技术领域
[0001] 本
发明涉及粪菌胶囊技术领域，尤其涉及用于治疗甲基苯丙胺成瘾戒断的肠道菌群胶囊及制备方法。
背景技术
[0002] 在人体肠道内环境中存在的各种
微生物统称肠道菌群。报道显示，大约有10万亿个细菌寄生于人体肠道中，该数量约为人
体细胞总数的10倍，包括大肠杆菌、乳酸菌、双歧杆菌、消化球菌、链球菌等等。这些菌落在婴儿时期就寄生在人体中，大部分栖息在人体大肠中，它们相互影响共同维持肠道微环境的动态平衡。研究发现，
哺乳动物大脑和肠道间存在双向信息交流，这种在不同层次上将胃肠道与中枢神经系统联系起来的神经-内分泌网络被称为肠-脑轴，包括中枢神经系统、自主神经系统、肠道内神经系统、神经内分泌系统、免疫系统等结构。大脑可通过此轴影响肠胃功能，胃肠活动也可经此轴对中枢神经产生影响，以实现胃肠道与大脑之间紧密连接的双向神经体液交流。
[0003] 众多对肠道菌群的研究表明，肠道菌群失调(肠道菌群区系结构或功能结构发生变化)能够导致各种
疾病的发生，如肥胖、糖尿病、神经系统疾病、过敏及各种
炎症等。肠道菌群区系组成或
密度的变化可增加人类和小鼠模型对多种病原体和异常黏膜免疫反应的敏感性。例如，抗生素引起的小鼠肠道微生物群和
代谢物的改变增加了难辨梭菌感染的易感性。近期研究显示，肠道菌群与毒品成瘾也存在关联。国外研究发现甲基苯丙胺诱导的条件性
位置偏爱大鼠，肠道菌群区系特征较正常大鼠发生显著变化，包括菌群多样性和菌种组成，这些变化可能影响大鼠体内血清素的释放和小胶质细胞的功能，并参与甲基苯丙胺引起的认知损害过程。人体研究中Fulcher等(FULCHER J A,HUSSAIN S K,COOK R,et al.Effects of Substance Use and Sex Practices on the Intestinal Microbiome During HIV-1Infection[J].J Infect Dis,2018,218(10):1560-1570)也发现，成瘾者肠道内
瘤胃球菌属(包括白色瘤胃球菌和黄化瘤胃球菌)、柯林斯氏菌属、副杆状菌属丰度的降低与甲基苯丙胺滥用存在关联，且以上菌群丰度的增加可能有利于毒品成瘾的戒断。
[0004] 肠道菌群作为治疗腹泻、
阴道酵母菌感染、
尿路感染、肠易激综合征等各类疾病有着悠久的历史。目前，肠道菌群移植主要应用于复发性难辨梭状芽胞杆菌感染、克罗恩病及炎症性肠病的治疗。菌群移植是指将来自供者的
粪便样品转移到受试者体内，从而改善受试者肠道菌群分布。肠道菌群移植主要通过两种方式进行：一种与灌肠剂相似，将粪便样品直接注射到受试者肛
门中；另一种是将粪便样品通过管子导入受试者肠道深处。在某些情况下，肠道菌群移植成为治疗某些疾病的唯一方法。近年来肠道菌群移植已得到美国食品药物监督管理局(FDA)批准，多例患者经肠道菌群移植已取得良好治疗效果。目前，治疗肠道失调和恢复健康的肠道稳态已成为治疗疾病的重要治疗策略。
[0005] 总之，肠道菌群作为人体的重要组成部分，与
机体健康紧密相关，目前已有研究观察到瘤胃球菌与药物成瘾存在关联，但还未有将该肠道菌种移植应用于甲基苯丙胺成瘾戒断的报道。因此，需要一种能抑制甲基苯丙胺成瘾，有效降低药物复吸率的肠道菌群胶囊。
发明内容
[0006] 基于上述问题，本发明的目的是提供一种用于治疗甲基苯丙胺成瘾戒断的肠道菌群胶囊及其制备方法，成瘾者服用该肠道菌群胶囊，能够调节成瘾者肠道菌群组成，实现对毒品成瘾的戒断，逐渐恢复成瘾者肠道微生态平衡，有效提高毒品戒断率。
[0007] 本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
[0008] 本发明的目的之一在于提供了一种用于治疗甲基苯丙胺成瘾戒断的肠道菌群胶囊的制备方法，包括以下步骤：
[0009] S1.采集健康人群新鲜粪便，封口袋密封保存，备用；
