本发明的技术方案属于生物法合成生物降解高分子材料研领域。

生物降解聚酯的合成研究始于20世纪60年代。1969年，研究圆弧青 霉菌（Pe"d〃/wm cyc/op/ww)的微生物学家Shimada禾口 Matsushima等推观!l 该菌中可能存在含苹果酸结构单元的聚合物，该聚合物能够抑制圆弧青霉 菌的酸性蛋白酶活性，最终证实该聚合物为聚苹果酸（PMA)。 1979年， Vert等首次合成了水溶性脂肪族聚酯——聚苹果酸，它以苹果酸为唯一单 体。1989年，Fisher等从黏菌（尸/^raram尸o(yce/?/za/wm)细胞中分离出PMA， 并发现它是DNA聚合酶a的抑制剂。迄今为止，以Vert、Cammas、Kajiyama 等为代表的国外学者已对PMA的合成、性能和应用做了较深入的研究； 国内直到近几年才有学者对PMA的合成与性能做了基础研究。
聚苹果酸（PMA)是一种脂肪族聚酯类聚合物，是完全生物降解性的 新型生物高分子。PMA能被某些微生物先降解为低聚物，而后形成苹果酸 单体，并最终降解为C02和H20，其降解产物无毒无害，不会对环境产生 二次污染，是一种理想的生物降解性材料。PMA主要有a、卩、Y三种结构， 存在于生物体内的主要是(3型，它具有良好的水溶性、可生物降解性、生 物相容性和生物可吸收性，而且它具有易代谢性和易修饰性。因此，J3-PMA 可以作为药物载体及微胶囊材料、生物医学材料，如手术缝合线和绷带等， 还可作为化妆品、食品包装材料等。
普鲁兰是出芽短梗霉产生的一种胞外多糖副产物，易溶于水，不溶于 乙醇。它是一种具有极好的成膜、成纤、阻气、粘接、无毒性生物高分子， 己广泛应用于生物医药和食品等领域。
PMA的制备主要有化学合成法和生物发酵法两种。研究伊始，其合成
方法主要集中于化学合成法，又分为直接聚合法和开环聚合法两种。直接
聚合法得到的主要是Y型PMA，并且相对分子质量比较低，实际应用价值 较小，而且催化剂有毒，较难分离得到产物。开环聚合法又分为交酯和内 酯开环法，交酯开环得到的是a型PMA，内酯开环法可得到P型PMA， 但该方法形成内酯的步骤较多、不经济或产率太低。生物发酵法可得到P 型PMA，并且分子量相对较大，所需的原料简单易得，反应条件温和，具 有较大的开发应用前景。但是，长期以来，微生物法制备聚苹果酸的研究 国际国内均处在实验室水平，并存在PMA产量低、分离纯化困难和黑色 素难以去除的问题，而且，由于忽视了副产物普鲁兰的分离纯化，使聚苹 果酸的制造成本高居不下，又引起环境问题。事实上，构建聚苹果酸生产 用基因工程菌是解决产物分离纯化问题最好的方法。然而，在高产聚苹果 酸基因工程菌构建还没有实现的情况下，副产物普鲁兰的去除一直是聚苹 果酸生产需要高度重视的问题之一。 发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种同时获得副产物普鲁兰的(3-聚苹果酸的制备方法，实现P-聚苹果酸和普鲁兰的双产物发酵，有效去除 黑色素，减少由于副产物普鲁兰废弃造成的环境污染。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是： 第一步，培养基的配制
① 活化培养基：即马铃薯蔗糖培养基（PSA):马铃薯200g/L，蔗糖
20g/L，琼脂20g/L， pH5.6， 12广C高压蒸汽灭菌30分钟；
② 发酵培养基的配制：葡萄糖120g/L， NaN032g/L， KH2P04 0.1g/L， MgS04.7H20 0.2g/L， KC1 0.5g/L， CaCO330g/L， pH 4.0, 121。C高压蒸汽灭 菌15分钟，CaC03单独干热灭菌，180°C2小时；
第二步，菌种活化
将冻干菌禾中-出芽短梗霉（4wrcok^Www;?w〃w/am， As3.837)采用
PSA在22-26t:进行活化培养40-卯小时； 第三步，种子培养在固体平板上挑取第二步制得的活化单菌，接种于装有第一步制得的
发酵培养基的L管中，在24-30'C ， 120 r/min条件下振荡培养40-100小 时；
第四步，接种发酵
