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一种用于预防和治疗器官损伤的化合物及其制备方法和用途

阅读：181发布：2021-02-28

专利汇可以提供一种用于预防和治疗器官损伤的化合物及其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种用于预防和治疗器官损伤的化合物及其制备方法和用途，所述化合物为通式1表示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体，其中，R1选自＝O，-NH2，-OH，或者-NH2或-OH取代的C1-4直链或支链烷基；R2不存在或选自-H，C1-4直链或支链烷基，-CHO，或者-CHO取代的C1-4直链或支链烷基；R3选自-H，C1-4直链或支链烷基，或者-OH；n为0-13的正整数。本发明提供的化合物衍生自叶酸，作用于多靶点，全方位抑制不同的器官损伤传导通路，可用来制备预防和/或治疗各种原因导致器官损伤的药物。，下面是一种用于预防和治疗器官损伤的化合物及其制备方法和用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种通式1表示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体，
其中，R1选自＝O，-NH2，-OH，或者-NH2或-OH取代的C1-4直链或支链烷基；
R2不存在或选自-H，C1-4直链或支链烷基；-CHO，或者-CHO取代的C1-4直链或支链烷基；
R3选自-H，C1-4直链或支链烷基，或者-OH；
n为0-13的正整数。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体，其特征在于：
R1选自＝O，-NH2，或者-OH；
R2不存在或选自-H，-CH3或者-CHO；
R3选自-H，-CH3，或者-OH；
优选地，n为0、1、2、3、4、5或13。
3.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体，其特征在于：所述化合物由通式2表示，
其中，R1、R2和R3的定义同权利要求1或2；
优选地，所述化合物选自以下由化学式a-e所表示的化合物，
更优选地，所述的化合物选自由以下化学式a-c所表示的化合物，
再优选地，所述的化合物选自由以下化学式a或b所表示的化合物，
最优选地，所述的化合物选自由以下化学式b所表示的化合物，
4.一种用于预防和/或治疗器官损伤的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据权利要求1至3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含其它用于预防和/或治疗器官损伤的药物；
优选地，所述其它用于预防和/或治疗器官损伤的药物选自肝素、水蛭素、阿加曲班、华法林、普陀卡利或缬沙坦中的一种或多种。
6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料；优选地，所述药学上可接受的辅料选自大豆油、橄榄油、中链甘油三酯、大豆磷脂、磷脂酰胆碱、聚乙二醇硬脂酸酯或聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯中的一种或多种；
优选地，所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体与药学上可接受的辅料的质量比为1：10～90，优选为1：15～50，更优选为1：17～30，最优选为1：20～25；
优选地，所述药物组合物为溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂或植入物。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体在制备用于预防和/或治疗器官损伤的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述器官损伤选自心肌梗死、脑中风、急性肾功能衰竭、重症肝炎、出血坏死性胰腺炎、急性肺损伤、骨髓急性损伤、急性坏死性肠炎、急性放射性损伤、败血症或放化疗所致的器官损伤、多器官功能衰竭、风湿、肝衰、类风湿、骨关节炎、呼吸窘迫综合征、同型半胱胺酸血症、经皮冠脉介入治疗(PCI)的并发症或巨幼红细胞性贫血中的一种或多种。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
通式3表示的化合物与C3-16脂肪酸氯甲酯，例如丁酸氯甲酯在碱存在下、在有机溶剂中反应生成通式1表示的化合物，
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述碱为三乙胺；优选地，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺。

说明书全文

一种用于预防和治疗器官损伤的化合物及其制备方法和用

途

技术领域

[0001] 本发明属于医学及药物化学领域，涉及一种用于预防和治疗器官损伤的化合物及其制备方法和用途。更具体来说，本发明提供了一种衍生自叶酸的作用于多靶点，全方位抑制不同器官损伤传导通路的化合物及其制备方法，以及其在制备用来预防和/或治疗各种原因导致的器官损伤的药物中的用途。

背景技术

[0002] 纵观临床上的重症疾病，包括心肌梗死、脑中风、重症肝炎、坏死性胰腺炎以及各种创伤等，其共同的病理本质都是由各种原因导致的组织细胞快速、大量死亡。因此，对于这些疾病的治疗，除了消除病因和对症治疗外，治疗的关键还在于有效地阻止细胞死亡。临床实践表明，对于上述疾病的治疗，单纯使用抗氧化剂、抗凋亡或抗炎剂已经无济于事，只有在全方位地阻断死亡传导途经的同时，提升组织器官对损伤的耐受性，才能有效地扼制细胞死亡，真正达到有效保护器官和降低死亡率的目的。

[0003] 叶酸作为重要的一碳基团载体，其在核苷酸合成、同型半胱氨酸的再甲基化等诸多重要生理代谢功能方面起着重要作用，因此叶酸是机体生长和发育所必需的物质。叶酸已被用于治疗同型半胱胺酸堆积导致的心血管病。有报道发现叶酸在不改变血液流变学特征的同时，可显著抑制iNOS的活性，强烈兴奋ERK2 信号通路。本发明人等曾借助叶酸作为载体将化疗药物递送进入肿瘤细胞，却发现叶酸可明显减轻化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效应，这些研究结果预示着叶酸具有抑制细胞死亡的功能。大量已发表的文献也充分表明叶酸具有强效的抗氧化应激和抑制细胞凋亡的作用。更为重要的是，人们熟知的是生理剂量的叶酸的功能，但超过生理需要量的叶酸还有众多不为人们所知的功能。例如，本发明人发现当叶酸浓度达10微摩尔时具有清除自由基的功能；高浓度的叶酸能降低血管通透性，激活ERK2，抑制GSK-3β传导通路，激活PPARγ以及抑制炎症反应等。此外，叶酸理化性质稳定，来源丰富，价格便宜，因此叶酸有望用来防治心肌梗死等疾病。