[0010] S2.将采集的新鲜粪便与无菌生理盐
水搅拌混匀，制得悬浮液，对悬浮液进行过滤，去除残渣，得到肠道菌群菌液，置于2～5℃的
冰箱中保存，备用；
[0011] S3.从肠道菌群菌液中提取白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)和/或黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)，培养，得到目标菌液；
[0012] S4.取海藻酸钠和果胶加入双蒸水中，搅拌溶解得到胶液；向目标菌液中加入CaCl2，得到混合溶液，将胶液加入混合溶液中，于室温下进行化学交联反应，过滤清洗，得到肠道菌群颗粒；
[0013] S5.将肠道菌群颗粒包裹于胶囊中，得到肠道菌群胶囊，避光常温保存。
[0014] 上述的采集新鲜粪便的健康人群需满足以下条件：
[0015] a.年轻人群或者成瘾者的亲属优先，尤其是成瘾者的亲属与成瘾者具有相似的微生态环境，但是需要满足未
接触任何成瘾物质包括饮酒、吸烟和吸毒等条件；
[0016] b.近半年来未发生腹泻；
[0017] c.近一年来未使用过抗生素，最近3个月内未使用抗菌药物以及其他导致肠道微生态紊乱的药物；
[0018] d.无任何已知的传染性疾病，例如甲肝、乙肝、丙肝等；
[0019] e.无胃肠道
肿瘤、息肉等消化系统疾病或肠道手术史；
[0020] f.无任何慢性病，如糖尿病、冠心病、
高血压等。
[0021] 进一步，所述步骤S3具体为：将肠道菌群菌液涂平板于RGCA固体培养基上，培养24小时后，将RGCA中生长的菌落接种至含有RGCA液态培养基的培养管中，并置于摇床上培养10～14h，得到目标菌液。RGCA固体培养基主要用于对瘤胃微生物的分离及培养。
[0022] 进一步，所述RGCA固体培养基包括瘤胃液30％、
葡萄糖1％、
纤维二糖1％、
淀粉1％、琼脂15％。
[0023] 进一步，所述RGCA液态培养基包括瘤胃液30％、葡萄糖1％、纤维二糖1％、淀粉1％。
[0024] 进一步，所述无菌生理盐水的浓度为0.9％的
氯化钠溶液，所述新鲜粪便与无菌生理盐水按照50g:(150mL～300mL)。
[0025] 进一步，所述胶液总浓度为5％，所述海藻酸钠和果胶的
质量比为2:1。
[0026] 进一步，所述混合溶液中的CaCl2浓度为0.3mol/L。
[0027] 进一步，所述胶液以流速0.3～0.5mL/min被电喷至搅拌中的混合溶液中，所述胶液和混合溶液的体积比为1:1。
[0028] 本发明的目的之二在于提供了上述制备方法制备得到的肠道菌群胶囊。
[0029] 本发明的目的之三在于提供了上述肠道菌群胶囊在甲基苯丙胺成瘾戒断治疗中的应用，服用该肠道菌群胶囊后，通过调控肠道菌群，实现对毒品的戒断。
[0030] 本发明主要采用经多项严格条件筛选的健康人群粪便中与抑制甲基苯丙胺毒品成瘾相关的肠道菌群白色瘤胃球菌和/或黄化瘤胃球菌，将其与海藻酸钠和果胶混合先制成肠道菌群颗粒，再将肠道菌群颗粒装入胶囊壳中，制得肠道菌群胶囊，通过口服该肠道菌群胶囊进行菌群移植，达到对甲基苯丙胺成瘾者毒品阶段的目的，具有无毒害性、长期有效性、戒断率高等多项优点。
[0031] 本发明采用以菌治菌的方法，根据甲基苯丙胺成瘾人群与正常人肠道菌群的差异，分析差异菌群在毒品成瘾中的作用，通过增加与甲基苯丙胺毒品抑制相关的肠道菌群白色瘤胃球菌和/或黄化瘤胃球菌，实现无毒
副作用的微生态疗法，并以肠道菌群胶囊的形式进行治疗，降低了甲基苯丙胺成瘾者对毒品的渴求，改善了机体肠道微生态平衡，有效提高了毒品戒断率。
具体实施方式
[0032] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域的技术人员可由本