将第三步制得的种子培养物以0.8-2%接种于发酵培养基中，在 24-30°C， 120 r/min条件下振荡培养发酵8-14天； 第五步，分离纯化
① 卩-聚苹果酸与普鲁兰的初步分离：在第四步发酵结束后，离心，固 液分离，除去菌体；将发酵液调节pH至5.0，加等体积乙醇，黑色絮状沉 淀即为吸附了黑色素的普鲁兰，淡黄色澄清液即为溶(3-聚苹果酸液；过滤 分离；将溶p-聚苹果酸液浓縮后加二倍体积乙醇，出现的少量絮状沉淀为 普鲁兰，过滤并入初次沉淀的普鲁兰中；二次旋蒸浓縮上清液，得到较为 纯化的卩-聚苹果酸浓縮液；
② P-聚苹果酸的纯化：将上面①浓縮后的p-聚苹果酸溶液加4倍体积 乙醇，置于fC冰箱过夜，有白色沉(3-聚苹果酸沉淀析出；再次溶于50-100 倍重量的水中，透析或超滤2天，去除(3-聚苹果酸中的黑色素和一些小分 子物质，冷冻干燥，得p-聚苹果酸白色粉末产物；
③ 普鲁兰的纯化：配制乙醇/丁酮比例6: 4的混合溶剂，将上面①得 到的普鲁兰与5-15倍该溶剂混合，搅拌2天，使普鲁兰与黑色素充分分离； 将普鲁兰粗品溶于水中，用常规透析方法透析除去残留的黑色素；将经过 纯化的普鲁兰溶液冷冻干燥，得副产物微黄色普鲁兰固体。
本发明与现有技术相比，有益效果是：第一，使用该制备方法以出芽 短梗霉进行发酵可获得卩-聚苹果酸和普鲁兰双产物；第二，能够有效去除 黑色素，提高产物纯度；第三，由于副产物普鲁兰的分离纯化，既可降低 卩-聚苹果酸的生产成本，又可避免由于普鲁兰随黑色素的废弃引起的环境 问题，减少环境污染。
具体实施方式 实施例l
按如下步骤制备(3-聚苹果酸和普鲁兰： 第一步，培养基的配制
①活化培养基：即马铃薯蔗糖培养基（PSA):马铃薯200g/L，蔗 糖20g/L，琼脂20g/L， pH5.6， 12rC高压蒸汽灭菌30分钟；
.②发酵培养基的配制：葡萄糖120g/L， NaN03 2g/L， KH2P04 0.1g/L， MgSO4.7H2O0.2g/L， KC10.5g/L， CaCO330g/L， pH4.0, 121°C 高压蒸汽灭菌15分钟，CaCCb单独干热灭菌，18(TC2小时； 第二步，菌种活化 -将保存于一70。C的甘油管中的出芽短梗霉（^weokwWwm;?w〃w/ara， As 3.837)采用第一步配置的PSA培养基在24'C进行活化培养48 小时。 第三步，种子培养
在固体平板上挑取第二步制得的单菌，接种于装有5mL第一步制得 的发酵培养基的L管中，在24。C ， 120 rpm条件下振荡培养90小 时。
第四步，接种发酵
以0.8%的接种量将第三步制得的种子培养液接种于发酵培养基中， 在28'C， 120rpm条件下振荡培养发酵14天。
第五步，分离纯化
① (3-聚苹果酸与普鲁兰的初步分离：在第四步发酵结束后，离心固 液分离，除去菌体；将发酵液调节pH至5.0，加等体积乙醇，黑色絮状 沉淀即为吸附了黑色素的普鲁兰，淡黄色澄清液即为P-聚苹果酸溶液； 过滤分离；将P-聚苹果酸溶液浓縮后加二倍体积乙醇，出现的少量絮状 沉淀为普鲁兰，过滤并入初次沉淀的普鲁兰中；二次旋蒸浓縮上清液， 得到较为纯化的(3-聚苹果酸浓縮液；
② P-聚苹果酸的纯化：将上面①浓縮后的卩-聚苹果酸溶液加4倍体 积乙醇，置于^C冰箱过夜，有白色P-聚苹果酸沉淀析出；再次溶于50 倍重量的水中，透析两天，去除P-聚苹果酸中的黑色素和一些小分子物
质，冷冻干燥，得(3-聚苹果酸白色粉末产物；
③普鲁兰的纯化：配制乙醇/丁酮比例6: 4的混合溶剂，将上面① 得到的普鲁兰与8倍该溶剂混合，搅拌2天，使普鲁兰与黑色素充分分 离；将普鲁兰粗品溶于水中，用透析袋透析除去残留的黑色素。将经过 纯化的普鲁兰溶液冷冻干燥，得副产物致密膜状微黄色普鲁兰固体。
实施例2
按如下步骤制备(3-聚苹果酸和普鲁兰： 第一步，培养基的配制
① 活化培养基：即马铃薯蔗糖培养基（PSA):马铃薯200g/L，蔗糖
20g/L，琼脂20g/L， pH5.6， 121'C高压蒸汽灭菌30分钟；
② 发酵培养基的配制：葡萄糖120g/L， NaN032g/L， KH2P04 0.1g/L， MgS(V7H2O0.2g/L， KC10.5g/L， CaC03 30g/L pH 4.0, 121。C高压蒸汽 灭菌15分钟，CaC03单独干热灭菌，18(TC2小时；
