技术领域
[0001] 本
发明涉及医药检测方法技术领域，尤其涉及一种磷脂混杂酶对肝癌细胞影响的检测方法。
背景技术
[0002] 磷脂混杂酶1(phospholipid scramblase 1,PLSCR1)是一个分子量约为35KD的II型膜蛋白，其最初是基于其具有促进细胞膜内外层磷脂翻转的活性而从血红细胞及血小板的细胞膜上被分离鉴定的。近年来的研究发现，磷脂混杂酶1在多种
肿瘤细胞中呈高表达，例如
结直肠癌，肝癌，卵巢癌等，其与肿瘤细胞的生长，增殖及细胞迁移密切相关，并且磷脂混杂酶1的高表达与肿瘤的
预后具有相关性。
[0003] 磷脂混杂酶1是一个新发现的
钙离子依赖的膜蛋白，在磷脂酰丝
氨酸及其他氨基酸磷脂的跨膜运动中具有重要的作用，并且这些跨膜运动往往与一些生理、病理事件相关，例如细胞损伤和细胞凋亡。有研究报道，PLSCR1参与了肿瘤细胞的增殖运动。Kodigepalli KM等报道PLSCR1可以促进
乳腺癌细胞的生长和增殖，并且在乳腺癌病人的癌组织及血清中高表达，与乳腺癌的预后直接相关。Kuo YB等也发现PLSCR1是结肠癌的一个肿瘤标志物，在结肠癌组织中高表达，Fan CW等发现抑制PLSCR1的表达可以显著抑制结肠癌的生长和转移。最近的研究也发现，PLSCR1还参与了血管生成素(Angiogenin)的细胞核
定位，并与细胞周期具有相关性。
发明内容
[0004] 为了研究检测磷脂混杂酶对肝癌细胞的影响，本发明提出了一种新的检测磷脂混杂酶对肝癌细胞影响的检测方法。
[0005] 本发明提出的一种检测磷脂混杂酶对肝癌细胞影响的检测方法：
[0006] A、细胞培养：将人肝癌细胞HepG2细胞培养于含10％胎
牛血清的DMEM培养基中，置5％CO2的37℃
培养箱中培养。
[0007] 优选的，所诉的人肝癌细胞HepG2细胞购自中国科学院上海细胞库。所述的胎牛血清(FBS)和DMEM培养基均购自美国Gibco公司。
[0008] B、siRNA干扰PLSCR1的表达及稳转细胞系的构建：将PLSCR1及GAPDH
抗体HepG2细胞培养于含10％FBS的DMEM培养液中至对数生长期，用0.025％的胰蛋白酶消化，按5 x105个细胞/ml接种于12孔板中，培养过夜后按照MOI 20感染HepG2细胞，同时设立对照组，48h后，将培养基换成含5μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基进行细胞筛选，以后隔天更换含5μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基，10-12d后，0.025％的胰蛋白酶消化细胞，将其按1个细胞/100μl培养液接种于96孔板，1周后，挑选单克隆株，继续扩大培养。Western Blot鉴定阳性克隆株，并挑选生长良好的单克隆株冻存及用于后续实验；
[0009] 优选的，所述的干扰PLSCR1的siRNA慢病毒载体，PLSCR1抗体及GAPDH抗体均购自美国Santa Cruze公司；
[0010] 优选的，所述的0.025％胰蛋白酶和嘌呤霉素均购自美国Gibco公司。
[0011] C、
细胞增殖及侵袭实验：将HepG2细胞培养于含10％FBS的DMEM培养液中，用0.025％的胰蛋白酶分别消化对数生长期的PLSCR1-siRNA-HepG2细胞、Control-siRNA-HepG2细胞及HepG2细胞，以每孔5x103个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为100μl，各组细胞分别做6个复孔。将培养板放入37℃、5％CO2培养箱中，48h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10μl，在37℃细胞培养箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm
波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸收值，记录结果。
[0012] HepG2细胞培养于含10％FBS的DMEM培养液中，按照24孔比色法检测细胞侵袭能
力试剂盒(QCMTM24-Well Colorimetric Cell Invasion Assay Kit(CHEMICON))的
说明书要求进行操作，用0.025％的胰蛋白酶分别消化对数生长期的PLSCR1-siRNA-HepG2细胞、Control-siRNA-HepG2细胞及HepG2细胞，将细胞按5 x 105个细胞/ml接种于小室，48小时后，对细胞进行
染色，在普通倒置
显微镜下观察细胞迁移情况，并检测细胞裂解液在
560nm下的吸光值，对其定量。
[0013] D、病理标本采集及RNA抽提：选取定量的手术
切除肝癌标本，每例标本均留取肿瘤组织和距肿瘤边缘5cm以上的
配对癌旁组织。手术标本离体后，于30min内液氮速冻，保存于-80℃
冰箱备用。所有病例均确诊为肝癌，临床资料完整，均未接受