说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他有点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列
实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。另外，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为
鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当视为本发明可实施的范畴。
[0033] 需要说明的是，本发明的制备方法中采集健康人群新鲜粪便，其中的健康人群的筛选条件如下：
[0034] a.年轻人群或者成瘾者的亲属优先，尤其是成瘾者的亲属与成瘾者具有相似的微生态环境，但是需要满足未接触任何成瘾物质包括饮酒、吸烟和吸毒等条件；
[0035] b.近半年来未发生腹泻；
[0036] c.近一年来未使用过抗生素，最近3个月内未使用抗菌药物以及其他导致肠道微生态紊乱的药物；
[0037] d.无任何已知的传染性疾病，例如甲肝、乙肝、丙肝等；
[0038] e.无胃肠道肿瘤、息肉等消化系统疾病或肠道手术史；
[0039] f.无任何慢性病，如糖尿病、冠心病、高血压等。
[0040] 溶液及培养基准备：
[0041] 浓度为0.9％的无菌生理盐水：取氯化钠加入双蒸水中搅拌至完全溶解，配置得到浓度为0.9％的生理盐水，对该生理盐水进行杀菌消毒处理，得到无菌生理盐水，备用。
[0042] RGCA固体培养基：按照以下质量百分数分别取各原料：瘤胃液30％、葡萄糖1％、纤维二糖1％、淀粉1％、琼脂15％，混合制备得到RGCA固体培养基。
[0043] RGCA液态培养基：按照以下质量百分数分别取各原料：瘤胃液30％、葡萄糖1％、纤维二糖1％、淀粉1％，混合制备得到RGCA液态培养基。
[0044] 本发明中使用RGCA固体培养基对瘤胃微生物进行分离及培养，参考了《中国奶
牛》2009年第4期第18-23页，孙建凤、林英庭发表的“瘤胃微生物的分离、鉴定及定量分析技术”。
[0045] 实施例1
[0046] 本实施例的肠道菌群胶囊的制备方法如下：
[0047] S1.采集健康人群新鲜粪便，用封口袋密封保存，备用。
[0048] S2.称取S1采集的新鲜粪便50g，量取150mL无菌生理盐水，将称取的新鲜粪便与无菌生理盐水搅拌混匀，得到悬浮液，采用3层纱布对悬浮液进行过滤，去除残渣，得到肠道菌群菌液。将肠道菌群菌液置于2～5℃的冰箱中保存，备用。
[0049] S3.将肠道菌群菌液涂平板于RGCA固体培养基上，培养24小时后，将RGCA固体培养基中生长的菌落接种至含有RGCA液态培养基的培养管中，并置于摇床上培养12h，得到目标菌液，即从肠道菌群菌液中提取出白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌，即目标菌液中含白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌。
[0050] S4.按海藻酸钠和果胶的质量比2:1，分别称取海藻酸钠和果胶，将称取好的海藻酸钠和果胶加入双蒸水中，搅拌溶解得到海藻酸钠和果胶质量总浓度为5％的胶液；于每升目标菌液中加入0.3mol的CaCl2，搅拌溶解，得到混合溶液；以0.3mL/min的流速将胶液电喷至快速搅拌中的混合溶液中，且喷入的胶液和混合溶液的体积比为1:1，胶液和混合溶液于室温下进行化学交联反应30min后，过滤清洗，得到肠道菌群颗粒。
[0051] S5.将肠道菌群颗粒包裹于胶囊中，得到肠道菌群胶囊，避光常温保存。
[0052] 实施例2
[0053] 本实施例的肠道菌群胶囊的制备方法如下：
[0054] S1.采集健康人群新鲜粪便，用封口袋密封保存，备用。
