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软骨细胞样细胞及其制造方法

阅读：14发布：2020-05-15

专利汇可以提供软骨细胞样细胞及其制造方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明的目的在于开发一种可以再生软骨组织且具有增殖能力的细胞，并确立一种用于提供在变形性软骨病的根本治疗中也能够使用的细胞供给源的技术。选择Myc家族基因和/或Klf家族基因与SOX9基因的组合，将其导入体细胞中，由此制造具有与软骨组织同等特性的能够增殖的软骨细胞样细胞，在软骨再生的医药用途中使用该软骨细胞样细胞。，下面是软骨细胞样细胞及其制造方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种软骨细胞样细胞的制造方法，其特征在于：
包括将选自Myc家族基因和Klf家族基因中的至少一种基因和SOX9基因导入体细胞中的工序。
2.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：
Myc家族基因是c-Myc基因。
3.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：
Klf家族基因是Klf4基因。
4.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：
体细胞来自人。
5.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：
体细胞是皮肤成纤维细胞或来自脂肪组织的间质细胞。
6.一种软骨细胞样细胞，其特征在于：
其通过将选自Myc家族基因和Klf家族基因中的至少一种基因和SOX9基因导入体细胞中而得到。
7.一种软骨组织再生用细胞制剂，其特征在于：
包含权利要求6所述的软骨细胞样细胞。
8.如权利要求7所述的软骨组织再生用细胞制剂，其特征在于：
还包含支架材料。
9.如权利要求7所述的软骨组织再生用细胞制剂，其特征在于：
支架材料是胶原。
10.一种植入物，其特征在于：
包含使用权利要求6所述的软骨细胞样细胞构建的软骨组织。
11.一种软骨组织用植入物的制造方法，其特征在于，包括下述工序：
向哺乳动物体内投与权利要求6所述的软骨细胞样细胞的工序、和将在哺乳动物体内由所述软骨细胞样细胞形成的软骨组织摘出的工序。
12.一种软骨疾病的治疗方法，其特征在于，包括下述工序：
向软骨疾病患者的软骨组织以外的部位投与权利要求6所述的软骨细胞样细胞的工序、和
将由所述软骨细胞样细胞形成的软骨组织摘出，将其移植到所述患者的软骨疾病部位的工序。
13.权利要求6所述的软骨细胞样细胞在软骨组织再生用细胞制剂的制造中的使用。
14.如权利要求13所述的使用，其特征在于：
软骨组织再生用细胞制剂是软骨疾病的治疗剂。
15.包含权利要求6所述的软骨细胞样细胞和支架材料的组合物在软骨组织再生用细胞制剂的制造中的使用。
16.如权利要求15所述的使用，其特征在于：
支架材料是胶原。
17.一种形成有软骨组织的非人哺乳动物，其特征在于：
其通过向非人哺乳动物中投与权利要求6所述的软骨细胞样细胞，在所述哺乳动物体内由所述软骨细胞样细胞形成软骨组织而制造。
18.一种判断被检验物质对软骨组织的药效的方法，其特征在于：
包括向权利要求13所述的非人哺乳动物中投与被检验物质，判断被检验物质对软骨组织的药效的工序。
19.一种软骨细胞样细胞制备用组合物，其特征在于：
包含选自Myc家族基因和Klf家族基因中的至少一种基因和SOX9基因。

说明书全文

软骨细胞样细胞及其制造方法

技术领域+

[0001] 本发明涉及从体细胞诱导的具有与软骨细胞同等特性的能够增殖的软骨细胞样细胞以及该软骨细胞样细胞的制造方法。另外，本发明涉及利用该软骨细胞样细胞得到的软骨组织再生用细胞制剂、植入物、植入物的制造方法、软骨疾病的治疗方法和被检验物质对软骨疾病的药效判断方法。本发明还涉及用于从体细胞诱导该软骨细胞样细胞的软骨细胞样细胞制备用组合物。

背景技术

[0002] 关节软骨在关节运动时在可动关节中吸收冲击，承担作为关节润滑剂的作用。软骨的机械功能由以Ⅱ型和Ⅺ型胶原及蛋白聚糖等胶原原纤维构建的软骨细胞外基质所赋予，已知软骨细胞外基质由存在于软骨内在的软骨细胞产生。

[0003] 作为软骨组织的代表性疾病，有变形性关节病。变形性关节病是因机械压迫(反复荷重、过度运动、外伤等)和年龄增长等使关节软骨变性、磨耗、损伤，由其加重而引起的。变形性关节病出现关节动作时疼痛(动作时痛)和可动区域的受限(可动区域受限)等症状，成为降低日常生活质量的原因。变形性关节病见于约20％的50岁以上的日本人，随着今后的医学发达和生活习惯改善而使平均寿命延长，预测其罹患者将日益增加，从而成为老龄化社会的大问题。

[0004] 以往，在变形性关节病的治疗中，采用通过安静来防止症状恶化的方法或投与消炎镇痛剂和补充剂、向关节腔内投与关节润滑剂等控制疼痛的方法。但是，软骨细胞只具有很弱的修复能力(参照非专利文献1)，因为不能使软骨组织再生，所以，这些方法终究只是对症疗法，有不能成为根本性治疗的缺点。另外，对于已经发展为软骨变性的变形性关节病而言，也进行取代为金属制人工关节的手术，但人工关节在施行手术时对患者的负担大，还有产生由人工关节磨损引起的恶化、人工关节容易脱臼、因人工关节松弛而必须再次进行取代手术等缺点。

[0005] 因此，近年通过使软骨组织再生，在以往的治疗中困难的变形性软骨病的根本治疗开始变得可能的技术受到关注。在实现这样的技术中，开发一种容易得到且保持分化形成软骨组织的能力，并且能够产生大量细胞的细胞供给源是当务之急(参照非专利文献2和3)。作为软骨组织再生所使用的细胞供给源，虽然可以考虑将软骨细胞作为有力的候补，但软骨细胞数量有限，另外由单层扩张(monolayer expansion)引起软骨细胞的去分化(参照非专利文献4)，因此在最近的研究中，致力于使用来自骨髓的间充质干(MS)细胞或胚胎干(ES)细胞诱导软骨组织形成的技术开发(参照非专利文献5～7)。但是，MS细胞只能增殖到有限程度，而且根据最近的研究提示，由MS细胞制作的软骨不稳定，不能具备充分的软骨特性(参照非专利文献8和9)。另外，来自ES细胞的分化细胞是不均匀的集团，担心软骨组织的功能变得不充分(参照非专利文献10和11)或引起畸胎瘤形成(参照非专利文献12)。

[0006] 另外，近年报告了通过向体细胞中导入编码Oct3/4、Klf4、c-Myc和Sox2的各基因，将体细胞初始化化而向诱导多能干(iPS)细胞诱导的技术，在再生医药领域中提供了革新的技术(参照专利文献1、非专利文献13～24)。但是，由于iPS细胞作为多能干细胞发挥功能，所以在用于软骨组织的再生时，确立一种使之分化为均匀的软骨细胞集团的技术是不可欠缺的，在向软骨组织再生的实用化中，还必须解决技术课题。

[0007] 以这样的现有技术为背景，急切地希望实现开发一种能够直接诱导软骨细胞，可以再生软骨组织且具有增殖能力的细胞，提供一种在变形性软骨病的根本治疗中也能够使用的细胞供给源。

[0008] 现有技术文献

[0009] 专利文献

[0010] 专利文献1：国际公开第2007/069666号小册子

[0011] 非专利文献

[0012] 非专利文献1：W.Hunter，Philos Trans Lond 42，514(1743).

[0013] 非专利文献2：C.Chung and J.A.Burdick，Adv Drug Deliv Rev 60(2)，243(2008).[0014] 非专利文献 3：J.Gao，J.Q.Yao，and A.I.Caplan，Proc.Inst.Mech.Eng.[H].221(5)，441(2007).

[0015] 非专利文献 4：U.R.Goessler，P.Bugert，K.Bieback et al.，Int.J.Mol.Med.14(6)，1015(2004).

[0016] 非专利文献5：J.Kramer，C.Hegert，K.Guan et al.，Mech.Dev.92(2)，193(2000).[0017] 非专利文献6：N.S.Hwang，M.S.Kim，S.Sampattavanich et al.，Stem Cells24(2)，284(2006).

[0018] 非专利文献7：N.S.Hwang，S.Varghese，and J.Elisseeff，PLoS ONE 3(6)，e2498(2008).

[0019] 非专利文献8：V.Vacanti，E.Kong，G.Suzuki et al.，J.Cell.Physiol.205(2)，194(2005).

