背景技术

白细胞介素-1(IL-1)是一种重要的对几种类型的细胞有生物 效应的免疫应答介质。白细胞介素-1与两种受体白细胞介素-1受 体1型(IL-1R1、CD121a、p80)和白细胞介素-1受体2型(IL- 1R1、CDw121b)相结合，白细胞介素-1受体1型与IL-1结合将 信号向细胞内传递，白细胞介素-1受体2型与IL-1结合不传递信 号，而是作为IL-1内源性调节剂。另一种调节IL-1与IL-1R1相 互作用的内源性蛋白是白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)。IL- 1ra与IL-1R1结合，但不激活IL-1R1以传递信号。

通过IL-1R1与IL-1(例如IL-1α或IL-1β)结合传递的信号 诱导广谱的可致病的生物活性。例如通过IL-1R1与IL-1(例如 IL-1α或IL-1β)结合传递的信号可导致局部及全身性炎症，产生 另外的炎性介质(如IL-6、I1-8、TNF)，发烧，激活免疫细胞 (如淋巴细胞、中性粒细胞)，食欲不振，低血压，白细胞减少症 和血小板减少。通过IL-1R1与IL-1(例如IL-1α或IL-1β)结合 传递的信号对非免疫细胞也有作用，如刺激软骨细胞释放胶原酶 和其他降解软骨的酶，以及刺激破骨细胞祖细胞分化为成熟的可 导致骨再吸收的破骨细胞。(参见例如Hallegua and Weisman， Ann.Theum.Dis.61：960-967(2002).)。因此，IL-1和IL-1R1的 相互作用已牵涉几种疾病如关节炎(如类风湿关节炎、骨性关节 炎)和炎症性肠病的发病机理。

某些与白细胞介素-1受体1型(IL-1R1)结合并使其无活性 (如IL-1ra)的物质，已被证明是某些炎症疾病的有效治疗剂，如 中度到严重的活动性类风湿关节炎。不过，其他与IL-1R1结合的 物质如抗IL-1R1抗体AMG 108(Amgen公司)已不能满足临床 研究中主要终点的要求。

存在着对拮抗IL-1R1的改进药物，以及施用此种药物治疗疾 病的方法的需求。

发明概述

本发明涉及与IL-1R1结合，并抑制IL-1(如IL-1α和/或 IL-1β)与受体的结合，但不抑制IL-1ra与IL-1R1结合的域抗体 (dAb)单体，以及包括此种dAb单体的配体。这种配体和dAb单 体可用作治疗剂，治疗炎症、疾病或全部或部分由IL-1与IL-1R1 结合所诱导的生物学功能所介导的其他疾病(如局部或全身性炎 症，炎症介质的产生(如IL-6、I1-8、TNF)，发烧，免疫细胞的 激活(如淋巴细胞、中性粒细胞)，厌食症，低血压，白细胞减 少，血小板减少)。本发明的配体或dAb单体可与IL-1R1结合， 并抑制IL-1R1的功能而不影响内源性IL-1R1抑制途径，如内源 性IL-1ra和内源性IL-1R1的结合。因此，这种配体或dAb单体 可施用于受试者，以补充抑制体内IL-1R1或IL-1活性的内源性 调节途径。此外，与IL-1R1结合，不抑制IL-1ra和IL-1R1结合 的配体或dAb单体作为诊断试剂是有利的，因为它们可用于结 合、检测、定量或测量样本中的IL-1R1，并且不会与样本中的 IL-1ra竞争与IL-1R1的结合。因此，可以准确测定样本中是否有 以及有多少IL-1R1。

与IL-1R1结合，抑制IL-1  (如IL-1α和/或IL-1β)与受体结 合，但不抑制IL-1ra与IL-1R1结合的dAb单体，还可以用作研 究工具。例如，这样的dAb单体可用于鉴别与IL-1R1结合，但 不抑制IL-1ra和IL-1R1结合的物质(如其他dAb、小的有机分 子)。在一个说明性的实施例中，在竞争性IL-1R1受体结合检 测，例如本文所述的受体结合检测中，检测了一物质或物质集合 抑制IL-1和IL-1R1结合的能力。随后在类似的竞争性IL-1R1受 体结合检测中，研究了抑制IL-1与IL-1R1结合的物质，以明了 其是否会和与IL-1R1结合但不抑制IL-1ra和IL-1R1结合的dAb 单体竞争。这样一种检测中的竞争性结合表明，该物质与IL-1R1 结合，抑制IL-1与受体结合，但不抑制IL-1ra与受体的结合。

一方面，本发明涉及一种dAb单体，该域抗体单体能特异性 结合白细胞介素-1受体1型(IL-1R1)，并抑制白细胞介素-1 (IL-1，如白细胞介素-1α(IL-1α)和/或白细胞介素-1β(IL- 1β))与受体结合，但不抑制白细胞介素-1受体拮抗剂((IL- 1ra)与IL-1R1的结合。

优选地，所述dAb单体抑制IL-1与IL-1R1结合，IC50≤1 μM。在一些实施方案中，在体外检测中所述dAb单体抑制IL-1 诱导的MRC-5细胞(ATCC检索号CCL-171)释放白细胞介素- 8，ND50≤1μM，或优选≤1nM。在其他实施方案中，在全血检测 中所述dAb单体抑制IL-1诱导的白细胞介素-6的释放，ND50≤1 μM。在其他实施方案中，在全血检测中所述dAb单体抑制IL-1 诱导的白细胞介素-6的释放，ND50≤1μM。

所述dAb单体内的一个或多个框架区(FR)可包括(a)人 框架区的氨基酸序列，(b)人框架区氨基酸序列的至少8个毗连 氨基酸，或(c)人种系抗体基因片段编码的氨基酸序列，其中所 述框架区如Kabat所定义。

所述dAb单体中一个或多个框架区的氨基酸序列可以与人种 系抗体基因片段编码的相应框架区氨基酸序列相同，或相对于人 种系抗体基因片段编码的相应框架区，一个或多个所述框架区的 氨基酸序列总共含有最高达5个氨基酸的差异。

所述dAb单体中FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可以 与人种系抗体基因片段编码的相应框架区氨基酸序列相同，或相 对于人种系抗体基因片段编码的相应框架区，FR1、FR2、FR3和 FR4的氨基酸序列总共含有最高达10个氨基酸的差异。

dAb单体可包括FR1、FR2和FR3区，所述FR1、FR2和 FR3的氨基酸序列可以与人种系抗体基因片段编码的相应框架区 氨基酸序列相同。在一些实施方案中，人种系抗体基因片段是 DPK9和JK1。

在一些实施方案中，所述dAb单体与选自下列的dAb竞争与 IL-1R1的结合：DOM4-122-23(SEQ ID NO：1)、DOM4-122-24 (SEQ ID NO：2)、DOM4-122(SEQ ID NO：95)、DOM4-122-1(SEQ ID NO：96)、DOM4-122-2(SEQ ID NO：97)、DOM4-122-3(SEQ ID NO：98)、DOM4-122-4(SEQ ID NO：99)、DOM4-122-5(SEQ ID NO：100)、DOM4-122-6(SEQ ID NO：101)、DOM4-122-7(SEQ ID NO：102)、DOM4-122-8(SEQ ID NO：103)、DOM4-122-9(SEQ ID NO：104)、DOM4-122-10(SEQ ID NO：105)、DOM4-122-11(SEQ ID NO：106)、DOM4-122-12(SEQ ID NO：107)、DOM4-122-13 (SEQ ID NO：108)、DOM4-122-14(SEQ ID NO：109)、DOM4-122- 15(SEQ ID NO：110)、DOM4-122-16(SEQ ID NO：111)、DOM4- 122-17(SEQ ID NO：112)、DOM4-122-18(SEQ ID NO：113)、 DOM4-122-19(SEQ ID NO：114)、DOM4-122-20(SEQ ID NO：115)、DOM4-122-21(SEQ ID NO：116)、DOM4-122-22(SEQ ID NO：117)、DOM4-122-25(SEQ ID NO：118)、DOM4-122-26 (SEQ ID NO：119)、DOM4-122-27(SEQ ID NO：120)、DOM4-122- 28(SEQ ID NO：121)、DOM4-122-29(SEQ ID NO：122)、DOM4- 122-30(SEQ ID NO：123)、DOM4-122-31(SEQ ID NO：124)、 DOM4-122-32(SEQ ID NO：125)、DOM4-122-33(SEQ ID NO：126)、DOM4-122-34(SEQ ID NO：127)、DOM4-122-35(SEQ ID NO：128)、DOM4-122-36(SEQ ID NO：129)、DOM4-122-37 (SEQ ID NO：130)、DOM4-122-38(SEQ ID NO：131)、DOM4-122- 39(SEQ ID NO：132)、DOM4-122-40(SEQ ID NO：133)、DOM4- 122-41(SEQ ID NO：134)、DOM4-122-42(SEQ ID NO：135)、 DOM4-122-43(SEQ ID NO：136)、DOM4-122-44(SEQ ID NO：137)、DOM4-122-45(SEQ ID NO：138)、DOM4-122-46(SEQ ID NO：139)、DOM4-122-47(SEQ ID NO：140)、DOM4-122-48 (SEQ ID NO：141)、DOM4-122-49(SEQ ID NO：142)、DOM4-122- 50(SEQ ID NO：143)、DOM4-122-51(SEQ ID NO：144)、DOM4- 122-52(SEQ ID NO：145)、DOM4-122-54(SEQ ID NO：146)、 DOM4-122-55(SEQ ID NO：147)、DOM4-122-56(SEQ ID NO：148)、DOM4-122-57(SEQ ID NO：149)、DOM4-122-58(SEQ ID NO：150)、DOM4-122-59(SEQ ID NO：151)、DOM4-122-60 (SEQ ID NO：152)、DOM4-122-61(SEQ ID NO：153)、DOM4-122- 62(SEQ ID NO：154)、DOM4-122-63(SEQ ID NO：155)、DOM4- 122-64(SEQ ID NO：156)、DOM4-122-65(SEQ ID NO：157)、 DOM4-122-66(SEQ ID NO：158)、DOM4-122-67(SEQ ID NO：159)、DOM4-122-68(SEQ ID NO：160)、DOM4-122-69(SEQ ID NO：161)、DOM4-122-70(SEQ ID NO：162)、DOM4-122-71 (SEQ ID NO：163)、DOM4-122-72(SEQ ID NO：164)、DOM4-122- 73(SEQ ID NO：165)、DOM4-1(SEQ ID NO：8)、DOM4-2(SEQ ID NO：9)、DOM4-3(SEQ ID NO：10)、DOM4-4(SEQ ID NO：11)、 DOM4-5(SEQ ID NO：12)、DOM4-6(SEQ ID NO：13)、DOM4-7 (SEQ ID NO：14)、DOM4-8(SEQ ID NO：15)、DOM4-9(SEQ ID NO：16)、DOM4-10(SEQ ID NO：17)、DOM4-11(SEQ ID NO：18)、DOM4-12(SEQ ID NO：19)、DOM4-13(SEQ ID NO：20)、 DOM4-14(SEQ ID NO：21)、DOM4-15(SEQ ID NO：22)、DOM4-20 (SEQ ID NO：23)、DOM4-21(SEQ ID NO：24)、DOM4-22(SEQ ID NO：25)、DOM4-23(SEQ ID NO：26)、DOM4-25(SEQ ID NO：27)、 DOM4-26(SEQ ID NO：28)、DOM4-27(SEQ ID NO：29)、DOM4-28 (SEQ ID NO：30)、DOM4-29(SEQ ID NO：31)、DOM4-31(SEQ ID NO：32)、DOM4-32(SEQ ID NO：33)、DOM4-33(SEQ ID NO：34)、 DOM4-34(SEQ ID NO：35)、DOM4-36(SEQ ID NO：36)、DOM4-37 (SEQ ID NO：37)、DOM4-38(SEQ ID NO：38)、DOM4-39(SEQ ID NO：39)、DOM4-40(SEQ ID NO：40)、DOM4-41(SEQ ID NO：41)、 DOM4-42(SEQ ID NO：42)、DOM4-44(SEQ ID NO：43)、DOM4-45 (SEQ ID NO：44)、DOM4-46(SEQ ID NO：45)、DOM4-49(SEQ ID NO：46)、DOM4-50(SEQ ID NO：47)、DOM4-74(SEQ ID NO：48)、 DOM4-75(SEQ ID NO：49)、DOM4-76(SEQ ID NO：50)、DOM4-78 (SEQ ID NO：51)、DOM4-79(SEQ ID NO：52)、DOM4-80(SEQ ID NO：53)、DOM4-81(SEQ ID NO：54)、DOM4-82(SEQ ID NO：55)、 DOM4-83(SEQ ID NO：56)、DOM4-84(SEQ ID NO：57)、DOM4-85 (SEQ ID NO：58)、DOM4-86(SEQ ID NO：59)、DOM4-87(SEQ ID NO：60)、DOM4-88(SEQ ID NO：61)、DOM4-89(SEQ ID NO：62)、 DOM4-90(SEQ ID NO：63)、DOM4-91(SEQ ID NO：64)、DOM4-92 (SEQ ID NO：65)、DOM4-93(SEQ ID NO：66)、DOM4-94(SEQ ID NO：67)、DOM4-95(SEQ ID NO：68)、DOM4-96(SEQ ID NO：69)、 DOM4-97(SEQ ID NO：70)、DOM4-98(SEQ ID NO：71)、DOM4-99 (SEQ ID NO：72)、DOM4-100(SEQ ID NO：73)、DOM4-101(SEQ ID NO：74)、DOM4-102(SEQ ID NO：75)、DOM4-103(SEQ ID NO：76)、DOM4-104(SEQ ID NO：77)、DOM4-105(SEQ ID NO：78)、DOM4-106(SEQ ID NO：79)、DOM4-107(SEQ ID NO：80)、DOM4-108(SEQ ID NO：81)、DOM4-109(SEQ ID NO：82)、DOM4-110(SEQ ID NO：83)、DOM4-111(SEQ ID NO：84)、DOM4-112(SEQ ID NO：85)、DOM4-113(SEQ ID NO：86)、DOM4-114(SEQ ID NO：87)、DOM4-115(SEQ ID NO：88)、DOM4-116(SEQ ID NO：89)、DOM4-117(SEQ ID NO：90)、DOM4-118(SEQ ID NO：91)、DOM4-119(SEQ ID NO：92)、DOM4-120(SEQ ID NO：93)、DOM4-121(SEQ ID NO：94)、DOM4-123(SEQ ID NO：166)、DOM4-124(SEQ ID NO：167)DOM4-125(SEQ ID NO：168)、DOM4-126(SEQ ID NO：169)、DOM4-127(SEQ ID NO：170)、DOM4-128(SEQ ID NO：171)、DOM4-129(SEQ ID NO：172)、DOM4-129-1(SEQ ID NO：173、)DOM4-129-2(SEQ ID NO：174)、DOM4-129-3(SEQ ID NO：175)、DOM4-129-4(SEQ ID NO：176)、DOM4-129-5(SEQ ID NO：177)、DOM4-129-6(SEQ ID NO：178)、DOM4-129-7(SEQ ID NO：179)、DOM4-129-8(SEQ ID NO：180)、DOM4-129-9(SEQ ID NO：181)、DOM4-129-10(SEQ ID NO：182)、DOM4-129-11(SEQ ID NO：183)、DOM4-129-12(SEQ ID NO：184)、DOM4-129-13 (SEQ ID NO：185)、DOM4-129-14(SEQ ID NO：186)、DOM4-129- 15(SEQ ID NO：187)、DOM4-129-16(SEQ ID NO：188)、DOM4- 129-17(SEQ ID NO：189)、DOM4-129-18(SEQ ID NO：190)、 DOM4-129-19(SEQ ID NO：191)、DOM4-129-20(SEQ ID NO：192)、DOM4-129-21(SEQ ID NO：193)、DOM4-129-22(SEQ ID NO：194)、DOM4-129-23(SEQ ID NO：195)、DOM4-129-24 (SEQ ID NO：196)、DOM4-129-25(SEQ ID NO：197)、DOM4-129- 26(SEQ ID NO：198)、DOM4-129-27(SEQ ID NO：199)、DOM4- 129-28(SEQ ID NO：200)、DOM4-129-29(SEQ ID NO：201)、 DOM4-129-31(SEQ ID NO：202)、DOM4-129-32(SEQ ID NO：203)、DOM4-129-33(SEQ ID NO：204)、DOM4-129-34(SEQ ID NO：205)、DOM4-129-35(SEQ ID NO：206)、DOM4-129-37 (SEQ ID NO：207)、DOM4-129-38(SEQ ID NO：208)、DOM4-129- 39(SEQ ID NO：209)、DOM4-129-40(SEQ ID NO：210)、DOM4- 129-41(SEQ ID NO：211)、DOM4-129-42(SEQ ID NO：212)、 DOM4-129-43(SEQ ID NO：213)、DOM4-129-44(SEQ ID NO：214)、DOM4-131(SEQ ID NO：347)、DOM4-132(SEQ ID NO：348)和DOM4-133(SEQ ID NO：349)。

优选地，所述dAb与选自下述的dAb竞争与IL-1R1的结 合：DOM4-122-23(SEQ ID NO：1)、DOM4-122-24(SEQ ID NO：2)、DOM4-122(SEQ ID NO：95)、DOM4-122-1(SEQ ID NO：96)、DOM4-122-2(SEQ ID NO：97)、DOM4-122-3(SEQ ID NO：98)、DOM4-122-4(SEQ ID NO：99)、DOM4-122-5(SEQ ID NO：100)、DOM4-122-6(SEQ ID NO：101)、DOM4-122-7(SEQ ID NO：102)、DOM4-122-8(SEQ ID NO：103)、DOM4-122-9(SEQ ID NO：104)、DOM4-122-10(SEQ ID NO：105)、DOM4-122-11(SEQ ID NO：106)、DOM4-122-12(SEQ ID NO：107)、DOM4-122-13 (SEQ ID NO：108)、DOM4-122-14(SEQ ID NO：109)、DOM4-122- 15(SEQ ID NO：110)、DOM4-122-16(SEQ ID NO：111)、DOM4- 122-17(SEQ ID NO：112)、DOM4-122-18(SEQ ID NO：113)、 DOM4-122-19(SEQ ID NO：114)、DOM4-122-20(SEQ ID NO：115)、DOM4-122-21(SEQ ID NO：116)、DOM4-122-22(SEQ ID NO：117)、DOM4-122-25(SEQ ID NO：118)、DOM4-122-26 (SEQ ID NO：119)、DOM4-122-27(SEQ ID NO：120)、DOM4-122- 28(SEQ ID NO：121)、DOM4-122-29(SEQ ID NO：122)、DOM4- 122-30(SEQ ID NO：123)、DOM4-122-31(SEQ ID NO：124)、 DOM4-122-32(SEQ ID NO：125)、DOM4-122-33(SEQ ID NO：126)、DOM4-122-34(SEQ ID NO：127)、DOM4-122-35(SEQ ID NO：128)、DOM4-122-36(SEQ ID NO：129)、DOM4-122-37 (SEQ ID NO：130)、DOM4-122-38(SEQ ID NO：131)、DOM4-122- 39(SEQ ID NO：132)、DOM4-122-40(SEQ ID NO：133)、DOM4- 122-41(SEQ ID NO：134)、DOM4-122-42(SEQ ID NO：135)、 DOM4-122-43(SEQ ID NO：136)、DOM4-122-44(SEQ ID NO：137)、DOM4-122-45(SEQ ID NO：138)、DOM4-122-46(SEQ ID NO：139)、DOM4-122-47(SEQ ID NO：140)、DOM4-122-48 (SEQ ID NO：141)、DOM4-122-49(SEQ ID NO：142)、DOM4-122- 50(SEQ ID NO：143)、DOM4-122-51(SEQ ID NO：144)、DOM4- 122-52(SEQ ID NO：145)、DOM4-122-54(SEQ ID NO：146)、 DOM4-122-55(SEQ ID NO：147)、DOM4-122-56(SEQ ID NO：148)、DOM4-122-57(SEQ ID NO：149)、DOM4-122-58(SEQ ID NO：150)、DOM4-122-59(SEQ ID NO：151)、DOM4-122-60 (SEQ ID NO：152)、DOM4-122-61(SEQ ID NO：153)、DOM4-122- 62(SEQ ID NO：154)、DOM4-122-63(SEQ ID NO：155)、DOM4- 122-64(SEQ ID NO：156)、DOM4-122-65(SEQ ID NO：157)、 DOM4-122-66(SEQ ID NO：158)、DOM4-122-67(SEQ ID NO：159)、DOM4-122-68(SEQ ID NO：160)、DOM4-122-69(SEQ ID NO：161)、DOM4-122-70(SEQ ID NO：162)、DOM4-122-71 (SEQ ID NO：163)、DOM4-122-72(SEQ ID NO：164)和DOM4-122- 73(SEQ ID NO：165)。

在其他实施方案中，所述dAb单体包含氨基酸序列，该氨基 酸序列与选自下列的氨基酸序列具有至少约90％的氨基酸序列一 致性：DOM4-122-23(SEQ ID NO：1)、DOM4-122-24(SEQ ID NO：2)、DOM4-122(SEQ ID NO：95)、DOM4-122-1(SEQ ID NO：96)、DOM4-122-2(SEQ ID NO：97)、DOM4-122-3(SEQ ID NO：98)、DOM4-122-4(SEQ ID NO：99)、DOM4-122-5(SEQ ID NO：100)、DOM4-122-6(SEQ ID NO：101)、DOM4-122-7(SEQ ID NO：102)、DOM4-122-8(SEQ ID NO：103)、DOM4-122-9(SEQ ID NO：104)、DOM4-122-10(SEQ ID NO：105)、DOM4-122-11(SEQ ID NO：106)、DOM4-122-12(SEQ ID NO：107)、DOM4-122-13 (SEQ ID NO：108)、DOM4-122-14(SEQ ID NO：109)、DOM4-122- 15(SEQ ID NO：110)、DOM4-122-16(SEQ ID NO：111)、DOM4- 122-17(SEQ ID NO：112)、DOM4-122-18(SEQ ID NO：113)、 DOM4-122-19(SEQ ID NO：114)、DOM4-122-20(SEQ ID NO：115)、DOM4-122-21(SEQ ID NO：116)、DOM4-122-22(SEQ ID NO：117)、DOM4-122-25(SEQ ID NO：118)、DOM4-122-26 (SEQ ID NO：119)、DOM4-122-27(SEQ ID NO：120)、DOM4-122- 28(SEQ ID NO：121)、DOM4-122-29(SEQ ID NO：122)、DOM4- 122-30(SEQ ID NO：123)、DOM4-122-31(SEQ ID NO：124)、 DOM4-122-32(SEQ ID NO：125)、DOM4-122-33(SEQ ID NO：126)、DOM4-122-34(SEQ ID NO：127)、DOM4-122-35(SEQ ID NO：128)、DOM4-122-36(SEQ ID NO：129)、DOM4-122-37 (SEQ ID NO：130)、DOM4-122-38(SEQ ID NO：131)、DOM4-122- 39(SEQ ID NO：132)、DOM4-122-40(SEQ ID NO：133)、DOM4- 122-41(SEQ ID NO：134)、DOM4-122-42(SEQ ID NO：135)、 DOM4-122-43(SEQ ID NO：136)、DOM4-122-44(SEQ ID NO：137)、DOM4-122-45(SEQ ID NO：138)、DOM4-122-46(SEQ ID NO：139)、DOM4-122-47(SEQ ID NO：140)、DOM4-122-48 (SEQ ID NO：141)、DOM4-122-49(SEQ ID NO：142)、DOM4-122- 50(SEQ ID NO：143)、DOM4-122-51(SEQ ID NO：144)、DOM4- 122-52(SEQ ID NO：145)、DOM4-122-54(SEQ ID NO：146)、 DOM4-122-55(SEQ ID NO：147)、DOM4-122-56(SEQ ID NO：148)、DOM4-122-57(SEQ ID NO：149)、DOM4-122-58(SEQ ID NO：150)、DOM4-122-59(SEQ ID NO：151)、DOM4-122-60 (SEQ ID NO：152)、DOM4-122-61(SEQ ID NO：153)、DOM4-122- 62(SEQ ID NO：154)、DOM4-122-63(SEQ ID NO：155)、DOM4- 122-64(SEQ ID NO：156)、DOM4-122-65(SEQ ID NO：157)、 DOM4-122-66(SEQ  ID  NO：158)、DOM4-122-67(SEQ ID NO：159)、DOM4-122-68(SEQ ID NO：160)、DOM4-122-69(SEQ ID NO：161)、DOM4-122-70(SEQ ID NO：162)、DOM4-122-71 (SEQ ID NO：163)、DOM4-122-72(SEQ ID NO：164)、DOM4-122- 73(SEQ ID NO：165)、DOM4-1(SEQ ID NO：8)、DOM4-2(SEQ ID NO：9)、DOM4-3(SEQ ID NO：10)、DOM4-4(SEQ ID NO：11)、 DOM4-5(SEQ ID NO：12)、DOM4-6(SEQ ID NO：13)、DOM4-7 (SEQ ID NO：14)、DOM4-8(SEQ ID NO：15)、DOM4-9(SEQ ID NO：16)、DOM4-10(SEQ ID NO：17)、DOM4-11(SEQ ID NO：18)、DOM4-12(SEQ ID NO：19)、DOM4-13(SEQ ID NO：20)、 DOM4-14(SEQ ID NO：21)、DOM4-15(SEQ ID NO：22)、DOM4-20 (SEQ ID NO：23)、DOM4-21(SEQ ID NO：24)、DOM4-22(SEQ ID NO：25)、DOM4-23(SEQ ID NO：26)、DOM4-25(SEQ ID NO：27)、 DOM4-26(SEQ ID NO：28)、DOM4-27(SEQ ID NO：29)、DOM4-28 (SEQ ID NO：30)、DOM4-29(SEQ ID NO：31)、DOM4-31(SEQ ID NO：32)、DOM4-32(SEQ ID NO：33)、DOM4-33(SEQ ID NO：34)、 DOM4-34(SEQ ID NO：35)、DOM4-36(SEQ ID NO：36)、DOM4-37 (SEQ ID NO：37)、DOM4-38(SEQ ID NO：38)、DOM4-39(SEQ ID NO：39)、DOM4-40(SEQ ID NO：40)、DOM4-41(SEQ ID NO：41)、 DOM4-42(SEQ ID NO：42)、DOM4-44(SEQ ID NO：43)、DOM4-45 (SEQ ID NO：44)、DOM4-46(SEQ ID NO：45)、DOM4-49(SEQ ID NO：46)、DOM4-50(SEQ ID NO：47)、DOM4-74(SEQ ID NO：48)、 DOM4-75(SEQ ID NO：49)、DOM4-76(SEQ ID NO：50)、DOM4-78 (SEQ ID NO：51)、DOM4-79(SEQ ID NO：52)、DOM4-80(SEQ ID NO：53)、DOM4-81(SEQ ID NO：54)、DOM4-82(SEQ ID NO：55)、 DOM4-83(SEQ ID NO：56)、DOM4-84(SEQ ID NO：57)、DOM4-85 (SEQ ID NO：58)、DOM4-86(SEQ ID NO：59)、DOM4-87(SEQ ID NO：60)、DOM4-88(SEQ ID NO：61)、DOM4-89(SEQ ID NO：62)、 DOM4-90(SEQ ID NO：63)、DOM4-91(SEQ ID NO：64)、DOM4-92 (SEQ ID NO：65)、DOM4-93(SEQ ID NO：66)、DOM4-94(SEQ ID NO：67)、DOM4-95(SEQ ID NO：68)、DOM4-96(SEQ ID NO：69)、 DOM4-97(SEQ ID NO：70)、DOM4-98(SEQ ID NO：71)、DOM4-99 (SEQ ID NO：72)、DOM4-100(SEQ ID NO：73)、DOM4-101(SEQ ID NO：74)、DOM4-102(SEQ ID NO：75)、DOM4-103(SEQ ID NO：76)、DOM4-104(SEQ ID NO：77)、DOM4-105(SEQ ID NO：78)、DOM4-106(SEQ ID NO：79)、DOM4-107(SEQ ID NO：80)、DOM4-108(SEQ ID NO：81)、DOM4-109(SEQ ID NO：82)、DOM4-110(SEQ ID NO：83)、DOM4-111(SEQ ID NO：84)、DOM4-112(SEQ ID NO：85)、DOM4-113(SEQ ID NO：86)、DOM4-114(SEQ ID NO：87)、DOM4-115(SEQ ID NO：88)、DOM4-116(SEQ ID NO：89)、DOM4-117(SEQ ID NO：90)、DOM4-118(SEQ ID NO：91)、DOM4-119(SEQ ID NO：92)、DOM4-120(SEQ ID NO：93)、DOM4-121(SEQ ID NO：94)、DOM4-123(SEQ ID NO：166)、DOM4-124(SEQ ID NO：167)DOM4-125(SEQ ID NO：168)、DOM4-126(SEQ ID NO：169)、DOM4-127(SEQ ID NO：170)、DOM4-128(SEQ ID NO：171)、DOM4-129(SEQ ID NO：172)、DOM4-129-1(SEQ ID NO：173、)DOM4-129-2(SEQ ID NO：174)、DOM4-129-3(SEQ ID NO：175)、DOM4-129-4(SEQ ID NO：176)、DOM4-129-5(SEQ ID NO：177)、DOM4-129-6(SEQ ID NO：178)、DOM4-129-7(SEQ ID NO：179)、DOM4-129-8(SEQ ID NO：180)、DOM4-129-9(SEQ ID NO：181)、DOM4-129-10(SEQ ID NO：182)、DOM4-129-11(SEQ ID NO：183)、DOM4-129-12(SEQ ID NO：184)、DOM4-129-13 (SEQ ID NO：185)、DOM4-129-14(SEQ ID NO：186)、DOM4-129- 15(SEQ ID NO：187)、DOM4-129-16(SEQ ID NO：188)、DOM4- 129-17(SEQ ID NO：189)、DOM4-129-18(SEQ ID NO：190)、 DOM4-129-19(SEQ ID NO：191)、DOM4-129-20(SEQ ID NO：192)、DOM4-129-21(SEQ ID NO：193)、DOM4-129-22(SEQ ID NO：194)、DOM4-129-23(SEQ ID NO：195)、DOM4-129-24 (SEQ ID NO：196)、DOM4-129-25(SEQ ID NO：197)、DOM4-129- 26(SEQ ID NO：198)、DOM4-129-27(SEQ ID NO：199)、DOM4- 129-28(SEQ ID NO：200)、DOM4-129-29(SEQ ID NO：201)、 DOM4-129-31(SEQ ID NO：202)、DOM4-129-32(SEQ ID NO：203)、DOM4-129-33(SEQ ID NO：204)、DOM4-129-34(SEQ ID NO：205)、DOM4-129-35(SEQ ID NO：206)、DOM4-129-37 (SEQ ID NO：207)、DOM4-129-38(SEQ ID NO：208)、DOM4-129- 39(SEQ ID NO：209)、DOM4-129-40(SEQ ID NO：210)、DOM4- 129-41(SEQ ID NO：211)、DOM4-129-42(SEQ ID NO：212)、 DOM4-129-43(SEQ ID NO：213)、DOM4-129-44(SEQ ID NO：214)、DOM4-131(SEQ ID NO：347)、DOM4-132(SEQ ID NO：348)和DOM4-133(SEQ ID NO：349)。