[0055] S2.称取S1采集的新鲜粪便50g，量取300mL无菌生理盐水，将称取的新鲜粪便与无菌生理盐水搅拌混匀，得到悬浮液，将悬浮液转入无菌离心管中，于离心
力2500～3000xg、
温度20～25℃的条件下离心20min，取出无菌离心管中的上清液，得到肠道菌群菌液。将肠道菌群菌液置于2～5℃的冰箱中保存，备用。
[0056] S3.将肠道菌群菌液涂平板于RGCA固体培养基上，培养24小时后，将RGCA固体培养基中生长的菌落接种至含有RGCA液态培养基的培养管中，并置于摇床上培养12h，得到目标菌液，即从肠道菌群菌液中提取出白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌，即目标菌液中含有白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌。
[0057] S4.按海藻酸钠和果胶的质量比2:1，分别称取海藻酸钠和果胶，将称取好的海藻酸钠和果胶加入双蒸水中，搅拌溶解得到海藻酸钠和果胶质量总浓度为5％的胶液；于每升目标菌液中加入0.3mol的CaCl2，搅拌溶解，得到混合溶液；以0.5mL/min的流速将胶液电喷至快速搅拌中的混合溶液中，且喷入的胶液和混合溶液的体积比为1:1，胶液和混合溶液于室温下进行化学交联反应30min后，过滤清洗，得到肠道菌群颗粒。
[0058] S5.将肠道菌群颗粒包裹于胶囊中，得到肠道菌群胶囊，避光常温保存。
[0059] 实施例3
[0060] 本实施例的肠道菌群胶囊的制备方法如下：
[0061] S1.采集健康人群新鲜粪便，用封口袋密封保存，备用。
[0062] S2.称取S1采集的新鲜粪便50g，量取200mL无菌生理盐水，将称取的新鲜粪便与无菌生理盐水搅拌混匀，得到悬浮液，将悬浮液转入无菌离心管中，于
离心力2500～3000xg、温度20～25℃的条件下低速离心20min，取出低速离心后的无菌离心管中的上清液，将上清液转移到新的无菌离心管中，于离心力6000～8000xg、温度15～20℃的条件下高速离心30min，取出高速离心后的无菌离心管中的上清液，得到肠道菌群菌液。将肠道菌群菌液置于2～5℃的冰箱中保存，备用。
[0063] S3.将肠道菌群菌液涂平板于RGCA固体培养基上，培养24小时后，将RGCA固体培养基中生长的菌落接种至含有RGCA液态培养基的培养管中，并置于摇床上培养12h，得到目标菌液，即从肠道菌群菌液中提取出白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌，即目标菌液中含有白色瘤胃球菌和/或黄化瘤胃球菌。
[0064] S4.按海藻酸钠和果胶的质量比2:1，分别称取海藻酸钠和果胶，将称取好的海藻酸钠和果胶加入双蒸水中，搅拌溶解得到海藻酸钠和果胶质量总浓度为5％的胶液；于每升目标菌液中加入0.3mol的CaCl2，搅拌溶解，得到混合溶液；以0.4mL/min的流速将胶液电喷至快速搅拌中的混合溶液中，且喷入的胶液和混合溶液的体积比为1:1，胶液和混合溶液于室温下进行化学交联反应30min后，过滤清洗，得到肠道菌群颗粒。
[0065] 本发明主要采用经多项严格条件筛选的健康人群粪便中与抑制毒品成瘾相关的肠道菌群，并制成胶囊，通过口服肠道菌群胶囊进行菌群移植，达到对甲基苯丙胺成瘾者毒品戒断的目的，具有无毒害性、长期有效性、戒断率高等多项优点。
[0066] 详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行
修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的
权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