[0004] 然而，叶酸是水溶性维生素，主要是通过叶酸受体介导的主动转运被吸收，极少部分以浓度梯度被动吸收。通过主动转运吸收的叶酸只能维持机体生理需要的量，达不到治疗目的所需的药物浓度。有报道，超高剂量的叶酸(超过常用量的100-1000倍)可有效地预防和治疗大鼠实验性急性心肌梗死。然而，这在临床应用上极不现实，超大剂量的叶酸有严重的副作用，如导致急性肾功能衰竭等。因此，叶酸要在生物体内达到产生治疗效应的药物浓度，必须改变其生物利用度和吸收方式。叶酸是非脂溶性的强极性化合物，LogP值为-0.68，机体被动吸收的效率极低。

[0005] 因此，如何有效提高叶酸的生物利用度已经成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

[0006] 鉴于现有技术中存在的叶酸因其生物利用度方面存在的问题而导致其应用受到限制的缺陷，本发明通过对叶酸进行衍生化的方法，提供了一种用于预防和/或治疗器官损伤的化合物及其制备方法和用途，所述化合物衍生自叶酸，其作用于多靶点，全方位抑制不同的器官损伤的传导通路，可用来制备有效地预防和/或治疗各种原因导致的器官损伤的药物。

[0007] 用于实现上述目的的技术方案如下：

[0008] 一种通式1表示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体，

[0009]

[0010] 其中，R1选自＝O，-NH2，-OH，或者-NH2或-OH取代的C1-4直链或支链烷基；

[0011] R2不存在或选自-H，C1-4直链或支链烷基，-CHO，或者-CHO取代的C1-4直链或支链烷基；

[0012] R3选自-H，C1-4直链或支链烷基，或者-OH；

[0013] n为0-13的正整数。

[0014] 优选地，R1选自＝O，-NH2，或者-OH；R2不存在或选自-H，-CH3或者-CHO；R3选自-H，-CH3，或者-OH。

[0015] 优选地，n为0、1、2、3、4、5或13，即通式1表示的化合物为叶酸的药学上可接受的酯(叶酸酯)，其包括但不限于，例如叶酸丙酸酯、叶酸丁酸酯、叶酸戊酸酯、叶酸己酸酯、叶酸庚酸酯、叶酸辛酸酯或叶酸棕榈酸酯，其都在本发明的范围内。

[0016] 优选地，所述化合物由通式2表示，

[0017]

[0018] 其中，R1、R2和R3的定义同上。

[0019] 进一步优选地，所述化合物选自由以下化学式a-e所表示的化合物，[0020]

[0021]

[0022] 更优选地，所述化合物选自由以下化学式a-c所表示的化合物，

[0023]

[0024] 再优选地，所述的化合物选自由以下化学式a或b所表示的化合物，[0025]

[0026]

[0027] 最优选地，所述化合物选自由以下化学式b所表示的化合物，

[0028]

[0029] 本发明所述的代谢中间体是指可以通过人类或动物体内的常规生物代谢作用，由通式1表示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物，特别是由化学式a-e所表示的化合物转化而成的代谢中间体。例如，通式1表示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物或溶剂化物进入体内后在酯酶作用下可降解为以下所示的代谢中间体1-3，这些代谢中间体仍然具有一定的保护器官损伤的效果。

[0030]

[0031]

[0032] 本发明还提供了一种用于预防和/或治疗器官损伤的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体。

[0033] 优选地，所述药物组合物还包含其它用于预防和/或治疗器官损伤的药物；优选地，所述其它用于预防和/或治疗器官损伤的药物选自肝素、水蛭素、阿加曲班、华法林、普陀卡利或缬沙坦中的一种或多种，但本发明所述其它用于预防和/或治疗器官损伤的药物并不局限于所述这些。

[0034] 优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。进一步优选地，所述药学上可接受的辅料选自大豆油、橄榄油、中链甘油三酯、大豆磷脂、磷脂酰胆碱、聚乙二醇硬脂酸酯或聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯中的一种或多种，但本发明所述药学上可接受的辅料并不局限于所述这些。进一步优选地，所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体与药学上可接受的辅料的质量比为1：10～90，优选为1：15～50，更优选为1：17～30，最优选为1：20～25。

[0035] 本发明所述药物组合物可以制成任意剂型，并以适当的给药方式给予经受重要器官急性损伤的治疗对象。优选地，所述药物组合物可以为溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂或植入物。例如，可以将本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体制成溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、植入物等剂型，在器官急性损伤之前、过程中或之后，通过口服、肌肉、静脉注射、经皮吸收、粘膜吸收、体内植入等方式，将本发明的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体给予患者。本领域技术人员可以根据患者的病征种类、身体健康情况、具体治疗方案等因素，适当地选择本发明化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体的用量以及给药途径。每日的剂量可以一次性给予，也可以分为多次给予。在本发明的一个优选实施方式中，本发明的保护剂通过口服或静脉注射方式给药。

[0036] 本领域技术人员可以根据具体情况选择本发明化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体给予患者的用量。在一个实施方式中，本发明化合物的用量为0.1-100毫克/千克体重，优选为1-50毫克/千克体重，更优选为1.5-20毫克/千克体重，最优选为1-10毫克/千克体重。

[0037] 本发明还提供了所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体在制备用于预防和/或治疗器官损伤的药物中的用途。优选地，所述器官损伤选自心肌梗死、脑中风、急性肾功能衰竭、重症肝炎、出血坏死性胰腺炎、急性肺损伤、骨髓急性损伤、急性坏死性肠炎、急性放射性损伤、败血症或放化疗所致的器官损伤、多器官功能衰竭、风湿、肝衰、类风湿、骨关节炎、呼吸窘迫综合征、同型半胱氨酸血症、经皮冠脉介入治疗(PCI)的并发症或巨幼红细胞性贫血中的一种或多种。