优选地，所述dAb单体包含氨基酸序列，该氨基酸序列与选 自下列的氨基酸序列具有至少约90％氨基酸序列一致性：DOM4- 122-23(SEQ ID NO：1)、DOM4-122-24(SEQ ID NO：2)、DOM4-122 (SEQ ID NO：95)、DOM4-122-1(SEQ ID NO：96)、DOM4-122-2 (SEQ ID NO：97)、DOM4-122-3(SEQ ID NO：98)、DOM4-122-4 (SEQ ID NO：99)、DOM4-122-5(SEQ ID NO：100)、DOM4-122-6 (SEQ ID NO：101)、DOM4-122-7(SEQ ID NO：102)、DOM4-122-8 (SEQ ID NO：103)、DOM4-122-9(SEQ ID NO：104)、DOM4-122-10 (SEQ ID NO：105)、DOM4-122-11(SEQ ID NO：106)、DOM4-122- 12(SEQ ID NO：107)、DOM4-122-13(SEQ ID NO：108)、DOM4- 122-14(SEQ ID NO：109)、DOM4-122-15(SEQ ID NO：110)、 DOM4-122-16(SEQ ID NO：111)、DOM4-122-17(SEQ ID NO：112)、DOM4-122-18(SEQ ID NO：113)、DOM4-122-19(SEQ ID NO：114)、DOM4-122-20(SEQ ID NO：115)、DOM4-122-21 (SEQ ID NO：116)、DOM4-122-22(SEQ ID NO：117)、DOM4-122- 25(SEQ ID NO：118)、DOM4-122-26(SEQ ID NO：119)、DOM4- 122-27(SEQ ID NO：120)、DOM4-122-28(SEQ ID NO：121)、 DOM4-122-29(SEQ ID NO：122)、DOM4-122-30(SEQ ID NO：123)、DOM4-122-31(SEQ ID NO：124)、DOM4-122-32(SEQ ID NO：125)、DOM4-122-33(SEQ ID NO：126)、DOM4-122-34 (SEQ ID NO：127)、DOM4-122-35(SEQ ID NO：128)、DOM4-122- 36(SEQ ID NO：129)、DOM4-122-37(SEQ ID NO：130)、DOM4- 122-38(SEQ ID NO：131)、DOM4-122-39(SEQ ID NO：132)、 DOM4-122-40(SEQ ID NO：133)、DOM4-122-41(SEQ ID NO：134)、DOM4-122-42(SEQ ID NO：135)、DOM4-122-43(SEQ ID NO：136)、DOM4-122-44(SEQ ID NO：137)、DOM4-122-45 (SEQ ID NO：138)、DOM4-122-46(SEQ ID NO：139)、DOM4-122- 47(SEQ ID NO：140)、DOM4-122-48(SEQ ID NO：141)、DOM4- 122-49(SEQ ID NO：142)、DOM4-122-50(SEQ ID NO：143)、 DOM4-122-51(SEQ ID NO：144)、DOM4-122-52(SEQ ID NO：145)、DOM4-122-54(SEQ ID NO：146)、DOM4-122-55(SEQ ID NO：147)、DOM4-122-56(SEQ ID NO：148)、DOM4-122-57 (SEQ ID NO：149)、DOM4-122-58(SEQ ID NO：150)、DOM4-122- 59(SEQ ID NO：151)、DOM4-122-60(SEQ ID NO：152)、DOM4- 122-61(SEQ ID NO：153)、DOM4-122-62(SEQ ID NO：154)、 DOM4-122-63(SEQ ID NO：155)、DOM4-122-64(SEQ ID NO：156)、DOM4-122-65(SEQ ID NO：157)、DOM4-122-66(SEQ ID NO：158)、DOM4-122-67(SEQ ID NO：159)、DOM4-122-68 (SEQ ID NO：160)、DOM4-122-69(SEQ ID NO：161)、DOM4-122- 70(SEQ ID NO：162)、DOM4-122-71(SEQ ID NO：163)、DOM4- 122-72(SEQ ID NO：164)和DOM4-122-73(SEQ ID NO：165)。

优选地，所述dAb单体与人IL-1R1结合的亲和力常数 (KD)为约300nM至约5pM，由表面等离子体共振测定。

另一方面，本发明涉及包括dAb单体和半衰期延长部分的配 体，该dAb单体特异性结合白细胞介素-1受体1型(IL-1R1)， 抑制白细胞介素-1(IL-1，例如白细胞介素-1α(IL-1α)和/或白 细胞介素-1β(IL-1β))与受体的结合，但不抑制白细胞介素-1 受体拮抗剂(IL-1ra)与IL-1R1的结合。该半衰期延长部分可以 是聚烷撑二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白或其转铁蛋 白结合部分、或包含与延长体内半衰期的多肽结合的位点的抗体 或抗体片段。在一些实施方案中，该半衰期延长部分是包含与血 清白蛋白或新生儿Fc受体结合的位点的抗体或抗体片段。在具体 实施方案中，所述半衰期延长部分是一个免疫球蛋白单可变域， 其与本文公开的抗血清白蛋白dAb竞争与人血清白蛋白的结合。 在其他具体实施方案中，半衰期延长部分是包含一氨基酸序列的 免疫球蛋白单可变域，所述氨基酸序列有至少90％的氨基酸序列 与本文公开的抗血清白蛋白dAb的氨基酸序列相同。

在进一步具体实施方案中，本发明是包括与IL-1R1特异性 结合，并抑制IL-1和受体结合，但不抑制IL-1ra和IL-1R1结合 的dAb单体的配体，其中所述dAb单体选自DOM4-122-23和 DOM4-122-24。该配体可以是例如dAb单体或所述dAb单体的同 源二聚体、同源三聚体或同源寡聚体。该配体可以进一步包括与 血清白蛋白如DOM7h-8结合的dAb单体。例如在一些实施方案 中，该配体包括DOM4-122-23和DOM7h-8，或包括DOM-122-24 和DOM7h-8。

在其他具体实施方案中，本发明是一种配体，其包括与IL- 1R1特异性结合，并抑制IL-1和受体结合，但不抑制IL-1ra与 IL-1R1结合的dAb单体，以及和肿瘤坏死因子受体1(TNFR1) 特异性结合的dAb单体。如果需要，所述配体可以进一步包括半 衰期延长部分。

优选地，所述对TNFR1具有结合特异性的dAb单体与本文 公开的抗TNFR1 dAb竞争与TNFR1的结合。在一些实施方案 中，所述对TNFR1具有结合特异性的dAb单体包含氨基酸序 列，该氨基酸序列与本文公开的抗TNFR1 dAb的氨基酸序列具有 至少90％的氨基酸序列一致性。

本发明还涉及编码dAb单体或配体的分离的或重组核酸，以 及包括所述重组核酸的载体(如表达载体)。本发明还涉及包括 重组核酸或载体的宿主细胞，以及一种制备配体或dAb单体的方 法，该方法包括在适合编码本发明的配体或dAb单体的核酸表达 的条件下使本发明的宿主细胞保持稳定。

本发明还涉及包括dAb单体或配体，以及生理学上可接受载 体的药物组合物。例如一种静脉注射、肌肉注射、腹腔内、动脉 内、鞘内注射、关节内、皮下、肺部、鼻腔内、阴道或直肠给药   的药物组合物。

本发明还涉及一种包括本发明药物组合物的给药装置。例如 所述给药装置可以是非肠道给药装置、静脉注射给药装置、肌肉 注射给药装置、腹腔内给药给药装置、透皮给药装置、肺部给药 装置、动脉内给药装置、鞘内注射给药装置、关节内给药装置、 皮下给药装置、鼻腔内给药装置、阴道给药装置或直肠给药装 置。这种给药装置的例子包括注射器、透皮给药装置(如贴 片)、胶囊、片剂、喷雾器、吸入器、雾化器、气雾器、起雾 器、干粉吸入器、定量吸入器、定量喷雾器、定量起雾器、定量 雾化器和导管。

本发明还涉及一种治疗炎症疾病的方法，其包括将治疗有效 量的本发明的dAb单体或配体施用于对其有需要的受试者。

本发明还涉及用于治疗、诊断和/或预防的本发明的dAb单体 或配体，以及本发明的dAb单体或配体在制备治疗本文所述疾病 (如炎症疾病、关节炎、呼吸疾病)的药物中的应用。

本发明还涉及治疗疾病(如炎症疾病、关节炎、呼吸疾病) 的方法，其包括将治疗有效量的耐蛋白酶降解的dAb单体施用于 对其有需要的受试者。

本发明还涉及耐蛋白酶降解，用于治疗、诊断或预防的dAb 单体，以及本发明的此种dAb单体在制备治疗本文所述疾病(如 炎症疾病、关节炎、呼吸疾病)的药物中的应用。

附图简述

图1是体外检测结果图，其中检测dAbs抑制IL-1诱导的经 培养MRC-5细胞(ATCC目录号CCL-171)释放IL-8的能力。 图1显示在此种细胞检测中被称为DOM4-122和DOM-129的抗 IL-1R1 dAb的剂量反应曲线。这两种dAb的ND50值为约1μM。

图2是体外检测结果图，其中检测了经历亲和力成熟的dAbs 抑制IL-1诱导的经培养MRC-5细胞(ATCC目录号CCL-171) 释放IL-8的能力。图2是DOM4-122-6、DOM4-129-1、DOM4- 122-23和IL-1ra的剂量反应曲线。DOM4-122-6和DOM4-122-23 是DOM4-122的亲和力成熟变体，DOM4-129-1是DOM4-129的 亲和力成熟变体。检测中DOM4-122-6和DOM4-129-1的ND50都 是约10nM。检测中DOM4-122-23的ND50为约1nM。

图3A和3B是传感图，显示DOM4-122-23(图3A)而非 IL-1α(图3B)与已经和IL-1ra结合的IL-1R1结合。IL-1ra被注 入并流经固定化的IL-1R1的表面，与固定化的受体结合(注射 1，在图3A和3B中从0至60秒)。然后注入或DOM4-122-23 或IL-1a(注射2，在图3A和3B中从60至120秒)。在传感图 中可以看出，是DOM4-122-23，而非IL-1α与已经和IL-1ra结合 的IL-1R1结合。

图4显示在竞争性结合ELISA中，浓度增加的DOM4-122-23 不抑制IL-1ra和IL-1R1结合，但检测中IL-1α抑制IL-1ra与IL- 1R1结合。浓度增加的DOM4-122-23或IL-1α与500pM IL-1ra混 合，混合物被加到IL-1R1包被的ELISA板上。

图5A-5Z图解了与人IL-1R1结合的几种人dAbs的氨基酸序 列。在一些所述序列中，CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸加了下 划线。

图6A-6Z、6AA-6ZZ、6AAA和6BBB图解了编码图5A-5Z 所示人dAbs的核酸的核苷酸序列。在一些所述序列中，编码 CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸加了下划线。

图7A是通过与小鼠血清白蛋白(MSA)结合而选得的三种 Vκs的氨基酸序列的比对。所述经比对的氨基酸序列来自被称为 MSA16、MSA 12和MSA 26的Vκs，MSA16也被称作DOM7m- 16(SEQ ID NO：723)、MSA 12也被称作DOM7m-12(SEQ ID NO：724)，MSA 26也被称作DOM7m-26(SEQ ID NO：725)。

图7B是通过与大鼠血清白蛋白(RSA)结合选得的六种Vκs 的氨基酸序列的比对。所述经比对的氨基酸序列来自被称为 DOM7r-1(SEQ ID NO：726)、DOM7r-3(SEQ ID NO：727)、DOM7r- 4(SEQ ID NO：728)、DOM7r-5(SEQ ID NO：729)、DOM7r-7(SEQ ID NO：730)和DOM7r-8(SEQ ID NO：731)的Vκs。

图7C是通过与人血清白蛋白(HSA)结合选得的六种Vκs 的氨基酸序列的比对。所述经比对的氨基酸序列来自称为 DOM7h-2(SEQ ID NO：732)、DOM7h-3(SEQ ID NO：733)、 DOM7h-4(SEQ ID NO：734)、DOM7h-6(SEQ ID NO：735)、 DOM7h-1(SEQ ID NO：736)和DOM7h-7(SEQ ID NO：737)的Vκs。

图7D是通过与人血清白蛋白的结合选得的七种VHs的氨基 酸序列的比对以及共有序列(SEQ ID NO：738)。所述经比对的氨 基酸序列来自被称为DOM7h-22(SEQ ID NO：739)、DOM7h-23 (SEQ ID NO：740)、DOM7h-24(SEQ ID NO：741)、DOM7h-25 (SEQ ID NO：742)、DOM7h-26(SEQ ID NO：743)、DOM7h-21 (SEQ ID NO：744)和DOM7h-27(SEQ ID NO：745)的VHs。

图7E是通过与人血清白蛋白(HSA)以及大鼠血清白蛋白结 合选得的三种Vκs的氨基酸序列的比对。所述经比对的氨基酸序 列来自被称为DOM7h-8(SEQ ID NO：746)、DOM7r-13(SEQ ID NO：747)和DOM7r-14(SEQ ID NO：748)的Vκs。

图8图解了通过与大鼠血清白蛋白(RSA)结合选得的Vκs 的氨基酸序列。该图解序列来自被称为DOM7r-15(SEQ ID NO：749)、DOM7r-16(SEQ ID NO：750)、DOM7r-17(SEQ ID NO：751)、DOM7r-18(SEQ ID NO：752)和DOM7r-19(SEQ ID NO：753)的Vκs。

图9A-9B图解了与大鼠血清白蛋白(RSA)结合的VHs的氨 基酸序列。该图解序列来自被称为DOM7r-20(SEQ ID NO：754)、 DOM7r-21(SEQ ID NO：755)、DOM7r-22(SEQ ID NO：756)、 DOM7r-23(SEQ ID NO：757)、DOM7r-24(SEQ ID NO：758)、 DOM7r-25(SEQ ID NO：759)、DOM7r-26(SEQ ID NO：760)、 DOM7r-27(SEQ ID NO：761)、DOM7r-28(SEQ ID NO：762)、 DOM7r-29(SEQ ID NO：763)、DOM7r-30(SEQ ID NO：764)、 DOM7r-31(SEQ ID NO：765)、DOM7r-32(SEQ ID NO：766)和 DOM7r-33(SEQ ID NO：767)的VHs。

图10图解了与WO 2004/041862中公开的小鼠血清白蛋白结 合的几种驼类(Camelid)VHHs的氨基酸序列。序列A(SEQ ID NO：768)、序列B(SEQ ID NO：769)、序列C(SEQ ID NO：770)、 序列D(SEQ ID NO：771)、序列E(SEQ ID NO：772)、序列F (SEQ ID NO：773)、序列G(SEQ ID NO：774)、序列H(SEQ ID NO：775)、序列I(SEQ ID NO：776)、序列J(SEQ ID NO：777)、序 列K(SEQ ID NO：778)、序列L(SEQ ID NO：779)、序列M(SEQ ID NO：780)、序列  N(SEQ ID NO：781)、序列O(SEQ ID NO：782)、序列P(SEQ ID NO：783)、序列Q(SEQ ID NO：784)。

图11A-11V图解了能与人TNFR1特异性结合的几种人免疫 球蛋白可变域的氨基酸序列。所述氨基酸序列是连续的没有空 位；符号～已被插入所述序列中，表示互补决定区(CDRs)的位 置。CDR1两侧是～，CDR2两侧是～～，以及CDR3两侧是～～～。

图12A-12B图解了能与小鼠TNFR1特异性结合的几种人免 疫球蛋白可变域的氨基酸序列。所述氨基酸序列是连续的没有空 位；符号～已被插入一些序列中，表示互补决定区(CDRs)的位 置。CDR1两侧是～，CDR2两侧是～～，以及CDR3两侧是～～～。

发明详述

本说明书结合供参考的实施方案以清楚和简洁的方式描述了 本发明。实施方案可有不同组合或拆分，并不偏离本发明，这是 本文的意图所在并应被理解。

本文所用的术语“配体”指包括与所需靶标特异性结合的域的 多肽。优选地，所述结合域是与所需靶抗原(如受体蛋白)特异 性结合的免疫球蛋白单可变域(如VH、VL、VHH)。所述结合域 还可以包括与合适形式的所需靶抗原特异性结合的免疫球蛋白单 可变域的一种或多种互补决定区(CDRs)，使得所述结合域与所 述靶抗原特异性结合。例如，所述CDRs可移植到合适的蛋白质 支架或骨架上，如亲和体、SpA支架、LDL受体A类域或EGF 域。此外，配体可以如本文所述是单价的(如dAb单体)、二价 的(同型二价、异型二价)或多价的(同型多价、异型多价)。 因此如本文所述“配体”包括由dAb组成的多肽，包括实质上由此 种dAb组成的多肽，包括合适形式的dAb(或dAb的CDRs)、 双特异性配体和多特异性配体的多肽，其中所述合适形式的dAb (或dAb的CDRs)如抗体形式(例如IgG样形式、scFv、Fab、 Fab’、F(ab’)2)或适合的蛋白支架或骨架，如亲和体、SpA支 架、LDL受体A类域或EGF域，所述双特异性配体包括与第一 靶蛋白、抗原或表位(如IL-1R1或TNFR1)结合的dAb，以及 与另一靶蛋白、抗原或表位(如血清白蛋白)结合的第二dAb。 结合域还可以是包括所需靶标结合位点的蛋白域，如选自亲和 体、SpA域、LDL受体A类域、EGF域和Avimer的蛋白域(参 见例如美国专利申请公开号2005/0053973、2005/0089932、 2005/0164301)。

“免疫球蛋白单可变域”指独立于其他V区或V域而特异性结 合抗原或表位的抗体可变域(VH，VHH，VL)；但是本文所用的免 疫球蛋白单可变域可以以与其他可变区或可变域一起的形式(如 同源或异源多聚体)出现，其他可变区或可变域对单免疫球蛋白 可变域结合的抗原来说不是必须的(即免疫球蛋白单可变域结合 抗原无需另外的可变域)。“免疫球蛋白单可变域”不仅包括分离 的抗体单可变域多肽，还包括含有一种或多种抗体单可变域多肽 序列的一种或多种单体。“域抗体”或“dAb”与本文所用的“免疫球 蛋白单可变域”多肽是相同的。本文所用的免疫蛋白单可变域多肽 指哺乳类免疫球蛋白单可变域多肽，优选人，但还包括啮齿类 (如WO 00/29004中公开的，其全部内容在此引作参考)或驼类 (Camelid)VHH dAbs。驼类(Camelid)  dAbs是来源于包括骆 驼、大羊驼、羊驼、单峰驼和原驼的种的免疫球蛋白单可变域多 肽，包括轻链天然缺失的重链抗体：VHH。VHH分子比IgG分子约 小10倍，作为单(域)多肽，它们非常稳定，可抗极端pH和温 度条件。

本文所用的术语“剂量”指一次(单位剂量)，或确定时间间 隔的两次或多次施用于受试者的药物(如抗IL-1R1 dAb、TNFR1 拮抗剂)的量。例如，剂量指一天(24小时)(每日剂量)、两 天、一周、两周、三周或一个或多个月(例如通过一次给药，或 通过两次或更多次给药)的过程中施用于受试者的药物(如抗IL- 1R1 dAb、TNFR1拮抗剂)的量。剂量间的时间间隔可以是任何 所需的时间量。

当两种免疫球蛋白域属于形成同源对或组的结构家族或是来 源于此种家族并保留此特征时，它们是“互补的”。例如，抗体的 VH域和VL域是互补的；两个VH域不是互补的，两种VL不是互 补的。可在免疫球蛋白超家族分子的其他成员中发现互补域，比 如T细胞受体的Vα和Vβ(或γ和δ)域。人工的域，例如除非 设计成与表位结合，否则不和表位结合的基于蛋白支架的域，是 非互补的。同样地，基于(例如)免疫球蛋白域和纤维连接蛋白 域的两个域不是互补的。

“免疫球蛋白”指保留了抗体分子的免疫球蛋白折叠特征的多 肽家族，抗体分子包含两个β折叠片，并通常含有保守二硫键。免 疫球蛋白超家族成员涉及体内细胞和非细胞间相互作用的许多方 面，包括在免疫系统中的普遍作用(例如抗体、T细胞受体分子 等)，涉及细胞粘附(例如ICAM分子)和细胞内信号转导(例 如受体分子，如PDGF受体)。本发明适用于所有具有结合区的 免疫球蛋白超家族分子。优选地，本发明涉及抗体。

“域(domain)”指保留其三级结构的折叠蛋白结构，该三级 结构独立于蛋白的其他部分。通常域是造成蛋白不连续的功能性 质的原因，在许多情况下域可能会增加，去除，或转移到其他蛋 白而不丧失蛋白剩余部分和/或域的功能。“单抗体可变域”是包括 抗体可变域序列特征的折叠多肽域。因此它包括完整的抗体可变 域和经修饰的可变域，例如其中一种或多种已被抗体可变域非特 征序列所取代的环，或已被截断的或包括N或C端延伸的抗体可 变域，以及至少部分保留全长域的结合活性和特异性的可变域折 叠片段。

术语“库”指不同变体的集合，例如多肽的变体，其一级结构 有差异。本发明所用的文库涵盖了包括至少1000种成员的多肽 库。

术语“文库”指异质多肽或核酸的混合物。库由成员组成，每 个成员都有单独的多肽或核酸序列。在这层意义上，“文库“与 “库”意思是相同的。文库成员间序列差异是造成库多样性的原 因。文库可以采用多肽或核酸的简单混合物的形式，也可以是用 核酸库进行转化的机体或细胞的形式，例如细菌、病毒、动物或 植物细胞等。优选地，每种个体有机体或细胞包含仅一种或有限 数量的文库成员。有利的是所述核酸包含在表达载体中，以允许 该核酸编码的多肽的表达。因此优选地文库可采用宿主有机体种 群的形式，每种有机体包含表达载体的一个或多个拷贝，该表达 载体含有核酸形式的文库单个成员，所述核酸能表达生成其相应 的多肽成员。因此宿主有机体的种群有可能编码基因多样性多肽 变体的大库。

“抗体”(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)或片段(如 Fab、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合式构象多特异性 抗体、二硫键连接的scFv、双价抗体)不管从任何物种自然产 生，由重组DNA技术创造而来，还是从血清、B细胞、杂交瘤、 转染瘤、酵母或细菌分离得到都是可以的。

“双特异性配体”是包括本文定义的第一免疫球蛋白单可变域 和第二免疫球蛋白单可变域的配体，其中可变域能与通常不被单 特异性免疫球蛋白结合的两种不同的抗原或相同抗原上的两种表 位结合。例如，所述两种表位可以在相同的半抗原上，但不是相 同的表位，或没有接近到能被单特异性配体结合。根据本发明的 双特异性配体是由具有不同特异性的可变域组成的，并且不包含 相互补的具有相同特异性的可变域对。双特异性配体和制备双特 异性配体的合适方法在WO 2004/058821、WO 2004/003019和 WO 03/002609中公开，这些已出版的国际申请的全部教导都在此 引作参考。

“抗原”是与根据本发明的配体结合的分子。典型地，抗原与 抗体配体结合，能提高抗体的体内应答。抗原可以是多肽、蛋 白、核酸或其他分子。一般来说，对根据本发明的双特异性配体 进行选择以得到特异性针对特定抗原的靶标。至于常规抗体和其 片段，由可变的环(L1、L2、L3和H1、H2、H3)定义的抗体结 合位点能与抗原结合。

“表位”是与免疫球蛋白VH/VL对常规结合的结构单元。表位 指抗体的最小结合位置，因此表现为抗体的特异性靶标。至于单 域抗体，表位指与分离的可变域结合的结构单元。

“通用框架”是单抗体框架序列，与Kabat定义的抗体保守序 列区(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，美国卫生 和福利部)相对应，或与Chothia and Lesk，(1987)J.Mol.Biol. 196：910-917.定义的人种系免疫球蛋白库或结构相对应。本发明提 供了单个框架或一套这种框架的用途，已经发现虽然变化仅发生 在高可变域，但所述框架允许衍生出几乎所有结合特异性。

“半衰期”指体内配体的血清浓度降低50％所需的时间，例如 由于自然机制的配体降解和/或配体清除或多价螯合。本发明的配 体通过与抗降解和/或清除或多价螯合的分子结合，在体内稳定， 半衰期延长。典型地，此种分子是自然生成的蛋白，其本身在体 内半衰期长。与对半衰期增加的分子无特异性的类似配体相比， 如果一种配体的功能活性持续更长的一段时间，则其半衰期增 加。因此，把对HSA和靶标分子有特异性的配体，和对HSA无 特异性，不与HSA结合而与另一分子结合的相同配体，进行比 较。例如配体可以与靶标分子上的第二个表位结合。典型地，半 衰期增加10％、20％、30％、40％、50％或更多。增加范围为2x、 3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x或更多倍的半衰期是可 能的。或者或此外，增加范围为高达30x、40x、50x、60x、 70x、80x、90x、100x、150x或更多倍的半衰期是可能的。

本文提及的术语“竞争”是指当第二表位与其同源表位结合域 结合时，第一表位与其同源表位结合域的结合受到抑制。例如结 合可受到立体抑制，比如通过结合域的物理阻断，或通过改变结 合域的结构或环境，这样结合域对表位的亲和力降低。

氨基酸和核苷酸序列的比对、同源性、相似性或一致性，如 本文所定义优选采用BLAST 2序列算法和预设参数(Tatusova，T. A.et al.，FEMS Microbiol Lett，174：187-188(1999))来处理及确 认。或者采用BLAST算法(版本2.0)进行序列比对，参数设为 预设值。BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，基本的局部 比对搜索工具)是程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx采 用的渐进搜索算法；这些程序的有效性归因于使用Karlin and Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(6)：2264-8的统计学方 法得到的结果。

本发明涉及与IL-1R1结合，并抑制IL-1(如  IL-1α和/或 IL-1β)与受体结合，但不抑制IL-1ra与IL-IR1结合的dAb单 体，以及包含此种dAb单体的配体。这种配体和dAb单体可用作 治疗剂，治疗炎症、疾病或其他全部或部分由IL-1与IL-1R1结 合诱导的生物学功能所介导的疾病(如局部或全身性炎症，炎症 介质的产生(如IL-6、I1-8、TNF)，发烧，免疫细胞的激活(如 淋巴细胞、中性粒细胞)，厌食症，低血压，白细胞减少，血小 板减少)。本发明的配体或dAb单体可与IL-1R1结合，并抑制 IL-1R1功能。本发明的配体或dAb单体可与IL-1R1结合，并抑 制IL-1R1的功能而不影响内源性IL-1R1抑制途径，如内源性IL- 1ra和内源性IL-1R1的结合。因此，这种配体或dAb单体可施 用于受试者，以补充抑制体内IL-1R1或IL-1活性的内源性调节 途径。此外，与IL-1R1结合，不抑制IL-1ra和IL-1R1结合的配 体或dAb单体作为诊断试剂是有利的，因为它们可用于结合、检 测、定量或测量样本中的IL-1R1，并且不会与样本中的IL-1ra竞 争与IL-1R1的结合。因此，可以准确测定样本中是否有以及有多 少IL-1R1。

与IL-1R1结合，抑制IL-1  (如IL-1α和/或IL-1β)与受体结 合，但不抑制IL-1ra与IL-1R1结合的dAb单体，还可以用作研 究工具。例如，这样的dAb单体可用于鉴别与IL-1R1结合，但 不抑制IL-1ra和IL-1R1结合的物质(如其他dAb、小的有机分 子)。在一个说明性的实施例中，在竞争性IL-1R1受体结合检 测，例如本文所述的受体结合检测中，检测了一物质或物质集合 抑制IL-1和IL-1R1结合的能力。随后在类似的竞争性IL-1R1受 体结合检测中，研究了抑制IL-1与IL-1R1结合的物质，以明了 其是否会和与IL-1R1结合但不抑制IL-1ra和IL-1R1结合的dAb 单体竞争。这样一种检测中的竞争性结合表明，该物质与IL-1R1 结合，抑制IL-1与受体结合，但不抑制IL-1ra与受体结合。

与IL-1R1结合的配体和dAb单体

本发明提供包含与IL-1R1结合的dAb的配体(例如包括这种 dAb，dAb单体的双特异性配体)，dAb与IL-1R1结合的的Kd为 300nM至5pM(即3 x 10-7至5 x 10-12M)，优选50nM至20 pM，更优选5nM至200pM，最优选1nM至100pM，例如1 x 10-7M或更少，优选1 x 10-8M或更少，更优选1 x 10-9M或更 少，有利的是1 x 10-10M或更少，最优选1 x 10-11M或更少；和/ 或Koff速率常数为5 x 10-1s-1至1 x 10-7s-1，优选1 x 10-2s-1至1 x 10-6s-1，更优选5 x 10-3s-1至1 x 10-5s-1，例如5 x 10-1s-1或更 少，优选1 x 10-2s-1或更少，有利的是1 x 10-3s-1或更少，更优选 1 x 10-4s-1或更少，还更优选1 x 10-5s-1或更少，最优选1 x 10-6s-1 或更少，以上由表面等离子体共振测定。

优选地，配体或dAb单体抑制IL-1(即IL-1α和/或IL-1β) 与IL-1R1结合，例如在受体结合检测中，半数抑制浓度 (IC50)等于或小于约1μM，例如IC50为约500nM至约50 pM，优选约100nM至约50pM，更优选约10nM至约100pM， 有利的是约1nM至约100pM；例如约50nM或更少，优选约5 nM或更少，更优选约500pM或更少，有利的是约200pM或更 少，最优选100pM或更少。

优选地，配体或dAb与人IL-1R1结合，抑制人IL-1(即 IL-1α和/或IL-1β)与人IL-1R1结合，并抑制与IL-1结合后通过 人IL-1R1的信号传导应答。