[0020] 非专利文献9：A.Nagai，W.K.Kim，H.J.Lee et al.，PLoS ONE 2(12)，e1272(2007).[0021] 非专利文献10：M.Amit and J.Itskovitz-Eldor，Journal of anatomy 200(Pt3)，225(2002).

[0022] 非专利文献11：E.J.Koay，G.M.Hoben，and K.A.Athanasiou，Stem Cells 25(9)，2183(2007).[0023] 非专利文献 12：S.Wakitani，K.Takaoka，T.Hattori et al.，Rheumatology(Oxford).42(1)，162(2003).

[0024] 非专利文献13：T.Aoi，K.Yae，M.Nakagawa et al.，Science 321(5889)，699(2008).[0025] 非专利文献14：M.Nakagawa，M.Koyanagi，K.Tanabe et al.，Nat.Biotechnol.26(1)，101(2008).

[0026] 非专利文献15：K.Takahashi，K.Okita，M.Nakagawa et al.，Nature protocols2(12)，3081(2007).

[0027] 非专利文献16：K.Takahashi，K.Tanabe，M.Ohnuki et al.，Cell 131(5)，861(2007).[0028] 非专利文献17：K.Takahashi and S.Yamanaka，Cell 126(4)，663(2006).[0029] 非专利文献18：K.Okita，T.Ichisaka，and S.Yamanaka，Nature 448(7151)，313(2007).[0030] 非专利文献19：M.Wernig，A.Meissner，R.Foreman et al.，Nature 448(7151)，318(2007).

[0031] 非专利文献20：N.Maherali，R.Sridharan，W.Xie et al.，Cell stem cell 1(1)，55(2007).

[0032] 非专利文献 21：A.Meissner，M.Wernig，and R.Jaenisch，Nat.Biotechnol.25(10)，1177(2007).

[0033] 非专利文献22：M.Wernig，A.Meissner，J.P.Cassady et al.，Cell stem cell2(1)，10(2008).

[0034] 非专利文献23：J.Yu，M.A.Vodyanik，K.Smuga-Otto et al.，Science 318(5858)，1917(2007).

[0035] 非专利文献24：I.H.Park，R.Zhao，J.A.West et al.，Nature 451(7175)，141(2008).

发明内容

[0036] 发明要解决的课题

[0037] 因此，本发明以解决上述现有技术的课题为目的，更具体而言，本发明的目的在于开发一种可以再生软骨组织且具有增殖能力的细胞，确立一种用于提供在变形性软骨病的根本治疗中也能够使用的细胞供给源的技术。

[0038] 用于解决课题的手段

[0039] 本发明的发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，从大量存在的分化细胞的初始化因子和软骨相关基因中选择Myc家族基因和/或Klf家族基因与SOX9基因的组合，发现通过将其导入体细胞中，能够制造具有与软骨细胞同等特性的可以增殖的软骨细胞样细胞。实际上，这样得到的软骨细胞样细胞能够以单层培养(monolayer culture)进行增殖，并确认表达软骨特异性标记物。还确认上述软骨细胞样细胞在使用胶原凝胶作为支架进行培养时，或不使用支架而向机体内投与时，能够形成软骨组织。本发明就是基于这些见解，通过进一步反复研究而完成的。

[0040] 即，本发明提供下述揭示的方式的发明。

[0041] 项1.一种软骨细胞样细胞的制造方法，其包括将选自Myc家族基因和Klf家族基因中的至少一种基因和SOX9基因导入体细胞中的工序。

[0042] 项2.如项1所述的制造方法，其中，Myc家族基因是c-Myc基因。

[0043] 项3.如项1或2所述的制造方法，其中，Klf家族基因是Klf4基因。

[0044] 项4.如项1至3中任一项所述的制造方法，其中，体细胞来自人。

[0045] 项5.如项1或2所述的制造方法，其中，体细胞是皮肤成纤维细胞或来自脂肪组织的间质细胞。

[0046] 项6.一种软骨细胞样细胞，其通过将选自Myc家族基因和Klf家族基因中的至少一种基因和SOX9基因导入体细胞中而得到。

[0047] 项7.如项6所述的软骨细胞样细胞，其中，Myc家族基因是c-Myc基因。

[0048] 项8.如项6或7所述的软骨细胞样细胞，其中，Klf家族基因是Klf4基因。

[0049] 项9.如项6至8中任一项所述的软骨细胞样细胞，其中，体细胞来自人。

[0050] 项10.如项6至9中任一项所述的软骨细胞样细胞，其中，体细胞是皮肤成纤维细胞或来自脂肪组织的间质细胞。。

[0051] 项11.一种软骨组织再生用细胞制剂，其包含项6至9中任一项所述的软骨细胞样细胞。

[0052] 项12.如项11所述的软骨组织再生用细胞制剂，其中，还包含支架材料。

[0053] 项13.如项12所述的软骨组织再生用细胞制剂，其中，支架材料是胶原。

[0054] 项14.一种植入物，其包含使用项6至8中任一项所述的软骨细胞样细胞构建的软骨组织。

[0055] 项15.一种软骨组织用植入物的制造方法，包括下述工序：向哺乳动物体内投与项6至8中任一项所述的软骨细胞样细胞的工序、和将在哺乳动物体内由上述软骨细胞样细胞形成的软骨组织摘出的工序。

[0056] 项16.一种软骨疾病的治疗方法，包括下述工序：向软骨疾病患者的软骨组织以外的部位投与项6至8中任一项所述的软骨细胞样细胞的工序、和将由上述软骨细胞样细胞形成的软骨组织摘出，将其移植到上述患者的软骨疾病部位的工序。

[0057] 项17.项6至9中任一项所述的软骨细胞样细胞在软骨组织再生用细胞制剂的制造中的使用。

[0058] 项18.如项17所述的使用，其中，软骨组织再生用细胞制剂是软骨疾病的治疗剂。

[0059] 项19.包含项6至9中任一项所述的软骨细胞样细胞和支架材料的组合物在软骨组织再生用细胞制剂的制造中的使用。

[0060] 项20.如项19所述的使用，其中，支架材料是胶原。

[0061] 项21.一种形成有软骨组织的非人哺乳动物，其通过向非人哺乳动物中投与项6至9中任一项所述的软骨细胞样细胞，在所述哺乳动物体内由上述软骨细胞样细胞形成软骨组织而制造。

[0062] 项22.一种判断被检验物质对软骨组织的药效的方法，包括向项21所述的非人哺乳动物中投与被检验物质，判断被检验物质对软骨组织的药效的工序。

[0063] 项23.一种软骨细胞样细胞制备用组合物，其包含选自Myc家族基因和Klf家族基因中的至少一种基因和SOX9基因。

[0064] 项24.如项23所述的软骨细胞样细胞制备用组合物，其中，选自Myc家族基因和Klf家族基因中的至少一种基因和SOX9基因以能够导入体细胞中的方式含有。

[0065] 发明的效果

[0066] 根据本发明，能够提供一种具有与软骨细胞同等特性的可以增殖的软骨细胞样细胞，因此能够提供一种对于变形性软骨病等伴有软骨损伤的软骨疾病的治疗有效的医疗手段。另外，根据本发明，能够由不仅变形性关节病，而且包括软骨形成异常病等生长软骨疾病的广泛的软骨疾病患者的体细胞制作软骨细胞样细胞，能够进行各种分析而有助于明确疾病状态。特别是由人制作得到的软骨细胞样细胞作为创伤药和药品开发材料也是适合的。

[0067] 此外，根据本发明，还能够由皮肤成纤维细胞和来自皮下脂肪组织的间质细胞等来自皮肤组织的体细胞得到软骨细胞样细胞，因此，从减轻患者和细胞提供者的负担的观点出发，可以说临床上的有用性高。附图说明

[0068] 图1是表示对于Collla2-βgeo转基因小鼠和从该小鼠分离得到的原代软骨细胞、MES和MDF的特性进行评价的结果图。a表示导入转基因小鼠中的导入基因的构成。b的左图表示X-gal染色的Collla2-βgeo转基因小鼠的图像，b的右图表示对于X-gal染色Collla2-βgeo转基因小鼠的软骨进行组织分析的结果。c的左图表示从βgeo转基因小鼠制备得到的原代软骨细胞以相差显微镜观察到的结果，c的右图表示将从βgeo转基因小鼠制备得到的原代软骨细胞X-gal染色的结果。d表示将从βgeo转基因小鼠制备得到的原代软骨细胞、MES和MDF以及从野生型的F1杂交小鼠制备得到的原代软骨细胞在0～900μg/ml的G418的存在下孵育的结果。d中，“Tg”表示来自βgeo转基因小鼠、“WT”表示来自野生型的同窝小鼠。“Tg”和“WT”的标记在其它图中以同样意义使用。

