一种包载疏水性药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚
合物、其制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本
发明涉及一种包载疏水性抗癌药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-
聚合物、其制备方法及其应用，属于
肿瘤药物制备领域。
背景技术
[0002] 肿瘤的
治疗目前仍以手术及放、化疗为主。放疗和化疗的协同治疗肿瘤成为肿瘤治疗的主要手段，近几年许多研究证实，同步
放化疗的疗效与放疗和化疗分开进行相比，其治疗效果较好，同时降低了放疗和化疗带给
机体的毒
副作用。
[0003] 近年来肿瘤放疗的患者与日俱增，由于实体肿瘤缺
氧现象的存在，即使用最大可能的照射剂量或改变照射方法，仍然很难根治肿瘤。为了有效的根治肿瘤，科学家们采用放疗增敏剂或放疗和化疗结合的方式来提高放疗的疗效。(1)放疗增敏剂：50年代后期科学家们开始研究放疗增敏剂，合成了一系列硝基咪唑类化合物，该类化合物对乏氧细胞具有特异性的放疗增敏作用。但是大部分该类增敏剂都是通过静脉滴注的方式
给药，需要大剂量才能产生增敏作用，同时引起严重的神经毒副作用。再者肿瘤细胞高度耐
辐射性的重要原因之一是其所处的微环境为缺氧环境，减少了氧自由基对DNA增殖的损伤。且越来越多的研究表明，
放射治疗前肿瘤组织的缺氧程度与放射治疗后患者的总体生存期密切相关。因此，研发安全高效的缺氧放射增敏剂已成为肿瘤治疗的当务之急。硝基咪唑化合物作为传统的缺氧放疗增敏剂，其增敏的主要原因是在乏氧情况下，与氧类似能通过转移
电子使受放射损伤的靶分子自由基不能重新获得电子而影响修复，进而固定DNA链断裂损伤导致的细胞死亡。因此，提高肿瘤组织的药物浓度同时减少药物对非肿瘤组织的毒副作用，成为使用此类放疗增敏剂面临的主要问题。(2)放化疗结合的方式：临床上同步放化疗治疗肿瘤，取得了一定的疗效，但是放疗和化疗治疗
叠加的毒副作用对机体影响严重。因此，降低肿瘤药物的毒副作用，同时有效地实现放疗和化疗的治疗效果，是提高放化疗治疗肿瘤的关键。
发明内容
[0004] 针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种包载疏水性抗癌药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物，包括脂质分子、具放疗增敏作用的硝基咪唑有机聚合物和疏水抗癌药物；该脂质分子包括DSPE-PEG-靶头、大豆卵磷脂、DSPE-PEG；具有放疗增敏作用的硝基咪唑有机聚合物通过亲疏水自组装的形式组成的；所述的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物中各原料及其
质量百分比为：聚硝基咪唑有机聚合物，物质的量比为25～90％；大豆卵磷脂物质的量比为5～50％；DSPE-PEG物质的量比为1～40％；DSPE-PEG-靶头靶向脂质分子物质的量比为0.1～10％；所述的疏水性抗癌药物通过疏水作用包载入脂质-聚合物纳米载体中，疏水性抗癌药物用量占脂质-聚合物纳米载体质量的 5～20％；所述的具放疗增敏功能的聚硝基咪唑聚合物，具有如下结构通式：
[0005]
[0006] 基团R为：
[0007]
[0008] 所述的基团R中：
[0009] 当R1为氢；R2为亚甲基；R3为甲基；R4为硝基；
[0010] 当R1为氢；R2为亚乙基；R3为甲基；R4为硝基；
[0011] 当R1为羟基；R2为亚甲基；R3为甲基；R4为硝基；
[0012] 当R1为氢，R2为亚乙基；R3为硝基；R4为氢；
[0013] n优化为8-60的聚合度。
[0014] 优选地，所述的具放疗增敏功能的聚硝基咪唑有机聚合物，其结构式如下：
[0015]
[0016] 优选地，所述的具放疗增敏功能的聚硝基咪唑聚合物，H-R为：
[0017] 2-甲基-5-硝基咪唑-1-
乙醇，其结构式为：
[0018] 2-甲基-5-硝基咪唑-1-丙醇，其结构式为：