[0038] 本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体的制备方法可以包括以下步骤：

[0039] 通式3表示的化合物与C3-16脂肪酸氯甲酯，例如丁酸氯甲酯在碱存在下、在有机溶剂中反应生成通式1表示的化合物，

[0040]

[0041] 在所述的制备方法中，优选地，所述碱为三乙胺；优选地，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺。

[0042] 本发明经研究发现，将叶酸酯化是提高其生物利用度的最有效手段，叶酸的酯化将形成剂量依赖性的药物吸收并能使其穿过血脑屏障进入脑组织。而针对现有技术中存在的大量可供选择的用于叶酸酯化的方法和试剂，本发明人经过大量设计和筛选试验，力图寻找一种最有利的叶酸酯化方式。在这个过程中，本发明人注意到一种组蛋白乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor/HDAC Inhibitors)，如丁酸钠等，能强烈诱导细胞表达热休克蛋白70(Hsp70)。众所周知，Hsp70是细胞保护蛋白，其高表达可以有效地保护细胞免受氧化损伤；组蛋白乙酰化酶抑制剂还能有效地阻断P53介导的细胞死亡信号传导途径。亦有报道称组蛋白乙酰化酶抑制剂能阻断TNF-alpha和TGF-beta等细胞因子介导的炎症反应。大量的报道称组蛋白乙酰化酶抑制剂还能增加细胞内谷胱甘肽的水平，以此增强细胞的抗氧化能力。

[0043] 以上研究结果充分表明，组蛋白乙酰化酶抑制剂既能抗凋亡(上调保护蛋白以及阻断死亡信号的传导途径)又能抗炎、抗氧化，可望用于治疗缺血再灌注或其它原因导致的器官损伤。亦有不少报道称丁酸钠可以有效地减轻实验性大鼠缺血再灌注引发的脑损伤。然而，组蛋白乙酰化酶抑制剂，特别是丁酸钠，由于其分子量很小(迅速由肾脏清除，因而半衰期极短)，又带有极性基团，特别是羧基，在偏碱的环境中更不容易被细胞有效摄取，所以其生物利用度差，血浆浓度要超过10毫摩尔级别才具有效果，只有当持续大剂量给予丁酸钠时才能达到有效治疗浓度。但是，持续大剂量给予丁酸钠势必加重炎性水肿，并可诱发颅内高压和心衰。

[0044] 为此，本发明人尝试采用协同前药的策略，将上述两种不同类型的化合物通过适当的形式偶联(酯化)而形成协同前药。令人惊喜地，药理实验表明，本发明获得这种前药显著提高了生物利用度，且在药效学方面形成了协同和互补的增效作用，增强了治疗效果，扩大了治疗适应症。

[0045] 具体而言，针对叶酸和丁酸钠极具潜力的治疗价值和作为药物的局限性。本发明利用有机合成技术巧妙地用酯键将叶酸与C3-16脂肪酸(例如丁酸)偶合成为杂合分子，克服了两种化合物在药学上的局限性，并在药效学上产生协同和互补作用，由此获得了通式1所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体。这些化合物可以作为广谱的、超强的细胞保护剂和抗炎剂，在患者发生急性重症疾病的情况下用来阻止细胞快速大量的死亡。该化合物集抗氧化、抗炎、抗凋亡于一体，克服了叶酸和丁酸钠这类组蛋白乙酰化酶抑制剂在药代动力学方面的缺陷，因此其体内抗氧化损伤、抗炎及抗凋亡的能力，特别是在安全性方面要显著优于所有的同类药物。

[0046] 实验表明，通式1所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体具有如下特征：

[0047] 1、具有最佳的脂水分配系数，LogP由-0.65变为2.18，呈剂量依赖性药物的吸收方式，极大提升了药物的生物利用度，并能透过血脑屏障；

[0048] 2、极大地延长了C3-16脂肪酸(例如丁酸)的半衰期，显著增加C3-16脂肪酸(例如丁酸)的膜通透性；

[0049] 3、杂合分子药效呈现协同效应，极大地增强治疗效果；

[0050] 4、杂合分子药效呈互补效应，极大地扩展了治疗适应症；

[0051] 5、所述化合物进入体内后，在脂酶的作用下将杂合分子水解为叶酸和C3-16脂肪酸(例如丁酸)后发挥作用，没有任何产生引起毒副作用的物质，因此该化合物有很高的安全性；

[0052] 6、成本低廉，合成技术简单，易于产业化等。

[0053] 在以往所有发表的文献和专利中，仅提及到叶酸和组蛋白乙酰化酶抑制剂可能分别具有器官保护作用，但都没有从根本上解决这些药物本身的缺陷，也没有实现临床上的有效应用。因此，本领域技术人员不可能预见到根据本发明的叶酸和丁酸的杂合分子比现有技术的活性成分及制剂具有如下更突出的技术效果：极大增强了器官保护效果；增加了抗炎作用；从根本上改善了药物的生物利用度，有效地穿过血脑屏障。附图说明

[0054] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0055] 图1显示了本发明化合物的细胞存活率测试结果；

[0056] 图2显示了本发明化合物对神经细胞缺氧损伤的保护结果；

[0057] 图3显示了本发明化合物对人胚胎肾细胞(HEK293)氧化损伤的保护结果；

[0058] 图4显示了本发明化合物对心肌细胞阿霉素损伤的保护结果；

[0059] 图5显示了本发明化合物对与细胞存活和死亡相关蛋白的影响；

[0060] 图6显示了本发明化合物对Caspase-3的强效抑制活性。

具体实施方式

[0061] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

[0062] 在以下实施例具体介绍了本发明化合物的一些具体例子的合成和细胞保护功能测试，但是需要理解的是，本发明的保护范围并不仅限于这些实施例。

[0063] 在以下内容中将会对本发明进行进一步的详细描述。在本发明中，除非另有说明，所有的比例均为质量比，所有的百分数均为质量百分数，温度的单位为℃，压力的单位为帕。室温指实验室内常规的环境温度，通常为25℃。另外，本发明描述的所有数值范围均包括端值，并且包括将公开的范围的上限和下限互相任意组合得到的新的数值范围。