优选地，配体或dAb单体在标准检测中(如IL-1诱导的 MRC-5细胞释放白细胞介素-8，IL-1诱导的全血细胞释放白细胞 介素-6)中和(抑制其活性)IL-1或IL-1R1，半数中和量 (ND50)少于或等于约1μM，例如ND50约500nM至约50 pM，优选约100nM至约50pM，更优选约10nM至约100pM， 有利的是约1nM至约100pM；例如约50nM或更少，优选约5 nM或更少，更优选约500pM或更少，有利的是约200pM或更 少，最优选约100pM或更少。例如，在体内检测中配体或dAb 单体可抑制IL-1诱导的(如IL-1α或IL-1β诱导的)MRC-5细胞 (ATCC检索号No.CCL-171)释放白细胞介素-8，ND50≤10 μM、≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤500pM、≤300 pM、≤100pM或≤10pM。在另一实施例中，在体外全血检测中 配体或dAb单体可抑制IL-1诱导的(如IL-1α或IL-1β诱导的) 白细胞介素-6的释放，ND50≤10μM、≤1μM、≤100nM、≤10 nM、≤1nM、≤500pM、≤300pM、≤100pM或≤10pM。

如本文所述，配体可以是单价的(例如dAb单体)或多价的 (例如双特异性的、多特异性的)。在具体实施方案中，配体是与 人IL-1R1结合dAb单体，并包含如聚烷撑二醇部分的半衰期延 长部分(如本文所述)。

在其他实施方案中，配体是多价的并包含两种或多种与IL- 1R1结合的dAb单体。多价的配体可以包含两个或多个与IL-1R1 结合的特定dAb拷贝，或包含两种或多种与IL-1R1结合的 dAb。例如，如本文所述，配体可以是包括两个或多个与IL-1R1 结合的特定dAb拷贝的二聚体、三聚体或多聚体，或可以包括两 种或多种与IL-1R1结合的不同dAb。在一些实施例中，配体分别 是包括两种或三种与IL-1R1结合的特定dAb拷贝的同型二聚体或 同型三聚体。优选地，在标准细胞检测中多价配体基本上不激动 IL-1R1(用作IL-1R1激动剂)(即配体浓度为1nM、10nM、 100nM、1μM、10μM、100μM、1000μM或5,000μM时，在 检测中产生不超过约5％的由IL-1(100pg/ml)诱导，IL-1R1介 导的活性)。

在某些实施方案中，多价配体包含两种或多种与IL-1R1所需 表位或域结合的dAb。例如多价配体可包括两个或多个和IL-1ra 竞争与IL-1R1结合的dAb拷贝。在另一实施例中，多价配体可 包括两个或多个不和IL-1ra竞争与IL-1R1结合的dAb拷贝。

在其他实施方案中，多价配体包含两种或多种与IL-1R1的不 同表位或域结合的dAb。在一个实施例中，多价配体包括与IL- 1R1第一表位结合的第一dAb，和与IL-1R1第二不同表位结合的 第二dAb。这种类型的配体可以以高亲和力与IL-1R1结合，并且 与其他配体形式如dAb单体相比，对与在其表面高浓度过度表达 IL-1R1或表达IL-1R1的细胞结合的选择性更高。

在某些实施方案中，当施用有效量时，本发明的配体或dAb 单体在模型疾病(如炎症疾病)中是有效的。一般炎症疾病模型 中的有效量为约1mg/kg至约10mg/kg(如约1mg/kg、约2 mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7 mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)。本领域技术人 员认为本文所述的慢性炎症疾病模型是用于预测对人的疗效的。 如本文所述，现有技术没有暗示在这些模型中使用配体或dAb单 体，或它们会是有效的。

几种合适的呼吸疾病动物模型为本领域所知，并被本领域技 术人员认为是用于预测对人的疗效的。例如合适的呼吸疾病动物 模型包括慢性阻塞性肺疾病模型(参见Groneberg，DA et al.， Respiratory Research 5：18(2004))，以及哮喘模型(参见Coffman et al.，J.Exp.Med.201(12)：1875-1879(2001))。例如配体或dAb 单体在香烟烟雾诱导的慢性阻塞性肺部疾病(COPD)小鼠模型中 是有效的(参见如Wright JL and Churg A.，Chest 122：301S-306S (2002))。例如与合适的对照相比，使用有效量的配体或dAb单 体可减少或延缓COPD症状的出现。

在具体实施方案中，在标准关节炎模型(如炎性关节炎或骨 关节炎)中，配体或dAb单体是有效的。几种有效的模型是本领 域所知的，例如小鼠胶原诱导的关节炎模型(参见如Juarranz，et al.，Arthritis Research and Therapy，7：R1034-R1045(2005))，  大鼠 佐剂诱导的关节炎(参见如Halloran，M.et al.，J.Immunol.，65：7492 (1999)，Halloran，M.et al.，Arthritis Rheum.，39：810(1996))，兔实 验性骨关节炎(参见如Spriet，et al.Osteoarthritis and Cartilage， 13：171-179(2005)，以及几种小鼠骨关节炎模型(参见如 Helminen，et al.，Rheumatology，41：848-856(2002))。

例如可通过把Arthrogen-CIA佐剂和Arthrogen-CIA胶原 (MD-biosciences公司)的乳剂注射动物，从而在DBA/1小鼠中 诱导关节炎。注射约21天后，可施用(如通过腹腔注射)待检测 的配体或dAb单体。临床关节炎的分值等级从0到4，可用于测 量动物四肢的每个肢体，正常肢体的值设为零，涉及多关节的发 炎最严重的肢体设为4。施用有效量的配体或dAb单体可降低小 鼠胶原诱导的关节炎模型中四肢关节炎分值总和的平均值，例如 与合适的对照相比，四肢关节炎分值总和的平均值可降低约1至 约16，约3至约16，约6至约16，约9至约16，或约12至约 16，或与合适的对照组相比，可延迟关节炎症状的产生，例如约 1天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约 10天，约14天，约21天或约28天。在另一实施例中，使用治 疗有效量的配体可使标准的小鼠胶原诱导的关节炎模型中四肢关 节炎分值总和的平均值为0至约3，约3至约5，约5至约7，约 7至约15，约9至约15，约10至约15，约12至约15，或约14 至约15。

在其他实施方案中，配体或dAb单体在小鼠  ARE关节炎 模型中是有效的(Kontoyiannis et al.，J Exp Med 196：1563-74 (2002))。例如与合适的对照相比，施用有效量的配体可降低小鼠 ARE关节炎模型中关节炎分值的平均值，例如降低约0.1至约 2.5，约0.5至约2.5，约1至约2.5，约1.5至约2.5，或约2至 约2.5。在另一实施例中，与合适的对照相比，施用治疗有效量 的配体可延迟小鼠  ARE关节炎模型中症状的出现，例如约1 天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约10 天，约14天，约21天或约28天。在另一实施例中，施用治疗有 效量的配体可使小鼠  ARE关节炎模型中关节炎分值的平均值为 0至约0.5，约0.5至约1，约1至约1.5，约1.5至约2，或约2 至约2.5。

在其他实施方案中，配体或dAb单体在小鼠  ARE炎症性肠 病(IBD)模型中是有效的(Kontoyiannis et al.，J Exp Med 196：1563-74(2002))。例如与合适的对照相比，施用治疗有效量 的配体可降低在小鼠ARE IBD模型中急性和/或慢性炎症分值的 平均值，例如降低约0.1至约2.5，约0.5至约2.5，约1至约 2.5，约1.5至约2.5，或约2至约2.5。在另一实施例中，与合适 的对照相比，施用治疗有效量的配体可延迟小鼠ARE IBD模型 中IBD症状的出现，例如延迟约1天，约2天，约3天，约4 天，约5天，约6天，约7天，约10天，约14天，约21天或约 28天。在另一实施例中，施用治疗有效量的配体可使小鼠  ARE IBD模型中急性和/或慢性炎症分值的平均值为1至约0.5，0.5至 约1，约1至约1.5，约1.5至约2，或约2至约2.5。

在其他实施方案中，配体或dAb单体在葡聚糖硫酸钠诱导的 小鼠IBD模型中是有效的(参见Okayasu I.et al.，Gastroenterology 98：694-702(1990)；  Podolsky K.，J Gasteroenterol.38 suppl XV：63- 66(2003))。例如与合适的对照相比，施用治疗有效量的配体可 降低小鼠DSS IBD模型中严重程度分值的平均值，例如降低约 0.1至约2.5，约0.5至约2.5，约1至约2.5，约1.5至约2.5，或 约2至约2.5。在另一实施例中，与合适的对照相比，施用治疗 有效量的配体可延迟小鼠DSS IBD模型中IBD症状的出现，例如 延迟约1天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7 天，约10天，约14天，约21天或约28天。在另一实施例中， 施用治疗有效量的配体可使小鼠DSS IBD模型中严重程度分值的 平均值为0至约0.5，约0.5至约1，约1至约1.5，约1.5至约 2，或约2至约2.5。

在一些实施方案中，所述配体包括一种dAb，其对IL-1R1具 有结合特异性，抑制IL-1(如IL-1α和/或IL-1β)和受体的结 合，但不抑制IL-1ra与IL-1R1结合，并与选自下述的dAb竞争 与IL-1R1的结合：DOM4-122-23(SEQ ID NO：1)、DOM4-122-24 (SEQ ID NO：2)、DOM4-122(SEQ ID NO：95)、DOM4-122-1(SEQ ID NO：96)、DOM4-122-2(SEQ ID NO：97)、DOM4-122-3(SEQ ID NO：98)、DOM4-122-4(SEQ ID NO：99)、DOM4-122-5(SEQ ID NO：100)、DOM4-122-6(SEQ ID NO：101)、DOM4-122-7(SEQ ID NO：102)、DOM4-122-8(SEQ ID NO：103)、DOM4-122-9(SEQ ID NO：104)、DOM4-122-10(SEQ ID NO：105)、DOM4-122-11(SEQ ID NO：106)、DOM4-122-12(SEQ ID NO：107)、DOM4-122-13 (SEQ ID NO：108)、DOM4-122-14(SEQ ID NO：109)、DOM4-122- 15(SEQ ID NO：110)、DOM4-122-16(SEQ ID NO：111)、DOM4- 122-17(SEQ ID NO：112)、DOM4-122-18(SEQ ID NO：113)、 DOM4-122-19(SEQ ID NO：114)、DOM4-122-20(SEQ ID NO：115)、DOM4-122-21(SEQ ID NO：116)、DOM4-122-22(SEQ ID NO：117)、DOM4-122-25(SEQ ID NO：118)、DOM4-122-26 (SEQ ID NO：119)、DOM4-122-27(SEQ ID NO：120)、DOM4-122- 28(SEQ ID NO：121)、DOM4-122-29(SEQ ID NO：122)、DOM4- 122-30(SEQ ID NO：123)、DOM4-122-31(SEQ ID NO：124)、 DOM4-122-32(SEQ ID NO：125)、DOM4-122-33(SEQ ID NO：126)、DOM4-122-34(SEQ ID NO：127)、DOM4-122-35(SEQ ID NO：128)、DOM4-122-36(SEQ ID NO：129)、DOM4-122-37 (SEQ ID NO：130)、DOM4-122-38(SEQ ID NO：131)、DOM4-122- 39(SEQ ID NO：132)、DOM4-122-40(SEQ ID NO：133)、DOM4- 122-41(SEQ ID NO：134)、DOM4-122-42(SEQ ID NO：135)、 DOM4-122-43(SEQ ID NO：136)、DOM4-122-44(SEQ ID NO：137)、DOM4-122-45(SEQ ID NO：138)、DOM4-122-46(SEQ ID NO：139)、DOM4-122-47(SEQ ID NO：140)、DOM4-122-48 (SEQ ID NO：141)、DOM4-122-49(SEQ ID NO：142)、DOM4-122- 50(SEQ ID NO：143)、DOM4-122-51(SEQ ID NO：144)、DOM4- 122-52(SEQ ID NO：145)、DOM4-122-54(SEQ ID NO：146)、 DOM4-122-55(SEQ ID NO：147)、DOM4-122-56(SEQ ID NO：148)、DOM4-122-57(SEQ ID NO：149)、DOM4-122-58(SEQ ID NO：150)、DOM4-122-59(SEQ ID NO：151)、DOM4-122-60 (SEQ ID NO：152)、DOM4-122-61(SEQ ID NO：153)、DOM4-122- 62(SEQ ID NO：154)、DOM4-122-63(SEQ ID NO：155)、DOM4- 122-64(SEQ ID NO：156)、DOM4-122-65(SEQ ID NO：157)、 DOM4-122-66(SEQ ID NO：158)、DOM4-122-67(SEQ ID NO：159)、DOM4-122-68(SEQ ID NO：160)、DOM4-122-69(SEQ ID NO：161)、DOM4-122-70(SEQ ID NO：162)、DOM4-122-71 (SEQ ID NO：163)、DOM4-122-72(SEQ ID NO：164)和DOM4-122- 73(SEQ ID NO：165)。

在一些实施方案中，配体包括一种dAb，其能与IL-1R特异 性结合，抑制IL-1(即IL-1α和/或IL-1β)和受体结合，但不抑 制IL-1ra与IL-1R1结合，并包含氨基酸序列，该氨基酸序列与 选自下述的氨基酸序列或dAb具有至少约80％，至少约85％，至 少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约 94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或 至少约99％的氨基酸序列一致性：DOM4-122-23(SEQ ID NO：1)、DOM4-122-24(SEQ ID NO：2)、DOM4-122(SEQ ID NO：95)、DOM4-122-1(SEQ ID NO：96)、DOM4-122-2(SEQ ID NO：97)、DOM4-122-3(SEQ ID NO：98)、DOM4-122-4(SEQ ID NO：99)、DOM4-122-5(SEQ ID NO：100)、DOM4-122-6(SEQ ID NO：101)、DOM4-122-7(SEQ ID NO：102)、DOM4-122-8(SEQ ID NO：103)、DOM4-122-9(SEQ ID NO：104)、DOM4-122-10(SEQ ID NO：105)、DOM4-122-11(SEQ ID NO：106)、DOM4-122-12(SEQ ID NO：107)、DOM4-122-13(SEQ ID NO：108)、DOM4-122-14 (SEQ ID NO：109)、DOM4-122-15(SEQ ID NO：110)、DOM4-122- 16(SEQ ID NO：111)、DOM4-122-17(SEQ ID NO：112)、DOM4- 122-18(SEQ ID NO：113)、DOM4-122-19(SEQ ID NO：114)、 DOM4-122-20(SEQ ID NO：115)、DOM4-122-21(SEQ ID NO：116)、DOM4-122-22(SEQ ID NO：117)、DOM4-122-25(SEQ ID NO：118)、DOM4-122-26(SEQ ID NO：119)、DOM4-122-27 (SEQ ID NO：120)、DOM4-122-28(SEQ ID NO：121)、DOM4-122- 29(SEQ ID NO：122)、DOM4-122-30(SEQ ID NO：123)、DOM4- 122-31(SEQ ID NO：124)、DOM4-122-32(SEQ ID NO：125)、 DOM4-122-33(SEQ ID NO：126)、DOM4-122-34(SEQ ID NO：127)、DOM4-122-35(SEQ ID NO：128)、DOM4-122-36(SEQ ID NO：129)、DOM4-122-37(SEQ ID NO：130)、DOM4-122-38 (SEQ ID NO：131)、DOM4-122-39(SEQ ID NO：132)、DOM4-122- 40(SEQ ID NO：133)、DOM4-122-41(SEQ ID NO：134)、DOM4- 122-42(SEQ ID NO：135)、DOM4-122-43(SEQ ID NO：136)、 DOM4-122-44(SEQ ID NO：137)、DOM4-122-45(SEQ ID NO：138)、DOM4-122-46(SEQ ID NO：139)、DOM4-122-47(SEQ ID NO：140)、DOM4-122-48(SEQ ID NO：141)、DOM4-122-49 (SEQ ID NO：142)、DOM4-122-50(SEQ ID NO：143)、DOM4-122- 51(SEQ ID NO：144)、DOM4-122-52(SEQ ID NO：145)、DOM4- 122-54(SEQ ID NO：146)、DOM4-122-55(SEQ ID NO：147)、 DOM4-122-56(SEQ ID NO：148)、DOM4-122-57(SEQ ID NO：149)、DOM4-122-58(SEQ ID NO：150)、DOM4-122-59(SEQ ID NO：151)、DOM4-122-60(SEQ ID NO：152)、DOM4-122-61 (SEQ ID NO：153)、DOM4-122-62(SEQ ID NO：154)、DOM4-122- 63(SEQ ID NO：155)、DOM4-122-64(SEQ ID NO：156)、DOM4- 122-65(SEQ ID NO：157)、DOM4-122-66(SEQ ID NO：158)、 DOM4-122-67(SEQ ID NO：159)、DOM4-122-68(SEQ ID NO：160)、DOM4-122-69(SEQ ID NO：161)、DOM4-122-70(SEQ ID NO：162)、DOM4-122-71(SEQ ID NO：163)、DOM4-122-72 (SEQ ID NO：164)和DOM4-122-73(SEQ ID NO：165)。

在一些实施方案中，配体包括一种dAb，其与IL-1R1结合， 并与本文所述的任何dAb竞争与IL-1R1(如人IL-1R1)的结合。

在优选的实施方案中，配体包括选自下述的dAb单体： DOM4-122-23和DOM4-122-24。例如配体可以是任何这些dAb 的单体，或异型或同型二聚体，三聚体或寡聚物。如果需要，配 体可进一步包括半衰期延长的部分，如聚乙二醇部分。在一些实 施例中，所述配体包括选自下述的dAb单体：DOM4-122-23和 DOM4-122-24，以及与血清白蛋白结合的dAb单体。例如，配体 可以是包括DOM4-122-23和DOM7h-8，或DOM4-122-24和 DOM7h-8的双特异性配体。

dAb单体可以包括任何合适的免疫球蛋白可变域，优选包括 人可变域或包括人框架区的可变域。在某些实施方案中，dAb单 体包括如本文所述的通用框架。

所述通用框架可以是VL框架(Vλ或Vκ)，例如包括由人种 系DPK1、DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、 DPK8、DPK9、DPK10、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、 DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、 DPK25、DPK26或DPK 28免疫球蛋白基因片段编码的框架氨基 酸序列的框架。如果需要，所述VL框架可进一步包括由人种系 Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5免疫球蛋白基因片段编码的框架氨基 酸序列。

在其他实施方案中，所述通用框架可以是VL框架(Vλ或 Vκ)，例如包括由人种系DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、 DP31、DP33、DP38、DP45、DP46、DP47、DP49、DP50、 DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68或DP69免疫 球蛋白基因片段编码的框架氨基酸序列的框架。如果需要，所述 VL框架可进一步包括由人种系JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5和 JH6免疫球蛋白基因片段编码的框架氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述dAb单体包括一种或多种框架 区，其包含与由人种系抗体基因片段编码的相应框架区氨基酸序 列相同的氨基酸序列，或相对于由人种系抗体基因片段编码的所 述相应框架区氨基酸序列，一种或多种所述框架区的氨基酸序列 总共包含最高达5个氨基酸的差异。

在其他实施方案中，所述dAb单体的FW1、FW2、FW3和 FW4的氨基酸序列与人种系抗体基因片段编码的相应框架区氨基 酸序列相同，或相对于由所述人种系抗体基因片段编码的相应框 架区氨基酸序列，FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列总共 包含最高达10个氨基酸的差异。

在其他实施方案中，所述dAb单体包括FW1、FW2和FW3 区，所述FW1、FW2和FW3区的氨基酸序列与人种系抗体基因 片段编码的相应框架区氨基酸序列相同。

在具体实施方案中，所述dAb单体配体包括DPK9 VL框架， 或选自DP47、DP45和DP38的VH框架。所述dAb单体可包括 如蛋白A、蛋白L和蛋白G的通用性配体的结合位点。

在某些实施方案中，所述配体或dAb单体实质上是抗聚集 的。例如在一些实施方案中，当在常规用于药物制剂的溶剂如盐 水、缓冲液、柠檬酸缓冲液、水、乳液，以及任何这些溶剂与如 FDA批准的赋形剂中的1-5mg/ml、5-10mg/ml、10-20mg/ml、 20-50mg/ml、50-100mg/ml、100-200mg/ml或200-500mg/ml的 配体或dAb溶液，在约22℃，22-25℃，25-30℃，30-37℃，37- 40℃，40-50℃，50-60℃，60-70℃，70-80℃，15-20℃，10- 15℃，5-10℃，2-5℃，0-2℃，-10℃至0℃，-20℃至-10℃，- 40℃至-20℃，-60℃至-40℃，或-80℃至-60℃下，维持约一段 时间如10分钟、1小时、8小时、24小时、2天、3天、4天、1 周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、1年 或2年时，少于约10％，少于约9％，少于约8％，少于约7％， 少于约6％，少于约5％，少于约4％，少于约3％，少于约2％或 少于约1％的所述配体或dAb单体聚集。

可以使用任何合适的方法评定聚集，如通过显微镜检查，肉 眼观察或光谱法或任何其他合适的方法评估浊度。优选地，通过 动态光散射评定聚集。抗聚集的配体或dAb单体有几处优点。例 如，作为通过使用合适的如大肠杆菌的生物制备体系表达的可溶 性蛋白，这种配体或dAb单体可以容易地大量制得，与常规的多 肽相比还可以在更高浓度下制成制剂和/或存储，聚集现象和活性 损失都更少。此外，抗聚集的配体或dAb单体比其他的抗原或表 位结合的多肽(如常规抗体)制备更经济。例如，一般来说打算 用于体内的抗原或表位结合多肽的制备包括去除聚集多肽的方法 (如凝胶过滤法)。无法去除此种聚集体可导致出现不适合体内应 用的制品，因为例如打算用作拮抗剂的抗原结合多肽的聚集体可 通过诱导靶抗原的交联或聚集成簇而表现出激动剂的作用。蛋白 聚集体还可以通过诱导受试者对其被施用物质的免疫应答，降低 治疗多肽的疗效。

相比之下，可以制备本发明的抗聚集配体或dAb单体进行体 内应用，无需包括去除聚集体的方法步骤，还可体外使用，而没 有多肽聚集体造成的上述不利之处。

在一些实施方案中，当温度加热到Ts并冷却Tc时，所述配 体或dAb单体可逆地解折叠，其中Ts高于dAb的熔点，Tc低于 dAb的熔点。例如当温度加热到80℃并冷却到约室温时，所述 dAb单体可逆地解折叠。可逆地解折叠的多肽，解折叠时丧失功 能，但重折叠后重获功能。这种多肽与解折叠时聚集的多肽或非 正确重折叠的多肽(错误折叠的多肽)不同，即解折叠时聚集的 多肽或非正确重折叠的多肽无法重获功能。

可对多肽解折叠或重折叠进行评定，例如采用任何合适的方 法直接或间接地检测多肽结构。例如，检测多肽结构可通过圆二 色性(CD)(即远紫外CD，近紫外CD)，荧光(如色氨酸侧链 的荧光)，对蛋白水解的易感性，核磁共振(NMR)，或通过检 测或测量依赖于正确折叠的多肽的功能(例如与靶配体结合，与 通用性配体结合)。在一个实施例中，多肽解折叠是采用功能分 析来评定的，在所述功能分析中结合功能的丧失(即结合通用型 和/或靶配体，结合底物)表明多肽是解折叠的。

配体或dAb单体解折叠和重折叠的程度可采用解折叠或热 变性曲线来确定。以温度为纵坐标，折叠多肽的相对浓度为横坐 标作图可得解折叠曲线。折叠配体或dAb单体的相对浓度可使用 任何合适的方法(例如CD、荧光、结合分析)直接或间接地确 定。例如可制备配体或dAb单体溶液，用CD确定溶液的椭圆 度。得到的椭圆度值代表折叠配体或dAb单体的百分比相对浓 度。溶液中的配体或dAb单体随后通过逐渐升高溶液温度而解折 叠，在合适的增量处可确定椭圆度(例如每次升高一度后)。然 后溶液中配体或dAb单体通过逐渐降低溶液温度而重折叠，在合 适的增量处确定椭圆度。用数据可绘制出解折叠曲线和重折叠曲 线。解折叠和重折叠曲线是典型的S型，包括其中配体或dAb单 体分子折叠的部分，其中配体或dAb单体分子不同程度解折叠的 解折叠/重折叠转变，以及其中配体或单体分子解折叠的部分。重 折叠曲线在Y轴的截距是复性的重折叠配体或dAb单体的相对 量。复性率至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至 少约75％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或 至少约95％，表明该配体或dAb单体可逆地解折叠。

在优选实施例中，所述配体或dAb单体解折叠的可逆性通过 制备配体或dAb单体溶液并绘制热解折叠和重折叠曲线来确定。 所述配体或dAb单体溶液可在任何合适的溶剂中制备，如其pH 适合配体或dAb溶解的水溶液缓冲液(如高于或低于等电点 (pI)三个单位的pH值)。所述配体或dAb单体溶液要浓到足以 检测解折叠/折叠。例如，所述配体或dAb溶液可以是约0.1μM 至约100μM，或优选约1μM至约10μM。

如果所述配体或dAb单体的熔点(Tm)已知，则溶液可加 热至约低于Tm 10度(Tm-10)，通过椭圆度或荧光评定折叠 (如200nm-250nm远紫外CD扫描，CD波长固定在235nm或 225nm；色氨酸的荧光发射光谱在300至450nm，激发波长 298nm)，以提供折叠的配体或dAb单体的相对百分比。溶液 随后以预定增量被加热到至少高出Tm10度(Tm+10)(如增加 约0.1至约1度)，在每个增量处测定椭圆度或荧光。然后所述 配体或dAb单体按预定增量冷却到至少Tm-10进行重折叠，在 每个增量处测定椭圆度或荧光。如果所述配体或dAb单体的熔点 未知，溶液可通过从约25℃逐渐加热至约100℃而解折叠，然后 逐渐冷却至至少约25℃而重折叠，在每次加热或冷却的增量处 测定椭圆度或荧光。获得的数据可绘制解折叠曲线和重折叠曲 线，其中重折叠曲线在Y轴上的截距是复性的重折叠蛋白的相对 量。在一些实施方案中，所述dAb单体不包括驼类(Camelid)免 疫球蛋白可变域，或一种或多种驼类(Camelid)种系抗体基因片 段编码的免疫球蛋白可变域独有的框架氨基酸。

优选地，当在大肠杆菌(E.coli)或毕赤酵母菌种(如巴斯德 毕赤酵母(P.pastoris))中表达时，所述配体或  dAb单体分 泌量至少约0.5mg/L。在其他优选实施方案中，当在大肠杆菌或 毕赤酵母菌种(如巴斯德毕赤酵母)中表达时，所述dAb单体分 泌量为至少约0.75mg/L，至少约1mg/L，至少约4mg/L，至少 约5mg/L，至少约10mg/L，至少约15mg/L，至少约20mg/L， 至少约25mg/L，至少约30mg/L，至少约35mg/L，至少约40 mg/L，至少约45mg/L，或至少约50mg/L，或至少约100mg/L， 或至少约200mg/L，或至少约300mg/L，或至少约400mg/L，或 至少约500mg/L，或至少约600mg/L，或至少约700mg/L，或至 少约800mg/L，至少约900mg/L，或至少约1g/L。在其他优选实 施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母菌种(如巴斯德毕赤酵母) 中表达时，所述dAb单体的分泌量至少约1mg/L到至少约 1g/L，至少约1mg/L到至少约750mg/L，至少约100mg/L到至 少约1g/L，至少约200mg/L到至少约1g/L，至少约300mg/L 到至少约1g/L，至少约400mg/L到至少约1g/L，至少约500 mg/L到至少约1g/L，至少约600mg/L到至少约1g/L，至少约 700mg/L到至少约1g/L，至少约800mg/L到至少约1g/L，或 至少约900mg/L到至少约1g/L。虽然当在大肠杆菌或毕赤酵母 菌种(如巴斯德毕赤酵母)中表达时，本文所述的配体或dAb单 体是可被分泌的，但它们还可使用任何合适的方法制备，如化学 合成方法或不采用大肠杆菌或毕赤酵母菌种的生物制备方法。

与血清白蛋白结合的dAb单体

本发明的配体包括与血清白蛋白(SA)结合的dAb单体，Kd 为1nM至500μM(即 x 10-9至5 x 10-4)，优选100nM至10 μM。优选地，对于包括第一抗SA的dAb和抗另一靶标的第二 dAb的双特异性配体，第二dAb对其靶标的亲和力(例如用 BiaCore的表面等离子共振测量的Kd和/或Koff)是第一dAb对 SA亲和力的1至100000倍(优选100至100000，更优选1000 至100000，或10000至100000倍)。例如，第一dAb与SA结 合的亲和力约为10μM，而第二dAb与其靶标结合的亲和力为 100pM。优选地，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一个 实施方案中，所述第一dAb(或dAb单体)与SA(即HSA)结 合的Kd约为50，优选70，更优选100、150或200nM。

在某些实施方案中，与SA结合的所述dAb单体抗聚集，可 逆解折叠和/或包括与IL-1R1结合的dAb单体的上述框架区。

在特定实施方案中，与血清白蛋白结合的抗体的抗原结合片 段是与血清白蛋白结合的dAb。在某些实施方案中，该dAb与人 血清白蛋白结合，并与选自下述的dAb竞争与白蛋白结合： DOM7m-16(SEQ ID NO：723)、DOM7m-12(SEQ ID NO：724)、 DOM7m-26(SEQ ID NO：725)、DOM7r-1(SEQ ID NO：726)、 DOM7r-3(SEQ ID NO：727)、DOM7r-4(SEQ ID NO：728)、DOM7r- 5(SEQ ID NO：729)、DOM7r-7(SEQ ID NO：730)、DOM7r-8(SEQ ID NO：731)、DOM7h-2(SEQ ID NO：732)、DOM7h-3(SEQ ID NO：733)、DOM7h-4(SEQ ID NO：734)、DOM7h-6(SEQ ID NO：735)、DOM7h-1(SEQ ID NO：736)、DOM7h-7(SEQ ID NO：737)、DOM7h-8(SEQ ID NO：746)、DOM7r-13(SEQ ID NO：747)、DOM7r-14(SEQ ID NO：748)、DOM7h-22(SEQ ID NO：739)、DOM7h-23(SEQ ID NO：740)、DOM7h-24(SEQ ID NO：741)、DOM7h-25(SEQ ID NO：742)、DOM7h-26(SEQ ID NO：743)、DOM7h-21(SEQ ID NO：744)、DOM7h-27(SEQ ID NO：745)、DOM7r-15(SEQ ID NO：749)、DOM7r-16(SEQ ID NO：750)、DOM7r-17(SEQ ID NO：751)、DOM7r-18(SEQ ID NO：752)、DOM7r-19(SEQ ID NO：753)、DOM7r-20(SEQ ID NO：754)、DOM7r-21(SEQ ID NO：755)、DOM7r-22(SEQ ID NO：756)、DOM7r-23(SEQ ID NO：757)、DOM7r-24(SEQ ID NO：758)、DOM7r-25(SEQ ID NO：759)、DOM7r-26(SEQ ID NO：760)、DOM7r-27(SEQ ID NO：761)、DOM7r-28(SEQ ID NO：762)、DOM7r-29(SEQ ID NO：763)、DOM7r-30(SEQ ID NO：764)、DOM7r-31(SEQ ID NO：765)、DOM7r-32(SEQ ID NO：766)和DOM7r-33(SEQ ID NO：767)。

