粒。
[0034] 优选地，所述疫苗还包括药学上可接受的载体和油包水乳液。
[0035] 第四方面，本发明提供如第一方面所述的纳米颗粒或如第三方面所述的疫苗在制备靶向肿瘤药物中的应用。
[0036] 优选地，所述肿瘤为黑色素瘤和/或乳腺癌。
[0037] 相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0038] (1)本发明纳米颗粒能够共递送吲哚胺2,3-双加氧酶小干扰RNA和相关抗原肽的水滑石纳米颗粒，该颗粒具有靶向DC细胞，打破免疫耐受，激活免疫系统，并引起较强的细
胞免疫反应的功能，相对于单独使用基于肿瘤抗原特异性表位的疫苗或IDO-siRNA，对于黑
色素瘤和乳腺癌的生长的抑制效果显著增强；
胞免疫反应的功能，相对于单独使用基于肿瘤抗原特异性表位的疫苗或IDO-siRNA，对于黑
色素瘤和乳腺癌的生长的抑制效果显著增强；
[0039] (2)本发明是一种复合型肿瘤免疫治疗疫苗，与单一免疫治疗方式如肿瘤抗原特异性表位疫苗，树突状细胞疫苗，细胞因子疫苗相比，本发明疫苗一方面沉默树突状细胞中
IDO基因的表达，抑制由IDO基因过表达导致的树突状细胞向免疫耐受性细胞的分化，从而
促进T细胞增殖活化；另一方面疫苗在内涵体中的逃逸能力促使肿瘤抗原表位进入细胞质
中与MHC I类分子结合，激发Th1免疫反应的产生。
附图说明
IDO基因的表达，抑制由IDO基因过表达导致的树突状细胞向免疫耐受性细胞的分化，从而
促进T细胞增殖活化；另一方面疫苗在内涵体中的逃逸能力促使肿瘤抗原表位进入细胞质
中与MHC I类分子结合，激发Th1免疫反应的产生。
附图说明
[0040] 图1为本发明琼脂糖凝胶电泳试验测定IDO-siRNA进入LDH层间的电泳胶图，其中，自左向右，1孔道为游离的IDO siRNA，2孔道为LDH，3-8孔道为IDO siRNA与LDH不同质量比
的纳米颗粒，质量比分别为1:1，1:5，1:10，1:20，1:30，1:40；
的纳米颗粒，质量比分别为1:1，1:5，1:10，1:20，1:30，1:40；
[0041] 图2为本发明2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠试验测定LDH/IDO-siRNA吸附Trp2的能力结果图；
[0042] 图3为本发明Trp2/LDH/IDO-siRNA疫苗颗粒在DC细胞内的移动路径和定位测定结果图；
[0043] 图4为本发明Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒疫苗下调DC细胞中IDO mRNA水平结果图；
[0044] 图5为本发明Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒疫苗下调DC细胞中IDO蛋白的表达结果图，其中，图5(A)为Western-blot检测IDO表达的蛋白水平，图5(B)为Odyssey LICOR SA
双色红外激光成像系统分析IDO的光密度；
双色红外激光成像系统分析IDO的光密度；
[0045] 图6为本发明Trp2/LDH/IDO-siRNA颗粒疫苗增强小鼠细胞免疫的结果图，其中，图6(A)为流式细胞仪分析测定CD8+/IFN-γ+细胞比例，图6(B)为IFN-γELISA kit测定细胞培
养上清液中IFN-γ水平；
养上清液中IFN-γ水平；
[0046] 图7为本发明Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒疫苗抑制小鼠黑色素瘤生长结果图。
具体实施方式
[0047] 下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0049] 实施例1：纳米颗粒疫苗的制备
[0050] 制备LDH：将10mL硝酸镁(0.03M)与硝酸铝(0.01M)混合液快速加入40mL NaOH(0.15M)溶液中，室温下快速搅拌15min后，在12000g下离心5min。所得产物用去碳酸水重悬
后，在30℃下震荡混悬30min，所得悬液转移至透析袋，在密闭容器中使用100倍悬液体积的
去碳酸水在室温下透析5h。随后悬液转移至密闭容器中，在30℃，280rpm下震荡混悬1h后转
移至100mL聚四氟乙烯水热釜(加样体积为50％)，在120℃下恒温15h，自然冷却。
后，在30℃下震荡混悬30min，所得悬液转移至透析袋，在密闭容器中使用100倍悬液体积的