[0064] 在本发明中使用以下缩写：RT-室温；min-分钟；h-小时；Biotin-生物素；DCM-二氯甲烷；FA-叶酸；5-Me-4H-FA-5-甲基四氢叶酸；DMF-二甲基甲酰胺；DMSO-二甲亚砜；LPS-细菌脂多糖；EtOAc-乙酸乙酯，MeOH-甲醇；K2CO3-碳酸钾；TEA/Et3N-三乙胺；NBT-氯化硝基四氮唑蓝；TUNEL-末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记；
1
HPLC-高压液相色谱法；IR-红外光谱；H NMR-磁共振氢质子波谱分析；MIS％-梗死比；
LVEDP-左室舒张末压；LDH-乳酸脱氢酶；ALT-谷丙转氨酶；AST-谷草转氨酶；SOD-超氧化物歧化酶；GSH-Px-谷胱甘肽氧化酶；MDA-丙二胺；CK-磷酸肌酸激酶；CK-MB-磷酸肌酸激酶同工酶；TNF-肿瘤坏死因子；IL-1-白细胞介素1；IL-6-白细胞介素6；Z-VAD-fmk-细胞凋亡抑制剂；IC50-半数有效量；Caspase-胱氨酸蛋白水解酶；Apoptosis-凋亡；

[0065] 除非另外说明，以下合成实施例所使用的化学试剂均为购自希格玛-艾尔德里奇(Sigma-Aldrich)公司的分析级试剂，所使用的水为去离子双蒸馏水。

[0066] 实施例1

[0067] 在此实施例中合成了化合物a，其合成过程如下：

[0068]

[0069] 将甲基四氢叶酸(457mg，1mmol)、丁酸氯甲酯301mg(2.2mol)、Et3N(三乙胺，202mg，2.2mmol)加入50mL二甲基甲酰胺(DMF)中，60℃下反应6h，反应结束后降温至
40℃，滤过，滤液减压抽干，得到黄色粗品，乙醇重结晶得目标化合物a，黄色固体，纯度为
95％，收率为68％。或者，滤液减压抽干后溶于50mL已酸乙酯，用50mL饱和Na2CO3、5％的乙酸、饱和氯化钠、蒸馏水水洗3次，产物纯度为96％，收率为69％。或者用硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷和甲醇的混合物，梯度洗脱(v/v＝97：3至9：1))，产物纯度为97％，收率为67％。

[0070] 1H-NMR(CDCl3):δ＝8.69(1H,bs,H-7),8.17(1H,m,CONHGlu),7.65,6.70(4H,2m,芳香H),7.31(2H,s,NH),4.82(2H,s,9-CH),4.22(4H,q,2CH),4.23(2H,m,2a-CH),3.20(3H,s),1.79-1.75(4H,m),1.60(4H,s,3CH)。

[0071] LC-MS：C30H40N7O8,m/z(M-H)660.5803。

[0072] 实施例2

[0073] 在此实施例中合成了化合物b，其合成过程如下：

[0074]

[0075] 将叶酸 (441mg，1mmol)、丁酸氯甲酯 301mg(2.2mol)、Et3N( 三乙胺)202mg(2.2mmol)加入50mL二甲基甲酰胺(DMF)中，60℃下反应6h，反应结束后降温至40℃，滤过，滤液减压抽干，得到黄色粗品，乙醇重结晶得目标化合物b，黄色固体，纯度为
95％，收率为68％。或者，滤液减压抽干后溶于50mL的已酸乙酯，用50mL饱和Na2CO3、5％的乙酸、饱和氯化钠、蒸馏水水洗3次，产物纯度为95％，收率为67％。或者用硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷和甲醇的混合物，梯度洗脱(v/v＝97：3至9：1))，产物纯度为97％，收率为62％。

[0076] 1H-NMR(CDCl3):δ＝8.65(1H,bs,H-7),8.15(1H,m,CONHGlu),7.70,6.70(4H,2m,芳香H),7.36(2H,s,NH),4.80(2H,s,9-CH),4.25(4H,q,2CH),4.23(2H,m,2a-CH),3.20(3H,s,),1.79-1.75(4H,m),1.43(4H,s,2CH)。

[0077] LC-MS：C29H35N7O8,m/z(M-H)642.5637。

[0078] 实施例3

[0079] 在此实施例中合成了化合物c，其合成过程如下：

[0080]

[0081] 将亚叶酸(473mg，1mmol)、丁酸氯甲酯301mg(2.2mol)、Et3N(三乙胺，202mg，2.2mmol)加入50mL二甲基甲酰胺(DMF)中，60℃下反应6h，反应结束后降温至40℃，滤过，滤液减压抽干，得到黄色粗品，乙醇重结晶得目标化合物c，黄色固体，纯度为95％，收率为
68％。或者，滤液减压抽干后溶于50mL已酸乙酯，用50mL饱和Na2CO3、5％的乙酸、饱和氯化钠、蒸馏水水洗3次，产物纯度为96％，收率为69％。或者用硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷和甲醇的混合物，梯度洗脱(v/v＝97：3至9：1))，产物纯度为97％，收率为67％。

[0082] 1H-NMR(CDCl3):δ＝8.65(1H,bs,H-7),8.15(1H,m,CONHGlu),7.70,6.70(4H,2m,芳香H),7.36(2H,s,NH),4.80(2H,s,9-CH),4.25(4H,q,2CH),4.23(2H,m,2a-CH),3.20(3H,s),1.79-1.75(4H,m),1.69(4H,s,3CH)。

[0083] LC-MS：C30H39N7O9,m/z(M-H)674.6131。

[0084] 实施例4

[0085] 在此实施例中合成了化合物e，其合成过程如下：

[0086]