在某些实施方案中，dAb与人血清白蛋白结合，并包含氨基 酸序列，该氨基酸序列与选自下述dAb的氨基酸序列具有至少约 80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约 96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的氨基酸序 列一致性：DOM7m-16(SEQ ID NO：723)、DOM7m-12(SEQ ID NO：724)、DOM7m-26(SEQ ID NO：725)、DOM7r-1(SEQ ID NO：726)、DOM7r-3(SEQ ID NO：727)、DOM7r-4(SEQ ID NO：728)、DOM7r-5(SEQ ID NO：729)、DOM7r-7(SEQ ID NO：730)、DOM7r-8(SEQ ID NO：731)、DOM7h-2(SEQ ID NO：732)、DOM7h-3(SEQ ID NO：733)、DOM7h-4(SEQ ID NO：734)、DOM7h-6(SEQ ID NO：735)、DOM7h-1(SEQ ID NO：736)、DOM7h-7(SEQ ID NO：737)、DOM7h-8(SEQ ID NO：746)、DOM7r-13(SEQ ID NO：747)、DOM7r-14(SEQ ID NO：748)、DOM7h-22(SEQ ID NO：739)、DOM7h-23(SEQ ID NO：740)、DOM7h-24(SEQ ID NO：741)、DOM7h-25(SEQ ID NO：742)、DOM7h-26(SEQ ID NO：743)、DOM7h-21(SEQ ID NO：744)、DOM7h-27(SEQ ID NO：745)、DOM7r-15(SEQ ID NO：749)、DOM7r-16(SEQ ID NO：750)、DOM7r-17(SEQ ID NO：751)、DOM7r-18(SEQ ID NO：752)、DOM7r-19(SEQ ID NO：753)、DOM7r-20(SEQ ID NO：754)、DOM7r-21(SEQ ID NO：755)、DOM7r-22(SEQ ID NO：756)、DOM7r-23(SEQ ID NO：757)、DOM7r-24(SEQ ID NO：758)、DOM7r-25(SEQ ID NO：759)、DOM7r-26(SEQ ID NO：760)、DOM7r-27(SEQ ID NO：761)、DOM7r-28(SEQ ID NO：762)、DOM7r-29(SEQ ID NO：763)、DOM7r-30(SEQ ID NO：764)、DOM7r-31(SEQ ID NO：765)、DOM7r-32(SEQ ID NO：766)和DOM7r-33(SEQ ID NO：767)。

例如，与人血清白蛋白结合的所述dAb可包含氨基酸序列， 该氨基酸序列与下述序列具有至少约90％，或至少约95％，或至 少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的氨基 酸序列一致性：DOM7h-2(SEQ ID NO：732)、DOM7h-3(SEQ ID NO：733)、DOM7h-4(SEQ ID NO：734)、DOM7h-6(SEQ ID NO：735)、DOM7h-1(SEQ ID NO：736)、DOM7h-7(SEQ ID NO：737)、DOM7h-8(SEQ ID NO：746)、DOM7r-13(SEQ ID NO：747)、DOM7r-14(SEQ ID NO：748)、DOM7h-22(SEQ ID NO：739)、DOM7h-23(SEQ ID NO：740)、DOM7h-24(SEQ ID NO：741)、DOM7h-25(SEQ ID NO：742)、DOM7h-26(SEQ ID NO：743)、DOM7h-21(SEQ ID NO：744)和DOM7h-27(SEQ ID NO：745)。

氨基酸序列的一致性优选采用合适的序列比对算法和预设参 数进行测定，例如BLAST P(Karlin and Altschul，Proc.Natl.Acad. i.USA 87(6)：2264-2268(1990))。

在进一步具体实施方案中，所述dAb是与人血清白蛋白结 合，并具有选自下述的氨基酸序列的Vκ dAb：DOM7h-2(SEQ ID NO：732)、DOM7h-3(SEQ ID NO：733)、DOM7h-4(SEQ ID NO：734)、DOM7h-6(SEQ ID NO：735)、DOM7h-1(SEQ ID NO：736)、DOM7h-7(SEQ ID NO：737)、DOM7h-8(SEQ ID NO：746)、DOM7r-13(SEQ ID NO：747)和DOM7r-14(SEQ ID NO：748)，或是具有选自下述氨基酸序列的VH dAb：DOM7h-22 (SEQ ID NO：739)、DOM7h-23(SEQ ID NO：740)、DOM7h-24 (SEQ ID NO：741)、DOM7h-25(SEQ ID NO：742)、DOM7h-26 (SEQ ID NO：743)、DOM7h-21(SEQ ID NO：744)和DOM7h-27 (SEQ ID NO：745)。在其他实施方案中，与血清白蛋白结合的抗体 的抗原结合片段是与人血清白蛋白结合，并包括任何前述氨基酸 序列的CDRs的dAb。

合适的与血清白蛋白结合的驼类(Camelid)VHH包括在 WO 2004/041862(Ablynx N.V.)和本文(SEQ ID NOS：768-784) 公开的那些。在某些实施方案中，驼类(Camelid)VHH与人血清 白蛋白结合，并包含氨基酸序列，该氨基酸序列与下述序列具有 至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或 至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的氨 基酸序列一致性：SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：770、SEQ ID NO：771、SEQ ID NO：772、SEQ ID NO：773、 SEQ ID NO：774、SEQ ID NO：775、SEQ ID NO：776、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：779、SEQ ID NO：780、 SEQ ID NO：781、SEQ ID NO：782、SEQ ID NO：783或SEQ ID NO：784。氨基酸序列的一致性优选采用合适的序列比对算法和预 设参数进行测定，例如BLAST P(Karlin and Altschul，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 87(6)：2264-2268(1990))。

在一些实施方案中，所述配体包括抗血清白蛋白的dAb，该 dAb与本文公开的任何抗血清白蛋白dAb竞争与血清白蛋白(例 如人血清白蛋白)的结合。

与肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)结合的dAb单体

本发明的配体可以包括与TNFR1结合的dAb单体。TNFR1 是跨膜受体，其含有与配体结合的胞外区，以及缺乏内在信号转 导活性但可与信号转导分子结合的胞内区。TNFR1与相结合的 TNF的复合体含有三条TNFR1链和三条TNF链(Banner et al.， Cell，73(3)431-445(1993).)。该TNF配体是与三种TNFR1链连 接的三聚体。(Id.)在所述受体-配体复合体中所述三条INFR1 链紧密簇生在一起，此聚集成簇是TNFR1介导的信号传导的前提 条件。实际上，与TNFR1结合的多价物质如抗TNFR1抗体，在 没有TNF时可诱导TNFR1聚集成簇和信号传导，并作为TNFR1 激动剂广泛使用(参见如Belka et al.，EMBO，14(6)：1156-1165 (1995)；Mandik-Nayak et al.，J.Immunol，167：1920-1928(2001).)。 因此，与TNFR1结合的多价物质一般不是TNFR1的有效拮抗 剂，即便其阻断TNFα和TNFR1的结合。

TNFR1的胞外区包括一种十三个氨基酸的氨基末端片段 (SEQ ID NO：996(人)的1-13个氨基酸；SEQ ID NO：997(小 鼠)的氨基酸1-13)，域1(SEQ ID NO：996(人)的氨基酸14- 53；SEQ ID NO：997(小鼠)的氨基酸14-53)，域2(SEQ ID NO：996(人)的氨基酸54-97；SEQ ID NO：997(小鼠)的氨基 酸54-97)，域3(SEQ ID NO：996(人)的氨基酸98-138；SEQ ID NO：997(小鼠)的氨基酸98-138)，以及域4(SEQ ID NO：996(人)的氨基酸139-167；SEQ ID NO：997(小鼠)的氨 基酸139-167)，域4后面是近膜区(SEQ ID NO：996(人)的氨 基酸168-182；SEQ ID NO：997(小鼠)的氨基酸168-183)的 (参见Banner et al.，Cell 73(3)431-445(1993)和Loetscher et al.， Cell 61(2)351-359(1990).)。域2和3与连接的配体(TNFβ、 TNFα)接触(Banner et al.，Cell，73(3)431-445(1993).)。TNFR1 的细胞外区域还包含一种域，其被称为配体组装前结构域或 PLAD域(SEQ ID NO：996(人)的氨基酸1-53；SEQ ID NO：997(小鼠)的氨基酸1-53)(美国政府，WO 01/58953； Deng et al.，Nature Medicine，doi：10.1038/nm1304(2005))。

通过包括域4内或近膜区内TNFR1(分别为SEQ ID NO：213 的氨基酸168-182，SEQ ID NO：215的氨基酸168-183)水解的方 法，TNFR1从体内细胞表面脱落，生成可溶形式的TNFR1。可溶 的TNFR1保留了与TNFα结合的能力，并因此也保留了作为 TNFα活性内源性抑制剂的功能。

人TNFR1的胞外区有以下氨基酸序列： LVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDC PGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISS CTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSC QEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSCSNCKKSLECTKLCLPQIENV KGTEDSGTT(SEQ ID NO：996)。

鼠(小鼠)TNFR1的胞外区有以下氨基酸序列： LVPSLGDREKRDSLCPQGKYVHSKNNSICCTKCHKGTYLVSDC PSPGRDTVCRECEKGTFTASQNYLRQCLSCKTCRKEMSQVEISP CQADKDTVCGCKENQFQRYLSETHFQCVDCSPCFNGTVTIPCK ETQNTVCNCHAGFFLRESECVPCSHCKKNEECMKLCLPPPLAN VTNPQDSGTA(SEQ ID NO：997)。

适合在本发明中使用的抗TNFR1 dAb(例如本文所述的配 体)可特异性结合肿瘤坏死因子受体1(TNFR1；p55； CD120a)。优选地，TNFR1的拮抗剂对肿瘤坏死因子2 (TNFR2)没有结合特异性，或基本上不拮抗TNER2。在标准细 胞检测中当拮抗剂(1nM、10nM、100nM、1μM、10μM或 100μM)对TNFα(100pg/ml)诱导的TNFR2介导的活性的抑制 不超过5％时，TNFR1的拮抗剂基本上不拮抗TNFR2。在某些实 施方案中，与TNFR1结合的所述dAb单体抗聚集，可逆地解折 叠和/或包括与IL-1R1结合的dAb单体的上述框架区。

合适的抗TNFR1 dAb和包括这样的dAb的配体不诱导可导 致受体激活和信号转导的TNFR1在细胞表面的交联或聚集成簇。 在具体实施方案中，所述配体包括与TNFR1的域1结合的抗 TNFR1的dAb。在进一步具体实施方案中，所述配体包括与 TNFR1的域1结合的抗TNFR1的dAb，并与TAR2m-21-23竞争 与小鼠TNFR1的结合或与TAR2h-205竞争与人TNFR1的结合。

在某些实施方案中，抗TNFR1的dAb与TNFR1的域2和/ 或域3结合。在具体实施方案中，抗TNFR1的dAb与TAR2h-10- 27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、 TAR2h-154-10或TAR2h-185-25竞争和TNFR1(如人和/或小鼠 TNFR1)的结合。

优选地，适于在本发明所述配体中使用的抗TNFR1的dAb 单体与TNFR1结合，Kd为300nM至5pM(即3 x 10-7至5 x 10-12 M)，优选50nM至20pM，更优选5nM至200pM，最优选1 nM至100pM，例如1 x 10-7M或更少，优选1 x 10-8M或更少， 更优选1 x 10-9M或更少，有利的是1 x 10-10M或更少，最优选1 x 10-11M或更少；和/或Koff速率常数为5 x 10-1s-1至1 x 10-7s-1 ，优选1 x 10-2s-1至1 x 10-6s-1，更优选5 x 10-3s-1至1 x 10-5s-1， 例如5 x 10-1s-1或更少，优选1 x 10-2s-1或更少，有利的是1 x 10-3 s-1或更少，更优选1 x 10-4s-1或更少，还更优选1 x 10-5s-1或更 少，最优选1 x 10-6s-1或更少，以上由表面等离子共振测定。 (Kd＝Koff/Kon)。适于在本发明中使用的某些抗TNFR1的dAb 单体与人TNFR1特异性地结合，表面等离子共振测定Kd为50 nM至20pM，Koff速率常数为5 x 10-1s-1至1 x 10-7s-1。

一些抗TNFR1的dAb单体抑制TNFα和TNFR1的结合。例 如一些抗TNFR1的dAb单体抑制TNFα和TNFR1的结合，半数 抑制浓度(IC50)为500nM至50pM，优选100nM至50pM， 更优选10nM至100pM，有利的是1nM至100pM；例如50nM 或更少，优选5nM或更少，更优选500pM或更少，有利的是 200pM或更少，最优选100pM或更少。优选地，TNFR1是人 TNFR1。

其他抗TNFR1的dAb单体不抑制TNFα和TNFR1的结合， 但抑制TNFR1介导的信号传导。例如抗TNFR1的dAb单体可以 抑制TNFα诱导的TNFR1聚集成簇，TNFR1聚集成簇可引发 TNFR1介导的信号传导。例如某些抗TNFR1的dAb单体可结合 TNFR1，并抑制TNFR1介导的信号传导，但基本上不抑制TNFα 和TNFR1的结合。例如，抗TNFR1的dAb单体抑制TNFα诱导 的TNFR1在细胞表面的交联或聚集成簇。这样的dAb(例如本文 所述的TAR2m-21-23)是有利的，因为它们可以拮抗细胞表面的 TNFR1，但基本上不减少内源性可溶TNFR1的抑制活性。例如抗 TNFR1的dAb可以结合TNFR1，但在受体结合检测中抑制TNFα 和TNFR1的结合不超过约10％，不超过约5％，不超过约4％， 不超过约3％，不超过约2％，或不超过约1％。而且在这些实施 方案中，在标准细胞检测中抗TNFR1的dAb抑制TNFα诱导的 TNFR1的交联和/或TNFR1介导的信号传导至少约10％，至少约 20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至 少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，或至少约 99％。因此，将包括这种dAb单体的配体施用于对其有需要的哺 乳动物，能补充抑制TNFα和TNFR1体内活性的内源性调节途 径。

优选地，在标准检测(如本文所述的标准L929或标准HeLa IL-8检测)中，所述配体或dAb单体中和(抑制其活性) TNFR1，半数中和量(ND50)为500nM至50pM，优选100nM 至50pM，更优选10nM至100pM，有利的是1nM至100pM； 例如50nM或更少，优选5nM或更少，更优选500pM或更少， 有利的是200pM或更少，最有利的是100pM或更少。在其他实 施方案中，在标准细胞检测中(如本文所述的标准L929或标准 HeLa IL-8检测)所述抗TNFR1的dAb单体与TNFRI结合并拮抗 TNFR1的活性，ND50≤100nM，在检测中浓度≤10μM时，dAb 激发TNFR1的活性≤5％。

在其他实施方案中，所述抗TNFR1的dAb单体对TNFR1具 有结合特异性，Kd如本文所述，并抑制标准小鼠LPS/D-半乳糖 胺诱导的感染性休克模型中的致死率(即与合适的对照相比，防 止或减低致死率至少约10％)。优选地，当给药量为约5mg/kg 或更优选约1mg/kg时，在标准小鼠LPS/D-半乳糖胺诱导的感染 性休克模型中，与合适的对照相比，抗TNFR1的dAb单体抑制 致死率至少约25％，或至少约50％)。

在具体实施方案中，在标准细胞检测，如本文所述的标准 L929或标准HeLa IL-8检测中，本发明的抗TNFR1的dAb单体 和包括此种dAb单体的配体基本上不激动TNFR1(用作TNFR1 激动剂)(即在检测中当浓度为1nM、10nM、100nM、1μM、 10μM、100μM、1000μM或5,000μM时，TNFα(100pg/ml) 诱导的TNFR1介导的活性不超过5％)。

在其他实施方案中，所述配体包括与肿瘤坏死因子受体1 (TNFR1、p55、CD120a)特异性结合的域抗体(dAb)单体，Kd 为300nM至5pM，并包含氨基酸序列，其至少约80％，至少约 85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至 少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约 98％，或至少约99％与选自下列的氨基酸序列或dAb同源： TAR2h-12(SEQ ID NO：785)、TAR2h-13(SEQ ID NO：786)、 TAR2h-14(SEQ ID NO：787)、TAR2h-16(SEQ ID NO：788)、 TAR2h-17(SEQ ID NO：789)、TAR2h-18(SEQ ID NO：790)、 TAR2h-19(SEQ ID NO：791)、TAR2h-20(SEQ ID NO：792)、 TAR2h-21(SEQ ID NO：793)、TAR2h-22(SEQ ID NO：794)、 TAR2h-23(SEQ ID NO：795)、TAR2h-24(SEQ ID NO：796)、 TAR2h-25(SEQ ID NO：797)、TAR2h-26(SEQ ID NO：798)、 TAR2h-27(SEQ ID NO：799)、TAR2h-29(SEQ ID NO：800)、 TAR2h-30(SEQ ID NO：801)、TAR2h-32(SEQ ID NO：802)、 TAR2h-33(SEQ ID NO：803)、TAR2h-10-1(SEQ ID NO：804)、 TAR2h-10-2(SEQ ID NO：805)、TAR2h-10-3(SEQ ID NO：806)、 TAR2h-10-4(SEQ ID NO：807)、TAR2h-10-5(SEQ ID NO：808)、 TAR2h-10-6(SEQ ID NO：809)、TAR2h-10-7(SEQ ID NO：810)、 TAR2h-10-8(SEQ ID NO：811)、TAR2h-10-9(SEQ ID NO：812)、 TAR2h-10-10(SEQ ID NO：813)、TAR2h-10-11(SEQ ID NO：814)、 TAR2h-10-12(SEQ ID NO：815)、TAR2h-10-13(SEQ ID NO：816)、 TAR2h-10-14(SEQ ID NO：817)、TAR2h-10-15(SEQ ID NO：818)、 TAR2h-10-16(SEQ ID NO：819)、TAR2h-10-17(SEQ ID NO：820)、 TAR2h-10-18(SEQ ID NO：821)、TAR2h-10-19(SEQ ID NO：822)、 TAR2h-10-20(SEQ ID NO：823)、TAR2h-10-21(SEQ ID NO：824)、 TAR2h-10-22(SEQ ID NO：825)、TAR2h-10-27(SEQ ID NO：826)、 TAR2h-10-29(SEQ ID NO：827)、TAR2h-10-31(SEQ ID NO：828)、 TAR2h-10-35(SEQ ID NO：829)、TAR2h-10-36(SEQ ID NO：830)、 TAR2h-10-37(SEQ ID NO：831)、TAR2h-10-38(SEQ ID NO：832)、 TAR2h-10-45(SEQ ID NO：833)、TAR2h-10-47(SEQ ID NO：834)、 TAR2h-10-48(SEQ ID NO：835)、TAR2h-10-57(SEQ ID NO：836)、 TAR2h-10-56SEQ ID NO：837)、TAR2h-10-58(SEQ ID NO：838)、 TAR2h-10-66(SEQ ID NO：839)、TAR2h-10-64(SEQ ID NO：840)、 TAR2h-10-65(SEQ ID NO：841)、TAR2h-10-68(SEQ ID NO：842)、 TAR2h-10-69(SEQ ID NO：843)、TAR2h-10-67(SEQ ID NO：844)、 TAR2h-10-61(SEQ ID NO：845)、TAR2h-10-62(SEQ ID NO：846)、 TAR2h-10-63(SEQ ID NO：847)、TAR2h-10-60(SEQ ID NO：848)、 TAR2h-10-55(SEQ ID NO：849)、TAR2h-10-59(SEQ ID NO：850)、 TAR2h-10-70(SEQ ID NO：851)、TAR2h-34(SEQ ID NO：852)、 TAR2h-35(SEQ ID NO：853)、TAR2h-36(SEQ ID NO：854)、 TAR2h-37(SEQ ID NO：855)、TAR2h-38(SEQ ID NO：856)、 TAR2h-39(SEQ ID NO：857)、TAR2h-40(SEQ ID NO：858)、 TAR2h-41(SEQ ID NO：859)、TAR2h-42(SEQ ID NO：860)、 TAR2h-43(SEQ ID NO：861)、TAR2h-44(SEQ ID NO：862)、 TAR2h-45(SEQ ID NO：863)、TAR2h-47(SEQ ID NO：864)、 TAR2h-48(SEQ ID NO：865)、TAR2h-50(SEQ ID NO：866)、 TAR2h-51(SEQ ID NO：867)、TAR2h-66(SEQ ID NO：868)、 TAR2h-67(SEQ ID NO：869)、TAR2h-68(SEQ ID NO：870)、 TAR2h-70(SEQ ID NO：871)、TAR2h-71(SEQ ID NO：872)、 TAR2h-72(SEQ ID NO：873)、TAR2h-73(SEQ ID NO：874)、 TAR2h-74(SEQ ID NO：875)、TAR2h-75(SEQ ID NO：876)、 TAR2h-76(SEQ ID NO：877)、TAR2h-77(SEQ ID NO：878)、 TAR2h-78(SEQ ID NO：879)、TAR2h-79(SEQ ID NO：880)、 TAR2h-15(SEQ ID NO：881)、TAR2h-131-8(SEQ ID NO：882)、 TAR2h-131-24(SEQ ID NO：883)、TAR2h-15-8(SEQ ID NO：884)、 TAR2h-15-8-1(SEQ ID NO：885)、TAR2h-15-8-2(SEQ ID NO：886)、TAR2h-185-23(SEQ ID NO：887)、TAR2h-154-10-5(SEQ ID NO：888)、TAR2h-14-2(SEQ ID NO：889)、TAR2h-151-8(SEQ ID NO：890)、TAR2h-152-7(SEQ ID NO：891)、TAR2h-35-4(SEQ ID NO：892)、TAR2h-154-7(SEQ ID NO：893)、TAR2h-80(SEQ ID NO：894)、TAR2h-81(SEQ ID NO：895)、TAR2h-82(SEQ ID NO：896)、TAR2h-83(SEQ ID NO：897)、TAR2h-84(SEQ ID NO：898)、TAR2h-85(SEQ ID NO：899)、TAR2h-86(SEQ ID NO：900)、TAR2h-87(SEQ ID NO：901)、TAR2h-88(SEQ ID NO：902)、TAR2h-89(SEQ ID NO：903)、TAR2h-90(SEQ ID NO：904)、TAR2h-91(SEQ ID NO：905)、TAR2h-92(SEQ ID NO：906)、TAR2h-93(SEQ ID NO：907)、TAR2h-94(SEQ ID NO：908)、TAR2h-95(SEQ ID NO：909)、TAR2h-96(SEQ ID NO：910)、TAR2h-97(SEQ ID NO：911)、TAR2h-99(SEQ ID NO：912)、TAR2h-100(SEQ ID NO：913)、TAR2h-101(SEQ ID NO：914)、TAR2h-102(SEQ ID NO：915)、TAR2h-103(SEQ ID NO：916)、TAR2h-104(SEQ ID NO：917)、TAR2h-105(SEQ ID NO：918)、TAR2h-106(SEQ ID NO：919)、TAR2h-107(SEQ ID NO：920)、TAR2h-108(SEQ ID NO：921)、TAR2h-109(SEQ ID NO：922)、TAR2h-110(SEQ ID NO：923)、TAR2h-111(SEQ ID NO：924)、TAR2h-112(SEQ ID NO：925)、TAR2h-113(SEQ ID NO：926)、TAR2h-114(SEQ ID NO：927)、TAR2h-115(SEQ ID NO：928)、TAR2h-116(SEQ ID NO：929)、TAR2h-117(SEQ ID NO：930)、TAR2h-118(SEQ ID NO：931)、TAR2h-119(SEQ ID NO：932)、TAR2h-120(SEQ ID NO：933)、TAR2h-121(SEQ ID NO：934)、TAR2h-122(SEQ ID NO：935)、TAR2h-123(SEQ ID NO：936)、TAR2h-124(SEQ ID NO：937)、TAR2h-125(SEQ ID NO：938)、TAR2h-126(SEQ ID NO：939)、TAR2h-127(SEQ ID NO：940)、TAR2h-128(SEQ ID NO：941)、TAR2h-129(SEQ ID NO：942)、TAR2h-130(SEQ ID NO：943)、TAR2h-131(SEQ ID NO：944)、TAR2h-132(SEQ ID NO：945)、TAR2h-133(SEQ ID NO：946)、TAR2h-151(SEQ ID NO：947)、TAR2h-152(SEQ ID NO：948)、TAR2h-153(SEQ ID NO：949)、TAR2h-154(SEQ ID NO：950)、TAR2h-159(SEQ ID NO：951)、TAR2h-165(SEQ ID NO：952)、TAR2h-166(SEQ ID NO：953)、TAR2h-168(SEQ ID NO：954)、TAR2h-171(SEQ ID NO：955)、TAR2h-172(SEQ ID NO：956)、TAR2h-173(SEQ ID NO：957)、TAR2h-174(SEQ ID NO：958)、TAR2h-176(SEQ ID NO：959)、TAR2h-178(SEQ ID NO：960)、TAR2h-201(SEQ ID NO：961)、TAR2h-202(SEQ ID NO：962)、TAR2h-203(SEQ ID NO：963)、TAR2h-204(SEQ ID NO：964)、TAR2h-185-25(SEQ ID NO：965)、TAR2h-154-10 SEQ IDNO：966)、TAR2h-205(SEQ ID NO：967)、TAR2h-10(SEQ ID NO：968)、TAR2h-5(SEQ ID NO：969)、TAR2h-5d1(SEQ ID NO：970)、TAR2h-5d2(SEQ ID NO：971)、TAR2h-5d3(SEQ ID NO：972)、TAR2h-5d4(SEQ ID NO：973)、TAR2h-5d5(SEQ ID NO：974)、TAR2h-5d6(SEQ ID NO：975)、TAR2h-5d7(SEQ ID NO：976)、TAR2h-5d8(SEQ ID NO：977)、TAR2h-5d9(SEQ ID NO：978)、TAR2h-5d10(SEQ IDNO：979)、TAR2h-5d11(SEQ ID NO：980)、TAR2h-5d12(SEQ ID NO：981)和TAR2h-5d13(SEQ ID NO：982)。