去碳酸水在室温下透析5h。随后悬液转移至密闭容器中，在30℃，280rpm下震荡混悬1h后转
移至100mL聚四氟乙烯水热釜(加样体积为50％)，在120℃下恒温15h，自然冷却。
[0051] 制备LDH/IDO-siRNA：将制备得到的水滑石与IDO siRNA混合，所述IDO siRNA的正义链(SEQ ID NO.1)：5’-GGGCUUCUUCCUCGUCUCUTT-3’,反义链(SEQ ID NO.2)：5’-
AGAGACGAGGAA GAAGCCCTT-3’，使用去碳酸水稀释至IDO siRNA终浓度为0.1μg/μL，涡旋震荡使其混合均匀后在37℃下恒温静置20min，制备得到含有IDO siRNA插层得到纳米颗粒，
其化学式为LDH/IDO-siRNA。
AGAGACGAGGAA GAAGCCCTT-3’，使用去碳酸水稀释至IDO siRNA终浓度为0.1μg/μL，涡旋震荡使其混合均匀后在37℃下恒温静置20min，制备得到含有IDO siRNA插层得到纳米颗粒，
其化学式为LDH/IDO-siRNA。
[0052] 制备Trp2/LDH/IDO-siRNA：使将制备得到的LDH/IDO-siRNA与一定量的Trp2混匀后，Trp2的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)为：SVYDFFVWL，使用去碳酸水稀释至水滑石终浓度为
1μg/μL，在37℃下恒温静置30min，然后以12000g速度离心5min，得到Trp2/LDH/IDO-siRNA。
1μg/μL，在37℃下恒温静置30min，然后以12000g速度离心5min，得到Trp2/LDH/IDO-siRNA。
[0053] 其中抗原表位肽可以替换为Melan-A/MART-1抗原表位肽、gp100抗原表位肽、鸡卵白蛋白替换抗原表位肽的疫苗与Trp2的疫苗效果类似，都对黑色素瘤具有治疗效果，以下
实施例就以Trp2/LDH/IDO-siRNA进行说明。
实施例就以Trp2/LDH/IDO-siRNA进行说明。
[0054] 所述抗原表位肽还可以替换为HER-2/neu肿瘤相关抗原、MUC1抗原肽，替换抗原表位肽的疫苗对乳腺癌具有生长抑制效果，除了针对乳腺癌其他与Trp2的疫苗效果类似，以
下实施例就以Trp2/LDH/IDO-siRNA进行说明。
下实施例就以Trp2/LDH/IDO-siRNA进行说明。
[0055] 实施例2：疫苗中IDO-siRNA插入到LDH的能力测定
[0056] 按照常规方法进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶电泳图中，游离的IDO siRNA迁移至凝胶底部，进入LDH层间的IDO siRNA则保留在上样孔中。IDO-siRNA插层进入LDH层间能力计
算方法如下：
算方法如下：
[0057] 水滑石具有的IDO siRNA插层能力根据如下公式进行计算：
[0058]
[0059] 试验结果如图1所示，其中，1孔道中游离的IDO siRNA质量为1μg，2孔道中LDH质量为40μg，3-8孔道中IDO siRNA质量均为1μg，LDH质量根据不同质量比加入。
[0060] 结果表明，使用本发明所描述的方法将IDO siRNA对LDH进行插层，当水滑石与IDO siRNA的质量比为10:1时，IDO siRNA可被完全插层，即此时IDO siRNA的插层能力最高，为
10％。随着水滑石与IDO siRNA的质量比增大，IDO siRNA可完全插层进入水滑石层间，但插
层能力逐渐下降，介于0～10％之间。
10％。随着水滑石与IDO siRNA的质量比增大，IDO siRNA可完全插层进入水滑石层间，但插
层能力逐渐下降，介于0～10％之间。
[0061] 实施例3：LDH/IDO-siRNA吸附Trp2的能力测定
[0062] 应用常规的2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠测定方法测定LDH/IDO-siRNA吸附Trp2的能力，LDH/IDO-siRNA对Trp2吸附能力根据如下公式进行计算：
[0063]
[0064] 说明：Mg3Al-IDO siRNA-LDH质量以水滑石质量计
[0065] 试验结果如图2所示：
[0066] LDH/IDO-siRNA与Trp2的质量为8:1时，Trp2吸附能力为8.5％；