[0069] 图2是表示对于将各因子导入MEF中而得到的细胞进行分析的结果图。a是表示对于将各因子导入MEF中而得到的细胞集落，通过阿辛蓝染色和结晶紫染色而计测得到的染色细胞集落数。a中，“4R”表示4个初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)。“4R”的标记在其它图中以同样意义使用。b表示将4个初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)和人SOX9同时转染MEF而得到的细胞进行阿辛蓝染色和结晶紫染色的结果。c表示将4个初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)和人SOX9同时转染MEF而得到的细胞集落中包含的细胞形状的观察结果。d表示MEF形状的观察结果。e表示对于导入3个初始化因子和Sox9而得到的细胞集落进行阿辛蓝染色和结晶紫染色所计测得到的染色细胞集落数。e中，“4R-c-Myc”表示4个初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)内不包含c-Myc；“4R-c-Klf-4”表示4个初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)内不包含Klf-4；“4R-Oct3/4”表示4个初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)内不包含Oct3/4；“4R-Sox2”表示4个初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)内不包含Sox2。这些标记在其它图中也以同样意义使用。f表示观察在MEF中导入c-Myc、Klf-4和在MEF中导入Sox9而得到的细胞集落中包含的细胞形状的结果。

[0070] 图3是表示对于将各因子导入MDF中而得到的细胞的分析结果图。A～C表示对于将各因子进行各种组合而导入MEF中得到的细胞集落，通过阿辛蓝染色和结晶紫染色计测得到的染色细胞集落数以及由多边形状的细胞构成的细胞集落数。D表示将各因子导入MDF中而得到的细胞集落中包含的细胞的形态的观察结果。E是表示培养将各因子导入MDF中而得到的细胞集落中包含的细胞，观察各细胞形态的结果图。

[0071] 图4是表示评价将各因子导入MDF中而得到的细胞(克隆化细胞)的特性的结果图。A表示将各因子导入MDF中而得到的细胞以及MDF进行阿辛蓝染色的结果。B表示对于将各因子导入MDF中而得到的细胞、MDF和原代软骨细胞，通过蛋白印迹分析分析导入基因(导入因子)的表达的结果。B中，“Pr chond.”表示原代软骨细胞。“Pr chond.”的标记在其它图中也以同样意义使用。C表示对于将各因子导入MDF中而得到的细胞、MDF和原代软骨细胞，通过RT-PCR分析导入基因(导入因子)的表达的结果。

[0072] 图5是表示评价将各因子导入MDF中而得到的细胞(克隆化细胞)的特性的结果图。a表示对于将各因子导入MDF中而得到的细胞、MDF和原代软骨细胞，分析软骨细胞标记基因表达的结果。b表示对于将各因子导入MDF中而得到的细胞、MDF和原代软骨细胞，分析MDF标记基因表达的结果。c表示分析将各因子导入MDF中而得到的细胞(MK-4、MKO-2)的核型的结果。

[0073] 图6是表示评价将各因子导入MDF中而得到的细胞(克隆化细胞)的特性的结果图。a是对于原代软骨细胞和MDF比较基因表达谱的图。b是对于MK-3和原代软骨细胞比较基因表达谱的图。c是对于对于MK-3和MDF比较基因表达谱的图。d是对于将各因子导入MDF中而得到的细胞、MDF和原代软骨细胞进行聚类分析的结果。e是对于MK-3、MK-3和MDF，通过亚硫酸氢钠测序法分析得到的二核苷酸的甲基化状态的结果。e中，黑圆表示在各基因中的CpG二核苷酸内被甲基化的二核苷酸，白圆表示在各基因中的CpG二核苷酸内未被甲基化的二核苷酸。

[0074] 图7是表示评价将各因子导入MDF中而得到的细胞(克隆化细胞)的特性的结果图。a是表示分析将各因子导入MDF中而得到的细胞以及MDF的增殖特性的结果图。b是表示培养将各因子导入MDF中而得到的细胞以及MDF后进行阿辛蓝染色的结果图。c是表示对使用MK-3和MDF进行胶原凝胶培养所形成的凝胶-细胞复合物进行分析得到的结果图。

[0075] 图8是表示将GFP和c-Myc、Klf-4与Sox9共同导入MDF中而得到的细胞(MK-5)注入裸小鼠皮下得到的结果图。A表示观察裸小鼠全身的结果(右边表示荧光显色的观察结果)。B表示观察将裸小鼠背部皮肤剥去状态的结果(右边表示荧光显色的观察结果)。C表示将从注入了细胞悬液的小鼠皮下部位得到的连续组织切片以番红O染色的结果。D表示C的四边包围部分的放大图。

[0076] 图9表示在裸小鼠皮下注入将c-Myc、Klf-4和Sox9导入MDF而得到的细胞(软骨细胞样细胞)，对注入部位的组织进行观察得到的结果图。在A中，表示对于将c-Myc、Klf-4和Sox9导入MDF而得到的细胞(MK-7)注入后16周时的注入部位组织，以番红O、快绿和铁苏木精染色的结果。在B中，表示对于将c-Myc、Klf-4和Sox9导入MDF而得到的细胞(MK-7)注入后8周时的注入部位组织，以番红O、快绿和铁苏木精染色的结果。

[0077] 图10表示对于在实施例1和2中制得的各软骨细胞样细胞的基因组DNA，使用Klf4 cDNA探针进行Southern杂交(DNA杂交)的结果。

[0078] 图11表示对于将c-Myc、Klf-4和Sox9导入来自脂肪组织的间质细胞而得到的细胞集落，通过阿辛蓝染色和结晶紫染色计测得到的染色细胞集落数、以及由多边形状细胞构成的细胞集落数。

[0079] 图12表示对于将OCT3/4、C-MYC、KLF-4和SOX9导入NHDF中而得到的细胞进行分析得到的结果图。a是表示对于导入了OCT3/4、C-MYC、KLF-4和SOX9的NHDF的培养皿(MKO)以及导入了EGFP的NHDF的培养皿(EGFP)进行阿辛蓝染色的结果图。b是表示观察将OCT3/4、C-MYC、KLF-4和SOX9导入NHDF中而得到的细胞集落中包含的细胞的形状的结果。c表示观察导入了EGFP的NHDF的培养皿的细胞形状的结果图。d是表示人原代软骨细胞的形态的图。本图是从Cell Applications，INC的首页(http://www.cellapplications.com/product_desc.php？id＝33&category_id＝51&subcategory_id＝68)复制的图。

具体实施方式

[0080] 1.软骨细胞样细胞的制造方法和软骨细胞样细胞的用途

[0081] 在本发明中，所谓“软骨细胞样细胞”，意指具有增殖能力且具有和软骨细胞同样特性，具备形成或再生软骨组织的能力的细胞(换言之，软骨干细胞)。在这里，所谓“和软骨细胞同样特性”，意指对于对软骨细胞特异的染色显示阳性并表达软骨细胞标记基因。

[0082] 本发明的软骨细胞样细胞的制造方法的特征在于，包括将选自Myc家族基因和Klf家族基因中的至少1种基因和SOX9基因导入体细胞中的工序。以下，详细叙述本发明的制造方法。

[0083] 在本发明中，作为被诱导为软骨细胞样细胞的体细胞，对于其种类没有特别限制，能够使用来自所有组织或部位的体细胞。作为在本发明中所使用的体细胞，例如，可以列举来自皮肤、皮下脂肪、肌肉、胎盘、骨骼、软骨等组织的体细胞，更具体而言，可以例示皮肤成纤维细胞、来自皮下脂肪组织的间质细胞(皮下脂肪细胞)、胚胎成纤维细胞、肌肉细胞、成骨细胞、软骨细胞等。其中，从对机体的侵袭轻微且更有效地制作软骨细胞样细胞的观点出发，优选来自皮肤的细胞和来自皮下脂肪的细胞，特别优选皮肤成纤维细胞和来自皮下脂肪组织的间质细胞。这样，能够从各种细胞选择材料，特别是也可以使用来自皮肤的细胞和来自皮下脂肪的细胞等容易获得的细胞，在减轻患者负担、细胞稳定获得方面，也具有临床上的优点。另外，作为上述体细胞，既可以使用市售品，另外也可以使用ES细胞或从间充质类干细胞等分化得到的体细胞。

[0084] 另外，根据软骨细胞样细胞的使用目的，上述体细胞可以适当选择来自人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、山羊、猴等哺乳动物的体细胞，但出于人的治疗目的使用时，合适的是来自人的体细胞。另外，使用来自人的体细胞时，可以是来自胎儿、幼儿、小儿和成人中的任一种的体细胞。在出于人的治疗目的使用软骨细胞样细胞时，希望使用从患者采取的体细胞。