[0019] 302985，其结构式为：
[0020] 优选地，所述的DSPE-PEG-靶头靶向脂质分子为：叶酸、RGD和 Angiopeptide-2。
[0021] 优选地，所述的DSPE-PEG为：DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、 DSPE-PEG3400或DSPE-PEG5000。
[0022] 优选地，所述的疏水性抗癌药物为去
盐酸盐的阿霉素，替莫唑胺，
氨甲蝶呤、紫杉醇、吲哚菁绿ICG。
[0023] 一种如上述的包载疏水性抗癌药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物的制备方法，其特征在于：按如下方法制备：按质量比称量包载瘤药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物原料：带有DSPE-PEG2000-靶头靶向脂质分子、聚甲硝唑PMTZ、DSPE-PEG2000和大豆卵磷脂和疏水性抗癌药物，全部溶解于适量的DMSO中，再缓慢的滴入到双蒸水中，边滴入边搅拌，制得包载疏水性抗癌药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物，使包载疏水性抗癌药物的脂质-聚合物的浓度为0.01mg/mL～50mg/mL。
[0024] 优选地，所述的包载疏水性抗癌药物的方法中的DMSO
溶剂为分析纯。
[0025] 如上述的一种包载疏水性抗癌药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物应用于制备肿瘤放
化疗药物。
[0026] 本发明的有益效果在于：1、实现放疗增敏剂与抗肿瘤药物同步协同治疗肿瘤，该脂质体可降低放化疗药物的毒副作用，并可实现放疗增敏剂和抗肿瘤药物靶向分布于肿瘤处；2、可包封
水溶性和脂溶性药物，具有提高药物
稳定性，减少药物用量，延缓释放，降低体内消除速度；改变药物体内的分布。
附图说明
[0027] 图1聚硝基咪唑有机聚合物(聚甲硝唑有机聚合物)的1H NMR检测；
[0028] 图2为本发明的包载疏水性抗癌药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物的电镜形貌表征；
[0029] 图3a为本发明的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物的粒径表征；图3b 为本发明的包载疏水性抗癌药物的去盐酸盐阿霉素具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物的粒径表征；图3c为制备的包载疏水性抗癌药物的替莫唑胺具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物的粒径表征；
[0030] 图4a、图4b和图4c为本发明的包载疏水性抗癌药物：去盐酸盐阿霉素或替莫唑胺的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物的MTT细胞毒性实验结果；
[0031] 图5为本发明的包载疏水性抗癌药物：去盐酸盐阿霉素(a)替莫唑胺(b) 的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物的细胞集落实验结果；
[0032] 图6a为本发明的包载疏水性抗癌药物的去盐酸盐阿霉素；图6b替莫唑胺具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物的放疗增敏移植鼠肿瘤抑制肿瘤生长的
荧光素酶检测的附图；
[0033] 图7a为本发明的包载疏水性抗癌药物的去盐酸盐阿霉素；图7b替莫唑胺具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物移植鼠肿瘤抑制肿瘤生长的荧光素
密度值的检测。
具体实施方式
[0034] 下面结合附图所示的
实施例对本发明作以下详细描述：