在其他实施方案中，所述配体包括和肿瘤坏死因子受体1 (TNFR1、p55、CD120a)特异性结合的域抗体(dAb)单体，Kd 为300nM至5pM，并与选自下列的dAb竞争与人TNFR1的结 合：TAR2h-12(SEQ ID NO：785)、TAR2h-13(SEQ ID NO：786)、 TAR2h-14(SEQ ID NO：787)、TAR2h-16(SEQ ID NO：788)、 TAR2h-17(SEQ ID NO：789)、TAR2h-18(SEQ ID NO：790)、 TAR2h-19(SEQ ID NO：791)、TAR2h-20(SEQ ID NO：792)、 TAR2h-21(SEQ ID NO：793)、TAR2h-22(SEQ ID NO：794)、 TAR2h-23(SEQ ID NO：795)、TAR2h-24(SEQ ID NO：796)、 TAR2h-25(SEQ ID NO：797)、TAR2h-26(SEQ ID NO：798)、 TAR2h-27(SEQ ID NO：799)、TAR2h-29(SEQ ID NO：800)、 TAR2h-30(SEQ ID NO：801)、TAR2h-32(SEQ ID NO：802)、 TAR2h-33(SEQ ID NO：803)、TAR2h-10-1(SEQ ID NO：804)、 TAR2h-10-2(SEQ ID NO：805)、TAR2h-10-3(SEQ ID NO：806)、 TAR2h-10-4(SEQ ID NO：807)、TAR2h-10-5(SEQ ID NO：808)、 TAR2h-10-6(SEQ ID NO：809)、TAR2h-10-7(SEQ ID NO：810)、 TAR2h-10-8(SEQ ID NO：811)、TAR2h-10-9(SEQ ID NO：812)、 TAR2h-10-10(SEQ ID NO：813)、TAR2h-10-11(SEQ ID NO：814)、 TAR2h-10-12(SEQ ID NO：815)、TAR2h-10-13(SEQ ID NO：816)、 TAR2h-10-14(SEQ ID NO：817)、TAR2h-10-15(SEQ ID NO：818)、 TAR2h-10-16(SEQ ID NO：819)、TAR2h-10-17(SEQ ID NO：820)、 TAR2h-10-18(SEQ ID NO：821)、TAR2h-10-19(SEQ ID NO：822)、 TAR2h-10-20(SEQ ID NO：823)、TAR2h-10-21(SEQ ID NO：824)、 TAR2h-10-22(SEQ ID NO：825)、TAR2h-10-27(SEQ ID NO：826)、 TAR2h-10-29(SEQ ID NO：827)、TAR2h-10-31(SEQ ID NO：828)、 TAR2h-10-35(SEQ ID NO：829)、TAR2h-10-36(SEQ ID NO：830)、 TAR2h-10-37(SEQ ID NO：831)、TAR2h-10-38(SEQ ID NO：832)、 TAR2h-10-45(SEQ ID NO：833)、TAR2h-10-47(SEQ ID NO：834)、 TAR2h-10-48(SEQ ID NO：835)、TAR2h-10-57(SEQ ID NO：836)、 TAR2h-10-56 SEQ ID NO：837)、TAR2h-10-58(SEQ ID NO：838)、 TAR2h-10-66(SEQ ID NO：839)、TAR2h-10-64(SEQ ID NO：840)、 TAR2h-10-65(SEQ ID NO：841)、TAR2h-10-68(SEQ ID NO：842)、 TAR2h-10-69(SEQ ID NO：843)、TAR2h-10-67(SEQ ID NO：844)、 TAR2h-10-61(SEQ ID NO：845)、TAR2h-10-62(SEQ ID NO：846)、 TAR2h-10-63(SEQ ID NO：847)、TAR2h-10-60(SEQ ID NO：848)、 TAR2h-10-55(SEQ ID NO：849)、TAR2h-10-59(SEQ ID NO：850)、 TAR2h-10-70(SEQ ID NO：851)、TAR2h-34(SEQ ID NO：852)、 TAR2h-35(SEQ ID NO：853)、TAR2h-36(SEQ ID NO：854)、 TAR2h-37(SEQ ID NO：855)、TAR2h-38(SEQ ID NO：856)、 TAR2h-39(SEQ ID NO：857)、TAR2h-40(SEQ ID NO：858)、 TAR2h-41(SEQ ID NO：859)、TAR2h-42(SEQ ID NO：860)、 TAR2h-43(SEQ ID NO：861)、TAR2h-44(SEQ ID NO：862)、 TAR2h-45(SEQ ID NO：863)、TAR2h-47(SEQ ID NO：864)、 TAR2h-48(SEQ ID NO：865)、TAR2h-50(SEQ ID NO：866)、 TAR2h-51(SEQ ID NO：867)、TAR2h-66(SEQ ID NO：868)、 TAR2h-67(SEQ ID NO：869)、TAR2h-68(SEQ ID NO：870)、 TAR2h-70(SEQ ID NO：871)、TAR2h-71(SEQ ID NO：872)、 TAR2h-72(SEQ ID NO：873)、TAR2h-73(SEQ ID NO：874)、 TAR2h-74(SEQ ID NO：875)、TAR2h-75(SEQ ID NO：876)、 TAR2h-76(SEQ ID NO：877)、TAR2h-77(SEQ ID NO：878)、 TAR2h-78(SEQ ID NO：879)、TAR2h-79(SEQ ID NO：880)、 TAR2h-15(SEQ ID NO：881)、TAR2h-131-8(SEQ ID NO：882)、 TAR2h-131-24(SEQ ID NO：883)、TAR2h-15-8(SEQ ID NO：884)、 TAR2h-15-8-1(SEQ ID NO：885)、TAR2h-15-8-2(SEQ ID NO：886)、TAR2h-185-23(SEQ ID NO：887)、TAR2h-154-10-5(SEQ ID NO：888)、TAR2h-14-2(SEQ ID NO：889)、TAR2h-151-8(SEQ ID NO：890)、TAR2h-152-7(SEQ ID NO：891)、TAR2h-35-4(SEQ ID NO：892)、TAR2h-154-7(SEQ ID NO：893)、TAR2h-80(SEQ ID NO：894)、TAR2h-81(SEQ ID NO：895)、TAR2h-82(SEQ ID NO：896)、TAR2h-83(SEQ ID NO：897)、TAR2h-84(SEQ ID NO：898)、TAR2h-85(SEQ ID NO：899)、TAR2h-86(SEQ ID NO：900)、TAR2h-87(SEQ ID NO：901)、TAR2h-88(SEQ ID NO：902)、TAR2h-89(SEQ ID NO：903)、TAR2h-90(SEQ ID NO：904)、TAR2h-91(SEQ ID NO：905)、TAR2h-92(SEQ ID NO：906)、TAR2h-93(SEQ ID NO：907)、TAR2h-94(SEQ ID NO：908)、TAR2h-95(SEQ ID NO：909)、TAR2h-96(SEQ ID NO：910)、TAR2h-97(SEQ ID NO：911)、TAR2h-99(SEQ ID NO：912)、TAR2h-100(SEQ ID NO：913)、TAR2h-101(SEQ ID NO：914)、TAR2h-102(SEQ ID NO：915)、TAR2h-103(SEQ ID NO：916)、TAR2h-104(SEQ ID NO：917)、TAR2h-105(SEQ ID NO：918)、TAR2h-106(SEQ ID NO：919)、TAR2h-107(SEQ ID NO：920)、TAR2h-108(SEQ ID NO：921)、TAR2h-109(SEQ ID NO：922)、TAR2h-110(SEQ ID NO：923)、TAR2h-111(SEQ ID NO：924)、TAR2h-112(SEQ ID NO：925)、TAR2h-113(SEQ ID NO：926)、TAR2h-114(SEQ ID NO：927)、TAR2h-115(SEQ ID NO：928)、TAR2h-116(SEQ ID NO：929)、TAR2h-117(SEQ ID NO：930)、TAR2h-118(SEQ ID NO：931)、TAR2h-119(SEQ ID NO：932)、TAR2h-120(SEQ ID NO：933)、TAR2h-121(SEQ ID NO：934)、TAR2h-122(SEQ ID NO：935)、TAR2h-123(SEQ ID NO：936)、TAR2h-124(SEQ ID NO：937)、TAR2h-125(SEQ ID NO：938)、TAR2h-126(SEQ ID NO：939)、TAR2h-127(SEQ ID NO：940)、TAR2h-128(SEQ ID NO：941)、TAR2h-129(SEQ ID NO：942)、TAR2h-130(SEQ ID NO：943)、TAR2h-131(SEQ ID NO：944)、TAR2h-132(SEQ ID NO：945)、TAR2h-133(SEQ ID NO：946)、TAR2h-151(SEQ ID NO：947)、TAR2h-152(SEQ ID NO：948)、TAR2h-153(SEQ ID NO：949)、TAR2h-154(SEQ ID NO：950)、TAR2h-159(SEQ ID NO：951)、TAR2h-165(SEQ ID NO：952)、TAR2h-166(SEQ ID NO：953)、TAR2h-168(SEQ ID NO：954)、TAR2h-171(SEQ ID NO：955)、TAR2h-172(SEQ ID NO：956)、TAR2h-173(SEQ ID NO：957)、TAR2h-174(SEQ ID NO：958)、TAR2h-176(SEQ ID NO：959)、TAR2h-178(SEQ ID NO：960)、TAR2h-201(SEQ ID NO：961)、TAR2h-202(SEQ ID NO：962)、TAR2h-203(SEQ ID NO：963)、TAR2h-204(SEQ ID NO：964)、TAR2h-185-25(SEQ ID NO：965)、TAR2h-154-10 SEQ ID NO：966)、TAR2h-205(SEQ ID NO：967)、TAR2h-10(SEQ ID NO：968)、TAR2h-5(SEQ ID NO：969)、TAR2h-5d1(SEQ ID NO：970)、TAR2h-5d2(SEQ ID NO：971)、TAR2h-5d3(SEQ ID NO：972)、TAR2h-5d4(SEQ ID NO：973)、TAR2h-5d5(SEQ ID NO：974)、TAR2h-5d6(SEQ ID NO：975)、TAR2h-5d7(SEQ ID NO：976)、TAR2h-5d8(SEQ ID NO：977)、TAR2h-5d9(SEQ ID NO：978)、TAR2h-5d10(SEQ ID NO：979)、TAR2h-5d11(SEQ ID NO：980)、TAR2h-5d12(SEQ ID NO：981)和TAR2h-5d13(SEQ ID NO：982)。

在其他实施方案中，所述配体包括与肿瘤坏死因子受体1 (TNFR1、p55、CD120a)的特异性结合的域抗体((dAb)单体， Kd为300nM至5pM，并包含氨基酸序列，其至少约80％，至少 约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％， 至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约 98％，或至少约99％与选自下列的氨基酸序列或dAb同源： TAR2m-14(SEQ ID NO：983)、TAR2m-15(SEQ ID NO：984)、 TAR2m-19(SEQ ID NO：985)、TAR2m-20(SEQ ID NO：986)、 TAR2m-21(SEQ ID NO：987)、TAR2m-24(SEQ ID NO：988)、 TAR2m-21-23(SEQ ID NO：989)、TAR2m-21-07(SEQ ID NO：990)、TAR2m-21-43(SEQ ID NO：991)、TAR2m-21-48(SEQ ID NO：992)、TAR2m-21-10(SEQ ID NO：993)、TAR2m-21-06(SEQ ID NO：994)和TAR2m-21-17(SEQ ID NO：995)。

在一些实施方案中，所述配体包括与TNFR1结合，并与本文 所述任何dAb竞争与TNFR1(例如小鼠和/或人TNFR1)的结合 的dAb单体。

耐蛋白酶的dAb

本发明还涉及耐蛋白酶降解的dAb单体(例如丝氨酸蛋白 酶、半胱氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、 弹性蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、组织蛋白酶(例如组织蛋白酶 G)、蛋白酶3)，还涉及包括耐蛋白酶dAb的配体。蛋白酶 (如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶)在蛋白的 正常更新和代谢中发挥作用。但是在某些生理状态下，如炎症状 态(如COPD)和癌症，出现在组织、器官或动物中(如肺中， 在肿瘤中或靠近肿瘤)的蛋白酶量可增加。蛋白酶的这种增加可 导致内源性蛋白和施用的治疗肽、多肽和蛋白的加速降解和失 活。事实上，一些可体内使用(如用于治疗、诊断或预防疾病) 的物质因为被蛋白酶快速降解和失活，所以仅有有限的疗效。

本发明涉及耐蛋白酶降解的dAb或包括dAb配体。本发明所 述耐蛋白酶的dAb有几种优点。例如耐蛋白酶的dAb可施用于受 试者，与对蛋白酶敏感的物质相比能保持更长的体内活性。因 此，耐蛋白酶dAb的功能会保持一段时间，足以产生生物效应。

耐蛋白酶降解的dAb与蛋白酶在适于蛋白酶活性的条件下孵 育至少约2小时，至少约3小时，至少约4小时，至少约5小 时，至少约6小时，至少约7小时，至少约8小时，至少约9 小时，至少约10小时，至少约11小时，至少约12小时，至少 约24小时，至少约36小时，或至少约48小时时，大体上没有 被蛋白酶降解。与所述蛋白酶共同孵育至少约2小时后，当不超 过约25％，不超过约20％，不超过约15％，不超过约14％，不 超过约13％，不超过约12％，不超过约11％，不超过约10％， 不超过约9％，不超过约8％，不超过约7％，不超过约6％，不 超过约5％，不超过约4％，不超过约3％，不超过约2％，不超 过约1％，或大体上没有所述蛋白被蛋白酶降解时，dAb大体上 没有被降解。可用任何合适的方法如采用本文所述的SDS- PAGE，评估蛋白降解。

耐蛋白酶能力可使用任何合适的的方法评估。例如可将蛋白 酶加入合适缓冲(例如PBS)中的dAb溶液里，得到dAb/蛋白 酶溶液，例如至少约0.01％(w/w)蛋白酶，约0.01％至约5％ (w/w)蛋白酶，约0.05％至约5％(w/w)蛋白酶，约0.1％至约 5％(w/w)蛋白酶，约0.5％至约5％(w/w)蛋白酶，约1％至 约5％(w/w)蛋白酶，至少约0.01％(w/w)蛋白酶，至少约 0.02％(w/w)蛋白酶，至少约0.03％(w/w)蛋白酶，至少约 0.04％(w/w)蛋白酶，至少约0.05％(w/w)蛋白酶，至少约 0.06％(w/w)蛋白酶，至少约0.07％(w/w)蛋白酶，至少约 0.08％(w/w)蛋白酶，至少约0.09％(w/w)蛋白酶，至少约0.1％ (w/w)蛋白酶，至少约0.2％(w/w)蛋白酶，至少约0.3％(w/w) 蛋白酶，至少约0.4％(w/w)蛋白酶，至少约0.5％(w/w)蛋白 酶，至少约0.6％(w/w)蛋白酶，至少约0.7％(w/w)蛋白酶，至 少约0.8％(w/w)蛋白酶，至少约0.9％(w/w)蛋白酶，至少约 1％(w/w)蛋白酶，至少约2％(w/w)蛋白酶，至少约3％(w/w) 蛋白酶，至少约4％(w/w)蛋白酶，或约5％(w/w)蛋白酶的溶 液。所述dAb/蛋白酶混合物可在适合蛋白酶活性的温度下(例如 37℃)孵育，在时间间隔处(例如在1小时、2小时、3小时等) 取样，终止蛋白酶反应。可使用任何合适的方法分析样品的蛋白 降解，例如SDS-PAGE分析。结果可用于建立降解的时间进程。

在具体实施方案中，耐蛋白酶的dAb耐弹性蛋白酶降解。例 如，所述耐弹性蛋白的dAb于37℃在0.04％(w/w)的弹性蛋白 溶液中孵育至少约2小时时大体上没有降解。优选地，所述耐弹 性蛋白的dAb于37℃在0.04％(w/w)的弹性蛋白溶液中孵育至 少约12小时时大体上没有降解。更优选地，耐弹性蛋白的dAb 于37℃在0.04％(w/w)的弹性蛋白溶液中孵育至少约24小时， 至少约36小时，或至少约48小时时大体上没有降解。

在具体实施方案中，所述耐蛋白酶的dAb耐胰蛋白酶降解。 例如所述耐胰蛋白酶的dAb于37℃在0.04％(w/w)的胰蛋白酶 溶液中孵育至少约2小时时大体上没有降解。优选地，所述耐胰 蛋白酶的dAb于37℃在0.04％(w/w)的胰蛋白酶溶液中孵育至 少约3小时时大体上没有降解。更优选地，所述耐胰蛋白酶的 dAb于37℃在0.04％(w/w)的胰蛋白酶溶液中孵育至少约4小 时，至少约5小时，至少约6小时，至少约7小时，至少约8小 时，至少约9小时，至少约10小时，至少约11小时，或至少约 12小时时大体上没有降解。

在某些实施方案中，本发明不包括WO 2004/081026中公开 的TAR1-5-19。

优选地，所述耐蛋白酶的dAb是轻链可变域。例如所述耐蛋 白酶的dAb可以是Vκ或Vλ。

dAb耐蛋白酶可能与其熔点(Tm)有关。一般来说，更高的 熔点与耐蛋白酶有关。在一些实施方案中，所述耐蛋白酶dAb的 Tm在约40℃至约95℃，约40℃至约85℃，约40℃至约 80℃，约45℃至约95℃，约45℃  至约85℃，45℃至约 80℃，至少约40℃，至少约45℃，至少约50℃，至少约55℃， 至少约60℃，至少约65℃，至少约70℃，至少约75℃，至少约 80℃，至少约85℃，至少约90℃，或至少约95℃。

所述耐蛋白酶的dAb可以特异性结合任何所需靶标，如人或 动物蛋白，包括细胞因子、生长因子、细胞因子受体、生长因子 受体、酶(如蛋白酶)、酶和DNA结合蛋白的辅助因子、脂类和 碳水化合物。合适的靶标包括但不限于细胞因子、生长因子、细 胞因子受体、生长因子受体以及其它包括但不限于下述的蛋白： ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌营养素-1、CEA、CD40、CD40 配体、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受体、ENA-78、嗜酸 粒细胞趋化因子、嗜酸粒细胞趋化因子-2、Exodus-2、FAPα、酸 性FGF、碱性FGF、成纤维生长因子-10、FLT3配体、神经趋化 蛋白(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、人血清白蛋 白、胰岛素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-1受体、 IL-1受体1型、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72 a.a.)、IL-8(77 a.a.)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、 IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角质细 胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴趋化因子、苗勒 管抑制物质、单核细胞克隆抑制因子、单核细胞趋化蛋白、M- CSF、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a.)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、 MCP-3、MCP-4、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a.)、MIG、MIP- 1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、髓系祖细胞抑制因子-1 (MPIF-1)、NAP-2、神经营养因子、神经生长因子、β-NGF、NT- 3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF- 4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、干细胞因子 (SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、肿中瘤坏死因 子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF受体I、TNF受体II、TNIL- 1、TPO、VEGF、VEGF A、VEGF B、VEGF C、VEGF D、 VEGF受体1、VEGF受体2、VEGF受体3、GCP-2、 GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、 HER 3、HER 4、血清白蛋白、vWF、淀粉样蛋白(如α-淀粉样蛋 白)、MMP12、PDK1、IgE以及其他本文所公开的靶标。应该理 解该列举绝非穷举。

在一些实施方案中，所述耐蛋白酶的dAb与肺部组织的靶标 结合，如选自下述的靶标：TNFR1、IL-1、IL-1R、IL-4、IL-4R、 IL-5、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-8R、IL-9、IL-9R、IL-10、IL-12、 IL-12R、IL-13、IL-13Rα1、IL-13Ra2、IL-15、IL-15R、IL-16、 IL-17R、IL-17、IL-18、IL-18R、IL-23、IL-23R、IL-25、CD2、 CD4、CD11a、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、 CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcER1、TGFb、 CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12(SDF-1)、糜酶、 FGF、弗林蛋白酶、内皮素-1、嗜酸性粒细胞趋化因子  (如嗜酸 性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、嗜酸性粒细胞趋 化因子-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、I-309、整 合素、L-选择素、MIF、MIP4、MDC、MCP-1、MMPs、中性粒 细胞弹性蛋白酶、骨桥蛋白、OX-40、PARC、PD-1、RANTES、 SCF、SDF-1、siglec8、TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、 TRANCE、类胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α4β7、 CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、αvβ6、αvβ8、 cMET、CD8、vWF、淀粉样蛋白(α-淀粉样蛋白)、MMP12、 PDK1和IgE。

本发明所述耐蛋白酶的dAb可体内施用，与不能类似地抗蛋 白酶降解的化合物相比，其保持功能更久。本发明耐蛋白酶降解 的dAb可用于治疗炎症疾病(如通过肺部给药方式对肺部局部给 药，如鼻腔给药，如吸入给药)。例如通过给予对其有需要的受 试者治疗有效量的耐蛋白酶降解的dAb单体。本发明还涉及用于 治疗、诊断和/或预防的耐蛋白酶降解的dAb单体，以及本发明的 此种dAb在制备治疗本发明所述疾病的药物中的用途(例如炎症 疾病、关节炎、呼吸系统疾病)。

在具体实施方案中，所述耐蛋白酶的dAb单体可通过肺部给 药用于治疗炎症疾病、关节炎，或呼吸系统疾病。该耐蛋白酶的 dAb还可用于制备治疗炎症疾病、关节炎、或呼吸系统疾病的药 物，其中所述dAb单体经肺部给药。弹性蛋白酶和胰蛋白酶是肺 部最常见的蛋白酶。优选地，肺部给药的耐蛋白酶的dAb耐弹性 蛋白酶，耐胰酶，或耐弹性蛋白酶和胰酶。

在具体实施方案中，所述耐蛋白酶的dAb单体(如耐弹性蛋 白酶的dAb单体)和IL-1R1结合，并抑制IL-1(如IL-1α和/或 IL-1β)和受体结合，但不抑制IL-1ra和IL-1R1的结合，也不抑 制IL-1ra和包括此种dAb单体的配体结合。此种dAb单体可用作 治疗药物以治疗炎症疾病，或其他全部或部分地由IL-1和IL-1R1 结合诱导的生物功能所介导的疾病(例如局部或系统性炎症，炎 症调节介质(如IL-6、I1-8、TNF)的产生，发烧，免疫细胞(如 淋巴细胞、中性粒细胞)的激活、厌食症、低血压、白细胞减 少、血细胞减少)。所述耐蛋白酶的dAb单体可以结合IL-1R1， 并抑制IL-1R1功能而不干扰内源性IL-1R1抑制途径，例如内源 性IL-1ra和内源性IL-1R1的结合。因此这种dAb单体可施用于 受试者以补充体内抑制IL-1R1或IL-1活性的内源性调节途径。 此外，与IL-1R1结合但不抑制IL-1ra和IL-1R1结合的耐蛋白酶 dAb单体作为诊断物质使用是有利的，因为其可用于结合、检 测、定量或测量样本中的IL-1R1，并且不会与样本中的IL-1ra竞 争与IL-1R1的结合。因此样本中是否有以及有多少IL-1R1是可 以准确测定的。

与IL-1R1结合，并抑制IL-1(如IL-1α和/或IL-1β)与受体 结合，但不抑制IL-1ra和IL-1R1结合的耐蛋白酶dAb单体(如 耐弹性蛋白酶的dAb单体)还是有用的研究工具。例如这种dAb 单体可用于识别与IL-1R1结合，但不抑制IL-1ra和IL-1R1结合 的物质(如其他dAb，小的有机分子)。在一个说明性的实施例 中，在如本文所述受体结合检测的竞争性IL-1R1受体结合检测 中，检测了待检测的一种物质或物质的集合抑制IL-1与IL-1R1 结合的能力。在这种检测中抑制IL-1和IL-1R1结合的物质，可 随后在类似的竞争性IL-1R1受体结合检测中研究其是否与和IL- 1R1结合但不抑制IL-1ra和IL-1R1结合的dAb单体竞争。在这种 检测中的竞争性结合表明该物质与IL-1R1结合，并抑制IL-1与 受体的结合，但不抑制IL-1ra与受体结合。

在一些实施方案中，所述耐蛋白酶的dAb与IL-1R1结合，并 与本文公开的任何dAb竞争与IL-1R1的结合(例如人IL- 1R1)。在一些实施方案中，所述dAb至少耐弹性蛋白酶和/或胰 蛋白酶。

在其他实施方案中，所述耐蛋白酶的dAb与抗IL-1R1的dAb 竞争与IL-1R1的结合，其中所述抗IL-1R1的dAb包含氨基酸序 列，其至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至 少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约 96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％与选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：349的氨基酸序列或dAb同源。

在其他实施方案中，所述耐蛋白酶的dAb与抗IL-1R1的dAb 竞争与IL-1R1的结合，其中所述抗IL-1R1的dAb包含氨基酸序 列，其至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至 少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约 96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％与选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列或dAb同源。

在其他实施方案中，所述耐蛋白酶的dAb与抗IL-1R1的dAb 竞争与IL-1R1的结合，其中所述抗IL-1R1的dAb包含氨基酸序 列，其至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至 少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约 96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％与选自SEQ ID NO：3至或SEQ ID NO：7的氨基酸序列或dAb同源。

在其他实施方案中，所述耐蛋白酶的dAb与抗IL-1R1的dAb 竞争与IL-1R1的结合，其中所述抗IL-1R1的dAb包含氨基酸序 列DOM4-130-54(SEQ ID NO：7)或氨基酸序列，其至少约80％， 至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约 93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至 少约98％，或至少约99％与DOM4-130-54(SEQ ID NO：7)同源。

配体形式

配体或dAb单体可形成单或多特异性抗体或抗体片段，或形 成单或多非抗体结构。合适的形式包括任何合适的多肽结构，其 中为了具有对结构上抗原的结合特异性可包括抗体可变域或其一 种或多种的CDR。各种合适的抗体形式为本领域所公知，例如 IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特 异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同型二聚 体和异型二聚体、任何上述的抗原结合片段(如Fv片段(单链 Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片 段)、单可变域(如VH、VL、VHH)、dAb和任何上述经修饰的 形式(如经聚烷撑二醇(如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或 其他合适的聚合物共价连接修饰)。参见2003年6月30日提交 的指定美国的  PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)，是关于 PEG化的单可变域和dAb，制备相同的体内半衰期增加的PEG化 单可变域、dAb单体和多聚物的合适方法，合适的PEG，优选流 体大小的PEG，优选流体大小的PEG化的单可变域和dAb单体 以及多聚物。PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全部教 导，包括上述所指的部分，都在此引作参考。

配体可以形成所需dAb单体的二聚体、三聚体或多聚体形 式，例如使用合适的接头如(Gly4Ser)n，n＝从1至8，例如2、3、 4、5、6或7。如果需要，配体，包括dAb单体、二聚体和三聚 体，可连接至抗体Fc区，包括CH2和CH3区的其中之一或两 者，以及任选的铰链区。例如编码作为单核苷酸序列连接到Fc区 的配体的载体可用于制备这样的多肽。

配体和dAb单体还可结合和/或形成非抗体多配体结构，从而 形成与靶分子结合的多价复合体，因而有很好的亲和力。例如天 然的细菌受体如SpA可用作CDRs移植的支架以生成特异性结合 一种或多种表位的配体。该方法的细节在US 5,831,012中有描 述。其他合适的支架包括基于纤维连接蛋白和亲和体的那些。合 适方法的细节在WO 98/58965中有描述。其他合适的支架包括在 van den Beuken et al.，J.Mol.Biol.310：591-601(2001)中描述的脂笼 蛋白和CTLA4，以及如在WO 00/69907(Medical Research Council)中所描述的那些支架，其是基于例如细菌GroEL的环结 构或其他分子伴侣多肽。蛋白支架可以相结合；例如CDRs可移 植到CTLA4支架上，与免疫球蛋白VH或VL区合用以形成配 体。同样地，纤维连接蛋白、脂笼蛋白和其他支架可以相结合。

制备任何所需形式的各种合适方法为本领域所知。例如抗体 链和形式(例如IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、 单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或 轻链的同型二聚体和异型二聚体)可通过合适的表达构建体的表 达和/或合适细胞的培养(例如杂交瘤、异种杂交瘤、含有编码所 述形式的重组构建物的重组宿主细胞)而制备。进一步地，如抗 体或抗体链的抗原结合片段的形式(如Fv片段(如单链Fv (scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片 段)可通过合适的表达构建物的表达，或抗体的例如使用木瓜蛋 白酶或胃蛋白酶的酶消化而进行制备。

所述配体可以形成如WO 03/002609中所述的双特异性配体 或多特异性配体，其所有的教导都在此引作参考。双特异性抗体 包括具有不同结合特异性的免疫球蛋白单可变域。这种双特异性 抗体可包括重链和轻链区的结合。例如该双特异性配体可包括VH 区和VL区，其可连接在一起形成scFv(例如使用合适的如 Gly4Ser的接头)，或形成其双特异性抗体或抗原结合片段(如 F(ab’)2片段)。所述双特异性抗体不包括互补的VH/VL对，其形 成与抗原或表位都结合的常规双链抗体抗原结合位点。而所述双 形式的配体包括VH/VL互补对，其中所述V区具有不同的结合特 异性。

此外，如果需要则所述双特异性配体可包括一种或多种CH 或CL域。如果需要还可包括铰链区。域的这种组合可以例如模 拟天然抗体，如IgG、IgM或其片段，如Fv、scFv、Fab或 F(ab’)2分子。也可设想其他结构如包括VH，VL，CH1和CL域的 IgG分子的单臂。优选地，虽然几种这样的配体可一起包含在同 样的蛋白中，但本发明的所述双特异性配体仅包括两种可变域， 例如两种这样的配体可包含在IgG或多体免疫球蛋白，如IgM 中。或者在另一实施方案中，多数双特异性配体组合形成多聚 体。例如，两种不同的双特异性配体组合形成四特异性分子。本 领域技术人员会理解，依照本发明的方法制备的双特异性配体的 轻或重可变域可以在相同的多肽链上，或者在不同的多肽链上。 至于可变域在不同的多肽链上，它们可随后可通过接头，一般是 弹性接头(如多肽链)、化学连接基团，或通过任何本领域所知 的其他方法连接起来。

所述多特异性配体具有超过一个表位的结合特异性。一般来 说，所述多特异性配体包括两个或多个表位结合域，如dAb或包 括表位结合位点的非抗体蛋白域，如亲和体、SpA域、LDL受体 A类域、EGF域、Avimer。多特异性配体可如本文所述进一步形 成。

在一些实施方案中，所述配体是IgG样的形式。这样的形式 具有IgG分子的常规四条链结构(两条重链和两条轻链)，其中 一个或多个单可变域已被具有所需特异性的dAb或单可变域取 代。优选地每个可变域(两个VH区和两个VL区)被dAb或单 可变域取代。包括在IgG样形式中的所述dAb或单可变域可以具 有相同的或不同的特异性。在一些实施方案中，所述IgG样形式 是四价的，可以有一种、两种、三种或四种特异性。例如，所述 IgG样形式可以是单特异性的，包括具有相同特异性的四种 dAb；双特异性的，包括具有相同特异性的三种dAb和另一种具 有不同特异性的dAb；双特异性的，包括具有相同特异性的两种 dAb和两种具有一般但不同特异性的dAb；三特异性的，包括具 有相同特异性的第一和第二dAb，具有不同特异性的第三dAb和 具有不同于第一、第二和第三dAb特异性的第四dAb；或四特异 性的，包括四种dAb，每种都有不同的特异性。可以制备IgG样 形式的抗原结合片段(如Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、scFv)。优选 地该IgG样形式或其抗原结合片段与TNFR1不交联。

半衰期延长的形式

所述配体如dAb单体，可形成其体内血清半衰期延长的形 式。体内半衰期增加对于免疫球蛋白的体内应用是有用的，尤其 是抗体，最尤其的是如dAb小抗体片段。这样的片段(Fvs、二硫 键连接的Fvs、Fabs、scFvs、dAbs)从体内被迅速清除，会限制 其临床应用。

如dAb单体的小的配体可以形成抗体的更大的抗原结合片段 或抗体(如形成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。配体 (如dAb单体)可形成抗体的更大的抗原结合片段或更大的流体 大小的抗体(如形成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。 还可形成更大的流体大小的配体，例如通过连接聚烷撑二醇基团 (如聚乙二醇(PEG)基团、聚丙二醇、聚丁二醇)、血清白蛋 白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或至少其转铁蛋白结合部分、抗体 Fc区，或通过与抗体域共轭。在一些实施方案中，所述配体(如 dAb单体)是PEG化的。优选地，所述PEG化的配体(如dAb 单体)与IL-1R1结合，其亲和力与非PEG化的相同配体大体相 同。例如所述配体可以是与IL-1R1结合的PEG化的dAb单体， 其中PEG化的dAb单体结合IL-1R1的亲和力，与非PEG化形式 的dAb亲和力的差异不超过约1000的系数，优选不超过约100 的系数，更优选不超过约10的系数，或相对于非PEG形式其亲 和力大体没有改变。参见2003年6月30日提交的指定美国的 PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)，关于PEG化的单可变域 和dAb，制备相同的体内半衰期增加的PEG化单可变域、dAb单 体和多聚物的合适方法，合适的PEG，优选流体大小的PEG，优 选流体大小的PEG化单可变域、dAb单体和多聚物。 PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全部教导，包括上述所 指的部分，在此引作参考。

本发明所述流体大小的配体(如dAb单体和多聚体)可使用 本领域公知的方法测定。例如凝胶过滤层析法可用于测定流体大 小的配体。测定流体大小的配体的合适凝胶过滤基质如交联琼脂 糖基质，是公知的并且容易得到。

配体形式的大小(如连接在dAb单体的PEG部分的大小) 可随所需的应用而变化。例如如果希望配体离开循环系统进入外 周组织，理想的是保持流体大小的配体小到利于从血流外渗。或 者如果需要配体在体循环中保留更长的时间，则可增加配体的大 小，例如通过形成Ig样蛋白或通过加上30至60kDa的PEG部 分(如线性或支链的PEG 30至40kDa PEG，比如加上两个 20kDa的PEG部分)。