[0085] 在本发明中，作为初始化因子(重编程因子)，组合选自Myc家族基因和Klf家族基因中的至少1种和作为软骨诱导性转录因子的SOX9基因，通过将这些导入上述体细胞，将体细胞诱导为软骨细胞样细胞。

[0086] 作为Myc家族基因，可以列举c-Myc、N-Myc和L-Myc等。这些Myc家族基因既可以单独使用1种，另外也可以组合2种以上使用。在这些Myc家族基因中，在本发明中，优选使用c-Myc基因和L-Myc基因，更优选使用c-Myc基因。c-Myc基因已知作为参与细胞分化和增殖的转录控制因子(S.Adhikary，M.Elilers，Nat.Rav.Mol.Cell Biol.，6，pp635-645，2005)，其碱基序列是公知的(NCBI accession Number NM_010849(human)、NM_002467(Mouse))。另外，对于N-Myc基因的碱基序列(NCBI accession Number NM_005378(human)、NM_008709(Mouse))和L-Myc基因的碱基序列(NCBI accession Number NM_005376(human)、NM_008506(Mouse))而言也是公知的。另外，在本说明书中，所谓NCBI，是美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的简称。

[0087] 另外，作为Klf家族基因，可以列举Klf1、Klf2、Klf4和Klf5等。这些Klf家族基因既可以单独使用1种，另外也可以组合2种以上使用。在这些Klf家族基因中，在本发明中，可以优选列举Klf2基因、Klf4基因和Klf5基因，可以更优选列举Klf2基因和Klf4基因，可以特别优选列举Klf4基因。Klf4基因已知作为作为肿瘤抑制因子(A.M.Ghaleb et al.，Cell Res.，15，pp92-96，2005)，其碱基序列是公知的(NCBI accession Number NM_010637(human)、NM_004235(Mouse))。另外，对于Klf1基因的碱基序列(NCBI accession Number NM_006563(human)、NM_010635(Mouse))、Klf2基因的碱基序列(NCBI accession Number NM_016270(human)、NM_008452(Mouse))、和Klf5基因的碱基序列(NCBI accession Number NM_001730(human)、NM_009769(Mouse))而言也是公知的。

[0088] 另外，SOX9基因已知作为进行Ⅱ型胶原等的表达调节的转录因子(V.Lefebvre el al.，Mol.Cell.Biol.17，pp2336-2346，1997)，其碱基序列是公知的(NCBI accession Number NM_000346(human)、NM_011448(Mouse))。如果将SOX9基因取代为其它的SOX家族基因，则不能向软骨细胞样细胞诱导。即，在本发明中，通过将Myc家族基因和/或Klf家族基因与SOX9基因组合，才向软骨细胞样细胞诱导，这些基因以一体不可分的关系使用是很重要的。

[0089] 这3种基因的来源，在包含人的哺乳动物中共同存在，可以使用来自任意的哺乳动物的基因，但希望根据导入的体细胞来源适当选择。例如，作为体细胞，如果是使用来自人的体细胞时，则希望上述3种基因是来自人的。另外，上述3种基因除了野生型基因以外，也可以是编码该基因产物的氨基酸序列中的数个(例如是1～10个、优选是1～6个、更优选是1～4个、更加优选是1～3个、特别优选是1个或2个)氨基酸被取代、缺失和/或插入且具有和野生型基因产物同等功能的突变基因产物的突变基因。

[0090] 在本发明中，上述3种基因能够基于公知的序列信息，按照通常方法制备。例如，通过从来自哺乳动物的细胞提取RNA，按照通常方法进行克隆，能够制备目的基因的cDNA。

[0091] 在本发明中，被导入体细胞的基因，作为初始化因子，可以是选自Myc家族基因和Klf4家族基因中的任意至少1种基因与SOX9基因的组合，但从提高对软骨细胞样细胞诱导效果的观点出发，可以例示优选Myc家族基因的至少1种和Klf家族基因的至少1种与SOX9基因的组合，更优选c-Myc基因或N-Myc基因和Klf2基因或Klf4基因与SOX9基因的组合，特别优选c-Myc基因和Klf4基因与SOX9这3种基因的组合。

[0092] 上述2种以上的基因向体细胞的导入，能够通过动物细胞的转染中通常所使用的方法进行。具体而言，作为将上述2种或3种基因向体细胞导入的方法，可以例示使用载体的方法、磷酸钙法、脂质体转染法、电穿孔法、显微注射法等。其中，从导入效率的方面出发，优选使用载体的方法。在使用载体将上述2种以上基因导入体细胞中时，作为载体，可以使用病毒载体、非病毒载体、人工病毒等，但从安全性的观点出发，适合使用腺病毒和逆转录病毒等病毒载体。另外，使用载体时，上述2种以上的基因既可以各自分别地重组入载体，也可以在1种载体中重组入2种以上的基因。

[0093] 这样导入了上述2种以上基因的体细胞，体细胞被初始化，并且被诱导为具有和软骨细胞同等特性的能够增殖的软骨细胞样细胞。从导入有上述2种以上的基因的体细胞中选择诱导为软骨细胞样细胞的细胞，能够将有无细胞增殖能力和是否具有和软骨细胞同等特性作为指标进行。这样的软骨细胞样细胞的选择，具体而言，从具有增殖能力的细胞中，能够以细胞形状、有无对软骨细胞特异的染色、细胞有无软骨细胞标记基因的表达等为指标进行。当在体细胞中预先导入软骨细胞标记基因的启动子与耐药性基因结合而制成的报告基因组成时，因为获得了软骨特性的细胞变得能够在药物存在下生长，所以，以药物存在下的生长为指标也能够选择获得了软骨特性的细胞。另外，软骨细胞样细胞如果以液体培养基单层培养，则呈现圆形或多边形状的形状，所以可以将这样的形状作为上述指标。此外，由于软骨细胞样细胞具有在软骨细胞中特异性表达的葡糖胺聚糖，所以也可以使用能够将葡糖胺聚糖染色的阿辛蓝，将其有无染色作为上述指标。此外，由于软骨细胞样细胞还可以表达软骨细胞标记基因(Col2a1、Acan、SOX5)，所以，也可以将有无该标记基因的表达成为上述指标。

[0094] 这样得到的软骨细胞样细胞能够在液体培养基中单层培养和增殖，通常直至9～21传代左右能够维持软骨细胞特性而稳定增殖。另外，在软骨细胞样细胞的培养中，可以使用在动物细胞培养中通常所使用的培养基。作为在软骨细胞样细胞培养中所使用的适合的培养基的一个例子，可以例示包含1～25容量％左右的FBS的DMEM培养基。

[0095] 另外，这样得到的软骨细胞样细胞，如果以体内方式(in vivo)在软骨组织中使用时，就能够将该软骨组织作为支架形成三维结构的新的软骨组织，另外，如果以体外方式(in vitro)在支架材料的存在下进行培养，就能够形成三维结构的软骨组织。

[0096] 这样，本发明所得到的软骨细胞样细胞具有增殖能力且能够在机体内再生软骨组织，因此，在变形性软骨病、软骨形成异常症关节炎(例如，关节风湿病等)、外伤、骨坏死等软骨疾病的治疗中有效，能够作为软骨组织再生用细胞制剂(医药组合物)使用。上述软骨细胞样细胞既可以直接单独在软骨疾病部位使用，或者也可以和支架材料共同在软骨疾病部位使用。另外，在将上述软骨细胞样细胞和支架材料共同在软骨疾病部位使用时，可以分别在软骨疾病部位使用上述软骨细胞样细胞和支架材料，但希望如后述那样通过使用包含上述软骨细胞样细胞和支架材料的细胞制剂而将其同时在软骨疾病部位中使用。

[0097] 在将上述软骨细胞样细胞作为软骨组织再生用细胞制剂进行制备时，根据需要，可以和上述软骨细胞样细胞共同包含药学上可接受的稀释用载体。在这里，作为药学上可接受的稀释用载体，例如，可以例示生理食盐水、缓冲液等。根据需要，该细胞制剂还可以包含作为药理活性成分和软骨细胞样细胞营养源的成分。

[0098] 另外，该细胞制剂中，上述软骨细胞样细胞希望包含支架(脚手架)材料。在该细胞制剂包含支架材料时，上述软骨细胞样细胞希望以载持在该支架材料中的状态包含。通过这样使用支架材料，就能够提高上述软骨细胞样细胞在软骨组织的疾病部位的成活率，更加促进软骨组织的再生。

[0099] 作为能够使用的支架材料，只要在药学上可接受，则没有特别限制，可以根据所应用于的软骨组织部位来适当选择，例如，可以列举凝胶状体或多孔体，生物分解性(biodegradable)或生物吸收性(bioresorbable)的材料。作为能够使用的支架材料，可以例示优选胶原、羟基磷灰石、α-TCP(磷酸三钙)、β-TCP(磷酸三钙)、聚乳酸、聚乙醇酸和这些的复合体等。这些支架材料既可以单独使用1种，也可以组合2种以上使用。在这些支架材料中，从软骨组织再生效率化的观点出发，优选胶原。另外，在使用胶原作为支架材料时，希望制成凝胶状并制备成为三维结构。