[0035] 本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0036] 一种包载疏水性抗癌药物的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物，包括脂质分子、具放疗增敏作用的硝基咪唑有机聚合物和疏水抗癌药物；该脂质分子包括DSPE-PEG-靶头、大豆卵磷脂、DSPE-PEG；具有放疗增敏作用的硝基咪唑有机聚合物通过亲疏水自组装的形式组成的；所述的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物中各原料及其质量百分比为：聚硝基咪唑有机聚合物，物质的量比为25～90％；大豆卵磷脂物质的量比为5～50％；DSPE-PEG物质的量比为 1～40％；DSPE-PEG-靶头靶向脂质分子物质的量比为0.1～10％；
所述的疏水性抗癌药物通过疏水作用包载入脂质-聚合物纳米载体中，疏水性抗癌药物用量占脂质-聚合物纳米载体质量的5-20％；所述的具放疗增敏功能的聚硝基咪唑聚合物，具有如下结构通式：
[0037]
[0038] 基团R为：
[0039] 所述的基团R中：
[0040] 当R1为氢；R2为亚甲基；R3为甲基；R4为硝基；
[0041] 当R1为氢；R2为亚乙基；R3为甲基；R4为硝基；
[0042] 当R1为羟基；R2为亚甲基；R3为甲基；R4为硝基；
[0043] 当R1为氢，R2为亚乙基；R3为硝基；R4为氢；
[0044] n优化为8-60的聚合度。
[0045] 所述的具放疗增敏功能的聚硝基咪唑有机聚合物，其结构式如下：
[0046]
[0047] 所述的具放疗增敏功能的聚硝基咪唑有机聚合物，H-R为：
[0048] 2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙醇，其结构式为：
[0049] 2-甲基-5-硝基咪唑-1-丙醇，其结构式为：
[0050] 302985，其结构式为：
[0051] 所述的DSPE-PEG-靶头靶向脂质分子为：叶酸、RGD和Angiopep-2。
[0052] 所述的DSPE-PEG为：DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、 DSPE-PEG3400或DSPE-PEG5000。
[0053] 所述的疏水性抗癌药物为去盐酸盐的阿霉素，替莫唑胺，氨甲蝶呤、紫杉醇、吲哚菁绿ICG。
[0054] 聚甲硝唑有机聚合物的合成：
[0055] 称取500mg丙烯酰基甲硝唑、80.17mg CTA、14.31mg AIBN置于放有
转子的长颈厚壁窄口反应瓶，并向反应瓶内加入1mL的DMF，待药品溶解后密封反应瓶。采用冻干、抽
泵、解冻的方法除去反应体系中的氧，分别制备出了6000 分子量的聚甲硝唑有机聚合物和12000分子量的聚甲硝唑有机聚合物。核磁检测结果见图1。
[0056] 具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物的制备：
[0057] 将按摩尔分数称量的原料，其中具放疗增敏功能的聚甲硝唑有机聚合物占 79.2％angiopeptide-2-DSPE-PEG2000占1％；全部溶解于适量的DMSO溶剂中，再缓慢的滴入到三重水中，边滴入边搅拌，待滴入完毕后继续搅拌5分钟，制得具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物，该具靶向和放疗增敏双重功能脂质- 聚合物的浓度为3mg/mL。
[0058] 包载疏水性抗癌药物的方法：
[0059] 所选用的具靶向和放疗增敏双重功能脂质-聚合物中的聚甲硝唑有机聚合物，其结构式为：
[0060]
[0061] 将按摩尔分数称量的原料，其中具放疗增敏功能的脂质分子PMTZ占79.2％，卵磷脂13.86％和聚乙二醇磷脂DSPE-PEG2000占5.94％，Anhiopeptide-2-DSPE-PEG2000占1％；溶解于适量的DMSO溶剂中，未包载疏水性抗癌药物去盐酸盐阿霉素脂质体浓度为3mg/mL，再加入疏水性抗癌药物：去盐酸盐阿霉素或者替莫唑胺，所述的疏水性抗癌药物去盐酸盐阿霉素或者替莫唑胺用量占具放疗增敏作用脂质体质量的15％；充分混匀后，缓慢滴入双蒸水中，充分搅拌5分钟，制成包载疏水性抗肿瘤药物的具靶向和放疗增敏双重作用的脂质-聚合物。