[0087] 在通氮气和搅拌的情况下，将实施例1合成的化合物a(661mg，1mmol)、硼氢化钠(189mg，5mol)溶于20mL的DMF，室温下反应30分钟。然后加入5mL 5％的盐酸和100mL乙酸乙酯，然后用5％的冰醋酸、10％的Na2CO3和饱和氯化钠溶液洗涤，滤过，滤液减压抽干，得到黄色粗品，乙醇重结晶得目标化合物e，黄色固体，纯度为97％，收率为81％。或者，滤液减压抽干后溶于50mL已酸乙酯，用50mL饱和Na2CO3、5％的乙酸、饱和氯化钠、蒸馏水水洗3次，产物纯度为92％，收率为83％。或者用硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷和甲醇的混合物，梯度洗脱(v/v＝97：3至9：1))，产物纯度为97％，收率为79％。

[0088] 1H-NMR(CDCl3):δ＝8.71(1H,bs,H-7),8.19(1H,m,CONHGlu),7.63,6.71(4H,2m,芳香H),7.31(2H,s,NH),4.82(2H,s,9-CH),4.22(4H,q,2CH),4.22(2H,m,2a-CH),3.83(dd1H),3.20(3H,s,),1.8–1.76(4H,m),1.61(4H,s,3CH)。

[0089] LC-MS：C30H40N7O8,m/z(M-H)660.5803。

[0090] 实施例5

[0091] 在此实施例中合成了化合物d，其合成过程如下：

[0092]

[0093] 在通氮气和搅拌的情况下，将实施例2合成的化合物b(643mg，1mmol)、硼氢化钠(189mg，5mol)溶于20mL的DCM，室温下反应30分钟。然后加入5mL的5％的盐酸和100mL的乙酸乙酯，然后用5％的冰醋酸、10％的Na2CO3和饱和氯化钠溶液洗涤，滤过，滤液减压抽干，得到黄色粗品，乙醇重结晶得目标化合物d，黄色固体，纯度为97％，收率为79％。或者，滤液减压抽干后溶于50mL已酸乙酯，用50mL饱和Na2CO3、5％的乙酸、饱和氯化钠、蒸馏水水洗3次，产物纯度为93％，收率为81％。或者用硅胶柱色谱法纯化(二氯甲烷和甲醇的混合物，梯度洗脱(v/v＝97：3至9：1))，纯度为96％，收率为75％。1

[0094] H-NMR(CDCl3)：δ＝8.67(1H,bs,H-7),8.16(1H,m,CONHGlu),7.71-7.65(4H,2m,芳香H),7.36(2H,s,NH),4.80(2H,s,9-CH),4.25(4H,q,2CH),4.23(2H,m,2a-CH),3.81(dd1H),3.20(3H,s),1.79-1.75(4H,m),1.45(4H,s,2CH)。

[0095] LC-MS：C29H35N7O8,m/z(M-H)642.5637。

[0096] 本发明所提供的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体均可实现本发明所述的技术效果，尤其是实施例1～5所制得的化合物a-e具有更明显的技术效果。

[0097] 本发明对化合物a-e进行了细胞保护活性实验，并与未进行修饰的叶酸、丁酸钠、甲基四氢叶酸以及已有的泛Caspase抑制剂Z-VAD-fmk进行比较。Caspase检测试剂盒包括的抑制剂(Z-VAD-fmk)和Caspase活化产物是购自美国普罗麦格公司(Promega)公司的分析级试剂。

[0098] 在以下的实施例中进行Caspase活性测定以及体外细胞存活实验，每种实验重复三次，每个浓度设三复孔。计量资料以均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，2
计数资料采用x检验，组间累计生存率的比较采用Kaplan-Meier分析，当p值<0.05时，认为差异有统计学意义。统计分析使用SPSS11.0 软件。

[0099] 试验例1

[0100] 1.体外实验

[0101] 1)采用比色法无细胞系统测定化合物对Caspase-1和Caspase-3的抑制活性[0102] 按照试剂盒说明书进行操作。具体来说，实验在96孔酶标板中进行，将上述合成的化合物a-e(0.10、0.5、2.50、12.5μM)以及Caspases抑制剂Z-VAD-fmk(阳性对照)分别与活化的Caspases-1和Caspase-3以及pNA标记的底物直接加入孔内，于37℃下反应1小时后，在酶标仪上用405nm 波长测OD值。同时使用未加入细胞保护剂的样本进行空白对照，将各实验结果测量值与空白对照相比较，得出Caspase活性被抑制的程度，计算其IC50(μM)，即Caspase活力被抑制一半所需化合物的浓度。结果见表1的第2列和第3列。

[0103] 2)对Caspase-3激活导致细胞凋亡的保护

[0104] 将四环素诱导的活化的Caspase-3稳定转染的细胞(HEK293-Caspase-3，HEK293细胞购自克隆技术实验室有限公司(Clontech Laboratories,Inc.))接种在96孔细胞培养板中(5000细胞/孔)，培养24小时后,将上述合成的化合物a-e(0.5、2.5、12.5、62.5μM)和Caspases抑制剂Z-VAD-fmk、叶酸、甲基四氢叶酸、丁酸钠、甲基四氢叶酸+丁酸钠分别与四环素(用于诱导Caspase-3表达从而导致细胞凋亡)一起直接加到细胞培养基中，培养48小时后，用MTT法测OD值以反映细胞存活情况：各孔加MTT 0.1mg(100μl)，培养3小时后弃上清液，向每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，振荡后用酶联仪测OD值(450nm)，细胞存活率＝(试验组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)。对照组：不加药物；空白对照组：培养液、MTT、DMSO，没有细胞。根据细胞存活率计算其IC50(μM)(50％细胞保护所需的计量)，结果见表1的第4列。