第二步，菌种活化
将保存于一70。C的甘油管中的出芽短梗霉""〜o6os诚ww/w〃wAms， As 3.837)采用第一步制得的PSA培养基在24"C进行活化培养48小时。 第三步，种子培养
在固体平板上挑取第二步制得的单菌，接种于装有5mL第一步制得的 发酵培养基的L管中，在26。C ， 120rpm条件下振荡培养72小时。 第四步，接种发酵
以1%的接种量将种子培养液接种于发酵培养基中，在28"C， 120 rpm 条件下振荡培养发酵9天。
第五步，分离纯化
①p-聚苹果酸与普鲁兰的初步分离：第四步得到的发酵液13000 rpm 离心10分钟，除去菌体。将发酵液调节pH5.0，加入等体积的无水乙醇， 观察到有黑色絮状漂浮物生成，此即为普鲁兰，离心分出。部分黑色素 附着于普鲁兰上， 一同被分出。淡黄色P-聚苹果酸澄清液浓缩后，加入
2倍体积无水乙醇，离心再次分离普鲁兰。
② (3-聚苹果酸的纯化：将一次沉淀后的上清液旋转蒸发浓縮后，加入
约4倍体积的无水乙醇，置于4。C冰箱过夜，进行二次沉淀，即有p-聚苹 果酸沉出。发现沉淀的(3-聚苹果酸以胶体状态存在于乙醇和水的混合液中， 向其中加入2 % (w/w)NaCl即有P-聚苹果酸沉淀下来。将所得的|3-聚苹果 酸沉淀再次溶于100水倍中，用透析袋透析除去残留的黑色素。将透析后 的|3-聚苹果酸溶液冷冻干燥，即得白色(3-聚苹果酸产品。
③ 普鲁兰的纯化：将上面①两次分离出的普鲁兰和黑色素的混合物置 于乙醇/丁酮比例6 : 4的混合溶剂中，在磁力搅拌器上80rpm搅拌2天， 过滤得到普鲁兰粗品，弃去含有黑色素的混合液。将普鲁兰粗品溶于水中， 用透析袋透析除去残留的黑色素。冷冻干燥透析袋中的普鲁兰溶液，得到 副产物淡黄色普鲁兰。
实施例3
按如下步骤制备卩-聚苹果酸和普鲁兰： 第一步，培养基的配制
① 活化培养基：即马铃薯蔗糖培养基（PSA):马铃薯200g/L，蔗糖20g/L， 琼脂20g/L， pH5.6， 121°C，高压蒸汽灭菌30分钟；
② 发酵培养基的配制：葡萄糖120g/L， NaN03 2g/L， KH2P04 0.1g/L， MgS04.7H20 0.2g/L， KC1 0.5g/L， CaCO330g/L， pH 4.0, 121。C高压蒸汽灭 菌15分钟，CaC03单独干热灭菌，180°C2小时；
第二步，菌种活化
将保存于一70°C的甘油管中的出芽短梗霉Uwreo6oyWww pw〃w/""j, As 3.837)采用第一步制得的PSA培养基在22。C进行活化培养90小时。 第三步，种子培养
在固体平板上挑取第二步制得的单菌，接种于装有5mL第一步制得的 发酵培养基的L管中，在28'C ， 120rpm条件下振荡培养60小时。 第四步，接种发酵
以2%的接种量将第三步制得的种子培养液接种于发酵培养基中，在 26°C， 120rpm条件下振荡培养发酵8天。 第五步，分离纯化
① p-聚苹果酸与普鲁兰的初步分离：在第四步发酵结束后，离心固液 分离，除去菌体；将发酵液调节pH至5.0，加等体积乙醇，黑色絮状沉淀 即为吸附了黑色素的普鲁兰，淡黄色澄清液即为(3-聚苹果酸溶液；过滤分 离；将P-聚苹果酸溶液浓縮后加二倍体积乙醇，出现的少量絮状沉淀为普 鲁兰，过滤并入初次沉淀的普鲁兰中；二次旋蒸浓縮上清液，得到较为纯 化的P-聚苹果酸浓縮液；
② (3-聚苹果酸的纯化：将上面①浓縮后的P-聚苹果酸溶液加4倍体积 乙醇，置于fC冰箱过夜，有白色p-聚苹果酸沉淀析出；再次溶于50倍重 量的水中，采用中空纤维分离器，用常规超滤方法进行超滤，膜的载留分 子量为5000D，去除(3-聚苹果酸中的黑色素和一些小分子物质，冷冻干燥， 得I3-聚苹果酸白色粉末产物；
③ 普鲁兰的纯化：先将上面①得到的普鲁兰溶于5倍重量的蒸馏水 中，8(TC水浴锅加热2小时，除去普鲁兰酶；配制乙醇/丁酮比例6: 4的 混合溶剂，将上述普鲁兰与8倍该溶剂混合，搅拌2天，使普鲁兰与黑色 素充分分离；将普鲁兰粗品溶于水中，用透析袋透析除去残留的黑色素。 将经过纯化的普鲁兰溶液冷冻干燥，得副产物致密膜状微黄色普鲁兰固体。