技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物提取物技术领域，尤其涉及一种脱色壶瓶碎米荠含硒蛋白的提取、纯化方法。
背景技术
[0002] 壶瓶碎米荠是一种富硒能
力极强的十字花科植物，壶瓶碎米荠
水提
喷雾干燥产物的含硒量高达1000mg/kg，其中有机硒含量约占93.30％，做为补硒保健产品的添加成分具有安全性高、吸收好的特点，有很大的应用空间。
[0003] 目前壶瓶碎米荠水提喷雾干燥产物为深棕褐色，其应用的范围收到限制，因此，必须该提取物进行脱色。目前脱色的主要方法有
活性炭法和双
氧水法，但是我们的研究发现，这两种方法都会极大影响碎米荠含硒蛋白的
生物活性，比如抗氧化活性，我们通过独有的脱色、纯化工艺，获得了
颜色为浅黄色的壶瓶碎米荠含硒蛋白并对其蛋白的性质及抗氧化活性进行了评价，结果显示脱色及纯化技术对其活性没有不利影响。
发明内容
[0004] 本发明提供了一种脱色壶瓶碎米荠含硒蛋白的提取、纯化方法。
[0005] 本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明的脱色壶瓶碎米荠含硒蛋白的提取、纯化方法的具体步骤如下：
[0007] (1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
[0008] 将干燥的壶瓶碎米荠进行
粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡20-40min，料液比为1:20-50，然后开始加热，在75-84℃下搅拌提取40-80min，继续升温在
85-95℃下搅拌提取40-80min，然后进行过滤，滤液进行喷雾干燥，得到壶瓶碎米荠提取物粉末；
[0009] (2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
[0010] 将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为5-15:200g/ml，然后调节壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置10-15h，然后在2-6℃，5000-7000r/min下离心8-12min，收集沉淀并
真空冰冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠
粗蛋白；
[0011] (3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
[0012] 将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白使用Sephadex G-100凝胶柱层析和DEAE-FF阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化含硒蛋白。
[0013] 步骤(1)中，干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过100目筛。
[0014] 步骤(1)中，优选往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡30min，料液比为1:30。
[0015] 步骤(1)中，优选在80℃下搅拌提取60min，继续升温在90℃下搅拌提取60min。
[0016] 步骤(1)中，优选进行120目过滤，滤液进行喷雾干燥，喷雾干燥的参数为：进
风温度185℃，流量25mL/min。
[0017] 步骤(2)中，优选壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为10:200g/ml。
[0018] 步骤(2)中，用
硫酸铵调节壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点(pH＝5.3)，静置12h，然后在4℃，6000r/min下离心10min，收集沉淀并真空冰冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白。
[0019] 步骤(3)中，Sephadex G-100分级条件为：26mm×500mm层析柱，用缓冲液洗脱，上样浓度200mg/mL，上样体积2mL，
泵流速5r/min，洗脱的溶液用部分收集器分步收集，每管收集2.0mL，将同一组分收集合并，进行
透析72h后，浓缩
冷冻干燥，将得到的蛋白含量、硒含量高的组分作为进一步纯化样品上
纤维素DEAE-FF柱。
[0020] 步骤(3)中，DEAE-FF分级条件为：以0-1mol/L NaCl梯度洗脱，上样浓度10mg/mL，上样体积2mL，泵流速3.8r/min，每管收集1.5mL，将同一组分收集合并，得到蛋白分离组分，透析72h，浓缩冷冻干燥，得纯化含硒蛋白粉末，含硒纯化蛋白硒含量、蛋白含量高的即为本发明的壶瓶碎米荠纯化含硒蛋白。
[0021] 本发明的积极效果如下：
[0022] (1)通过调节壶瓶碎米荠提取物溶液的pH值获得色泽明显变浅的壶瓶碎米荠粗蛋白粉。
[0023] (2)通过柱层析的方法可以获得纯化硒含量较高的纯化含硒蛋白。
[0024] (3)脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白粉和纯化含硒蛋白仍然具有较好的自由基清除活性，表明经过处理的壶瓶碎米荠能够提高产品在同类产品中的竞争力，有利于产品的开发应用。