[0105] 由表1可知，叶酸及其衍生物和丁酸钠无论多高的浓度都没有任何直接抑制Caspase-1或3的功能，本发明的化合物a-e体外也无直接抑制Caspase-1或3活性的功能，但能有效抑制活化的Caspase-3引起的细胞凋亡。

[0106] 表1 本发明的化合物对Caspase的抑制效果

[0107]

[0108] 注：“-”表示无抑制活性

[0109] 3)对心肌细胞体外缺血再灌注损伤的保护

[0110] 将大鼠原代培养的心肌细胞接种在96孔细胞培养板中(10000细胞/孔)，在完全培养基(含10％的小牛血清)中培养24小时后，换用无血清培养基继续培养8小时(缺血细胞模型)，然后换用完全培养基继续培养(造缺血再灌注损伤的细胞模型)。在缺血后的3小时，将化合物a-e和对照药物(Z-VAD-fmk、丁酸钠、叶酸及叶酸衍生物(5-甲基四氢叶酸))加到细胞培养基中，培养48小时，用MTT法(同上)检测细胞存活率，结果见图1。由图1可知，叶酸在剂量超过25μM时能保护缺血再灌注引起的体外培养的心肌细胞损伤，然而当叶酸浓度低于10μM时不能有效保护缺血再灌注引起的心肌细胞损伤(p>0.05)；
丁酸钠浓度低于2000μM时对细胞无明显保护作用(p>0.05)，叶酸与丁酸钠合用时并没有达到降低剂量仍然能有效保护细胞的目的(p<0.05)，但是在各自有效剂量下，呈现协同保护效应；本发明的化合物a-e，特别是a和b与对照药物Z-VAD-fmk等相比，其保护效应产生了惊人的增强：当浓度达5μM时，几乎可阻断缺血再灌注引起的心肌细胞损伤(达到80％)的保护(p<0.001)；单用叶酸或四氢叶酸时，浓度达50μM时才有一定的保护效果；而Z-VAD-fmk当浓度高达25μM时，其保护效应仅能提高10-15％，当Z-VAD-fmk浓度超过50μM时，反而显著促进细胞死亡(结果未显示)。引人注目的是，即使在缺血后的3小时，给予本发明的化合物a、b、c、d或e仍能有效保护缺血再灌注引起的心肌细胞损伤(p<0.05)，结果见图1。

[0111] 4)对神经细胞缺氧损伤的保护

[0112] 将大鼠神经细胞(PC12)接种在含有载玻片的12孔细胞培养板中，在完全培养基(含10％的小牛血清并含10ng/ml的NGF)中培养24小时后，换用低氧环境(3％氧)继续培养12小时，然后在正常环境中继续培养。在缺氧后的3小时，将化合物a、b和对照药物(Z-VAD-fmk、叶酸及其衍生物(5-甲基四氢叶酸)、丁酸钠)加到细胞培养基中，培养48小时后，细胞用Hoechst 33342和碘化丙啶双染色，检测凋亡细胞(红色)和存活细胞(蓝色)，结果见图2。由图2可知，叶酸在剂量为10μM并合用丁酸钠(100μM)时，不能保护缺氧引起的神经细胞损伤(p>0.05)；本发明的化合物a和b，当浓度达5μM时，能有效地保护缺氧导致的神经细胞损伤(p<0.01)。

[0113] 5)对人胚胎肾细胞(HEK293)氧化损伤的保护

[0114] 将人胚胎肾细胞(HEK293)接种在含有载玻片的12孔细胞培养板中(30000细胞/孔)，在完全培养基(含10％的小牛血清)中培养24小时后，向培养基中加入200μM的过氧化氢(H2O2)继续培养。在加入过氧化氢(H2O2)后的3小时，将不同浓度的化合物a和b以及不同浓度的叶酸+丁酸钠加到细胞培养基中，培养48小时，直接在倒置显微镜下观察细胞密度并拍照。结果见图3。由图3可知，叶酸在剂量为25μM时并合用丁酸钠(2500μM)能保护双氧水引起的胚胎肾细胞损伤(p<0.05)，然而当叶酸浓度低于5μM时，不能保护双氧水引起的胚胎肾细胞损伤(p>0.05)；丁酸钠浓度低于500μM时对细胞仅轻度的保护作用(p＝0.0518)，本发明的化合物a呈剂量依赖的保护作用,化合物b对细胞的保护效果与化合物a相似，化合物b的结果未显示。

[0115] 6)对心肌细胞阿霉素损伤的保护

[0116] 将大鼠原代培养的心肌细胞接种在96孔细胞培养板中(10000细胞/孔)，在完全培养基(含10％的小牛血清)中培养24小时后，向培养基中加入1μM的阿霉素继续培养。在加入阿霉素后的3小时，将化合物a-e和对照药物(Z-VAD-fmk、叶酸及衍生物(5-甲基四氢叶酸)、丁酸钠等)加到细胞培养基中，培养48小时。细胞用Hoechst 33342染色，检测细胞存活率和凋亡发生率，结果见图4。由图4可知，叶酸在剂量超过25μM并合用丁酸钠(500μM)时，能轻度保护阿霉素引起的心肌细胞细胞损伤，叶酸与丁酸钠合用时并没有达到降低剂量仍然能有效保护细胞的目的，但是在各自有效剂量下，呈现协同保护效应；本发明的化合物a和b与对照药物Z-VAD-fmk等相比，其保护效应产生了极大的增强：当浓度达
5μM时，几乎可阻断阿霉素导致的心肌细胞损伤(p<0.001)，而Caspase抑制剂Z-VAD-fmk的最大保护效应仅能提高10-15％(p<0.05)。引人注目的是，即使在阿霉素处理后的3小时后，给予本发明的化合物仍能有效保护阿霉素引起的心肌细胞损伤(p<0.005)。结果见图
4。