[0067] LDH/IDO-siRNA与Trp2的质量为8:2时，Trp2吸附能力为13.9％；
[0068] LDH/IDO-siRNA与Trp2的质量为8:3时，Trp2吸附能力为15.5％；
[0069] LDH/IDO-siRNA与Trp2的质量为8:4时，Trp2吸附能力为17.8％；
[0070] LDH/IDO-siRNA与Trp2的质量为8:6时，Trp2吸附能力为30.9％；
[0071] LDH/IDO-siRNA与Trp2的质量为8:10时，Trp2吸附能力为52.0％；
[0072] LDH/IDO-siRNA与Trp2的质量为8:20时，Trp2吸附能力为122.0％。
[0073] 可见，
[0074] 在下述实施例中，本发明所应用的疫苗颗粒中IDO-siRNA插入到LDH的量为6％，Trp2吸附到LDH的量为20％。
[0075] 实施例4：Trp2/LDH/IDO-siRNA能够被DC细胞吞噬，从溶酶体中逃逸
[0076] 试验方法：将1×105个DC2.4细胞接种于培养皿中，在37℃，5％CO2浓度环境中培养24h后按照20μg/mL的终浓度加入使用FAM荧光分子标记IDO-siRNA的Trp2/LDH/IDO-
siRNA纳米颗粒，共培养24h。选取4h,12h和24h三个时间点，加入Lyso tracker red对溶酶
体染色后，立即使用4％多聚甲醛固定细胞，并用DAPI对细胞核进行染色。经上述方法处理
得到的细胞在激光共聚焦显微镜下观察。
siRNA纳米颗粒，共培养24h。选取4h,12h和24h三个时间点，加入Lyso tracker red对溶酶
体染色后，立即使用4％多聚甲醛固定细胞，并用DAPI对细胞核进行染色。经上述方法处理
得到的细胞在激光共聚焦显微镜下观察。
[0077] 试验结果如图3所示，
[0078] Blank：使用Lyso Tracker Red对溶酶体染色(红色荧光，下同)，使用DAPI对细胞核染色(蓝色荧光，下同)，溶酶体(红色荧光)较密集的分布于细胞核(蓝色)周围；
[0079] 4h：Trp2/LDH/IDO-siRNA(绿色荧光，下同)主要吸附在细胞膜上形成较致密的绿色荧光层，仅少量纳米颗粒被吞噬进入细胞与溶酶体(红色荧光)发生共定位形成黄色荧
光；
光；
[0080] 12h：大部分Trp2/LDH/IDO-siRNA被吞噬进入细胞，且与溶酶体共定位(黄色荧光)；
[0081] 24h：大部分Trp2/LDH/IDO-siRNA从溶酶体中逃逸出来扩散至细胞质中，并富集在细胞核周围。
[0082] 实施例5Trp2/LDH/IDO-siRNA疫苗下调DC细胞mRNA水平
[0083] 将2×106个小鼠BMDC细胞接种在12孔细胞培养板上，加入Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒使其终浓度为20μg/mL，在37℃，5％CO2浓度环境中培养16h。按照RNeasy Lipid
Tissue Mini Kit(Qiagen)说明书操作，提取细胞总RNA。应用PrimeScripTM RT-PCR
(TaKaRa)试剂盒将所提总RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Select Master Mix(Applied
Biosystems)荧光探针以及7500-快速实时定量PCR仪(Applied Biosystems)检测IDO基因
表达，GAPDH作为内参。引物序列为：IDO：5’-GGGCTTTGCTCTACCACATCCACT-3’和5’-
ACATCGTCATCCCCTCGGTTCC-3’，GAPDH：5’-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAA-3’和5’-
TGGGATGGAAATTGTGAGGGAGAT-3’。
Tissue Mini Kit(Qiagen)说明书操作，提取细胞总RNA。应用PrimeScripTM RT-PCR
(TaKaRa)试剂盒将所提总RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Select Master Mix(Applied
Biosystems)荧光探针以及7500-快速实时定量PCR仪(Applied Biosystems)检测IDO基因
表达，GAPDH作为内参。引物序列为：IDO：5’-GGGCTTTGCTCTACCACATCCACT-3’和5’-