如本文所述，配体(如dAb单体)的流体大小及其血清半衰 期还可通过使所述配体与结合域(如抗体或抗体片段)共轭或相 连接而增加，所述结合域指与增加体内半衰期的抗原或表位相结 合的结合域。例如所述配体(如  dAb单体)可以与抗血清白蛋 白或抗新生儿Fc受体抗体或抗体片段，如抗SA或抗新生儿Fc 受体dAb、Fab、Fab’或scFv，或抗SA亲和体或抗新生儿Fc受 体亲和体共轭或连接。

用于根据本发明的配体的合适白蛋白、白蛋白片段或白蛋白 变体的例子在WO 2005/077042A2中有描述，其全部在此引作参 考。尤其地，下述白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体可用于本发 明：

·SEQ ID NO：1(如在WO 2005/077042A2所描述的，该序列 明确地在本公开中引作参考)；

·包括或由WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸1- 387组成的白蛋白片段或变体；

·白蛋白，或其片段或变体，包括选自下述氨基酸序列： (a)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸54至61； (b)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸76至89； (c)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸92至100； (d)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸170至176； (e)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸247至252； (f)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸266至277； (g)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸280至288； (h))WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸362至368； (i)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸439至447； (j)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸462至475； (k))WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸478至486； 和(l))WO 2005/077042A2中SEQ ID NO：1的氨基酸560至 566。

用于根据本发明的配体的合适白蛋白、片段或类似物的进一 步的例子在WO 2005/077042A2中有描述，其全部在此引作参 考。尤其地，下述白蛋白、片段或变体可用于本发明：

·如在WO 03/076567A2中描述的人血清白蛋白，如图3(该 序列信息明确地在本公开中引作参考)；

·人血清白蛋白(HA)由585个氨基酸的单非糖基化的多肽 链组成，分子量为66,500(参见Meloun，et al.，FEBS Letters 58：136(1975)；Behrens，et al.，Fed.Proc.34：591(1975)；Lawn，et al.， Nucleic Acids Research 9：6102-6114(1981)；Minghetti，et al.，J.Biol. Chem.261：6747(1986))；

·如Weitkamp，et al.，Ann.Hum.Genet.37：219(1973)中所描述 的白蛋白的多态性变体或类似物或片段；

·如EP 322094中描述的白蛋白片段或变体，如HA(1-373)、 HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)和HA(1-419)以及1-369和1- 419之间的片段。

·如EP 399666中描述的白蛋白片段或变体，如HA(1-177)和 HA(1-200)以及HA(1-X)之间的片段，其中X是178至199的任 何数。

如果一种或多种半衰期延长的部分(如白蛋白、转铁蛋白以 及其片段以及类似物)被用于本发明的配体，则可以使用任何合 适的方法使其共轭，如通过与IL-1R1结合部分(如抗IL-1R1的 dAb或抗体片段)直接融合，例如通过使用编码融合蛋白的单核 苷酸构建物，其中所述融合蛋白被编码为带有位于所述IL-1R1结 合部分N端或C端的半衰期延长部分的单多肽链。或者可通过在 各部分间使用肽接头以实现共轭，如WO 03/076567A2或WO 2004/003019中描述的肽接头(这些接头的公开在本公开中引作参 考，提供用于本发明的例子)。

典型地，增加体内血清半衰期的多肽是体内自然生成并抗降 解或抗内源性机制的去除的多肽，所述内源性机制是从有机体 (如人)去除不需要的物质。例如增加体内血清半衰期的多肽可选 自：细胞外基质蛋白，血液中的蛋白，血脑屏障或神经组织中的 蛋白，集中在肾、肝、肺、心脏、皮肤或骨骼的蛋白、应激蛋 白、疾病特异性蛋白，或涉及Fc转运的蛋白。

增加血清体内半衰期的合适多肽，例如转铁蛋白受体特异性 配体-神经药物融合蛋白(参见美国专利No.5,977,307，其教导在 此引作参考)，脑毛细血管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白 受体(如可溶转铁蛋白受体)、胰岛素、胰岛素样生长因子1 (IGF 1)受体、胰岛素样生长因子2(IGF 2)受体、胰岛素受 体、凝血因子X、α1-抗胰蛋白酶和HNF 1α。增加血清半衰期的 合适多肽还包括α-1糖蛋白(血清类粘蛋白；AAG)、α-1抗糜蛋 白酶(ACT)、α-1微球蛋白(蛋白HC；AIM)、抗凝血酶III (AT III)、载脂蛋白A-1(Apo A-1)、载脂蛋白B  (Apo B)、铜 蓝蛋白(Cp)、补体成分C3(C3)、补体成分C4(C4)、C1 酯酶抑制剂(C1 INH)、C-反应蛋白(CRP)、铁蛋白 (FER)、血色素结合蛋白(HPX)、脂蛋白(a)  (Lp(a))、甘露 糖结合蛋白(MBP)、肌红蛋白(Myo)、前白蛋白(甲状腺素 运载蛋白；PAL)、视黄醇结合蛋白(RBP)和类风湿因子 (RF)。

合适的细胞外基质蛋白包括，例如胶原、层粘连蛋白、整合 素和纤维连接蛋白。胶原是细胞外基质的主要蛋白。最近已知约 有15种胶原分子在身体的不同部分被发现，如I型胶原(占身体 胶原的90％)在骨骼、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏器官中被发 现，或II型胶原在软骨、椎间盘、脊索和眼玻璃体液中被发现。

来自血液的合适蛋白包括，例如血浆蛋白(如纤维蛋白、α-2 巨球蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原(如纤维蛋白原A、纤维蛋 白原B)、血清淀粉样蛋白A、结合珠蛋白、抑制蛋白、泛素、 子宫球蛋白和β-2-巨球蛋白)、酶和酶抑制剂(如  纤溶酶原、 溶菌酶、胱抑素C、α-1-抗胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂)、免疫 系统蛋白、如免疫球蛋白(如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫 球蛋白轻链(κ/λ))、转运蛋白(如视黄醇结合蛋白、α-1巨球蛋 白)、防御素(如  β-防御素1、中性粒细胞防御素1、中性粒细 胞防御素2和中性粒细胞防御素3)等等。

血脑屏障或神经组织中发现的合适蛋白包括，例如黑素皮质 素受体、髓鞘、抗坏血酸转运体等等。

增加血清体内半衰期的合适多肽还包括集中在肾的蛋白(如 多囊蛋白、IV型胶原、有机阴离子转运体K1、Heymann抗原) 集中在肝脏的蛋白(如乙醇脱氢酶、G250)、集中在肺的蛋白 (如与IgA结合的分泌片)、集中在心脏的蛋白(如与扩张性心肌 病相关的HSP 27)、集中在皮肤的蛋白(如角蛋白)、骨特异性 蛋白，如形态发生蛋白(BMPs)，其为表现出成骨活性的转化生 长因子β超家族蛋白的亚群(例如BMP-2、BMP-4、BMP-5、 BMP-6、BMP-7、BMP-8)，肿瘤特异性蛋白(如滋养层抗原、 herceptin受体、雌激素受体、组织蛋白酶(如组织蛋白酶B，其 可在肝脏及脾脏中发现))。

合适的疾病特异性蛋白包括，例如仅在活化的T细胞上表达 的抗原，包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)、骨保护素配体 (OPGL；参见Nature 402，304-309(1999))；OX40(TNF受体家 族成员，在活化的T细胞上表达，并在嗜人T细胞白血病病毒I 型(HTLV-I)生成细胞中被特异性上调；参见Immunol.165 (1)：263-70(2000))。合适的疾病特异性蛋白还包括，例如金属蛋 白酶(与关节炎/癌症相关)，包括果蝇CG6512、人paraplegin、 人FtsH、人AFG3L2、小鼠ftsH；以及血管生长因子，包括酸性 成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子 (FGF-2)、血管内皮生长因子/血管渗透因子(VEGF/VPF)、转 化生长因子-α(TGFα)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管生 成素、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-8(IL-8)、血小板 源性内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(P1GF)、中 期因子血小板源性生长因子-BB(PDGF)，以及趋化因子。

增加血清体内半衰期的合适多肽还包括如热休克蛋白 (HSPs)的应激蛋白。HSPs正常是在细胞内发现的。当其在细胞 间被发现时则表明细胞已经死亡，细胞内容物溢出。这种非程序 性细胞死亡(坏死)作为创伤、疾病或损伤的结果而发生，细胞 外HSPs引发免疫系统的反应。与细胞外HSP结合可导致本发明 的组合物集中在疾病部位。

涉及Fc转运的合适蛋白包括，例如Brambell受体(还被称 为FcRB)。该Fc受体有两种功能，都对传递有潜在用处。所述 功能是(1)通过胎盘从母亲向孩子转运IgG(2)保护IgG免受 讲解从而延长其血清半衰期。人们认为受体循环利用来自核内体 的IgG。(参见Holliger et al，Nat Biotechnol 15(7)：632-6 (1997).)。

配体半衰期的药代动力学分析和测定方法是本领域技术人员 来熟悉的。详情在Kenneth，A et al：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists和Peters et al， Pharmacokinetc analysis：A Practical Approach(1996)中可找到。供 参考的还有“Pharmacokinetics”，M Gibaldi & D Perron，Marcel Dekker出版，2nd Rev.ex edition(1982)，其描述了药代动力学参数 如tα和tβ半衰期和曲线下面积(AUC)。

核酸分子、载体和宿主细胞

本发明还提供编码本文所述抗IL-1R1和dAb单体的分离的 和/或重组核酸分子，包括双特异性配体(如与IL-1R1和血清白 蛋白结合的配体；与IL-1R1和TNFR1结合的配体)和多特异性 配体(如与IL-1R1、血清白蛋白和TNFR1结合的配体)。本发 明还提供分离的和/或重组核酸分子，其编码抗dAb单体或配体的 蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽 酶、组织蛋白酶(如组织蛋白酶G)和蛋白酶3)，所述配体包 括本文所述的抗蛋白酶的dAb单体。

在特定实施方案中，所述分离的和/或重组核酸包括编码域抗 体(dAb)的核苷酸序列，该域抗体与IL-1R特异性结合，抑制 IL-1(如IL-1α和/或IL-1β)和IL-1ra与IL-1R1的结合，还包含 氨基酸序列，其至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约 91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至 少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％与选自下列 的氨基酸序列或dAb同源：DOM4-122-23(SEQ ID NO：1)、 DOM4-122-24(SEQ ID NO：2)、DOM4-122(SEQ ID NO：95)、 DOM4-122-1(SEQ ID NO：96)、DOM4-122-2(SEQ ID NO：97)、 DOM4-122-3(SEQ ID NO：98)、DOM4-122-4(SEQ ID NO：99)、 DOM4-122-5(SEQ ID NO：100)、DOM4-122-6(SEQ ID NO：101)、 DOM4-122-7(SEQ ID NO：102)、DOM4-122-8(SEQ ID NO：103)、 DOM4-122-9(SEQ ID NO：104)、DOM4-122-10(SEQ ID NO：105)、 DOM4-122-11(SEQ ID NO：106)、DOM4-122-12(SEQ ID NO：107)、DOM4-122-13(SEQ ID NO：108)、DOM4-122-14(SEQ ID NO：109)、DOM4-122-15(SEQ ID NO：110)、DOM4-122-16 (SEQ ID NO：111)、DOM4-122-17(SEQ ID NO：112)、DOM4-122- 18(SEQ ID NO：113)、DOM4-122-19(SEQ ID NO：114)、DOM4- 122-20(SEQ ID NO：115)、DOM4-122-21(SEQ ID NO：116)、 DOM4-122-22(SEQ ID NO：117)、DOM4-122-25(SEQ ID NO：118)、DOM4-122-26(SEQ ID NO：119)、DOM4-122-27(SEQ ID NO：120)、DOM4-122-28(SEQ ID NO：121)、DOM4-122-29 (SEQ ID NO：122)、DOM4-122-30(SEQ ID NO：123)、DOM4-122- 31(SEQ ID NO：124)、DOM4-122-32(SEQ ID NO：125)、DOM4- 122-33(SEQ ID NO：126)、DOM4-122-34(SEQ ID NO：127)、 DOM4-122-35(SEQ ID NO：128)、DOM4-122-36(SEQ ID NO：129)、DOM4-122-37(SEQ ID NO：130)、DOM4-122-38(SEQ ID NO：131)、DOM4-122-39(SEQ ID NO：132)、DOM4-122-40 (SEQ ID NO：133)、DOM4-122-41(SEQ ID NO：134)、DOM4-122- 42(SEQ ID NO：135)、DOM4-122-43(SEQ ID NO：136)、DOM4- 122-44(SEQ ID NO：137)、DOM4-122-45(SEQ ID NO：138)、 DOM4-122-46(SEQ ID NO：139)、DOM4-122-47(SEQ ID NO：140)、DOM4-122-48(SEQ ID NO：141)、DOM4-122-49(SEQ ID NO：142)、DOM4-122-50(SEQ ID NO：143)、DOM4-122-51 (SEQ ID NO：144)、DOM4-122-52(SEQ ID NO：145)、DOM4-122- 54(SEQ ID NO：146)、DOM4-122-55(SEQ ID NO：147)、DOM4- 122-56(SEQ ID NO：148)、DOM4-122-57(SEQ ID NO：149)、 DOM4-122-58(SEQ ID NO：150)、DOM4-122-59(SEQ ID NO：151)、DOM4-122-60(SEQ ID NO：152)、DOM4-122-61(SEQ ID NO：153)、DOM4-122-62(SEQ ID NO：154)、DOM4-122-63 (SEQ ID NO：155)、DOM4-122-64(SEQ ID NO：156)、DOM4-122- 65(SEQ ID NO：157)、DOM4-122-66(SEQ ID NO：158)、DOM4- 122-67(SEQ ID NO：159)、DOM4-122-68(SEQ ID NO：160)、 DOM4-122-69(SEQ ID NO：161)、DOM4-122-70(SEQ ID NO：162)、DOM4-122-71(SEQ ID NO：163)、DOM4-122-72(SEQ ID NO：164)和DOM4-122-73(SEQ ID NO：165)。

在特定实施方案中，所述分离的和/或重组核酸包括编码域抗 体(dAb)单体的核苷酸序列，该域抗体单体对IL-1R1具有结合 特异性，抑制IL-1与受体的结合，其中所述核苷酸序列与选自下 列的核苷酸序列具有至少约80％，至少约85％，至少约90％，至 少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约 95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的 核苷酸序列一致性：DOM4-122-23(SEQ ID NO：1)、DOM4-122-24 (SEQ ID NO：2)、DOM4-122(SEQ ID NO：95)、DOM4-122-1(SEQ ID NO：96)、DOM4-122-2(SEQ ID NO：97)、DOM4-122-3(SEQ ID NO：98)、DOM4-122-4(SEQ ID NO：99)、DOM4-122-5(SEQ ID NO：100)、DOM4-122-6(SEQ ID NO：101)、DOM4-122-7(SEQ ID NO：102)、DOM4-122-8(SEQ ID NO：103)、DOM4-122-9(SEQ ID NO：104)、DOM4-122-10(SEQ ID NO：105)、DOM4-122-11(SEQ ID NO：106)、DOM4-122-12(SEQ ID NO：107)、DOM4-122-13 (SEQ ID NO：108)、DOM4-122-14(SEQ ID NO：109)、DOM4-122- 15(SEQ ID NO：110)、DOM4-122-16(SEQ ID NO：111)、DOM4- 122-17(SEQ ID NO：112)、DOM4-122-18(SEQ ID NO：113)、 DOM4-122-19(SEQ ID NO：114)、DOM4-122-20(SEQ ID NO：115)、DOM4-122-21(SEQ ID NO：116)、DOM4-122-22(SEQ ID NO：117)、DOM4-122-25(SEQ ID NO：118)、DOM4-122-26 (SEQ ID NO：119)、DOM4-122-27(SEQ ID NO：120)、DOM4-122- 28(SEQ ID NO：121)、DOM4-122-29(SEQ ID NO：122)、DOM4- 122-30(SEQ ID NO：123)、DOM4-122-31(SEQ ID NO：124)、 DOM4-122-32(SEQ ID NO：125)、DOM4-122-33(SEQ ID NO：126)、DOM4-122-34(SEQ ID NO：127)、DOM4-122-35(SEQ ID NO：128)、DOM4-122-36(SEQ ID NO：129)、DOM4-122-37 (SEQ ID NO：130)、DOM4-122-38(SEQ ID NO：131)、DOM4-122- 39(SEQ ID NO：132)、DOM4-122-40(SEQ ID NO：133)、DOM4- 122-41(SEQ ID NO：134)、DOM4-122-42(SEQ ID NO：135)、 DOM4-122-43(SEQ ID NO：136)、DOM4-122-44(SEQ ID NO：137)、DOM4-122-45(SEQ ID NO：138)、DOM4-122-46(SEQ ID NO：139)、DOM4-122-47(SEQ ID NO：140)、DOM4-122-48 (SEQ ID NO：141)、DOM4-122-49(SEQ ID NO：142)、DOM4-122- 50(SEQ ID NO：143)、DOM4-122-51(SEQ ID NO：144)、DOM4- 122-52(SEQ ID NO：145)、DOM4-122-54(SEQ ID NO：146)、 DOM4-122-55(SEQ ID NO：147)、DOM4-122-56(SEQ ID NO：148)、DOM4-122-57(SEQ ID NO：149)、DOM4-122-58(SEQ ID NO：150)、DOM4-122-59(SEQ ID NO：151)、DOM4-122-60 (SEQ ID NO：152)、DOM4-122-61(SEQ ID NO：153)、DOM4-122- 62(SEQ ID NO：154)、DOM4-122-63(SEQ ID NO：155)、DOM4- 122-64(SEQ ID NO：156)、DOM4-122-65(SEQ ID NO：157)、 DOM4-122-66(SEQ ID NO：158)、DOM4-122-67(SEQ ID NO：159)、DOM4-122-68(SEQ ID NO：160)、DOM4-122-69(SEQ ID NO：161)、DOM4-122-70(SEQ ID NO：162)、DOM4-122-71 (SEQ ID NO：163)、DOM4-122-72(SEQ ID NO：164)和DOM4-122- 73(SEQ ID NO：165)。

在其他实施方案中，所述分离的和/或重组核酸包括编码抗本 文所述耐蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白 酶、羧肽酶、组织蛋白酶(如组织蛋白酶G)和蛋白酶3)的 dAb的核苷酸序列。

本发明还提供包括本发明的重组核酸分子的载体。在特定实 施方案中，该载体是包括一种或多种可操作地连接到本发明重组 核酸的表达调控元件或序列的表达载体。本发明还提供包括本发 明的重组核酸分子或载体的重组宿主细胞。合适的载体(例如质 粒、噬菌体展示载体)、表达调控元件、宿主细胞和制备本发明 重组宿主细胞的方法在本领域是公知的，本文的实施例会进一步 说明。

合适的表达载体可含有若干构件，例如复制起点、选择标记 基因、一种或多种表达调控元件如转录调控元件(如启动子、增 强子、终止子)和/或一种或多种翻译信号、信号序列或前导序列 等等。表达调控元件和信号序列如果存在，则由载体或其他来源 提供。例如编码抗体链的克隆核酸的转录和/或翻译调控序列可用 于直接表达。

可提供启动子用于所需宿主细胞内的表达。启动子可以是组 成型的或诱导型的。例如，启动子可以是可操作地连接到编码抗 体、抗体链或其部分的核酸上，从而引导核酸转录。可获得各种 原核细胞(如大肠杆菌的1ac、tac、T3、T7启动子)和真核细胞 (如猴病毒40早期或晚期启动子，劳氏肉瘤病毒长末端重复序 列、巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子)宿主的合适启动 子。

此外，表达载体通常包括筛选携带所述载体的宿主细胞的选 择性标记，对于复制表达载体来说，还包括复制起点。编码具有 抗菌或耐药性的产物的基因是常用选择性标记，可用于原核细胞 (如内酰胺酶基因(耐氨苄西林)、四环素抗性的Tet基因)和真 核细胞(如新霉素(G418或遗传霉素)、谷丙转氨酶(霉酚 酸)、氨苄西林或潮霉素抗性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因 在多种宿主细胞中允许用甲氨蝶呤进行筛选。编码宿主基因缺陷 型标记的基因产物的基因(LEU2、URA3、HIS3)常用于酵母中 的选择性标记。使用病毒(例如杆状病毒)或噬菌体载体，以及 能整合到宿主细胞基因组的载体如逆转录病毒载体，也在考虑范 围中。在哺乳动物细胞和原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞(果 蝇Schnieder S2细胞、Sf9)和酵母(甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤 酵母、酿酒酵母)中表达的合适的表达载体为本领域所公知。

合适的宿主细胞可以是原核的，包括细菌细胞如大肠杆菌、 枯草杆菌和/或其他合适的细菌；真核细胞，如真菌或酵母细胞 (如毕赤酵母、曲霉、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、粗糙脉胞菌)或 其他更低等的真核细胞，以及更高等的真核细胞如昆虫细胞(果 蝇Schnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO 94/26087 (O’Connor))，哺乳动物细胞(例如COS细胞，如COS-1 (ATCC检索号No.CRL-1650)和COS-7(ATCC检索号No.CRL- 1651)、CHO(如ATCC检索号No.CRL-9096、CHO DG44 (Urlaub，G.and Chasin，LA.，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，77(7)：4216- 4220(1980)))、293(ATCC检索号No.CRL-1573)、HeLa(ATCC 检索号No.CCL-2)、CV1(ATCC检索号No.CCL-70)、WOP (Dailey，L.，et al.，J.Virol.，54：739-749(1985)、3T3、293T(Pear，W. S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90：8392-8396(1993))NS0细 胞、SP2/0、HuT 78细胞等等，或植物细胞(如烟草)。(参见 例如Ausubel，F.M.et al.，eds.Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993).)在一些实施方案中，所述宿主细胞是分离的宿主细胞， 不是多细胞有机体(如植物或动物)的一部分。在优选的实施方 案中，宿主细胞是非人的宿主细胞。

本发明还提供制备本发明的配体(如dAb单体、双特异性配 体、多特异性配体)的方法，包括将包括本发明的重组核酸的重 组宿主细胞保持在适合重组核酸表达的条件下，从而使重组核酸 得以表达并且生成配体。在一些实施方案中，所述方法进一步包 括分离所述配体。

基于免疫球蛋白的配体的制备

根据本发明的配体(如双特异性配体、dAb单体)可根据以 往确立的用于抗体工程领域的技术制备，用于scFv、“噬菌体”抗 体和其他基因工程抗体分子的制备。用于制备所述抗体的技术如 下列综述和其引用文献中所描述的：Winter & Milstein，(1991) Nature 349：293-299；Pluckthun(1992)Immunological Reviews 130：151-188；Wright et al.，(1992)Crti.Rev.Immunol.12：125-168； Holliger，P.& Winter，G.(1993)Curr.Op.Biotechn.4，446-449； Carter，et al.(1995)J.Hematother.4，463-470；Chester，K.A.& Hawkins，R.E.(1995)Trends Biotechn.13，294-300；Hoogenboom， H.R.(1997)Nature Biotechnol.15，125-126；Fearon，D.(1997)Nature Biotechnol.15，618-619；Plückthun，A.& Pack，P.(1997) Immunotechnology 3，83-105；Carter，P.& Merchant，A.M.(1997) Curr.Opin.Biotechnol.8，449-454；Holliger，P.& Winter，G.(1997) Cancer Immunol.Immunother.45，128-130。

筛选具有所需特异性的抗体可变域所采用的合适技术使用的 是本领域已知的库和筛选方法。使用从人B细胞采集到的重排V 基因的天然库(Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.，222：581；Vaughan et al.(1996)Nature Biotech.，14：309)为本领域技术人员所公知。合 成库((Hoogenboom & Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381； Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457；Nissim et al.(1994)EMBO J.，13：692；Griffiths et al.(1994)EMBO J.，13： 3245；De Kruif et al.(1995)J.Mol.Biol.，248：97)通常采用PCR 技术由克隆免疫球蛋白V基因制备。PCR方法中的错误可导致高 度随机性。VH和/或VL可针对靶抗原或表位分别进行筛选，在这 种情况下直接选择单域结合，或者可一起进行筛选。

库载体系统

本领域已知的各种筛选系统都适用于本发明。这种系统的例 子描述如下。

可直接检测噬菌体λ表达系统的噬菌体噬菌斑或溶源性细菌 菌落，此二者如前所述(Huse et al.(1989)Science，246：1275；Caton and Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax et al. (1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：8095；Persson et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：2432)，并在本发明中使用。虽然 此种表达系统可用于筛选库的多达106种不同成员，但真得不适 合筛选更大的数量(大于106种成员)。库构建中特别使用的是 能使核酸连接到其表达的多肽上的筛选展示系统。正如本文所使 用的，筛选展示系统是借由合适的展示手段，通过与通用的和/或 靶配体结合从而对库的各个成员进行筛选的系统。

分离所需大库成员的筛选方法为本领域所知，代表的如噬菌 体展示技术。这种各种肽序列展示在丝状噬菌体表面的系统(Scott and Smith(1990)Science，249：386)，已被证实可用于建立抗体片段 (以及编码它们的核苷酸序列)库，这种库用于体外筛选和扩增与 靶抗原结合的特异性抗体片段(McCafferty et al.，WO 92/01047)。 编码可变域的核苷酸序列被连接到编码引导其进入大肠杆菌周质 空间的前导信号的基因片段上，结果得到的抗体片段展示在噬菌 体表面，典型的是与噬菌体外壳蛋白(如pIII或pVIII)相融 合。或者抗体片段展示在λ噬菌体衣壳外表面(phagebody)。基 于噬菌体的展示系统的优点是，由于其为生物系统，所以选定的 库成员可仅通过使含有选定库成员的噬菌体在细菌细胞中生长而 得以扩增。此外由于编码多肽库成员的所述核苷酸序列包含在噬 菌体或噬菌粒载体中，因而序列测定、表达和后续遗传操作相对 简单。

噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的构建方法为本领 域所公知(McCafferty et al.(1990)Nature，348：552；Kang et al. (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson et al.(1991) Nature，352：624；Lowman et al.(1991)Biochemistry，30：10832； Burton et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，88：10134； Hoogenboom et al.(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133；Chang et al. (1991)J.Immunol.，147：3610；Breitling et al.(1991)Gene，104： 147；Marks et al.(1991)supra；Barbas et al.(1992)supra；Hawkins and Winter(1992)J. Immunol.，22：867；Marks et al.，1992，J.Biol. Chem.，267：16007；Lerner et al.(1992)Science，258：1313在此引作 参考。

一种特别有利的方法是使用scFv噬菌体文库(Huston et al.， 1988，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，85：5879-5883；Chaudhary et al. (1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，87：1066-1070；McCafferty et al. (1990)supra；Clackson et al.(1991)Nature，352：624；Marks et al. (1991)J.Mol.Biol.，222：581；Chiswell et al.(1992)Trends Biotech.， 10：80；Marks et al.(1992)J.Biol.Chem.，267)。已描述了展示在 噬菌体外壳蛋白的scFv文库的各种实施方案。噬菌体展示方法的 改进已为公众所知，例如在WO96/06213和WO92/01047 (Medical Research Council et al.)以及WO97/08320(Morphosys)中 所述，其在此都引作参考。

其他产生多肽文库的系统涉及为体内合成库成员使用无细胞 酶促装置。在一种方法中，通过多轮针对靶配体的筛选和PCR扩 增的交替操作，筛选RNA分子(Tuerk and Gold(1990)Science，249： 505；Ellington and Szostak(1990)Nature，346：818)。类似的技术可 用于鉴别与预先确定的人转录因子结合的DNA序列(Thiesen and Bach(1990)Nucleic Acids Res.，18：3203；Beaudry and Joyce (1992)Science，257：635；WO92/05258 and WO92/14843)。类似 地，体外翻译可作为生成大库的方法用于合成多肽。这些一般包 括稳定的多核糖体复合物的方法在WO88/08453、WO90/05785、 WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058和WO92/02536中有进 一步描述。如在WO95/22625和WO95/11922(Affymax公司)中 公开的非基于噬菌体的可供选择的展示系统，使用多核糖体展示 用于筛选的多肽。

进一步的技术分类涉及人工小室里库的筛选，该人工小室允 许基因与其基因产品相连接。例如在WO99/02671、WO00/40712 和Tawfik & Griffiths(1998)Nature Biotechnol 16(7)，652-6中描述 的油包水乳剂形成的微囊中，可筛选其中核酸编码所需基因产品 的筛选系统。编码具有所需活性基因产品的遗传因子被分隔进入 微囊中，而后在微囊内转录和/或翻译生成其相应的基因产品 (RNA或蛋白)。随后对生成具有所需活性基因产品的遗传因子 进行分类。该方法通过各种方法检测所需活性以筛选感兴趣的基 因产品。

文库构建

用于筛选的文库可使用本领域已知的技术构建，例如如上所 述或可商业渠道购买。用于本发明的文库在如WO99/20749中有 描述。一旦选定载体系统，并且一种或多种编码感兴趣的多肽的 核酸序列被克隆到所述文库载体，则可通过表达前的突变在被克 隆的分子内产生多样性；或者如上所述，在突变和额外的几轮筛 选前，可表达并筛选被编码的蛋白。通过标准分子方法对编码结 构经优化的多肽的核酸序列进行突变。特别使用的是聚合酶链反 应，或PCR(Mullis and Faloona(1987)Methods Enzymol.，155： 335，本文在此引作参考)。PCR采用由热稳定的，依赖DNA的 DNA聚合酶催化若干次循环的DNA复制，扩增感兴趣的靶序 列，这在本领域是公知的。各种抗体库的构建已在Winter et al. (1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55及其中引用的文献里进行 了讨论。

使用模板DNA(至少1fg，更多地使用1-1000ng)以及至少 25pmol的寡核苷酸引物进行PCR；由于每个序列只需库分子的一 小部分即可表示，并且在之后的扩增循环中数量受到限制，所以 当引物库大部分是异质的时，使用更大量的引物是有利的。典型 的反应混合物包括：2μl DNA、25pmol寡聚核苷酸引物、2.5μl 10X PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、0.4μl 1.25 μM dNTP、0.15μl  (或2.5单位)Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer， Foster City，CA)，去离子水加至总体积25μl。以矿物油覆盖，使 用程序热循环仪进行PCR反应。PCR循环每一步的长度和温度以 及循环次数，依据效果的严格要求进行调整。退火温度和时间都 是由引物预期与模板结合的效率以及可接受的错配程度来决定 的；显然地，当核酸分子同时被扩增和突变时，至少在第一轮合 成中的错配是需要的。本领域一般技术人员都具备很好的对严格 的引物退火条件进行优化的能力。采用的退火温度为30℃至72 ℃。模板分子最初变性正常发生在92℃至99℃之间，4分钟， 随后是20-40个循环，由变性(94至99℃，15秒至1分钟)，退 火(温度如上述讨论确定；1至2分钟)，和延伸(72℃，1-5分 钟，取决于所述扩增产物的长度)组成。最后的延伸一般是 72℃，4分钟，可能后续还有4℃下不确定(0至24小时)的步 骤。