附图说明
[0025] 图1为纯化含硒蛋白的
变形和非变性
电泳图谱。
[0026] 图2为纯化含硒蛋白
圆二色性光谱谱图。
具体实施方式
[0027] 下面的
实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0028] 本发明采用的壶瓶碎米荠经鉴定为十字花科碎米荠属植物；葡聚糖凝胶G-100、DEAE-FF等购自武汉鼎国昌盛生物科技有限公司，其他
试剂均为国药集团化学试剂有限公司。
[0029] BT-2245
电子天平购自德国Sartorius公司；BSZ-100自动收集器购自上海沪西分析仪器有限公司；AFS-8220
原子荧光光度计购自吉天仪器有限公司；DYY-Ⅱ-28A垂直夹芯式电泳槽购自北京六一仪器厂；DYY-Ⅲ4高压双稳电泳仪购自北京六一仪器厂；HL-2S恒流购自上海沪西分析仪器有限公司；LGJ-185
冷冻干燥机购自北京松源华兴科技发展有限公司；CR-400色彩色差计购自日本柯尼卡美能达控股公司。
[0030] 实施例1
[0031] (1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
[0032] 将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡20min，料液比为1:20，然后开始加热，在75℃下搅拌提取80min，继续升温在85℃下搅拌提取80min，然后进行过滤，滤液进行喷雾干燥，得到壶瓶碎米荠提取物粉末；
[0033] (2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
[0034] 将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为5:200g/ml，然后调节壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置10h，然后在2℃，5000r/min下离心12min，收集沉淀并真空冰冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
[0035] (3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
[0036] 将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白使用Sephadex G-100凝胶柱层析和DEAE-FF阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化含硒蛋白。
[0037] 步骤(1)中，干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过100目筛。
[0038] 步骤(1)中，进行120目过滤，滤液进行喷雾干燥，喷雾干燥的参数为：进风温度185℃，流量25mL/min。
[0039] 步骤(2)中，用硫酸铵调节壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点(pH＝5.3)。
[0040] 步骤(3)中，Sephadex G-100分级条件为：26mm×500mm层析柱，用缓冲液洗脱，上样浓度200mg/mL，上样体积2mL，泵流速5r/min，洗脱的溶液用部分收集器分步收集，每管收集2.0mL，将同一组分收集合并，进行透析72h后，浓缩冷冻干燥，将得到的蛋白含量、硒含量高的组分作为进一步纯化样品上
纤维素DEAE-FF柱。
[0041] 步骤(3)中，DEAE-FF分级条件为：以0-1mol/L NaCl梯度洗脱，上样浓度10mg/mL，上样体积2mL，泵流速3.8r/min，每管收集1.5mL，将同一组分收集合并，得到蛋白分离组分，透析72h，浓缩冷冻干燥，得纯化含硒蛋白粉末，含硒纯化蛋白硒含量、蛋白含量高的即为本发明的壶瓶碎米荠纯化含硒蛋白。
[0042] 实施例2
[0043] (1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
[0044] 将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡40min，料液比为1:50，然后开始加热，在84℃下搅拌提取40min，继续升温在95℃下搅拌提取40min，然后进行过滤，滤液进行喷雾干燥，得到壶瓶碎米荠提取物粉末；
[0045] (2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
[0046] 将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为15:200g/ml，然后调节壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置15h，然后在6℃，5000r/min下离心8min，收集沉淀并真空冰冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
[0047] (3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