[0100] 另外，对于上述支架材料的形状而言，也没有特别限制，根据作为该细胞制剂应用对象的软骨组织的损伤部位的形状适当设计即可。

[0101] 将上述软骨细胞样细胞载持在支架材料上，例如在支架材料上接种或混合上述软骨细胞样细胞进行培养即可。

[0102] 在该细胞制剂中，将上述软骨细胞样细胞载持在支架材料中或由上述软骨细胞样细胞构建三维结构的软骨组织时，对于上述软骨细胞样细胞相对于支架材料所使用的比例，可以根据作为应用对象的软骨组织的部位、支架材料的种类等适当设定，作为1个例3 6 8
子，可以例示每1cm 支架材料上述软骨细胞样细胞为1×10 ～1×10cells的比例。

[0103] 对于在软骨组织疾病部位应用该细胞制剂的方法而言，可以根据该细胞制剂的种类、所应用的软骨组织的部位等适当设定，例如，可以列举切开并将该细胞制剂直接注入作为治疗目的软骨组织的疾病部位的方法，或者利用关节镜将该细胞制剂注入作为治疗目的软骨组织的疾病部位的方法等。

[0104] 另外，对于应用于软骨组织疾病部位的该细胞制剂的投与量而言，基于细胞制剂类型、软骨组织部位、症状程度、患者年龄和性别等适当设定对于软骨组织再生有效的量即可。

[0105] 此外，利用上述软骨细胞样细胞在体外构建三维结构的软骨组织，将其作为软骨组织用植入物，也能够在伴有变形性软骨病等软骨缺损的软骨疾病的治疗中使用。

[0106] 在由上述软骨细胞样细胞构建三维结构的软骨组织时，例如，在支架材料中播种上述软骨细胞样细胞，在上述软骨细胞样细胞能够生长的培养基中进行培养，直至三3
维结构的软骨组织被构建即可。更具体而言，每1cm 支架材料播种上述软骨细胞样细胞
6 8
1×10 ～1×10cells左右，在5％CO2条件下以37℃培养1～4周左右即可。上述三维
结构的软骨组织的构建中所使用的支架材料与在上述细胞制剂中能够使用的支架材料是同样的。另外，对于支架材料的形状而言，根据目的植入物形状适当设定即可。另外，对于在构建三维结构的软骨组织时所使用的培养基，只要是上述软骨细胞样细胞能够生长的培养基，则没有特别限制，作为1个例子，可以列举包含1～25容量％左右FBS的DMEM培养基，但从临床应用的观点出发，希望使用无血清的组成明确的培养基(defined serum-free medium)。

[0107] 这样所制备的三维结构的软骨组织以包含支架材料的形态或以除去支架材料的形态，作为软骨组织用的植入物使用。

[0108] 对于上述植入物应用于软骨组织疾病部位的方法，根据该植入物的形状和所应用的软骨组织部位等适当设定，例如，可以列举切开并将该植入物直接植入作为治疗目的的软骨组织疾病部位的方法。

[0109] 另外，上述软骨细胞样细胞即使投与软骨组织以外的机体内部位中，也可以形成软骨组织。因此，通过在哺乳动物机体内投与上述软骨细胞样细胞，在哺乳动物机体内由上述软骨细胞样细胞形成软骨组织后，摘出软骨组织，也能够得到软骨组织用植入物。

[0110] 在这样的软骨组织用植入物的制造中，所使用的哺乳动物既可以是人，另外也可以是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、山羊、猴等非人哺乳动物。另外，在软骨组织用植入物的制造中，对于上述软骨细胞样细胞投与的部位而言，没有特别限制，但从所形成的软骨组织的摘出容易性的观点出发，皮下，特别是背部皮下是适当的。另外，在软骨组织用植入物的制造中，既可以将上述软骨细胞样细胞和支架(脚手架)材料共同投与，也可以不包含支架而单独投与上述软骨细胞样细胞。即使这样不投与支架，上述软骨细胞样细胞也能够在机体内形成充分大小的软骨组织。

[0111] 在软骨组织用植入物的制造中，对于上述软骨细胞样细胞对哺乳动物的投与量而4 8 5 7
言，没有特别限制，可以列举通常10 ～10cells左右，优选10 ～10cells左右。另外，在哺乳动物中投与上述软骨细胞样细胞后，在14～35日后，优选在21～28日后可以确认软骨组织的形成。

[0112] 另外，也可以在软骨疾病患者的机体内进行上述软骨组织用植入物的制造，将制得的软骨组织移植到该患者的软骨疾病部位。即，通过在软骨疾病患者的软骨组织以外的部位投与上述软骨细胞样细胞，在患者机体内由上述软骨细胞样细胞形成软骨组织后，摘出软骨组织并投与该患者的软骨疾病部位，也能够进行软骨疾病的移植治疗。

[0113] 另外，被投与上述软骨细胞样细胞而具有由上述软骨细胞样细胞形成的软骨组织的非人哺乳动物，可以作为用于评价被检验物质对软骨组织的药效的工具使用。即，通过将被检验物质投与具有由上述软骨细胞样细胞形成的软骨组织的非人哺乳动物并判断被检验物质对该软骨组织的药效，就能够评价被检验物质对软骨组织的药效。在这里，所谓被检验物质，是作为对软骨组织的药效评价对象的物质，具体而言，可以列举软骨疾病治疗药的候补物质。

[0114] 另外，上述软骨细胞样细胞可以作为用于解明各种软骨疾病病态的工具使用，而且，从人的体细胞诱导的软骨细胞样细胞作为用于软骨疾病相关的药物创立和药品开发的工具也是有用的。

[0115] 2.软骨细胞样细胞制备用组合物

[0116] 如上所述，通过将选自Myc家族基因和Klf家族基因中的至少1种基因和SOX9基因组合导入体细胞中，能够制备软骨细胞样细胞。因此，本发明还提供包含选自Myc家族基因和Klf家族基因中的至少1种基因和SOX9基因的软骨细胞样细胞制备用组合物。该软骨细胞样细胞制备用组合物是包含用于从体细胞诱导软骨细胞样细胞所使用的初始化因子和软骨诱导性转录因子的一套组合物，希望上述2种以上的基因以能够导入体细胞中的形态包含。作为上述2种以上基因能够导入体细胞中的形态，具体而言，可以例示重组有上述2种以上的基因的载体。在这里，上述2种以上的基因既可以分别重组入各自的载体中，也可以将2种以上的基因同时重组入1个载体中。

[0117] 在该软骨细胞样细胞制备用组合物中所使用的基因、载体的种类等如上所述。

[0118] 实施例

[0119] 以下，基于实施例等详细说明本发明，但本发明不被这些实施例所限定。

[0120] 实施例1.由皮肤成纤维细胞和胚胎成纤维细胞制造软骨细胞样细胞

[0121] 1.Col 11a2-βgeo转基因小鼠的制作

[0122] <方法>

[0123] 首先，在图1a所示的Collla2启动子/增强子序列的控制下，用以下所示的程序制作表达β-geo(β-半乳糖苷酶基因和抗新霉素基因的融合基因)的转基因小鼠。

[0124] 作为α2(Ⅺ)胶原基因基础的表达载体742LacZint，包含作为小鼠Collla2启动子(-742～+380)、SV40RNA剪接部位、β-半乳糖苷酶报告基因、SV40多腺苷酸化信号和作为增强子的Collla2的2.34-kb的第1内含子序列(参考文献1)。为了制作βgeo导入基因，将0.8-kb抗新霉素基因片段与编码LacZ的3.1-kb cDNA片段的3’末端连接。将βgeo片段取代LacZ基因，重组入742LacZlnt表达载体的Notl部位，制作了Collla2-βgeo质粒。

[0125] 以EcoR1和Pst1消化Collla2-βgeo质粒，释放该质粒内的插入物(inserts)放出。以与参考文献1同样的方法，通过将上述插入物显微注射入来自F1杂交小鼠(C57BL/6×DBA)的受精卵原核，制作了转基因小鼠。通过从尾部提取的基因组DNA的PCR检测鉴定了转基因小鼠。具体而言，使用识别LacZ基因的引物(CGC TAC CAT TAC CAG TTG：序列序号1)和识别抗新霉素基因的引物(CCA GTC ATA GCC GAA TAG：序列序号2)，通过导入基因特异的PCR扩增基因组DNA，扩增了βgeo转基因小鼠中特异性包含的135-bp产物，进行了转基因小鼠的鉴定。使经上述鉴定的转基因小鼠与C57BL/6系小鼠至少在4代之间交配。