ACATCGTCATCCCCTCGGTTCC-3’，GAPDH：5’-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAA-3’和5’-
TGGGATGGAAATTGTGAGGGAGAT-3’。
[0084] 结果如图4所示，Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒疫苗能够下调显著小鼠BMDC细胞中IDO mRNA的水平。
[0085] 实施例6Trp2/LDH/IDO-siRNA下调DC细胞IDO蛋白水平
[0086] 将2×106个小鼠BMDC细胞接种在12孔细胞培养板上，加入Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒使其终浓度为20μg/mL，在37℃，5％CO2浓度环境中培养16h。使用RIPA裂解液裂解细胞，使用12％聚丙烯酰氨凝胶分离蛋白，随后将蛋白电转至硝化纤维膜上。使用5％脱脂牛
奶室温封闭2h，加入IDO抗体(1:200,Millipore,Billerica,MA)与α-tubulin抗体(1:1000,
Sigma,Germany)作为一抗，在4℃孵育过夜，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠抗体作为
二抗，进行杂交。应用Odyssey LICOR SA双色红外激光成像系统分析光密度(LICOR,USA)。
奶室温封闭2h，加入IDO抗体(1:200,Millipore,Billerica,MA)与α-tubulin抗体(1:1000,
Sigma,Germany)作为一抗，在4℃孵育过夜，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠抗体作为
二抗，进行杂交。应用Odyssey LICOR SA双色红外激光成像系统分析光密度(LICOR,USA)。
[0087] 结果如图5(A)-5(B)所示，应用Trp2/LDH/IDO-siRNA处理的DC细胞中IDO蛋白水平较对照组细胞明显下降。
[0088] 实施例7Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒疫苗增强小鼠细胞免疫反应
[0089] 将接种B16-F10肿瘤细胞的各免疫组小鼠在第20天安乐死后手术摘取脾脏，研磨，并用70-μm尼龙细胞过滤器(BD Biosciences,USA)过滤获取脾脏细胞，随后在37℃，5％CO2
环境中培养48h。使用小鼠单克隆抗体CD3(PE/Cy7-labelled),CD8(Pacific BlueTM-
labelled)or CD4(FITC-labelled)，IFN-γ(APC-labelled)和IL-4(PE-labelled)标记脾
脏细胞，通过BD Arial III流式细胞仪分析脾脏细胞中CD8+/IFN-γ+细胞比例。使用IFN-γ
ELISA kit(Neobioscience,China)分析细胞培养上清液中IFN-γ水平。
环境中培养48h。使用小鼠单克隆抗体CD3(PE/Cy7-labelled),CD8(Pacific BlueTM-
labelled)or CD4(FITC-labelled)，IFN-γ(APC-labelled)和IL-4(PE-labelled)标记脾
脏细胞，通过BD Arial III流式细胞仪分析脾脏细胞中CD8+/IFN-γ+细胞比例。使用IFN-γ
ELISA kit(Neobioscience,China)分析细胞培养上清液中IFN-γ水平。
[0090] 结果如图6(A)所示，Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒疫苗能够显著提高小鼠中CD8+/IFN-γ+细胞比例，达到0.55％。对照组LDH，游离Trp2，游离Trp2+IDO-siRNA，LDH/IDO-
siRNA，Trp2/LDH小鼠脾脏细胞中CD8+/IFN-γ+细胞比例分别为0.2％，0.29％，0.21％，
0.34％和0.49％。
siRNA，Trp2/LDH小鼠脾脏细胞中CD8+/IFN-γ+细胞比例分别为0.2％，0.29％，0.21％，
0.34％和0.49％。