[0048] 将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白使用Sephadex G-100凝胶柱层析和DEAE-FF阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化含硒蛋白。
[0049] 步骤(1)中，干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过100目筛。
[0050] 步骤(1)中，进行120目过滤，滤液进行喷雾干燥，喷雾干燥的参数为：进风温度185℃，流量25mL/min。
[0051] 步骤(2)中，用硫酸铵调节壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点(pH＝5.3)。
[0052] 步骤(3)中，Sephadex G-100分级条件为：26mm×500mm层析柱，用缓冲液洗脱，上样浓度200mg/mL，上样体积2mL，泵流速5r/min，洗脱的溶液用部分收集器分步收集，每管收集2.0mL，将同一组分收集合并，进行透析72h后，浓缩冷冻干燥，将得到的蛋白含量、硒含量高的组分作为进一步纯化样品上纤维素DEAE-FF柱。
[0053] 步骤(3)中，DEAE-FF分级条件为：以0-1mol/L NaCl梯度洗脱，上样浓度10mg/mL，上样体积2mL，泵流速3.8r/min，每管收集1.5mL，将同一组分收集合并，得到蛋白分离组分，透析72h，浓缩冷冻干燥，得纯化含硒蛋白粉末，含硒纯化蛋白硒含量、蛋白含量高的即为本发明的壶瓶碎米荠纯化含硒蛋白。
[0054] 实施例3
[0055] (1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
[0056] 将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡30min，料液比为1:30，然后开始加热，在80℃下搅拌提取60min，继续升温在90℃下搅拌提取60min，然后进行过滤，滤液进行喷雾干燥，得到壶瓶碎米荠提取物粉末；
[0057] (2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
[0058] 将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为10:200g/ml，然后调节壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置12h，然后在4℃，6000r/min下离心10min，收集沉淀并真空冰冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
[0059] (3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
[0060] 将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白使用Sephadex G-100凝胶柱层析和DEAE-FF阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化含硒蛋白。
[0061] 步骤(1)中，干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过100目筛。
[0062] 步骤(1)中，进行120目过滤，滤液进行喷雾干燥，喷雾干燥的参数为：进风温度185℃，流量25mL/min。
[0063] 步骤(2)中，用硫酸铵调节壶瓶碎米荠提取物溶液pH值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点(pH＝5.3)。
[0064] 步骤(3)中，Sephadex G-100分级条件为：26mm×500mm层析柱，用缓冲液洗脱，上样浓度200mg/mL，上样体积2mL，泵流速5r/min，洗脱的溶液用部分收集器分步收集，每管收集2.0mL，将同一组分收集合并，进行透析72h后，浓缩冷冻干燥，将得到的蛋白含量、硒含量高的组分作为进一步纯化样品上纤维素DEAE-FF柱。
[0065] 步骤(3)中，DEAE-FF分级条件为：以0-1mol/L NaCl梯度洗脱，上样浓度10mg/mL，上样体积2mL，泵流速3.8r/min，每管收集1.5mL，将同一组分收集合并，得到蛋白分离组分，透析72h，浓缩冷冻干燥，得纯化含硒蛋白粉末，含硒纯化蛋白硒含量、蛋白含量高的即为本发明的壶瓶碎米荠纯化含硒蛋白。
[0066] 取实施例3所得的纯化含硒蛋白进行如下检测，经试验证明，具有抗氧化活性，有关实验情况如下：
[0067] 羟基自由基清除率的测定：
[0068] 分别取2mL样品溶液于试管中，加入1mLFeSO4溶液(9mmol/L)，1mL水杨酸-
乙醇溶液(9mmol/L)，最后加1mLH2O2(8.8mmol/L)，测得吸光值为Ax；蒸馏水为空白，其他操作相同测得吸光值为A0；蒸馏水为空白且不加水杨酸(以乙醇代替)测得吸光值为A水；加样品但不加水杨酸(以乙醇代替)测得吸光值为A样。计算·OH自由基清除能力公式为：
[0069] 抑制率(％)＝[(Ao-A水)－(Ax-A样)]/(Ao-A水)×100
[0070] 超氧阴离子清除率的测定：