[0126] 对于这样制成的转基因小鼠，按照在参考文献2中记载的方法进行小鼠身体和切片的X-gal染色。

[0127] <结果>

[0128] α2(Ⅺ)胶原链是支持软骨组织结构的软骨特异性基质蛋白质，在吸收冲击的软骨功能中发挥重要的作用。已知Collla2启动子/增强子序列在软骨中特异性表达(参考文献1)。Collla2启动子包含绝缘子活性，可以认为有助于转基因小鼠中稳定的导入基因表达。将上述转基因小鼠以X-gal染色，在软骨细胞中特异地显示LacZ活性，但在其它组织中不显示(参照图1b的左图)。另外，通过组织学分析确认了全部软骨细胞表达βgeo(参照图1b的右图)。

[0129] 2.来自Collla2-βgeo转基因小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞、成体小鼠皮肤成纤维细胞和原代软骨细胞的分离和分析

[0130] <方法>

[0131] 使用在上述得到的转基因小鼠，按照以下程序分离小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast)(MEF)、成体小鼠皮肤成纤维细胞(adult mouse dermal fibroblast)(MDF)和原代软骨细胞。

[0132] MEF以与参考文献3同样的方法分离。具体而言，首先从13.5dpc的胚胎除去头部和内脏组织。接着，将残余的身体剪碎，以胰蛋白酶处理后，移入管中。通过离心分离回收6
细胞，使其悬浮在含有10％FBS的DMEM培养基中。接着，将所得到的细胞1×10cells在
100mm培养皿中培养，由此得到MEF(第1代)。

[0133] MDF从3～6月龄的转基因小鼠制备。具体而言，将转基因小鼠的体毛剃除后，将皮肤切碎，然后在37℃进行胰蛋白酶处理4小时。以尼龙筛(微孔尺寸40μm，Tokyo Screen，Tokyo，Japan)过滤通过胰蛋白酶处理而游离的细胞，制作单细胞的悬液，将其在100mm培养皿中培养，由此得到MDF(第1代)。

[0134] 原代软骨细胞以与参考文献4同样的方法分离。具体而言，解剖转基因小鼠，在包含2％FBS和链霉素/青霉素的DMEM培养基中分离采取其肱骨和股骨的骨端软骨。将骨端软骨的附着组织和软骨膜在37℃以胶原酶(Ⅱ型，Sigma)消化(DMEM/2％FBS中，2mg/ml)30分钟后，物理除去。接着，将除去了附着组织和软骨膜的骨端软骨在胶原酶溶液中处理2～4小时，使原代软骨细胞游离。通过离心分离(4℃，5分钟，200×g)回收游离的细胞，然后悬浮在新鲜的培养基中。在60mm或100mm培养皿中接种细胞，以含有2％FBS的DMEM培养基培养，得到原代软骨细胞。

[0135] 另外，上述得到的第1代MEF和MDF在胰蛋白酶处理后冷冻保存在液氮中，在后述的试验中使用。

[0136] 另外，对于在上述得到的原代软骨细胞进行X-gal染色，评价LacZ活性。

[0137] 在包含0～900μg/ml的G418(遗传霉素)的培养基中添加在上述得到的原代软骨细胞、MEF和MDF，在5％CO2条件下以37℃孵育，评价各细胞的生长。另外，原代软骨细胞的培养使用含有2％FBS的DMEM培养基，MEF和MDF的培养使用含有10％FBS的DMEM培养基。另外，为了比较，以和上述同样的手法，对于从野生型的同窝小鼠制备的原代软骨细胞也同样地在G418的存在下孵育，评价其生长。

[0138] <结果>

[0139] 对由βgeo转基因小鼠制备得到的原代软骨细胞进行X-gal染色，确认约50％细胞被染色(参照图1的c)。该结果提示软骨细胞去分化，或在制备时污染了附着在软骨上的纤维组织中的成纤维细胞。

[0140] 另外，图1d表示在G418的存在下孵育从βgeo转基因小鼠制备得到的原代软骨细胞、MEF和MDF的结果。MEF和MDF在300μg/ml的G418的存在下完全死亡，与之相对，从转基因小鼠制备得到的原代软骨细胞即使在900μg/ml的G418的存在下也生长。另外，从野生型的F1杂交小鼠(C57BL/6×DBA)制备得到的原代软骨细胞，其大部分在300μg/ml的G418存在下死亡。

[0141] 3.将MEF诱导为软骨细胞的因子的研究

[0142] <方法>

[0143] 为了鉴定将体细胞诱导为软骨细胞的因子，使用4个初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)和软骨诱导性转录因子(Sox9)进行在上述得到的MEF的转染，评价有无向软骨细胞的诱导。由于显示软骨细胞表型的细胞显示对G418的耐性，所以，在本试验中，以G418耐性为指标确认有无向软骨细胞的诱导。具体而言，按照以下程序进行试验。

[0144] 在本试验中，上述初始化因子和软骨诱导性转录因子向体细胞的导入，以与参考文献3同样的方法，使用逆转录病毒pMXs/Plat-E载体系统实施。即，使用重组有小鼠c-Myc的逆转录病毒载体(pMXs-c-Myc)、重组有小鼠Klf4的逆转录病毒载体(pMXs-Klf4)、重组有小鼠Sox2的逆转录病毒载体(pMXs-Sox2)和重组有小鼠Oct3/4的逆转录病毒载体(pMXs-Oct3/4)。另外，对于重组有人SOX9的逆转录病毒载体而言，使用在Gateway pENTR-1A载体(Invitrogen)中重组入人SOX9 cDNA，再通过LR反应(Invitrogen)将得到的质粒插入pMXs-gw中而得到的载体。

[0145] 转录因子向体细胞的导入用以下程序实施。首先，在100mm培养皿中，在10ml含有10％FBS的DMEM培养基(含有1μg/ml puromycin、10μg/ml brastcidine、penicillin
6
和streptomycin)中接种8×10cells的Plat-E细胞，在此1日后，使用Fugene 6转基因试剂(Roche)将各pMXs基础的逆转录病毒载体转染Plat-E细胞。转染24小时后，更换培养基。培养基更换24小时后，从Plat-E培养物中回收培养基作为含有病毒的上清。

[0146] 在100mm培养皿中接种冷冻保存的MEF。在转导的前1日，将MEF或MDF进行胰蛋5
白酶处理后，在100mm培养皿中加入5×10cells，在含有10％FBS的DMEM培养基中静置培养24小时(第3代)。

[0147] 以0.45μm醋酸纤维素过滤膜(Schleicher & Schuell)过滤在上述得到的各含有各病毒的上清，对得到的滤液添加聚凝胺(Nacalai Tesque)，使最终浓度为4mg/ml，制备了病毒溶液。根据转导的基因组合，混合各病毒溶液，制备了混合病毒溶液。另外，在制备混合病毒溶液时，以使含有的各个逆转录病毒载体为等量的方式设定所混合的各病毒溶液。

[0148] 在上述培养的MEF培养皿中添加上述病毒液或病毒混合液，在37℃孵育16小时，转导逆转录病毒载体。孵育后，对培养皿中的细胞进行胰蛋白酶处理，接着，将细胞分至加入有含有10％FBS的DMEM培养基的3个10cm培养皿中，静置培养2日。接着，更换为包含500μg/ml的G418的含有10％FBS的DMEM培养基，静置培养2周，每隔1日以相同组成的培养基进行培养基更换。

[0149] 这样所培养的细胞在进行了阿辛蓝染色后再进行结晶紫染色，计测在各培养皿中被染色的细胞集落数。在这里，被染色的细胞集落数通过记数3个培养皿被染色的细胞集落数的合计数来计测。其中，在结晶紫染色中，全部细胞被染色，在阿辛蓝染色中，在软骨细胞中特异性表达的葡糖胺聚糖被染色，因此仅有分化为软骨细胞的细胞被染色。