单可变域结合

本发明中有用的免疫球蛋白可变域一旦选定，即可由本领域 所知的各种方法结合，包括共价和非共价的方法。优选的方法包 括使用多肽接头，如所述的例如与scFv分子连接(Bird et al.， (1988)Science 242：423-426)。接头优选柔性的，允许所述的两个 单域相互作用。一种接头的例子是(Gly4 Ser)n接头，其中n＝1至 8，例如1、2、3、4、5、6、7或8。还可采用双价抗体中使用的 柔性较低的接头(Holliger et al.，(1993)Proc Nat Acad Sci(USA) 90：6444-6448)。在一个实施方案中，所采用的接头不是免疫球蛋 白铰链区。

可变域可使用非接头的方法结合。例如通过自然生成或人为 设计的半胱氨酸残基得到的二硫桥可用于稳定VH-VH、VL-VL或 VH-VL二聚体(Reiter et al.，(1994)Protein Eng.7：697-704)，或通 过重塑可变域间的界面以改善适配性从而改善相互作用的稳定性 (Ridgeway et al.，(1996)Protein Eng.7：617-621；Zhu et al.，(1997) Protein Science 6：781-788)。可采用其他连接或稳定免疫球蛋白可 变域的技术，特别是抗体VH域，是适宜的。

配体的表征

配体(例如dAb单体，双特异性配体)结合到其特异性抗原 或表位，可通过本领域技术人员熟知的方法包括ELISA，进行检 测。在本发明优选实施方案中，使用单克隆噬菌体ELISA对结合 进行检测。噬菌体ELISA可依据任何合适的方法进行：典型的方 法如下所述。

每轮筛选制得的噬菌体族群可通过ELISA筛选其与选定抗原 或表位的结合，从而鉴定多克隆噬菌体抗体。来自这些族群的单 个被感染的细菌克隆可随后通过ELISA筛选以鉴定“单克隆”噬菌 体抗体。筛选与抗原或表位结合的可溶抗体片段也是理想的，这 也可以通过ELISA，使用例如针对C端或N端标签的试剂进行 (参见如Winter et al.(1994)Ann.Rev Immunology 12，433-55及其 中引用的文献)。

选定的噬菌体单克隆抗体的多样化还可以通过PCR产物的凝 胶电泳(Marks et al.1991，supra；Nissim et al.1994 supra)、探针 (Tomlinson et al.，1992)J.Mol.Biol.227，776)或通过载体DNA的 序列分析来评定。

配体的结构

如果所述免疫球蛋白可变域是从V基因库筛选的，例如使用 本文所述的噬菌体展示技术，则这些可变域包含通用框架区 (universal framework region)，这样就可以通过本文所述的特异性 通用型配体对其进行识别。通用框架区、通用性配体等等的用途 在WO99/20749有描述。

如果使用V区基因库，则多肽序列的变化优选位于可变域的 环结构。所述可变域多肽序列可以或者用DNA改组技术或者突变 来改变，以增强各可变域与其互补对间的相互作用。DNA改组技 术是本领域所知的，并且在例如本文所引用的Stemmer，1994， Nature 370：389-391以及美国专利6,297,053中有教导。突变的其 他方法为本领域技术人员所熟知。

一般来说，筛选、制备以及形成配体所需的核酸分子和载体 构建物可以用如Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA.之类的标准实验手册 中所述的方法来构建和操作。

典型地用于本发明的核酸的操作是在重组载体上进行的。本 文所用的载体指用于将外源DNA引入细胞进行其表达或复制的非 连续的元件。这样的载体的筛选、构建，及随后的使用方法已为 本领域普通技术人员所熟知。大量载体可以公开获得，包括细菌 质粒，噬菌体，人工染色体以及附着体载体。此类载体可用于简 单克隆及突变；或者还可以用基因表达型载体。可筛选根据本发 明所使用的载体，使其与编码所希望大小的多肽序列多肽相适 应，典型的长度是0.25kb至40kb或更长。体外克隆操作后，用 载体转化合适的宿主细胞。每个载体含有多种功能构件，一般包 括克隆(或多聚接头)位点、复制起点，以及至少一个选择标记 基因。如果给定的载体为表达载体，其额外有一个或多个下述构 件：增强子元件、启动子、转录终止及信号序列，各自定位于克 隆位点的毗连区域，从而可操作地连接到编码根据本发明的配体 基因上。

通常情况下，克隆与表达载体都含有使所述载体在一个或多 个经筛选的宿主细胞内复制的核酸序列。典型地在克隆载体中， 该序列使载体不依赖于宿主染色体DNA而自主复制，并含有复制 起点或自主复制序列。各种细菌，真菌以及病毒的此类序列已众 所周知。所述质粒pBR322的复制起点适合大多数革兰氏-阴性 菌，该2微米的质粒起点适用于酵母，多种病毒起点(如SV40， 腺病毒)对哺乳动物细胞中的克隆载体是有用的。总的来说，哺 乳动物表达载体不需要复制起点，除非这些用于哺乳动物细胞的 复制起点能复制高水平的DNA，比如COS细胞。

有利的是，克隆或表达载体可包含筛选基因，也称为选择性 标记物。该基因编码转化的宿主细胞在选择性培养介质中存活或 生长所必需的蛋白。没有被含有筛选基因的载体转化的宿主细胞 将因此无法在培养介质中存活。典型的筛选基因编码赋予宿主细 胞抗抗生素和其它毒素如氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素 性质的蛋白，生长介质中不补充缺少的营养或提供关键的营养成 分。

因为编码根据本发明的配体的载体在大肠杆菌中复制最便 利，所以大肠杆菌-选择性标记如赋予抗抗生素氨苄西林性质的β- 内酰胺酶基因，是有用的。这些可从大肠杆菌质粒获得，如 pBR322或如pUC18或pUC19的pUC质粒。

表达载体通常含有启动子，其被宿主机体识别并可操作地连 接到感兴趣的编码序列上。这样的启动子可以是是诱导型的或组 成型的。术语“可操作地连接”指并列连接，其中所述各构件间的 关系使其以预期方式发挥功能。调控序列“可操作地连接”到编码 序列，该连接方式是指在适宜于调控序列的条件下实现所述编码 序列的表达。

适用于原核宿主的启动子包括如β-内酰胺酶和乳糖启动子系 统、碱性磷酸酯酶、色氨酸(trp)启动子系统，以及如tac启动 子的杂合启动子。在细菌系统中应用的启动子通常还含有可操作 地连接到所述编码序列的Shine-Delgarno序列。

优选的载体为表达载体，其使得对应于多肽库成员的核酸序 列的表达成为可能。因此用第一和/或第二抗原或表位的筛选可通 过分离增殖，表达多肽库成员的单克隆的表达，或利用任何筛选 展示系统进行。如前所述，优选的筛选展示系统为噬菌体展示系 统。因此可利用噬菌体或噬菌粒载体，如pIT1或pIT2。本发明 中有用的前导序列包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA.。 一个例子是噬菌粒载体，其具有大肠杆菌.复制起点(用于双链复 制)，还有噬菌体复制起点(用于单链DNA的生成)。此类载体 的操作及表达在本领域众所周知(Hoogenboom and Winter(1992) supra；Nissim et al.(1994)supra)。简而言之，所述载体含有β-内 酰胺酶基因，使噬菌粒具有选择性，以及表达盒上游的lac启动 子，该表达盒(N端至C端)由pelB前导序列(其引导表达的多 肽进入周质空间)，多克隆位点(用于克隆所述文库成员的核酸 序列)，任选的一个或多个肽标签(检测用)，任选的一个或多 个TAG终止密码子以及噬菌体蛋白pIII组成。因此，使用多种抑 制型和非抑制型大肠杆菌株，加入葡萄糖，异丙基-β-D-硫代半乳 糖苷(IPTG)或辅助噬菌体如VCS M13，所述载体能象质粒那样 无表达地复制，仅产生大量的多肽库成员或产生噬菌体，其中有 些含有至少一个拷贝的融合在其表面的多肽-pIII。

采用常规连接技术构建编码根据本发明配体的载体。被分离 的载体或DNA片段被切割、剪裁，以所需形式再连接，从而生成 所需载体。如果需要，可用已知的方法进行分析，以确认正确的 序列出现在所构建的载体中。构建表达载体，体外制备转录产 物，将DNA导入到宿主细胞，进行分析以评价表达和功能的合适 方法为本领域技术人员所知。用如Southern或Northern分析法， Western印迹，DNA、RNA或蛋白的斑点杂交技术，原位杂交技 术，免疫细胞化学，或核酸或蛋白分子的序列分析的常规方法来 检测样品中基因序列的出现，或对其扩增和/或表达进行定量分 析。本领域技术人员容易想象，如果需要则可如何调整这些方 法。

骨架

如上所述，骨架起源可基于免疫球蛋白分子或非免疫球蛋 白。优选的免疫球蛋白骨架，如本文所定义，包括任意一种或多 种选自下述的骨架：免疫球蛋白分子，其包含至少(i)抗体的 CL区(κ或λ亚类)；或(ii)抗体重链的CH1区；包含抗体重链 CH1与CH2区的免疫球蛋白分子；包含抗体重链CH1、CH2和 CH3区的免疫球蛋白分子；或任意与抗体CL(κ或λ亚类)区相 关联的亚类(ii)。域的这样的组合可如模拟天然抗体，比如IgG 或IgM，或其片段，如Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分子。本领域所 属的技术人员应知道，该列举并非穷举。

蛋白支架

每个表位结合域都含有蛋白支架以及一个或多个CDRs，其 涉及该域与一个或多个表位间的特异性相互作用。有利的是根据 本发明的表位结合域含有三个CDRs。合适的蛋白支架包括任意 选自下列的蛋白支架：基于免疫球蛋白域的，基于纤连蛋白的， 基于亲和体的，基于CTLA4的，基于如GroEL的分子伴侣的， 基于脂笼蛋白，以及基于细菌Fc受体SpA与SpD的蛋白支架。 本领域所述的技术人员应该明白，该列举并非穷举。

构建配体中使用的支架

主链构象的选择

免疫球蛋白超家族成员的多肽链都具有相似的折叠。例如尽 管就其一级序列而言抗体是高度多样的，序列比较和晶体结构已 揭示，与预期相反，抗体的6个抗原结合环区中的5个(H1、 H2、L1、L2、L3)采取了有限数量的主链构象，或典型结构 (Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196：901；Chothia et al.(1989) Nature，342：877)。因此对环长度与关键残基的分析已能预测在 大部分人抗体中发现的H1、H2、L1、L2与L3的主链构象 (Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.，227：799；Tomlinson et al.(1995) EMBO J.，14：4628；Williams et al.(1996)J.Mol.Biol.，264：220)。 尽管就序列，长度和结构而言，H3区更多样化(因为D片段的 使用)，但对于短的环，它还是形成了有限数量的主链构象，这 取决于所述环和抗体框架中关键位置特定残基的长度、出现或残 基类型(Martin et al.(1996)J.Mol.Biol.，263：800；Shirai et al. (1996)FEBS Letters，399：1)。

可以设计配体和/或域的库，其中某些环的长度和关键残基已 经过筛选，以确保成员的主链构象是已知的。有利的是，如前所 述这些是自然界中发现的免疫球蛋白超家族分子的真正构象，以 使其处于非功能状态的机会最小化。种系V基因片段用作构建抗 体或T-细胞受体库的合适的基本框架；其它序列也有用处。低频 率的变化可能会发生，这样少量功能性成员可能具有不影响其功 能的改变了的主链构象。

经典结构理论也可用于估计配体编码的不同主链构象的数 量，以预测基于配体序列的主链构象，并选择不影响典型结构的 多样化的残基。众所周知，在人的Vκ区中，所述L1环可采用 四个典型结构之一，所述L2环具有单一的典型结构，对L3环 而言，有90％人的Vκ区采用了四个或五个典型结构之一 (Tomlinson et al.(1995)supra)；因此，仅在Vκ区，不同的典型 结构能结合产生一系列不同的主链构象。鉴于Vλ区编码不同系列 的L1，L2和L3环典型结构，Vκ与Vλ区能与编码H1和H2环 几种典型结构的任何VH区配对，观察到的这五个环的典型结构组 合的数量是非常巨大的。这意味着，主链构象中多样性的产生对 广泛的结合特异性的产生可能是必须的。然而，通过构建基于单 一已知主链构象的抗体库已发现，与预期相反，对于产生实质上 以所有抗原为靶向的足够多的多样性而言，主链构象的多样性并 不是必需的。更让人惊讶的是，所述的单一主链构象不必是共有 结构--单一的自然出现的构象可用作为整个库的基础。因此，在优 选方面，本发明的所述双特异性配体具有单一已知的主链构象。

选定的所述单一主链构象优选所讨论的所述免疫球蛋白超家 族类型分子中的普通构象。观测到的大量自然产生的分子所采取 的构象是普通构象。因此，在本发明优选的方面中，对于免疫球 蛋白的每个结合环区而言，所述自然产生的不同主链构象可分别 考虑，然后选定具有不同环主链构象的所需组合的自然产生的可 变域。如果没有自然产生的可变域，则可选择最接近的等价物。 优选的是，不同环主链构象的所需组合是通过选择编码所需主链 构象的种系基因片段创建的。更优选的是，所述选定的种系基因 片段在自然界上被频繁表达。最优选的是，它们是所有天然种系 基因片段的被最频繁表达的那些。

在设计的配体(如dAbs)或其库中，对于所述六个抗原结合 环区的每个而言，可分别考虑不同主链构象的发生率。对H1、 H2、L1、L2和L3而言，选择20％到40％的自然产生分子的抗原 结合环区所采用的特定构象。典型地，选定构象的观测到的发生 率大于35％(即35％到100％)，理想的是50％以上或甚至65％ 以上。因为绝大部分的H3环区不具有典型结构，所以优选显示 出典型结构的那些环中常见的主链构象。所以对于各个所述的环 而言，选择天然库中最常观测到的构象。在人的抗体中，每个环 最常见的典型结构(CS)如下：H1-CS 1(表达库的79％)， H2-CS 3(46％)，Vκ的L1-CS 2(39％)，L2-CS 1 (100％)，Vκ的L3-CS 1(36％)(计算时假定κ:λ比为70:30， Hood et al.(1967)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，48：133)。 对于有典型结构的H3环，从残基94至101有一盐桥的7个残基 的CDR3长度(Kabat et al.(1991)Sequences of proteins of immunological interest，美国卫生福利部)看来是最常见的。 EMBL数据库中有至少16个人抗体序列有所需H3长度和关键残 基，以形成该构象，蛋白质数据库中有至少两种晶体结构可用作 抗体模建的基础(2cgr与1tet)。具有这种经典结构组合的最频 繁表达的种系基因片段为VH片段3-23(DP-47)、JH片段JH4b、 Vκ片段O2/O12(DPK9)和Jκ片段Jκ1。VH片段DP45与DP38也 是合适的。这些片段因此可在组合中使用，作为构建具有所需单 一主链构象的库的基础。

或者对于每个所述结合环而言，不是以自然产生的不同主链 构象为基础分别选择所述单一主链构象，而是以自然产生的主链 构象的组合作为选择单一主链构象的基础。就抗体而言，例如可 以确定任意两个、三个、四个、五个或全部六个抗原结合环的天 然产生的典型结构组合。此处优选的是所述选定的构象在自然产 生的抗体中是常见的，最优选的是所述选定的构象是天然库中最 频繁观察到的。因此，在人抗体中，例如当考虑到五个抗体结合 环，H1、H2、L1、L2与L3的自然结合时，可确定典型结构的最 经常的组合，然后与H3环的最常见构象相组合，作为选择所述 单一主链构象的基础。

典型序列的多样化

已选定几种已知的主链构象，或优选单一已知的主链构象， 为了生成具有结构和/或功能多样性的库，本发明的配体(如 dAbs)或库可通过变化所述分子的结合位点进行构建。这意味着 生成了具有足够的结构和/或功能多样性的变体，这样所述变体能 提供一系列活性。

所述的所需多样性典型地通过在一个或多个位置改变所选定 的分子而产生。将要变化的位置可以以随机或优选的方式选择。 所述改变可随后或者通过随机化过程，其中所述特定位置的氨基 酸被任意氨基酸或其天然的或合成的类似物取代，从而产生非常 大量的突变，或者被限定的一小组氨基酸中的一个或多个取代， 从而产生数量上更为有限的变体。

经报导了多种方法引入此种多样性。易错PCR法(Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.，226：889)，化学诱变(Deng et al.(1994) J.Biol.Chem.，269：9533)或细菌突变株(Low et al.(1996)J.Mol. Biol.，260：359)可用于将随机突变引入编码所述分子的基因中。 选定位置突变的方法已经为本领域所公知，包括错配寡核苷酸或 简并寡核苷酸的应用，使用或是不使用PCR。例如通过针对所述 抗原环进行靶突变已建立了几个合成的抗体库。人破伤风类毒素- 结合Fab的H3区已经随机突变，形成一系列新结合特异性 (Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457)。随机或半 随机突变H3与L3区已连接到种系V基因片段以制备具有未突变 框架区的大库(Hoogenboom & Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381； Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457；Nissim et al. (1994)EMBO J.，13：692；Griffiths et al.(1994)EMBO J.，13：3245； De Kruif et al.(1995)J.Mol.Biol.，248：97)。此种多样化已扩展到 包括一些或所有的其它抗原结合环(Crameri et al.(1996)Nature Med，2：100；Riechmann et al.(1995)Bio/Technology，13：475； Morphosys，WO97/08320，supra)。

因为环随机突变可能仅对H3就创建大约超过1015个结构， 对其它五个环创建类似的大量突变体，所以用当前的转化技术或 甚至用无细胞系统以产生代表所有可能组合的库是不可行的。例 如在迄今为止构建的最大的库之一中，生成了6 x 1010个不同的 抗体，对该设计得到的库而言，这只是可能的多样性的一部分 (Griffiths et al.(1994)supra)。

优选地，仅直接涉及创建或修饰所述分子的所需功能的所述 残基被多样化。对许多分子而言，该功能是与靶结合，因此多样 性应集中于该靶结合位点，同时避免改变对所述分子整体装配或 维持选定的主链构象关键的残基。

用于抗体域时典型序列的多样化

就基于抗体的配体(如dAbs)而言，所述靶标结合位点最经 常是抗原结合位点。因此优选只有抗原结合位点中的那些残基发 生变化。这些残基在所述人抗体库中是非常多样化的，并且已知 与高溶解性的抗体/抗原复合体相接触。例如在L2中，已知位置 50和53在自然产生的抗体中是多样化的，观测到其与抗原相接 触。相比之下，常规方法已使Kabat et al.定义的相应互补决定区 (CDR1)中所有残基多样化，与所述的两个相比，根据本发明使 用的所述库中大约7个残基多样化。这表明就为产生一系列抗原 结合特异性所需的功能多样性而言，有显著的进步。

自然界中抗体多样性是两个过程的结果：种系V，D，J基因 片段的体细胞重组，以创建初始的原始文库(所谓的种系与连接 多样性)，以及所述得到的重排V基因的体细胞超变异。人抗体 序列的分析已表明，原始文库的多样性集中于抗原结合位点的中 心，而体细胞的超变异将多样性扩展至原代库中高度保守的抗原 结合位点的外围(参见Tomlinson et al.(1996)J.Mol.Biol.，256： 813)。该互补性或许已经发展成有效的序列空间搜索策略，虽然 显然为抗体独有，但其可容易地应用于其它多肽库。所述经变化 的残基是那些形成与靶的结合位点的子集。如果需要，靶结合位 点中残基的不同(包括重叠部分)子集是在筛选过程的不同阶段 被多样化的。

关于抗体库，可以建立最初的“初始”库，其中抗原结合位点 中的一些而非全部的残基被多样化。此处上下文使用的术语“初 始”指没有预先确定的靶的抗体分子。这些分子类似于没有经历免 疫多样化的个体的免疫球蛋白基因编码的分子，就如同胎儿或新 生个体一样，其体内免疫系统尚未被各种各样的抗原刺激物刺激 过。该库可随后针对一系列抗原或表位进行筛选。如果需要，则 所述初始库中经多样化的区域的外围可引入进一步的多样性。可 对该成熟的库筛选修饰过的功能，特异性或亲和力。

用于配体构建的结合域的初始库，其中所述抗原结合位点中 的一些或所有残基发生变化，该初始库为本领域所知。(参见 WO2004/058821、WO2004/003019和WO03/002609)。该“原始” 文库模拟天然的原始库，具有的多样性局限于抗原结合位点中心 的残基，所述抗原结合位点在所述种系V基因片段中多样化(种 系多样性)，或在所述重组过程中被多样化(连接多样性)。被 多样化的那些残基包括但不限于：H50、H52、H52a、H53、 H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、 L92、L93、L94和L96。在所述“体细胞”库中，多样性局限于重 组过程中被多样化的(连接多样性)或高度体细胞突变的残基。 那些被多样化的残基包括但不限于：H31、H33、H35、H95、 H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34和L96。以上所列的适 于在这些库中多样化的所有残基已知与一个或多个抗体抗原复合 物相接触。因为在这两个库中，并非所有的抗原结合位点中的残 基被改变，所以如果需要，可在筛选过程中通过改变其余的残基 得到额外的多样性。任何这些残基的任何子集(或包括所述抗原 结合位点的额外的残基)可用于所述抗原结合位点的初始的和/或 随后的多样化，这对本领域技术人员应该是显而易见的。

在本发明所用的库的构建中，选定位置的多样化典型地在核 酸水平实现，通过改变详细说明多肽序列的编码序列，从而在该 位置包含大量的可能氨基酸(全部20个或其子集)。用IUPAC 命名法，用途最多的密码子为NNK，其编码所有的氨基酸残基以 及TAG终止密码子。该NNK密码子优选地为引入所需多样性而 使用。能获得同样目的的其它密码子也是有用的，包括所述NNN 密码子，其导致额外的终止密码子TGA与TAA的产生。

人抗体的抗原结合位点中侧链多样性的特点，是偏好某些氨 基酸残基的明显倾向性。如果对在各个所述VH、Vκ和Vλ区中 十个最多样化位置的氨基酸组成进行总计，则超过76％的侧链多 样性来自仅7个不同的氨基酸残基，这些是：丝氨酸(24％)， 酪氨酸(14％)，天冬酰胺(11％)，甘氨酸(9％)，丙氨酸 (7％)，天冬氨酸(6％)和苏氨酸(6％)。对亲水残基和可提 供主链柔性的小体积残基的这种偏好可能反应了倾向于和广泛的 抗原或表位结合的表面的演变，并可有助于解释在初始库中抗体 的所需多样性。

因为优选的是模拟氨基酸的这种分布，所以待改变位置的氨 基酸分布优选模拟在抗体的抗原结合位点中看到的氨基酸。氨基 酸取代中的此种偏好使得针对一系列靶抗原的对某些多肽的筛选 更加容易应用到任何多肽库。形成待改变位置的氨基酸分布倾向 性有多种方法(包括使用三核苷酸突变，参见WO97/08320)， 由于易于合成，所以优选的方法是使用常规的简并密码子。通过 将由简并密码子(每个位置单重、双重、三重和四重简并的比率 相同)的所有组合编码的氨基酸特征与所用的天然氨基酸比较， 可能计算出最具代表性的密码子。密码子(AGT)(AGC)T、 (AGT)(AGC)C与(AGT)(AGC)(CT)——分别用IUPAC命名法即 DVT、DVC与DVY——是最接近于所需氨基酸特征的密码子： 它们编码22％丝氨酸与11％的酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨 酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此优选地，用DVT、DVC 或DVY密码子之一在每个多样化的位置构建库。

治疗和诊断组合物及用途

本发明提供包括本发明的配体(如双特异性配体、多特异性 配体、dAb单体)和药学上可接受的载体、稀释剂或辅料的组合 物，以及采用本发明的所述配体或组合物进行治疗与诊断的方 法。根据本发明的方法的配体(如双特异性配体、多特异性配 体、dAb单体)可用于体内治疗或预防应用、体内诊断应用等 等。

本发明的配体(如多特异性配体、双特异性配体、dAb单 体)的治疗和预防用途包括将根据本发明的配体施用于接受的哺 乳动物，如人类。双特异性和多特异性配体(如双特异性抗体形 式)以很强的亲和力与多聚抗原结合。双特异性或多特异性配体 可使两个抗原交联，如在募集细胞毒T细胞以介导肿瘤细胞系的 杀伤中。

优选至少90％-95％均质性的大体上纯的如dAb单体的配体施 用于哺乳动物，最优选均质性98％-99％或更高的作为药用，尤其 所述哺乳动物为人时。一旦如所需地部分纯化或纯化至均质性， 则该配体可用于诊断或治疗(包括体外应用)或用于开发和进行 检验方法，免疫荧光染色法等等(Lefkovite and Pernis，(1979 and 1981)Immunological Methods，Volumes I and II，Academic Press， NY)。

例如发现本发明的配体(如dAb单体)典型地在预防、抑制 或治疗炎症或炎症状态，包括急性炎症性疾病和/或慢性炎症性疾 病中的用途。还可施用本发明的配体(如dAb单体)以抑制IL-1 (如IL-1α和/或IL-1β)与IL-1R1结合而诱导的生物过程。

在本申请中，术语“预防”涉及在疾病诱发前施用所述保护性 的组合物。“抑制”指在诱导事件后，但疾病临床出现前施用该组 合物。“治疗”涉及疾病症状变得明显后施用该该保护性组合物。

可施用本发明的配体包括dAb单体，以预防、抑制或治疗慢 性炎症性疾病，过敏性疾病，癌症，细菌或病毒感染，自身免疫 性疾病(其包括但不仅限于I型糖尿病，哮喘，多发性硬化症， 系统性红斑狼疮，炎症性肠病(如Crohn病、溃疡性结肠炎)， 重症肌无力和Behcet综合征)，银屑病，子宫内膜异位症和腹腔 粘连(如腹部手术后)。

可以施用本发明配体包括dAb单体，以预防、抑制或治疗肺 炎，慢性阻塞性呼吸系统疾病(如慢性支气管炎、慢性阻塞性支 气管炎、肺气肿)，哮喘(如类固醇抗药性哮喘)，肺炎(例如 细菌性肺炎，如金黄色葡萄球菌肺炎)，过敏性肺炎，迁延性肺 嗜酸性粒细胞浸润症，环境性肺部疾病，支气管扩张症，囊性纤 维化，间质性肺疾病，原发性肺动脉高压，肺血栓栓塞症，胸膜 异常，纵隔异常，对膈肌异常，通气不足，过度通气，睡眠呼吸 暂停，急性呼吸窘迫症候群，间皮瘤，肉瘤，移植排斥反应，移 植物抗宿主病，肺癌，过敏性鼻炎，过敏症，石棉肺，曲菌球， 曲霉菌病，慢性支气管炎，肺气肿，嗜酸性粒细胞性肺炎，特发 性肺纤维化，侵润性肺炎球菌病(IPD)，流行性感冒，非结核性分 枝杆菌，胸腔积液，肺尘埃沉着病，肺孢子虫病，肺放线菌病， 肺泡蛋白沉积症，肺炭疽，肺水肿，肺栓塞，肺部发炎，肺组织 细胞增多症X(嗜酸性肉芽肿)，肺动脉高血压，肺诺卡菌病， 肺结核，肺静脉闭塞病，类风湿性肺病，结节病，Wegener肉芽 肿病，和非小细胞肺癌。

可以施用本发明配体包括dAb单体，以预防、抑制或治疗流 感，呼吸道合胞病毒相关的呼吸系统疾病和病毒性肺(呼吸系 统)疾病。

可以施用本发明配体包括dAb单体，以预防、抑制或治疗骨 关节炎或炎性关节炎。“炎性关节炎”指在免疫系统引起或加剧关 节炎症的那些关节疾病，包括类风湿关节炎、幼年类风湿关节 炎、脊柱关节病，如强直性脊柱炎、反应性关节炎、Reiter综合 征、银屑病关节炎、银屑病性脊椎炎、肠病性关节炎、肠病性脊 柱炎、幼年型脊柱关节病和未分化脊柱关节病。炎性关节炎普遍 的特点是滑膜组织浸润和/或关节液被白细胞浸润。

根据本发明的与涉及内吞作用的细胞外靶标(如网格蛋白) 结合的配体(双特异性配体、多特异性配体、dAb单体)，可被 内吞使其达到细胞内靶标。此外，双或多特异性配体提供了一种 方式，通过该方式，能够与细胞内靶标结合的结合域(如dAb单 体)可以被传送入细胞内环境。这种战略要求例如具有能使其保 持细胞内功能的物理性质的双特异性配体。或者如果最终目的地 细胞内功能区隔是氧化性的，则折叠很好的配体可有二硫键。

有利的是，双或多特异性配体可用于靶向至细胞因子受体以 及其它的在有机体中的治疗条件下起协同作用的分子。本发明因 此提供了使与细胞因子受体或其它分子结合的两个或多个结合域 (如dAbs)活性起协同作用的方法，包括施用能与所述两个或多 个分子(如细胞因子受体)结合的双或多特异性配体。在本发明 的这个方面，该双或多特异性配体可以是任何双或多特异性配 体，例如本发明的这个方面涉及VH区和VL区的组合，仅VH区 和仅VL区。

在治疗方面的协同作用可以以许多方式实现。例如只有当配 体靶向两个靶标时，靶标组合才可能是治疗上有活性的，而单独 靶向一个靶标时是没有治疗效果的。在另一实施方案中，单独靶 向一个靶标可有一些治疗效果，但与第二个靶一起，则该组合治 疗效果协同增加(不仅是加和的效果)。