[0091] 图6(B)所示，在各免疫组小鼠中，应用Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒疫苗的小鼠脾脏细胞表达IFN-γ水平为1148pg/mL。对照组LDH，游离Trp2，游离Trp2+IDO-siRNA，LDH/
IDO-siRNA，Trp2/LDH小鼠脾脏细胞表达IFN-γ水平分别为438pg/mL，345pg/mL，680pg/mL，
789pg/mL和756pg/mL。应用Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒疫苗治疗的小鼠脾脏细胞表达
IFN-γ水平明显高于对照组小鼠(*P<0.05)。
IDO-siRNA，Trp2/LDH小鼠脾脏细胞表达IFN-γ水平分别为438pg/mL，345pg/mL，680pg/mL，
789pg/mL和756pg/mL。应用Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒疫苗治疗的小鼠脾脏细胞表达
IFN-γ水平明显高于对照组小鼠(*P<0.05)。
[0092] 实施例8Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒疫苗显著抑制小鼠体内黑色素瘤生长
[0093] 将8周龄大的雌性C57/BL小鼠(华阜康生物公司，中国)在胸腔皮下接种B16-F10黑色素瘤细胞2×106个(使用50μL 10mM HEPES溶液重悬)，接种当日即为第0天。饲养4天后，
观察小鼠胸腔表皮黑色素瘤生长情况，选取肿瘤生长均一性好的小鼠(标准是黑点生长不
分散，形状接近圆形)随机分为6个试验组，每组包含6只小鼠。在第4天，按照分组向各组小
鼠注射对照物或药物。给药内容与剂量分别为：(1)500μg LDH，(2)100μg游离的Trp2，(3)
100μg游离的Trp2与30μg游离的IDO-siRNA混合物，(4)含30μg IDO-siRNA和500μg LDH的
LDH/IDO-siRNA，(5)含100μg Trp2和500μg LDH的Trp2/LDH，(6)含100μg Trp2，500μg LDH和30μg IDO-siRNA的Trp2/LDH/IDO-siRNA。药物使用200μL HEPES(10mM)溶液配制，分两点在小鼠两侧腹股沟皮下各注射100μL。自第10天起，每隔2天应用电子游标卡尺测量小鼠肿
瘤的体积(分别测量肿瘤的长边与宽边长度，根据公式：肿瘤体积＝长边长度×宽边长度2，
计算得到肿瘤体积)。
观察小鼠胸腔表皮黑色素瘤生长情况，选取肿瘤生长均一性好的小鼠(标准是黑点生长不
分散，形状接近圆形)随机分为6个试验组，每组包含6只小鼠。在第4天，按照分组向各组小
鼠注射对照物或药物。给药内容与剂量分别为：(1)500μg LDH，(2)100μg游离的Trp2，(3)
100μg游离的Trp2与30μg游离的IDO-siRNA混合物，(4)含30μg IDO-siRNA和500μg LDH的
LDH/IDO-siRNA，(5)含100μg Trp2和500μg LDH的Trp2/LDH，(6)含100μg Trp2，500μg LDH和30μg IDO-siRNA的Trp2/LDH/IDO-siRNA。药物使用200μL HEPES(10mM)溶液配制，分两点在小鼠两侧腹股沟皮下各注射100μL。自第10天起，每隔2天应用电子游标卡尺测量小鼠肿
瘤的体积(分别测量肿瘤的长边与宽边长度，根据公式：肿瘤体积＝长边长度×宽边长度2，
计算得到肿瘤体积)。
[0094] 结果如图7所示，Trp2/LDH/IDO-siRNA、单独插层IDO-siRNA的LDH/IDO-siRNA、单独吸附Trp2的Trp2/LDH与未携带药物的LDH相比，对于黑色素瘤生长的抑制能力分别为
75％，33％和48％。结果表明，共递送IDO-siRNA和Trp2的Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒具
有显著抑制黑色素瘤生长的能力，且效果要明显优于单独装载IDO-siRNA或Trp2的LDH纳米
颗粒(*P<0.05)。
75％，33％和48％。结果表明，共递送IDO-siRNA和Trp2的Trp2/LDH/IDO-siRNA纳米颗粒具
有显著抑制黑色素瘤生长的能力，且效果要明显优于单独装载IDO-siRNA或Trp2的LDH纳米
颗粒(*P<0.05)。
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