[0150] 另外，为了比较，使用将重组有GFP cDNA的逆转录病毒载体(pMXs-EGFP)，以与上述同样的方法进行向MEF的转染、转染细胞的评价。

[0151] <结果>

[0152] 在图2中表示对于在MEF中导入了各因子得到的细胞进行分析的结果。在图2的a中，表示对于在MEF中导入了各因子得到的细胞，由阿辛蓝染色和结晶紫染色所计测的染色细胞集落数。另外，在图2的b中，表示在MEF中同时转导了4个初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)和人SOX9而得到的细胞进行阿辛蓝染色和结晶紫染色时的结果。在向MEF只转导SOX9时，在G418的存在下，没有诱导细胞集落形成(图2的a)。另外，在MEF中只转导4个初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)时，形成了由具有纺锤形状的非软骨细胞样形态的细胞组成的少量细胞集落，但这些细胞集落不被阿辛蓝染色，因此可知未分化为软骨细胞。另外，在MEF中同时转导4个初始化因子和SOX9时，可以确认在每个10cm培养皿中形成约110个G418耐性细胞集落，其中约30％的细胞集落被阿辛蓝染色(参照图2的a和b)。在MEF中同时转导了4个初始化因子和SOX9而得到的细胞的形状，在细胞集落之间不同，有的细胞集落由多边形状细胞(图2的c左)构成，这些和原代软骨细胞的形状(图1的c)类似，而其它细胞集落如MEF(图2的d右)那样由纺锤形状的细胞(图2的e右)构成。

[0153] 接着，为了鉴定哪个因子在G418耐性细胞集落的形成中是重要的，在MEF中转导上述4个初始化因子中的3个初始化因子和Sox9，对所得到的细胞进行了分析。在图2的e中表示对于导入有3个初始化因子和Sox9的细胞进行阿辛蓝染色和结晶紫染色而计测的染色细胞集落数。其结果可知，细胞集落的平均数在未导入c-Myc或Klf4时减少。另一方面，即使未导入Oct3/4或Sox2，所形成的细胞集落数也不减少。这些结果显示，在由MEF诱导软骨细胞上，c-Myc、Klf4和Sox9的转导是重要的。另外，在MEF中导入c-Myc、Klf4和Sox9时，约250个形成的G418耐性细胞集落中的大约50％由具有多边形状的具有软骨细胞样形态的细胞构成(参照图2的f)。

[0154] 4.将MDF诱导为软骨细胞的因子的研究

[0155] <方法>

[0156] 以与上述相同的方法，对MDF以各种组合转导4个初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)和软骨诱导性的转录因子(SOX9)，分析所得到细胞的特性。

[0157] <结果>

[0158] 在图3中表示对于在MDF中导入各因子而得到的细胞进行分析的结果。在图3的A～C中表示对于在MEF中导入各因子而得到的细胞，由阿辛蓝染色或结晶紫染色计测的染色细胞集落数以及由多边形细胞构成的细胞集落数。向MDF只转导SOX9时，在G418的存在下没有诱导细胞集落形成(参照图3的A)。向MDF只转导4种初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)时，也只形成很少量细胞集落。另一方面，在MDF中同时转导了4种初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)和SOX9时，可以确认形成约120个G418耐性细胞集落，这些细胞集落的约30％由多边形状的具有软骨细胞样形态的细胞构成。使用MDF得到的这些结果显示与使用MEF得到的结果(参照图2的a)相同的倾向。

[0159] 另外，在SOX9的存在下，从4种初始化因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf-4)中缺少c-Myc、Klf-4和Oct3/4的任意1个时，所形成的细胞集落数稍微减少，而在缺少Sox2时，所形成的细胞集落数增加(参照图3的B)。在所形成的细胞集落中，在SOX9的存在下4种初始化因子中c-Myc和Klf-4的任意1个缺少的情况下，看不到由圆形或多边形状的细胞构成的细胞集落(图3的B)，在SOX9的存在下4种初始化因子中缺少Oct3/4时，大致5分之1的细胞集落由圆形或多边形状的细胞构成(参照图3的B)。这些结果显示，c-Myc、Klf-4和SOX9的组合，在由MDF形成包含G418耐性且为软骨细胞样形状的细胞的细胞集落是重要的。即，可知c-Myc、Klf-4和SOX9的组合由MDF制作约200个G418耐性细胞集落，该细胞集落内的大致40％是由圆形或多边形状的细胞构成的(参照图3的C)。另一方面，c-Myc和SOX9的组合也形成约200个G418耐性细胞集落，这些细胞集落几乎由具有纺锤形的或更平坦形状的非软骨细胞样形态的细胞构成，但也可以看到少量由圆形或多边形状的软骨细胞样形态的细胞构成的细胞集落(参照图3的C)。另外，在SOX9只和Klf4组合时，约350个G418耐性细胞集落形成，这些细胞集落内，虽然量少，但存在由圆形或多边形状的软骨细胞样形态的细胞构成的细胞集落(参照图3的C)。

[0160] 根据以上的结果，通过导入c-Myc、Klf-4和SOX9，能够由5×105cells的MDS制成约50个G418耐性的由软骨细胞样形态的细胞构成的细胞集落。即使在这3种因子的组合中加入Oct3/4，也不影响G418耐性的由软骨细胞样形态的细胞构成的细胞集落数。另外，如果加入Sox2，就妨碍细胞集落的形成。另外，c-Myc和SOX9的组合或Klf-4和SOX9的组合，也能够确认形成由软骨细胞样形态的细胞构成的G418耐性细胞集落。此外，根据本结果也提示了Sox2的导入阻碍向软骨细胞样形态的细胞的诱导。

[0161] 另一方面，使用SOX5和SOX6取代SOX9，以与上述同样的方法在MDF中共同导入c-Myc和Klf-4时，看不到G418耐性细胞集落的形成。SOX5和SOX6具有支持SOX9的作用，但已知不具有SOX9中存在的反式激活结构域(transactivation domain)。如果考虑这一点，则推断在向软骨细胞样形态的细胞的诱导中，涉及SOX9中存在的反式激活结构域。

[0162] 从上述实验结果也可以把握，属于Myc家族基因的各基因和属于Klf家族基因的各基因基本上分别具有相同的生物学活性，因此，通过组合使用属于Myc家族基因的基因、属于Klf家族基因的基因和SOX9，就能够将体细胞向软骨细胞样形态的细胞诱导。

[0163] 5.克隆的制作

[0164] <方法>

[0165] 从由MDF诱导的G418耐性细胞集落中选择以下11个细胞集落制作克隆。

[0166] ·从通过c-Myc、Klf-4、Sox2、Oct3/4和Sox9的转导制作得到的细胞集落中选择1个(以下，将该克隆标记为MKSO-1)

[0167] ·从通过c-Myc、Klf4、Sox2和Sox9的转导制作的细胞集落中选择2个(以下，将这些克隆标记为MKS-1或-2)

[0168] ·从通过c-Myc、Klf4、Oct3/4和Sox9的转导制作的细胞集落中选择4个(以下，将这些克隆标记为MKO-1～-4)

[0169] ·从通过c-Myc、Klf4和Sox9的转导制作的细胞集落中选择4个(以下，将这些克隆标记为MK-1～-4)

[0170] 在对作为标的的各细胞集落进行胰蛋白酶处理并回收细胞后，在96孔板中，在包含500μg/ml的G418的含有10％FBS的DMEM培养基中，在5％CO2条件下，在37℃培养6～10日。此后，将在96孔板中增殖的细胞移入24孔板中，在5％CO2条件下，在37℃培养24～31日。接着，将在24孔板中增殖的细胞移入6孔板，在5％CO2条件下，在37℃培养18～31日。将该细胞移入10cm培养皿，将该阶段的细胞规定为第4代。使这样增殖得到的细胞在包含500μg/ml的G418和含有10％FBS的DMEM培养基中培养，每6日传代一次。

[0171] <结果>

[0172] 使用包含G-418的培养基对在上述方法中11个细胞集落中所包含的细胞进行培养，来自MKO-4细胞集落的细胞在第7代后停止增殖。通过上述培养，除去MKO-4，能够制作10个克隆(MKSO-1、MKS-1、-2、MKO-1～-3和MK-1～-4)。所制作的各克隆具有多边形状，显示和软骨细胞同样的形态(参照图3的E)。

[0173] 6.克隆化细胞的特性的评价

[0174] 对于上述克隆化的细胞进行利用阿辛蓝染色的分析、导入基因的表达分析、软骨细胞标记基因的表达分析、核型分析、基因表达谱分析、在Colla2的启动子领域的甲基化CpG二核苷酸的分析、增殖特性的分析。

[0175] 6-1.利用阿辛蓝染色的分析

[0176] 在60mm培养皿中，在包含500μg/ml的G418的含有10％FBS的DMEM培养基中培养上述克隆化的细胞(第6代)和MDF(第3代)，细胞融合后，再培养14日。对这样培养得到的细胞进行阿辛蓝染色。

[0177] 在图4的A中表示得到的结果。培养后的细胞被阿辛蓝强烈染色，确认葡糖胺聚糖存在。另外，染色强度在克隆之间不同。

[0178] 6-2.导入基因的表达分析

[0179] 使用扩增来自逆转录病毒导入基因的转录物但不扩增内在性基因的转录物的引物，进行RT-PCR和蛋白质印迹分析，分析上述克隆化的细胞的导入基因的表达。具体而言，按照以下顺序实施。