[0062] 放疗增敏作用脂质-聚合物形貌的表征：用透射电子
显微镜观察具放疗增敏作用脂质-聚合物的形貌，结果显示，呈粒径均一的球形结构(图2)，并且粒径大约65.61nm见图3a。
[0063] 放疗增敏作用脂质-聚合物负载盐酸阿霉素或者替莫唑胺水
力学直径的表征：利用
马尔文粒度检测仪检测包载盐酸阿霉素的具放疗增敏作用脂质-聚合物的水力学直径，结果显示其粒径大约60.38nm(见图3b)。
[0064] 利用马尔文粒度检测仪检测包载替莫唑胺的具放疗增敏作用脂质-聚合物的水力学直径，结果显示其粒径大约79.27nm(见图3c)。
[0065] 具放疗增敏作用脂质-聚合物的细胞毒性：良好的
生物相容性是药物制剂应用的前提，本实验采用脑胶质瘤细胞模型，在2％氧气条件下，考察了实施例3的具放疗增敏作用脂质-聚合物的细胞毒性。将胶质瘤细胞以1×104的密度接种于 96孔板中，培养24h。之后用含有空放疗增敏脂质-聚合物组、PLGA加放疗组、 PBS组和PBS加放疗组的含有10％FBS的培养基换液，培养24h。每孔加入10 μL的CCK8于培养基中，在37℃条件下孵育4h。在
波长为450nm条件下测定吸光度值，以未处理细胞为参照，计算细胞存活率。聚甲硝唑有机聚合物在850 μg/mL的浓度下细胞生存率达到85％以上，证明其生物相容性好(图4)。
[0066] 在缺氧环境(2％氧气)，2Gy放射治疗的条件下，具放疗增敏作用脂质体组其放射治疗效果最佳(见图5)。
[0067] 阿霉素载药量和包封率的检测：将2mL包载盐酸阿霉素的具放疗增敏作用脂质体，浓度3mg/mL，置于3500分子量的
透析袋中，透析2-10小时，取出10 μL样品，加入到96孔板中，加入140μL DMSO混匀，在激发光470nm和吸收光590nm处，进行样品的检测，其载药量和包封率计算公式如下：
[0068]
[0069]
[0070] 本发明所制备2ml包载水溶性抗肿瘤药物盐酸阿霉素的具放疗增敏作用脂质体各成分的质量，见表1。
[0071] 表1：各成分的质量
[0072]
[0073] 具放疗增敏作用脂质-聚合物负载阿霉素和替莫唑胺对原位胶质瘤放疗增敏的试验：
[0074] 方法：雄性裸鼠6-7周龄18g，购买于北京华阜康公司。人胶质瘤原位移植模型(C6-Luci)，作为评估放疗增敏作用脂质体的有用模型而建立。允许动物在移植肿瘤细胞前1周适应新环境。肿瘤接种10天后，通过小动物活体成像仪确定肿瘤的大小，将裸鼠进行分组(n＝6)。通过尾静脉注射PBS组，注射PBS 并进行放疗组，注射PLGA并进行放疗组，注射放疗增敏作用脂质-聚合物并进行放疗组。接种肿瘤后12天给药，放疗增敏作用脂质-聚合物的浓度为3mg/mL， 16.8mg/kg聚甲硝唑聚有机物，阿霉素3mg/kg，尾静脉给药后4h，进行2Gy 放疗。隔天给药次数为3次，3次给药要均进行放射治疗，放疗的总剂量为6Gy。于接种肿瘤后第10天、第20天、第27天进行荧光素酶活体成像。肿瘤体积通过荧光素酶成像的图片(见图6a)和荧光素密度值来检测(见图7a和b)，结果显示放疗增敏功能的脂质-聚合物相比于非放疗增敏功能脂质-聚合物负载阿霉素具有显著协同抑制肿瘤的作用。
[0075] 接种肿瘤后12天给药，放疗增敏作用脂质-聚合物的浓度为3mg/mL，112 mg/kg聚甲硝唑聚有机物，替莫唑胺20mg/kg，尾静脉给药后4h，进行2Gy 放疗。隔天给药次数为3次，3次给药要均进行放射治疗，放疗的总剂量为6Gy。于接种肿瘤后第10天、第20天、第27天进行荧光素酶活体成像。肿瘤体积通过荧光素酶成像的图片(见图6b)和荧光素密度值来检测(见图7b)，结果显示放疗增敏功能的脂质-聚合物相比于非放疗增敏功能脂质-聚合物负载替莫唑胺具有显著协同抑制肿瘤的作用。
[0076] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