可获得用于筛选本发明配体在预防或治疗疾病有效性的动物 模型系统。易感小鼠中系统性红斑狼疮(SLE)的试验方法已为 本领域所知(Knight et al.(1978)J.Exp.Med.，147：1653；Reinersten et al.(1978)New Eng.J.Med.，299：515)。重症肌无力(MG)是 通过用来自另一物种的可溶性AchR蛋白诱发疾病，在SJL/J雌性 小鼠上试验的(Lindstrom et al.(1988)Adv.Immunol.，42：233)。通 过注射II型胶原，在敏感品系的小鼠上诱发关节炎(Stuart et al. (1984)Ann.Rev.Immunol.，42：233)。对通过注射分枝杆菌热休克 蛋白在易感大鼠上诱发的佐剂性关节炎模型已有描述(Van Eden et al.(1988)Nature，331：171)。如同所述的，通过施用甲状腺球 蛋白诱发小鼠甲状腺炎(Maron et al.(1980)J.Exp.Med.，152： 1115)。胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)自然发生或如Kanasawa 等(1984，Diabetologia，27：113)所述的可在某些品系的小鼠上 被诱发。小鼠与大鼠的EAE作为人MS的模型。在此模型中，脱 髓鞘疾病是通过施用髓鞘碱性蛋白诱发的(参见Paterson(1986) Textbook of Immunopathology，Mischer et al.，eds.，Grune and Stratton， New York，pp.179-213；McFarlin et al.(1973)Science，179：478；  以 及Satoh et al.(1987)J.Immunol.，138：179)。其它合适的模型在 本文中有描述。

总的来说，所述配体以纯化的形式与药理学上合适的载体一 起使用。典型地，这些载体包括：水性或醇性/水性溶液，乳液或 混悬液，包括盐水和/或缓冲介质。肠道外赋形剂包括：氯化钠溶 液，林格氏液葡萄糖，葡萄糖与氯化钠以及乳酸林格氏液。如果 需要保持多肽复合物处于混悬态，合适的生理上可接受的赋型剂 可以选用如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐的 增稠剂。

静脉注射赋型剂包括如那些基于林格氏液葡萄糖的流体和营 养补充剂以及电解质补充剂。还可以有如抗菌剂、抗氧化剂、螯 合剂和惰性气体的防腐剂和其他添加剂。处方取决于给药途径， 各种合适的处方均可使用，包括缓释处方(参见如Mack(1982) Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th Edition.)。

所述配体(如dAb单体)可以与一个或多个额外治疗剂或活 性物质一起施用和/或配制。当配体与其它治疗剂施用时，该配体 可以在其它治疗剂施用之前、同时或之后施用。总的来说，该配 体(如dAb单体)和其它物质以提供治疗效果重合的方式施用。 可与本发明配体一起施用或配制的其它成分包括，例如免疫治疗 药，如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂，抗生素，抗真菌 药，抗病毒药和免疫毒素。

例如，当施用拮抗剂以预防、抑制或治疗肺部炎症或呼吸系 统疾病的时候，可以与磷酸二酯酶抑制剂(如磷酸二酯酶4抑制 剂)，支气管扩张剂(如β2-受体激动剂、抗胆碱能药物、茶 碱)，短效β-受体激动剂(如沙丁胺醇、沙丁胺醇、班布特罗、 非诺特罗、乙基异丙肾上腺素(isoetherine)、异丙肾上腺素、左 旋沙丁胺醇、间羟异丙基肾上腺素、吡布特罗、特布他林和比托 特罗)，长效β-受体激动剂(如福莫特罗和沙美特罗)，短效抗 胆碱能药物(如异丙托溴铵和氧托溴铵)，长效抗胆碱能药物 (如噻托溴铵)，茶碱(如短效制剂、长效制剂)，吸入性类固醇 (如倍氯米松、布地奈德、氟尼缩松、氟替卡松丙酸酯和曲安奈 德)，口服类固醇(如甲基强的松龙，强的松龙，氢化泼尼松和 泼尼松)，短效β-受体激动剂与抗胆碱能药物(如沙丁胺醇/舒喘 宁/异丙阿托品，和非诺特罗/异丙阿托品)联合，长效β-受体激动 剂与吸入性类固醇(如沙美特罗/氟替卡松，和福莫特罗/布地奈 德)和溶黏液剂(如厄多司坦、乙酰半胱氨酸、溴己新 (bromheksin)、羧甲司坦、愈创木酚甘油醚(guiafenesin)和碘 化甘油)。

当施用所述拮抗剂以预防、抑制或治疗关节炎(如炎性关节 炎(如类风湿性关节炎))时，其可以与病症缓解性抗风湿药 (如甲氨蝶呤、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、硫唑嘌呤、D -青霉胺、金制剂(口服或肌肉注射)、米诺环素、环孢菌素、葡 萄球菌蛋白A)，非甾体抗炎药(如COX-2选择性非甾体抗炎 药，如罗非昔布)，水杨酸类药物，糖皮质激素(如强的松)和 镇痛药合用。

药物组合物可包括各种细胞毒或其它物质与本发明配体合用 的混合物，或甚至是根据本发明的具有不同特异性的配体的合 用，如用不同的靶抗原或表位筛得的配体，无论它们在施用前是 否混合。

依据本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域所属普通 技术人员通常所知的任何给药途径。出于治疗目的，包括但不限 于免疫治疗，本发明选定的配体可以根据标准技术施用于任何患 者。可以以任何合适的方式给药，包括肠道外(如静脉注射、肌 肉注射、腹腔内、关节内、鞘内注射)，透皮吸收，经肺给药， 或者还可以，恰当地通过导管直接灌注。给药剂量与频率取决于 年龄，性别和患者状态，其它药物的共同给药情况，禁忌症和临 床医生需考虑的其他参数。按指导给药可以是局部的(如通过肺 部给药局部传送到肺，如鼻腔内给药)或全身给药。

本发明的配体可以冻干存储，使用前在合适的载体中重建。 该技术已证明对常规免疫球蛋白是有效的，可以用本领域已知的 冻干与重建技术。本领域技术人员应该理解，冻干和重建可导致 不同程度的抗体活性损失(例如用常规免疫球蛋白，IgM抗体的 易于产生比IgG更大的活性损失)，并且可能要上调使用水平以 补偿该损失。

可以施用含有本发明拮抗剂(如配体)或其混合物的组合 物，以进行预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，实现选 定细胞群落被至少部分抑制、抑制、调节、杀伤的足够量，或一 些其它可测量参数，被定义为“治疗有效量”。例如为治疗肺部炎 症和/或呼吸道疾病，抑制痰的量，抑制支气管活检炎症的量，抑 制呼吸困难的量，增加第1秒钟用力呼吸容积的量，提高健康状 况改善的量，如St.George呼吸疾病问卷的合适问卷中量化的量 (如4分的改善分值)可施用于病患。在另一实施例中，为治疗关 节炎(如炎性关节炎(如类风湿性关节炎))，可以施用足以使 美国风湿病学会核心设置指标中至少三项实现20％或更大改善的 量(Felson et al.，Arthritis and Rheumatism，38：727-735(1995))。

达到该剂量所需的量取决于疾病的严重程度和患者的一般状 态，包括患者的年龄、性别、体重、一般健康状况(如患者免疫 系统状态)。基于这些和其它合适的标准，熟练的医师可以确定 要施用的配体的合适量。通常情况下，所述数量范围为，每公斤 体重0.005至5.0mg配体，更常用的剂量为0.05至2.0mg/kg/剂 量。就预防应用而言，含有本发明配体或其混合物的组合物还可 以以相似略低的剂量施用，以预防、抑制或延迟疾病的发生(如 持续缓解或保持稳定，或预防急性期)。熟练的医师能确定合适 的剂量间隔以治疗、抑制或预防疾病。施用本发明配体可多达每 天4次，每周2次，每周1次，每隔两个星期1次，每月1次， 或每隔两个月1次，给药剂量如大约10μg/kg至大约80mg/kg、 大约100μg/kg至大约80mg/kg、大约1mg/kg至大约80mg/kg、 大约1mg/kg至大约70mg/kg、大约1mg/kg至大约60mg/kg、 大约1mg/kg至大约50mg/kg、大约1mg/kg至大约40mg/kg、 大约1mg/kg至大约30mg/kg、大约1mg/kg至大约20mg/kg、 大约1mg/kg至大约10mg/kg、大约10μg/kg至大约10mg/kg、 大约10μg/kg至大约5mg/kg、大约10μg/kg至大约2.5mg/kg、 大约1mg/kg、大约2mg/kg、大约3mg/kg、大约4mg/kg、大约 5mg/kg、大约6mg/kg、大约7mg/kg、大约8mg/kg、大约9 mg/kg或大约10mg/kg。在具体实施方案中，施用配体以治疗、 抑制或预防慢性炎症疾病，每隔两周一次每月一次，剂量大约 10μg/kg至大约10mg/kg(如大约10μg/kg，大约100μg/kg，大 约1mg/kg，大约2mg/kg，大约3mg/kg，大约4mg/kg，大约5 mg/kg，大约6mg/kg，大约7mg/kg，大约8mg/kg，大约9 mg/kg或大约10mg/kg)。

如果相对于治疗前出现的此类症状，或相对于没有用该组合 物治疗的个体(人或模型动物)或其它合适对照中的此类症状， 减少了一个或多个症状(如减少至少10％或临床评价表上至少一 个点)，则用本文描述的组合物进行治疗被视为“有效”。虽然针 对的疾病不同症状会明显不同，但普通熟练的临床医师或技术人 员能判断出来。对此类症状的判断可以例如通过监测疾病的一个 或多个生化指标水平(如与所述疾病相关的酶或代谢物水平，受 影响的细胞数等)，通过监测身体表现(如炎症、肿瘤大小 等)，或者通过被接受的临床评分，例如扩展病残状态评分(用 于多发性硬化)，Irvine炎症性肠病问卷(以32分评价对关于肠 功能，全身症状，社会功能和情绪状况的生活质量进行评估--分值 范围从32到224，分值越高表明生活质量越好)，类风湿性关节炎 生活质量量表，美国风湿病学会核心设置指标，或其它本领域已 知的可接受的临床评估。疾病症状的持续(如一天或多天，优选 更长时间)减少至少10％或给定的临床量表上减少一分或多分意 味着“有效”治疗。类似地，如果相对于没有用所述化合物治疗的 类似个体(人或动物)中的此种症状而言，一个或多个症状的出 现或严重程度被延迟、减少或消除，则用本发明所述的组合物进 行预防是有效的。

含有根据本发明的配体或其混合物的组合物，可用在预防以 及治疗设置上，以辅助改变、灭活、杀伤或移除哺乳动物中选定 的靶细胞群落。此外，本文所述选定的多肽库可在体外使用或体 外有选择的杀伤、消耗或从异源细胞集合中有效除去靶细胞群 落。按照标准技术，哺乳动物的血液可在体外与配体，如抗体、 细胞表面受体或其结合蛋白结合，从而杀死不需要的细胞或将其 从血液中移除，再使血液回到哺乳动物。

含有根据本发明的拮抗剂(如配体)的组合物可用于预防及 治疗设置上，以辅助改变、灭活、杀伤或移除哺乳动物中选定的 靶细胞群落。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗、抑制或预防慢性炎 症疾病的方法，包含将治疗有效剂量或数量的本发明配体施用于 对其有需求的哺乳动物。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗、抑制或预防关节炎 (如炎性关节炎(如类风湿性关节炎，幼年类风湿性关节炎，脊柱 关节病，如强直性脊柱炎、反应性关节炎、Reiter综合征、银屑 病关节炎、银屑病性脊椎炎、肠病性关节炎、肠病性脊柱炎、幼 年型脊柱关节病和未分化脊柱关节病))的方法，包括将治疗有 效剂量或数量的本发明的配体施用于对其有需要的哺乳动物。

在另一实施方案中，本发明提供了治疗、抑制或预防炎症性 肠病(如Crohn病、溃疡性结肠炎)的方法，包括将治疗有效剂 量或数量的本发明的配体施用于对其有需求的哺乳动物。

实施例

实施例1

方法

选择与筛选

对于初筛，Vκ域抗体单体4G-K2库用IL-1R1-Fc融合蛋白 进行淘选(Axxora，Nottingham，UK)。初筛得到的域抗体进行三 轮进一步的筛选。第1轮用蛋白G包被的磁珠(Dynal公司， Norway)和100nM IL-1R1-Fc筛选；第2轮用抗人IgG磁珠 (Novagen，Merck Biosciences，Nottingham，UK)和10nM IL-1R1- Fc筛选；第3轮用蛋白G磁珠和1nM IL-1R1-Fc筛选。 (Henderikx et al.，Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display：Methods and protocols，Ed.O′Brien and Atkin，Humana Press(2002).)。各阶段的洗脱用1mg/ml胰蛋白酶- 磷酸盐缓冲液(PBS)进行。对于亲和力成熟筛选，使用了上述 方法，但是做了如下改动：使用蛋白G磁珠进行了两轮筛选，第 1轮用了1nM IL-1R1-Fc，第2轮用了100pM IL-1R1-Fc。通过质 粒提取(Qiagen)分离筛选得到(第2、3轮)的噬菌体载体，用 Sal I与Not I进行限制性内切，释放dAb插入片段。该插入片段 连接到噬菌体表达载体(Sal I/Not I酶切pDOM5)，转化大肠杆 菌菌株HB2151，用于dAb的可溶性表达和筛选。

上清液受体结合分析(RBA)

挑取单个转化的大肠杆菌菌落于含添加100μg/ml羧苄青霉素 和0.1％(w/v)葡萄糖的2xTY的96孔板中，37℃生长至约 OD600＝0.9，用1mM IPTG诱导。在受体结合分析中检测30℃诱 导过夜后的上清液抑制IL-1β与ELISA板捕获的IL-1R1结合的能 力。简而言之，MaxiSorpTM免疫分析板(Nunc公司，Denmark) 与抗IL-1RI小鼠单克隆抗体(R&D Systems，Minneapolis，USA) 共同孵育过夜。各孔用含0.1％(v/v)Tween-20的磷酸盐缓冲液 (PBS)洗涤，用含1％(w/v)BSA的PBS封闭，而后与重组IL-1RI (500ng/ml，R&D Systems)孵育。含待筛选dAbs的大肠杆菌培养 上清液置于洗过的检测板孔中，该板室温孵育30min，然后将IL- 1β(4ng/ml，R&D Systems)加入各孔并混合。用生物素酰化的 抗IL-1β抗体(R&D Systems)检测IL-1β结合，接着加入过氧化 酶标记的抗生物素抗体(Stratech，Soham，UK)，然后与3，3′，5，5′- 四甲基对二氨基联苯(TMB)底物(KPL公司，Gaithersburg， USA)孵育。加入HCl终止反应并在450nm处读取吸收值。抗L- 1RI dAb的活性引起IL-1β结合的减弱，因此与仅有IL-1β的对照 相比吸收减弱。

细胞分析

检测经分离的dAbs抑制IL-1诱导的经培养MRC-5细胞 (ATCC目录号：CCL-171)释放IL-8的能力。简而言之，RPMI 介质中5000个胰蛋白酶消化的MRC-5细胞置于组织培养微孔 板，用IL-1α或IL-1β(R&D Systems，终浓度200pg/ml)和待检 测的dAb稀释液混合。混合物37℃孵育过夜，细胞释放到培养 介质中的IL-8用ELISA(R&D Systems)定量。抗IL- 1RI dAb的活性引起与IL-1结合减弱，以及相应的IL-8释放减 少。

人全血分析

人的全血与待检测dAB的系列稀释液一起孵育，混合物在 37℃/5％ CO2孵育30分钟。接着加入270或900pM(终浓度) 的IL-1α或IL-1β并混合，然后混合物在37℃/5％ CO2继续孵育 20小时。随后将血离心(500 x g，5min)，ELISA(， R&D Systems)法定量释放到上清液中的IL-6。抗IL-1RI dAb的 活性引起IL-1结合减弱，以及相应的IL-6释放减少。

解离速率筛选

这些实验是使用偶联有～600RU的IL-1RI(R&D Systems) 的CM5芯片(Biacore)在BIACORE 3000表面等离子共振仪上 进行的。分析物流经IL-1RI包被的流动池，以空白流动池为线内 参比，在HBS-EP运行缓冲液(Biacore)中的流速为30μl/min。 含有可溶性dAb的10微升上清液用运行缓冲液以1:1稀释，以 10μl/min流速注入(Kinject)，并允许其在缓冲液中解离。相比 母本克隆，解离速率改善的克隆用肉眼鉴别或用BIAevaluation软 件v4.1测定。

用表面等离子共振分析IL-1a竞争

这些实验是使用偶联有～600RU的IL-1RI(R&D Systems) 的CM5芯片(Biacore)在BIACORE 3000表面等离子共振仪上 进行的。分析物流经IL-1RI包被的流动池，以空白流动池为线内 参比，在HBS-EP运行缓冲液(Biacore)中流速为30μl/min。IL- 1ra(100nM，R&D Systems)在60秒内注入，接着立即在60秒内 用共注射装置注入200nM DOM4-130-3dAb或100nM IL-1α。

IL-1ra竞争ELISA

MaxiSorpTM免疫分析板(Nunc，Denmark)用1μg/ml IL-1R1- Fc包被过夜，然后用PBS洗涤3次，再用1％(v/v)Tween 20的 PBS封闭。再次洗涤免疫分析板，加入与DOM4-130-3或IL-1α 系列稀释液混合的500pM IL-1ra。用生物素酰化的抗IL-1ra抗体 R&D Systems)检测IL-1ra与受体的结合，随后如前所 述加入链霉亲和素-HRP，用3，3′，5，5′-四甲基对二氨基联苯 (TMB)底物(KPL，Gaithersburg，USA)显色。与不含IL-1ra的 对照孔相比，A450的减少表明与IL-1ra竞争和IL-1R1的结合。

亲和力成熟噬菌体库的构建

构建了两种类型的库：CDR重新多样化库和错配库。对于前 者，用含NNK或NNS密码子的简并寡核苷酸进行PCR反应，使 亲和力待成熟的dAb中所需位置多样化，然后通过组装PCR生成 全长多样化插入片段。对于错配库，用 II随机诱变 试剂盒(Stratagene)对编码待亲和力成熟的质粒DNA进行PCR 扩增。这两种方法生成的插入片段用Sal I与Not I酶切，与经切 割的噬菌体载体连接。该连接物通过电穿孔转化大肠杆菌菌株 TB1，被转化的细胞置于含15μg/ml四环素的2xTY琼脂平板上， 生成>1×108克隆规模的库。

结果

初筛与筛选

初步噬菌体筛选用4G-K2库进行，将筛得物亚克隆到可溶性 表达载体(pDOM5)中。用上清液RBA鉴定抑制IL-1与IL-1R1 结合的dAb克隆，随后表达，用蛋白L纯化，在MRC-5细胞分 析中测试其抑制IL-1诱导的IL-8释放的能力。图1是这样的细胞 分析中抗-IL-1R1 dAbDOM4-122和DOM4-129量效曲线。本分析 中每种dAb的半数中和量(ND50)为约1μM。DOM4-122和 DOM4-129就其CDRs 1和2而言有相同的氨基酸序列，就其 CDR3而言5个氨基酸残基中有两个相同，因此预期DOM4-122 和DOM4-129能与受体上相同的表位结合。

亲和力成熟

成熟阶段I

以DOM4-122为模板，构建成熟库，该库具有在位置28、 30、31、92和93处编码全部20个氨基酸的多样性。同时DOM4- 129通过错配PCR诱变实现亲和力成熟。得到的噬菌体库用于针 对IL-1R1-Fc的可溶性筛选。第2和第3轮筛得物克隆到噬菌体 表达载体(pDOM5)中，dAbs在大肠杆菌中表达，以母本dAb 为对照，筛选解离速率提高的表达上清液中的dAb。解离速率改 善的克隆被表达，纯化并在MRC-5/IL-8分析中检测。图2展示了 改进的变体DOM4-122-3和DOM4-129-1的量效曲线，两者的 ND50值都为～10nM。

成熟阶段II

通过CDRs1和3重新多样化实现的抗IL-1R1 dAb DOM4-122 (ND50～1μM)亲和力成熟阶段I生成了DOM4-122-6(～10 nM)。通过错配PCR的DOM4-129(～1μM)的突变生成 DOM4-129-1(～10nM)。DOM4-129-1获得额外突变S56R的过 程中，DOM4-129-1和DOM4-122-6共同获得了突变L46F。从突 变筛选分离的克隆中经常发现这两种变化，因此所述S56R被引 入DOM4-122-6，生成DOM4-122-23。该组合变体dAb的ND50 为约1nM(图2)。DOM4-122和DOM4-129获得额外点突变 K45M经证实在回复到DOM4-122-23时不是必需的，生成 DOM4-122-24。

dAbs的表位特异性

为了确定抗-IL-1R1 dAbs的表位特异性，进行了竞争性结合 分析。用BIOCORE表面等离子共振仪进行的研究中，注入IL- 1ra流经偶联有IL-1R1的芯片，然后立即注入DOM4-122-23或 IL-1a。结果见图3A与3B。图3A表明DOM4-122-23与已和IL- 1ra结合的IL-1R1结合。注入IL-1ra，接着注入IL-1α，这两种分 子已知会竞争与受体的结合，则IL-1α也不能与受体结合(图 3B)。本结果用竞争ELISA法得以证实，其中在DOM4-122-23 或IL-1a(系列浓度)存在下IL-1ra与IL-1R1结合得到了确认。 该ELISA结果表明，DOM4-122-23即便浓度高达1μM时，仍不 抑制IL-1ra(500pM)和IL-1R1结合，其中  IL-1a不抑制IL-1ra 和IL-1R1结合(图4)。该结果证实DOM4-122-23抑制IL-1和 IL-1R1结合，但不会和IL-1ra竞争与IL-1R1的结合。

实施例2蛋白酶稳定性

蛋白酶稳定性

dAbs和含有dAbs的配体可用于治疗多种疾病，如炎症疾 病。此外，如本文所述，dAbs以及配体的半衰期可以如通过聚乙 二醇化而改变。因而dAbs以及配体可以用于如全身给药(如聚乙 二醇化的dAb治疗关节炎)或局部给药(如dAb单体治疗 COPD)。

研究了与IL-1R1结合的两种dAb对弹性蛋白酶或胰蛋白酶作 用的稳定性。发现这两种蛋白酶自然状态时在肺中处于低水平， 但是在如COPD的疾病状态时，弹性蛋白酶等蛋白酶水平升高。 本研究中使用了dAB单体DOM4-130-54，和含有一个点突变的 DOM4-130-54变体，所述点突变提供了特异性连接PEG的半胱氨 酸残基。

将1mg/ml DOM4-130-54的PBS溶液与0.04％胰蛋白酶或弹 性蛋白酶(人唾液白细胞弹性蛋白酶购自Elastin Products Company Inc)一起孵育。该dAb/蛋白酶混合物随后在30℃孵 育，在规定时间间隔取样(0、1、3和24小时)用于SDS-PAGE 分析。在给定的时间点，加入SDS-PAGE上样缓冲液(×10浓储 存液)以终止反应，接着在液氮里将样品速冻。样品用SDS- PAGS分析，使蛋白带显色，以揭示dAb的蛋白酶降解的时间过 程。

结果

测试了两种形式的DOM4-130-54：大肠杆菌表达的单体以及 巴斯德毕赤酵母表达的半胱氨酸基因工程变体P80C，对弹性蛋白 酶作用的稳定性。DOM4-130-54的所述P80C点突变提供了特异 性连接PEG的半胱氨酸残基。

弹性蛋白酶降解的时间过程揭示了即便是24小时后DOM4- 130-54也没有降解的迹象。该结果还表明了与DOM4-130-54相 比，引入所述P80C突变对该蛋白的稳定性没有影响。这些结果 意味着所述P80C变体的三级结构与DOM4-130-54的三级结构没 有实质性差别。

还检测了胰蛋白酶存在下单体dAb DOM4-130-54的稳定性。 胰蛋白酶降解的时间过程显示DOM4-130-54可以稳定至少3小 时，仅在第24小时这个时间点观察到降解。

本研究的结果表明dAbs是稳定的，耐弹性蛋白酶或胰蛋白酶 介导的降解。dAbs对蛋白酶降解作用所显示的稳定性说明dAb可 以在体内给药，在足够长的时间内都有功能，从而产生显著的生 物效应。例如本结果表明当dAb施用于肺时，可耐蛋白酶降解， 并因此保持足够长时间的功能，从而产生显著的生物效应(如结 合并抑制如IL-1R1的靶蛋白的活性)。

虽然本发明已详细说明，并以参考其优选实施方案的方式进 行描述，但本领域所属的技术人员应该明白，其中可做出的形式 及细节的各种变化不偏离所附权利要求包括的本发明的范围。

相关申请

本申请要求2005年12月1号提交的美国临时申请No. 60/742,062的利益。上述申请的全部教导在此引作参考。

序列表

<110>Domantis Limited

Drew，Philip D.

de Wildt，Rudolf M.T.

Tomlinson，Ian M.

Basran，Amrik

<120>NONCOMPETITIVE DOMAIN ANTIBODY FORMATS

THAT BIND INTERLEUKIN 1 RECEPTOR TYPE 1

<130>3440.1004002

<150>60/742，062

<151>2005-01-12

<160>997

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

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<212>DNA

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<400>643

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>646

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>647

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>648

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>649

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>650

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<211>324

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<213>人(Homo sapiens)

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<212>DNA

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<400>657

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>658

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>659

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>660

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>661

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>662

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>663

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>664

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>665

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<211>324

<212>DNA

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<400>666

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<211>324

<212>DNA

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<400>667

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>668

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>674

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>675

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>676

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>677

<210>678

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>678

<210>679

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>679

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>680

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>681

<210>682

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>682

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>683

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>684

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>685

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<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>686

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<211>324

<212>DNA

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<400>687

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>688

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>689

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>690

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>691

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>692

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>693

<210>694

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>694

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>698

<210>699

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>699

<210>700

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>700

<210>701

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>701

<210>702

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>702

<210>703

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>703

<210>704

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>704

<210>705

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>705

<210>706

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>706

<210>707

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>707

<210>708

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>708

<210>709

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>709

<210>710

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>710

<210>711

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>711

<210>712

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>712

<210>713

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>713

<210>714

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>714

<210>715

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>715

<210>716

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>716

<210>717

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>717

<210>718

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>718

<210>719

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>719

<210>720

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>720

<210>721

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>721

<210>722

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>722

<210>723

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>723

<210>724

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>724

<210>725

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>725

<210>726

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>726

<210>727

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>727

<210>728

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>728

<210>729

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>729

<210>730

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>730

<210>731

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>731

<210>732

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>732

<210>733

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>733

<210>734

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>734

<210>735

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>735

<210>736

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>736

<210>737

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>737

<210>738

<211>35

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>30，31

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>738

<210>739

<211>123

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>739

<210>740

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>740

<210>741

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>741

<210>742

<211>117

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>742

<210>743

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>743

<210>744

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>744

<210>745

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>745

<210>746

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>746

<210>747

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>747

<210>748

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>748

<210>749

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>749

<210>750

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>750

<210>751

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>751

<210>752

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>752

<210>753

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>753

<210>754

<211>116

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>754

<210>755

<211>117

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>755

<210>756

<211>117

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>756

<210>757

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>757

<210>758

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>758

<210>759

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>759

<210>760

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>760

<210>761

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>761

<210>762

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>762

<210>763

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>763

<210>764

<211>121

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>764

<210>765

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>765

<210>766

<211>116

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>766

<210>767

<211>117

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>767

<210>768

<211>115

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>768

<210>769

<211>115

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>769

<210>770

<211>114

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>770

<210>771

<211>114

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>771

<210>772

<211>128

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>772

<210>773

<211>124

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>773

<210>774

<211>120

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>774

<210>775

<211>123

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>775

<210>776

<211>125

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>776

<210>777

<211>125

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>777

<210>778

<211>124

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>778

<210>779

<211>131

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>779

<210>780

<211>126

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>780

<210>781

<211>128

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>781

<210>782

<211>120

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>782

<210>783

<211>123

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>783

<210>784

<211>125

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>驼类(Camelid)

<400>784

<210>785

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>785

<210>786

<211>116

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>786

<210>787

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>787

<210>788

<211>116

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>788

<210>789

<211>124

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>789

<210>790

<211>123

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>790

<210>791

<211>116

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>791

<210>792

<211>117

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>792

<210>793

<211>117

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>793

<210>794

<211>121

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>794

<210>795

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>795

<210>796

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>796

<210>797

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>797

<210>798

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>798

<210>799

<211>121

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>799

<210>800

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>800

<210>801

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>801

<210>802

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>802

<210>803

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>803

<210>804

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>804

<210>805

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>805

<210>806

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>806

<210>807

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>807

<210>808

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>808

<210>809

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>809

<210>810

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>810

<210>811

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>811

<210>812

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>812

<210>813

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>813

<210>814

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>814

<210>815

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>815

<210>816

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>816

<210>817

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>20

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>817

<210>818

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>818

<210>819

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>819

<210>820

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>820

<210>821

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>821

<210>822

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>822

<210>823

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>823

<210>824

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>824

<210>825

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>825

<210>826

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>826

<210>827

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>827

<210>828

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>828

<210>829

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>829

<210>830

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>830

<210>831

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>831

<210>832

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>832

<210>833

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>833

<210>834

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>834

<210>835

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>835

<210>836

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>836

<210>837

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>837

<210>838

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>838

<210>839

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>839

<210>840

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>840

<210>841

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>841

<210>842

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>842

<210>843

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>843

<210>844

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>844

<210>845

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>845

<210>846

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>846

<210>847

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<210>913

<211>124

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>916

<210>917

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

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<212>PRT

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>62

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<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>62

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>920

<210>921

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>921

<210>922

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>922

<210>923

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<212>PRT

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<400>923

<210>924

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>924

<210>925

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>925

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>926

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>927

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>928

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>939

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<212>PRT

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<212>PRT

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<211>122

<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

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<400>948

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<212>PRT

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<400>949

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

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<212>PRT

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<400>951

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<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>952

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<212>PRT

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<400>953

<210>954

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>954

<210>955

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>955

<210>956

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>956

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>957

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<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>958

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<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

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<212>PRT

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<400>962

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

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<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>963

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<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>964

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<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>965

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>966

<210>967

<211>119

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>967

<210>968

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>968

<210>969

<211>115

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>969

<210>970

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>970

<210>971

<211>115

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

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<400>971

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<211>119

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>30

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>972

<210>973

<211>119

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>33

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>973

<210>974

<211>119

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>974

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<211>115

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

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<212>PRT

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<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

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<212>PRT

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<221>变异体

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<220>

<221>变异体

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<213>人(Homo sapiens)

<400>988

<210>989

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>989

<210>990

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>990

<210>991

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>991

<210>992

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>992

<210>993

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>993

<210>994

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>994

<210>995

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>995

<210>996

<211>182

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>996

<210>997

<211>183

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>997