[0117] 试验例2针对急性心肌梗死的治疗

[0118] A.急性心肌梗死模型的建立

[0119] 冠脉结扎法：选用Sprague-Dawly(SD)雄性大鼠，体重200～250g，将SD大鼠用戊巴比妥钠(40mg/kg)经腹腔注射麻醉后，按常规方法制备大鼠MI/R(30min/3h)模型。仰卧位固定于动物手术板上，常规备皮、消毒、首先在颈正中线做切口，钝性分离并暴露气管，沿3、4气管软骨环间进行气管切开术，插管并接通小型动物呼吸机后，剪断2根肋骨，打开胸壁，暴露心脏，小心剪开心包，在左心耳下约3～4mm处左冠动脉前降支与后降支分叉处用无创伤丝线穿过左冠脉前降支，打结后可见左室前壁及心尖部颜色变暗、搏动减弱。同步观察心电图是否逐渐出现ST段弓背向上抬高、Q波以及QRS波峰降低。结扎30分钟后，松开结扎线，恢复血液灌注120分钟，然后关闭胸腔，然后依次缝合肌肉及皮肤。再灌注24h后检测心梗面积、心功能、心肌细胞凋亡及氧化/硝化应激、炎症等指标检测。假手术组采用同样的方法处理，只是不进行冠脉结扎术。

[0120] B.治疗实验(分三部分)

[0121] 1.使用试验例2A得到的大鼠急性心肌梗死模型测试本发明的化合物对急性心肌梗死大鼠模型的疗效。将大鼠随机分为以下编号为a-g的7组(每组包括8只大鼠模型)：a.假手术组(SHAM)，冠脉下穿线不结扎；b.心肌缺血/再灌注(MI/R)组；阳性治疗组包括：c.Z-VAD-fmk(23mg/kg Z-VAD-fmk＝50μM)；d.尼可地尔(0.1mg/kg)；e.叶酸+丁酸钠组(FA：3.2mg/kg＝8μM+BA-Na：36mg/kg＝200μM)；f.本发明的化合物a(a：5mg/kg＝
8μM)；g.本发明的化合物b(b：5.1mg/kg＝8μM)。在急性心肌梗死大鼠模型造成后(缺血后)的半小时，从股静脉或腹腔缓慢注射给药，连续给药2天，每天给药2次。

[0122] 2.在另一个治疗试验中，采用本发明的化合物b的低、中、高三个浓度：

[0123] 低：1mg/kg＝1.7μM；

[0124] 中：3mg/kg＝5μM；

[0125] 高：9mg/kg＝15μM；

[0126] 甲基四氢叶酸(MTFA)+丁酸钠(BA)组的低、中、高三个浓度：

[0127] 低：FA：1mg/kg＝2.7μM+BA:12.7mg/kg＝67μM；

[0128] 中：FA：3mg/kg＝7μM+BA：37.3mg/kg＝200μM；

[0129] 高：FA：9mg/kg＝21μM+BA：112mg/kg＝600μM；

[0130] 进行治疗试验。

[0131] 3.在另一个治疗试验中，在再灌注3小之后静脉或腹腔给予本发明的高剂量的化合物b(9mg/kg)和FA+BA(30mg/kg+336mg/kg)。

[0132] 观测指标

[0133] 1.心脏功能检测：通过多导生理记录仪(RM-4200)持续监测大鼠心电图及血流动力学各指标。心电图、左室发展压(LVDP)、左室等容收缩/舒张期压力上升或下降最大速率(±dP/dtmax)等均通过数据分析系统由计算机自动采集、记录并计算。

[0134] 2.心肌梗死范围测定：第5天取血后取出大鼠心脏，去掉心房组织及脂肪，称重，将左心室心肌横切5片，然后浸入氯化硝基四氮唑蓝(NBT)磷酸缓冲液中，置37℃恒温水浴染色30分钟后取出切片，正常组织染色，缺血组织不染色，切下缺血心肌称重，用缺血心肌与左心室湿重的百分比计算梗死比例(MIS％)。

[0135] 3.血生化指标包括炎症指标的检测：在第3小时和24小时抽取全血用全自动生化分析仪器(UniCel DxC 600Synchron，Beckman，美国)测定血清心肌酶谱(谷草转氨酶/AST、乳酸脱氢酶/LDH、肌酸激酶同工酶/CKMB)；采用双抗体夹心ELISA法检测血TNF、IL-6的变化。

[0136] 4.与细胞存活和死亡相关蛋白的检测：用免疫印迹(Western Blots)方法检测心肌组织P53，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，热休克蛋白70(Hsp70)，金属硫蛋白1(Metallothionein 1，MT1)表达的变化。

[0137] 5.心肌细胞凋亡指数(AI)及caspase-3活性:心肌细胞凋亡的检测用末端标记法，Caspase-3活性测定用Western Blots，用抗PARP的抗体测定PARP被切割的情况。

[0138] 6.抗氧化指标的检测：丙二胺(MDA)含量用硫代巴比妥酸比色法，超氧氧化物歧化酶(SOD)含量采用黄嘌呤氧化酶法测定，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量采用二硫代二硝基苯甲酸法检测。

[0139] 结果

[0140] 1.心脏功能的变化：为观察研发药物对缺血心脏功能是否具有保护作用，监测了大鼠的血流动力学指标。缺血前各指标的基础值无明显差异。再灌注后，各组间心率(HR)无统计学差异；LVDP值SHMA正常对照组为(20±2)kPa，MI/R组比SHAM组有显著降低[(5±1.1)vs(20±2)kPa，n＝8，P<0.01]；FA[(6.1±1.1)kPa，n＝8，P＞0.05]；MTFA[(6.7±1.3)kPa，n＝8，P＞0.05]；尼可地尔[(10.9±1.2)kPa，n＝8，P＞0.05]；
FA+BA[(7.3±1.6)kPa，n＝8，P＞0.05]；Z-VAD-fmk[(6.9±1.1)kPa，n＝8，P＞0.05]；
a[(15.8±1.7)kPa，n＝8，P<0.01]；b[(17.1±1.9)kPa，n＝8，P<0.01]。