放化疗。
[0014] 优选的，所述的RNA抽提按照Trizol(美国Invitrogen公司)试剂说明书操作，总RNA的纯度及完整性通过检测A260/280及琼脂糖凝胶
电泳来确定。
[0015] E、
荧光定量
聚合酶链反应(qPCR)检测PLSCR1：取1μg RNA反转录成cDNA，再取1μl cDNA在ABI 7500荧光定量PCR仪中进行反应。每个组织样本分别做3个重复进行检测。
[0016] F、综合数据分析磷脂混杂酶对肝癌细胞的影响。
附图说明
[0017] 图1是Western blot检测siRNA干扰HepG2细胞PLSCR1蛋白表达图。
[0018] 图2是MTT检测PLSCR1对HepG2细胞增殖的影响图。siRNA组与Control组比较(*p<0.05),siRNA组与HepG2未处理组比较(#p<0.05)。
[0019] 图3是PLSCR1对HepG2细胞侵袭能力的影响图。图A为通过倒置显微镜CCD拍摄发生侵袭的HepG2细胞。图B为对图A的定量分析结果。siRNA组与Control 组比较(*p<0.05),siRNA组与HepG2未处理组比较(#p<0.05)。
具体实施方式
[0020] A、细胞培养：人肝癌细胞HepG2细胞购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清(FBS)，DMEM培养基，0.025％胰蛋白酶，青
链霉素和嘌呤霉素均购自美国Gibco公司。HepG2细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置5％CO2的37℃培养箱中培养。
[0021] B、siRNA干扰PLSCR1的表达及稳转细胞系的构建：干扰PLSCR1的siRNA慢病毒载体，PLSCR1抗体及GAPDH抗体均购自美国Santa Cruze公司，稳转细胞株按照说明书操作。PLSCR1及GAPDH抗体HepG2细胞培养于含10％FBS的DMEM培养液中至对数生长期，用0.025％的胰蛋白酶消化，按5 x 105个细胞/ml接种于12孔板中，培养过夜后按照MOI20感染HepG2细胞，同时设立对照组，48h后，将培养基换成含5μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基进行细胞筛选，以后隔天更换含5μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基，10-12d后，0.025％的胰蛋白酶消化细胞，将其按1个细胞/100μl培养液接种于96孔板，1周后，挑选单克隆株，继续扩大培养。Western Blot鉴定阳性克隆株，并挑选生长良好的单克隆株冻存及用于后续实验。
[0022] C、细胞增殖及侵袭实验：HepG2细胞培养于含10％FBS的DMEM培养液中，用0.025％的胰蛋白酶分别消化对数生长期的PLSCR1-siRNA-HepG2细胞、Control-siRNA-HepG2细胞及HepG2细胞，以每孔5x103个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为100μl，各组细胞分别做6个复孔。将培养板放入37℃、5％CO2培养箱中，48h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10μl，在37℃细胞培养箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各 孔吸收值，记录结果。
[0023] HepG2细胞培养于含10％FBS的DMEM培养液中，按照24孔比色法检测细胞侵袭能力试剂盒(QCMTM24-Well Colorimetric Cell Invasion Assay Kit(CHEMICON))的说明书要求进行操作，用0.025％的胰蛋白酶分别消化对数生长期的PLSCR1-siRNA-HepG2细胞、Control-siRNA-HepG2细胞及HepG2细胞，将细胞按5 x 105个细胞/ml接种于小室，48小时后，对细胞进行染色，在普通倒置显微镜下观察细胞迁移情况，并检测细胞裂解液在
560nm下的吸光值，对其定量。
[0024] D、病理标本采集及RNA抽提：20例肝癌标本为2009年1月至2013年6月湖州市中心医院手术切除肝癌标本，每例标本均留取肿瘤组织和距肿瘤边缘5cm以上的配对癌旁组织。手术标本离体后，于30min内液氮速冻，保存于-80℃冰箱备用。其中男14例，女6例，平均年龄63岁。所有病例均确诊为肝癌，临床资料完整，均未接受放化疗。RNA抽提按照Trizol(美国Invitrogen公司)试剂说明书操作，总RNA的纯度及完整性通过检测A260/280及琼脂糖凝胶电泳来确定。