[0071] 分别加入2.8mL Tris-HCl溶液(0.2mmol/L)，其中一个试管中加入0.1mL邻苯三酚溶液(18mmol/L)测得吸光值为A1，另一个试管水浴10min后，加入0.1mL HCl溶液(0.01mol/L)测定吸光值为A2；其他操作相同，用蒸馏水代替样品，分别测得吸光值为A0和A。加入邻苯三酚后迅速420nm处测其吸光值，每30s测一次，共测4min，8次。其中A为A0的调零，A2为A1的调零。邻苯三酚溶液(用0.01mol/L的HCl溶液配)现配现用。计算超-氧根离子(O2·)清除能力公式为：
[0072] 清除率(％)＝(K1-K2)/K1×100
[0073] DPPH自由基清除率的测定：
[0074] 分别取1mL样品溶液于具塞试管中，加入1mLDPPH-无水乙醇溶液(0.2mmol/L)，混匀后于25℃静置30min，以蒸馏水为参比，在分光光度计517nm处测其吸光值A1；用1mL的无水乙醇替代DPPH-无水乙醇溶液，同上操作，测定吸光值为A2；用1mL的无水乙醇替代样液，同上操作，测定吸光值为A0。计算DPPH-自由基清除能力公式为：
[0075] 抑制率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100
[0076] 结果显示，壶瓶碎米荠水提物脱色后，随硒含量上升，抗氧化能力愈大，与脱色前对比，脱色后壶瓶碎米荠对羟自由基的清除能力大大提高，对DPPH的清除能力略有下降，对超氧阴离子的清除能力大大降低。纯化含硒蛋白具有较好的抗氧化能力，与壶瓶碎米荠水提物的抗氧化活性相比较发现，当硒浓度在2μg/mL以上时，含硒蛋白对超氧阴离子和羟基自由基的清除率与同样硒浓度下壶瓶碎米荠水提物差异不大。
[0077] 表1 柯尼卡CR-400色彩色差计测定其
色度的结果
[0078]
[0079] 本发明所得的壶瓶碎米荠粗蛋白粉使用柯尼卡CR-400色彩色差计测定其色度发现经过脱色后获得的粗蛋白a值和b值(见表1)显著性减小，表明脱色后的粗蛋白粉色泽较未处理的明显浅淡，达到对壶瓶碎米提取物脱色的目的。
[0080] 本发明所得的化合物在结构上经测定分析，有关实验数据如下：
[0081] 由图1可知，纯化含硒蛋白SDS-PAGE电泳图中却显示有三个条带，因为变性电泳中β-巯基乙醇会将蛋白结构中的二硫键打开形成多个亚基，因而推测该蛋白由三种相对分子量不同的亚基构成。根据标准蛋白的迁移距离和相对分子
质量可计算出纯化含硒蛋白的三个条带蛋白的相对分子质量大约是18,36,39KDa。
[0082] 不同结构所产生CD谱带的
位置、峰型等都不相同，可反应所测
蛋白质的主链构象。典型的α-螺旋在192nm附近有一正CD谱峰，同时在222nm及208nm处有两负CD峰带；β-折叠则明显不同，在216nm有一负的波峰，而且在185nm-200nm有一正的波峰；β-转
角则在206nm附近有一正的波峰。因此，根据所测得蛋白质的CD谱图，可得出蛋白质的二级结构的信息。由图2可以看出，192nm附近有正的波峰，且222nm和208nm附近有两个双负肩峰带，可推断含有α-螺旋结构；在216nm处有负的谱峰，同时在185nm-200nm有正的谱带，说明有β-折叠结构存在。含硒蛋白CD图谱数据经分析可知，其二级结构中α-螺旋
15.3％，β-折叠34.1％，β-转角20.8％，无规卷曲29.8％。
[0084]
[0085]
[0086] 由表2可知，含硒蛋白中谷氨酸含量最高，占总氨基酸含量的15.30％，其次为酪氨酸，占总氨基酸的10.27％，而半胱氨酸、脯氨酸、蛋氨酸含量极低，含量几乎为零。推测可能是由于硒进入植物中，导致以Se-Met和Se-Cys的形式进入蛋白质中，形成含硒蛋白。
[0087] 表3 MALDI-TOF-MS分析结果
[0088]
[0089] 由表3可知，纯化含硒蛋白与候选蛋白(gi|295687390)肽段相同序列中均不含Met和Cys残基，而与候选蛋白(gi|168066734、gi|90017730)肽段相同序列中共有5个Met残基，其中2个均被氧化，间接表明了蛋白中原有Met和Cys中的硫被硒所代替，形成对应的含硒氨基酸，从而进入到蛋白质中形成含硒蛋白。与纯化含硒蛋白相匹配的蛋白可能是DING protein、predicted protein和chalcone synthase。
[0090] 综上所述，含硒蛋白由三个亚基组成，亚基分子量分别为：18、36、39kDa。含硒蛋白谷氨酸含量为15.3％，酪氨酸含量为10.27％，半胱氨酸、脯氨酸、蛋氨酸含量极低，含量几乎为零。含硒蛋白二级结构中二级结构中α-螺旋15.3％，β-折叠34.1％，β-转角20.8％，无规卷曲29.8％。其匹配蛋白可能是DING protein、predicted protein和chalcone synthase三种蛋白质。且通过原子荧光法测得含硒蛋白硒含量为323.28μg/g.[0091] 本发明提供一种壶瓶碎米荠提取物的脱色工艺，该工艺可以明显改善壶瓶碎米荠提取物色泽。本发明还提供一种从壶瓶碎米荠中提取纯化含硒蛋白工艺，其制备方法先进、科学、操作方便，壶瓶碎米荠粗蛋白、纯化含硒蛋白仍具有较好的抗氧化活性，实现在制备具有抗氧化、抗衰老作用保健品的应用中，为壶瓶碎米荠的应用提供了有利的技术手段和使用价值，经济社会效益巨大。
[0092] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、
修改、替换和变型，本发明的范围由所附
权利要求及其等同物限定。