[0141] 除本发明的化合物a和b外，其它药物组均不能使LVDP较I/R组显著升高。令人印象深刻的是，Z-VAD-fmk虽然能有效地保护缺血导致的体外培养的心肌细胞的损伤，然而Z-VAD-fmk却不能有效改善动物缺血心肌的心功能，尼可地尔有中度改善LVDP的作用。

[0142] 2.心肌梗死范围和心肌血清酶学的变化：心肌梗死面积和血清酶学指标结果汇总见表2，其表明本发明合成的化合物对心肌缺血再灌注损伤有强保护作用，明显优于Z-VAD-fmk组、尼可地尔以及叶酸+丁酸组，其中在本试验给定的浓度下(FA：5μM，BA：200μM)未有明显的保护作用。即使在缺血半小时后给予本发明的化合物a或b仍然能将梗死面积缩小近3倍，表明本发明的化合物能阻断已经激活的死亡传导通路，有很重要的临床应用价值。

[0143] 表2 化合物对急性心肌梗死的治疗效果

[0144]

[0145] 与梗死组相比，1P<0.05；2P>0.05；3P>0.05；4P<0.001；5P<0.001；

[0146] *P<0.05；#P>0.05

[0147] 3.炎症指标的检测：治疗组和对照组血清炎症因子的变化结果汇总见表3。创伤后3h血浆TNF-α、IL-1、IL-6达到峰值。在再灌注前给予化合物a或b可阻断TNF-α、IL-1、IL-6水平的升高，几乎近正常水平。Z-VAD-FMK仅降低IL-1，尼可地尔仅降低TNF，不能降低其它炎症介质。以上结果表明本发明的化合物能明显有效抑制心肌损伤后的炎症反应，具有广谱的抗炎作用。

[0148] 表3 化合物对急性心肌梗死面积和炎症因子的影响

[0149]

[0150] 与梗死组相比，1P<0.05；2P>0.05；3P>0.05；4P<0.001；5P<0.001；

[0151] *P<0.05；#P>0.05；**P<0.05；##P<0.05

[0152] 4.与细胞存活和死亡相关蛋白的变化：化合物a和b均能有效地抑制死亡蛋白和炎症蛋白的表达，同时增加有保护功能的蛋白的表达；丁酸钠轻度增加Hsp70、MT1的表达。心肌组织P53、iNOS、Hsp70、COX2以及Metallothionein(MT1)表达的变化情况如图5。

[0153] 5.Caspase-3活性的变化:心肌细胞凋亡的检测用末端标记法，Caspase-3活性测定用Western Blots，用抗PARP的抗体测定PARP被切割的情况，结果如图6所示，本发明的化合物能强效抑制Caspase-3的活性。

[0154] 6.抗氧化指标的变化：心肌组织MDA含量、SOD、GSH-Px活性测定结果显示，化合物a和b均能显著增强SOD和GSH-Px的活性，化合物a或b增强SOD和GSH-Px的活性明显优于阳性对照药物以及叶酸与丁酸钠的组合应用。化合物a和b均能显著降低MDA的含量。说明化合物a或b具有强抗氧化功能，其结果如表4所示。

[0155] 表4 心肌组织SOD、GSH-Px、MDA水平的变化

[0156]1 2 3 4 5

[0157] 与梗死组相比，P<0.05；P>0.05；P>0.05；P<0.001；P<0.001

[0158] 7.化合物b剂量依赖性地保护缺血再灌注引起的心肌损伤:高剂量的化合物b在再灌注前给药，几乎可以完全恢复左室射血分数，心肌梗死面积减少近5倍。对应的高浓度的叶酸(9mg/kg)加上高浓度的丁酸钠(112mg/kg)仅能使心肌梗死面积减少20％，结果如表5所示。

[0159] 表5 化合物b剂量依赖性的心脏保护

[0160]

[0161] 与梗死组相比，1P>0.05；2P>0.05；3P<0.001；4P<0.001

[0162] 8.在再灌注3小时后给予化合物b仍然能有效保护心肌损伤：在再灌注3小时后给予高剂量的化合物b仍然能有效保护心肌损伤，使梗死面积减少40％左右，尼可地尔、Caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)在再灌注前能有效保护心肌损伤，在再灌注3小时后给药则没有保护作用，因此本发明的化合物有重要的临床应用价值，结果如表6所示。

[0163] 表6 化合物对急性心肌梗死的治疗效果

[0164]1 2 3

[0165] 与梗死组相比，P>0.05；P>0.05；P<0.001

[0166] 试验例9实验小鼠半数致死量LD50测定

[0167] 本发明人还测定了实验小鼠的半数致死量LD50。具体来说，本发明人选择了10只体重为20克左右的Swiss小鼠，分为五组，每组小鼠各自一次性经腹腔注射5种不同剂量的本发明化合物b的DMSO溶液，所采用的五种注射量分别为11mg、33mg、100mg、300mg和900mg。记录半数小鼠死亡时所用的剂量并基于小鼠的体重进行换算。该实验测得小鼠的半数致死量为470-520mg/kg。

[0168] 综上所述，本发明提供的化合物或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或代谢中间体具有超强的抗细胞凋亡、抗炎及抗氧化损伤的功效，可以用于治疗重要器官损伤。动物实验显示，对于心肌梗死而言，即使在疾病发作后的几小时内给药,本发明的化合物仍能有效地抑制器官的损伤，因此特别适合于治疗窗口狭窄的器官急性损伤疾病，如心肌梗死、脑中风等的治疗。我们还注意到，本发明的化合物保护心肌梗死的效果要明显优于目前最有效的药物，因此是绝佳的急救药品。同时，本发明化合物的制备工艺简单，容易实现工业化大规模生产。

[0169] 总之，以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

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