[0025] E、荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测PLSCR1：取1μg RNA按照PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)(TAKARA)说明书反转录成cDNA，再取1μl cDNA混合按TM照PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)(TAKARA)说明书操作，在ABI 7500荧光定量PCR仪中进行反应。引物由上海英骏
生物技术公司合成，引物序列见表1。反应条件:95℃10s，60℃10s，72℃30s，共40个循环。用RQ代表目的基因mRNA相对含量(RQ-ΔΔCt
＝2 ，ΔΔCт＝(CTPLSCR1癌-CTGAPDH癌)-(CTPLSCR1癌旁-CTGAPDH癌旁))。每个组织样本分别做
3个重复进行检测。
[0026] 表1：qPCR引物序列
[0027]
[0028] FOR表示上游引物，REV表示下游引物。
[0029] F、统计学方法：应用SPSS18.0统计
软件分析。数据均以均数±标准差 表示，计量资料采用独立样本t检验。
[0030] 检测结果：
[0031] 1.PLSCR1干扰细胞株PLSCR1-siRNA-HepG2的构建及鉴定：通过慢
病毒感染及嘌呤霉素筛选，我们成功得到了PLSCR1被干扰的稳定细胞株PLSCR1-siRNA-HepG2。抽提细胞蛋白后，通过Western Blot验证了PLSCR1的表达，PLSCR1-siRNA-HepG2细胞株几乎不表达PLSCR1蛋白(图1)。
[0032] 2.PLSCR1促进HepG2细胞的增殖和侵袭：通过MTT实验，PLSCR1-siRNA-HepG2细胞与Control-siRNA-HepG2细胞和HepG2细胞比较，其细胞增殖效率发生显著降低(p<0.05)(图2)，而Control-siRNA-HepG2细胞和HepG2细胞比较，其细胞增殖率差异无统计学意义(p>0.05)。
[0033] 通过细胞迁移实验，PLSCR1-siRNA-HepG2细胞与Control-siRNA-HepG2细胞和HepG2细胞比较，其细胞侵袭效率发生显著降低(p<0.05)(图3)，而Control-siRNA-HepG2细胞和HepG2细胞比较，其细胞侵袭率差异无统计学意义(p>0.05)。
[0034] 肝癌组织PLSCR1的表达及其与肝癌临床病理特征的关系：通过荧光定量聚 合酶链反应(qPCR)检测比较了肝癌患者的20对癌组织与癌旁组织，肝癌组织PLSCR1基因的表达量明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(p<0.05)。分析这30位肝癌患者的病理因素。在全部20例患者中，男为14例，女为6例，其2-ΔΔCт值分别10.45±7.36和9.05±7.08；而年龄>50的10名患者与年龄<50岁的患者，其2-ΔΔCт值分别10.53±7.42和7.50±6.98；5例肿瘤低分化的患者与15例中-高分化患者的2-ΔΔCт值分别3.21±1.91和11.55±4.57；
10例I-II期和III-IV期临床分期的患者其2-ΔΔCт值分别5.94±3.57和13.00±7.73。
结果，PLSCR1的表达与患者的年龄，性别无明显相关(p>0.05)，而与肿瘤分化程度和临床分期具有明显相关性(p<0.05)。
[0035] 本研究通过siRNA干扰人肝癌细胞HepG2中PLSCR1的表达，进而发现PLSCR1被抑制后，肝癌细胞HepG2的生长也受到了显著地影响，并且还减弱了肝癌细胞HepG2的侵袭能力。因此，我们推测，PLSCR1可能在肝癌的生长、发展过程中起到了重要的调控作用。为了研究PLSCR1在肝癌中的调控作用，我们对20位肝癌确诊患者的癌及癌旁组织进行了组织RNA抽提，通过荧光定量PCR的方法检测了癌及癌旁组织中PLSCR1的基因表达，我们发现，PLSCR1在癌组织中的表达量显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(p<0.05)。然后，对这20位患者的病理因素进行了分析，发现PLSCR1的高表达与肝癌的分化程度及临床分期具有重要相关性，PLSCR1表达越高，肿瘤分化程度越高，肿瘤临床分期越高，患者预后越差。以上研究表明，PLSCR1的表达
水平的增强，可能在肝癌的发生、发展中具有重大的意义。为了探讨其调控机理，我们还通过
酵母双杂交技术在肝癌cDNA库中发现了PLSCR1可以与中期因子(midkine,MK)发生相互作用，并且在与中期因子一起参与了肝癌细胞的增殖、迁移及侵袭等，并对血管新生具有一定的调控作用。对于其调控机理，有待于做进一步的研究。
[0036] 本研究结果表明，PLSCR1在肝癌组织中的过表达参与调控了肝癌细胞的生长及侵袭，并且与肝癌的转移及预后具有密切的相关性。
[0037] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何熟悉
本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