[0180] 在60mm培养皿中，在包含500μg/ml的G418的含有10％FBS的DMEM中培养在上述克隆化的细胞(第6代)和MDF(第3代)，另外，在含有2％FBS的DMEM中培养
由βgeo转基因小鼠制备得到的原代软骨细胞(第1代)。达到细胞融合后，使用RNeasy Mini Kits(Qiagen.Santa Clarita.CA)提取细胞总RNA。接着，以DN酶消化所提取得到的总RNA，除去污染的基因组DNA。使用QuantiTect Reverse Transcription(Qiagen)，将所得到的总RNA(1μg)逆转录为单链(first-strand)cDNA。将所得到的cDNA(2μl)在含有ExTaq(Takara Bio株式会社)和对各基因特异的引物(4pmol)的混合液(20μl)中进行PCR扩增，测定各RNA的表达水平。在表1中列举使用的引物。

[0181] [表1]

[0182]

[0183] 另外，在60mm培养皿中，在包含500μg/ml的G418的含有10％FBS的DMEM中培养在上述克隆化的细胞(第6代)和MDF(第3代)，另外，在含有2％FBS的DMEM中培养由βgeo转基因小鼠制备得到的原代软骨细胞(第1代)。达到融合后，溶解细胞。将得到的细胞溶解液供给十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并进行电转印，接着进行免疫染色。抗体使用抗-Sox9抗体(Santa-Cruz Biotechnology.Inc.，1∶200稀释)、抗-c-Myc抗体(Santa-Cruz Biotechnology.Inc.，1∶200稀释)、抗-Klf4抗体(Santa-Cruz Biotechnology.Inc.，1∶ 200稀释)、抗-Oct3/4 抗体(Santa-Cruz Biotechnology.Inc.，1∶600稀释)、抗-Sox2抗体(Santa-Cruz Biotechnology.Inc.，1∶200稀释)、抗-β-肌动蛋白抗体(Cell Signaling Technology，1∶5000稀释)。

[0184] 在图4的B中表示RT-PCR的分析结果，在图4的C中表示蛋白质印迹分析的结果。由RT-PCR的分析结果确认，克隆化的细胞表达导入基因。另外，由蛋白质印迹分析确认，克隆化的细胞在蛋白质水平表达导入基因，但在MDF中没有表达这些基因。

[0185] 6-3.软骨细胞标记基因的表达分析

[0186] 使用RT-PCR分析在上述克隆化的细胞的软骨细胞标记基因的表达。具体而言，以与上述同样的方法从克隆化的细胞(第6代)、MDF(第3代)和由βgeo转基因小鼠制备得到的原代软骨细胞(第1代)获得总RNA，通过RT-PCR分析，分析了软骨细胞标记基因(Col2a1、Acan、Hapln1、Sox5、Sox6、Col9a1、Col9a2、Col9a3、Col11a1、Col11a2)的表达和MDF标记基因(Col1a1、Col1a2、Gapdh、RT-)的表达。在表2中列举使用的引物。

[0187] [表2]

[0188]

[0189] 在图5的a中表示软骨细胞标记基因表达的分析结果，在图5的b中表示MDF标记基因表达的分析结果。由该结果显示，上述克隆化的细胞以各种水平表达软骨细胞标记基因。MKS-1、MKO-2、MK-1、MK-3和MK-4表达软骨细胞标记基因，但MKS-2和MK-2不表达软骨细胞标记基因。另外，也确认MKS-1表达成纤维细胞特异性的Ⅰ型胶原基因(Col1a1和Col1a2)。

[0190] 另外，在由βgeo转基因小鼠制备得到的原代软骨细胞中，正如LacZ阴性细胞的存在所表示的那样，可能污染了来自附着于软骨的周围纤维性组织的成纤维细胞(参照图1的c)。因此推测从来自原代软骨细胞的RNA检测出据认为在成纤维细胞中表达、但在纯粹的软骨细胞中不表达的1型胶原基因(Col1a1和Col1a2)mRNA。

[0191] 6-4.核型分析

[0192] 以奎纳克林-Hoechst染色分析上述克隆化的细胞的核型。其中，本分析在财团法人实验动物中央研究所(Internation Council for Laboratory Animal Science(ICLAS)Monitoring Center(Japan))中实施。

[0193] 在图5的c中表示一部分得到的结果。MKS-2、MKO-2和MK-4显示40XY的正常核型，MK-3显示正常的40XY和41XY+4的混合物。

[0194] 6-5.基因表达谱的分析

[0195] 用以下所示的方法，通过DNA微阵列分析的散点图分析上述克隆化的细胞(MKS-1、MKO-2、MKl-1、MK-3、MK-4)、MDF和由βgeo转基因小鼠制备得到的原代软骨细胞中的全部基因表达谱。

[0196] 使用MessageAmpⅢ RNA Amplification Kit(Ambion)，从250ng的总RNA得到生物素标记的cRNA。接着，以45℃、16小时的条件使10μg的片段化cRNA相对于Affymetrix430 2.0GeneChip阵列进行杂交。此后，洗净DNA芯片，再进行染色。接着，使用Affymetrix Fluidics station 450和扫描设备对所得到的DNA芯片进行扫描，使用GCOS 软件分析得到的图像。标准化使用MAS5.0 算法算出。聚类分析使用Cluster 3.0(东京大学)实施。

[0197] 在图6的a～c中表示DNA微阵列分析的散点图的结果。和原代软骨细胞比较，在MDF中，过量表达的基因数很少，但和MDF比较，在原代软骨细胞中过量表达的基因数很多(参照图6的a)。这和原代软骨细胞推测被成纤维细胞污染是一致的。另外，和原代软骨细胞比较在MK-3中过量表达的基因数(参照图6的b)，少于和MDF比较在MK-3中过量表达的基因数(参照图6的c)。另外，和MK-3比较在原代软骨细胞中过量表达的基因数(参照图6的b)，与和MK-3比较在MDF中过量表达的基因数(参照图6的c)是同等程度。可以认为这是起因于原代软骨细胞被成纤维细胞污染。这些结果表示MK-3在全部的转录水平上和纯粹的软骨细胞类似。另外，MK-3和原代软骨细胞双方中，相比于其它基因的表达水平，包括Col2a1、聚集蛋白聚糖基因(Acan)以及Col9a1的软骨基质基因的表达水平极高(参照图6的b)。

[0198] 另外，在图6的d中表示聚类分析的结果。从聚类分析的结果可知，除了MKS-1以外的克隆化的细胞被分类为与MDF、原代软骨细胞和MKS-1不同的类。这和MKS-1表达软骨细胞标记基因和MDF标记基因双方的RT-PCR的见解以及原代软骨细胞被成纤维细胞污染的推测一致。

[0199] 6-6.在软骨细胞标记基因的启动子区域和MDF标记基因的启动子区域中的甲基化CpG二核苷酸的分析

[0200] 对于在上述克隆化的细胞(MK-3、MK-4)和MDF，通过亚硫酸氢钠测序法(bisulfite genomic sequencing analyses)评价软骨细胞标记基因(Col2a1和Acan)的启动子和MDF标记基因(Colla2)的启动子中的胞嘧啶鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的甲基化状态。亚硫酸氢钠测序法，具体地按照下述方法实施。使用EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen)，按照在该试剂盒中附加的指示书中记载的方法进行亚硫酸氢盐处理。使用的PCR引物如在表3中所示。使用Mighty TA-cloning Kit(Takara)，在pMD20-T载体中将扩增产物克隆化。对各基因随机选择的10个克隆使用T7和T3引物进行测序

[0201] [表3]

[0202]

[0203] 在图6的e中表示得到的结果。Col1a2的启动子中的胞嘧啶鸟嘌呤(CpG)二核苷酸在MK-3和MK-4中被高度甲基化，但在MDF中未被甲基化。另外，Col2a1和Acan的启动子中CpG二核苷酸的甲基化状态，在上述克隆化的细胞(MK-3、MK-4)和MDF的双方几乎没有被甲基化。

[0204] 6-7.增殖特性的分析

[0205] 在60mm培养皿中，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养克隆化的细胞(第6代)和MDF(第6代)，评价增殖特性。

[0206] 在图7的a中表示得到的结果。MKO-2、MK-1、MK-3和MK-4至少在48日内呈指数增殖，但在培养40日以后，渐渐出现纺锤形状或平坦形态的细胞。另一方面，MDF从培养开始在第15日停止增殖。另外，MKS-1的增值速度迅速上升，在培养24日以后显示向纺锤形状变化。这暗示MKS-1去分化，可能和该细胞的染色体数异常相关联。

[0207] 另外，在细胞数大于1×1010cells时，分离各种细胞的一部分，将其接种在10cm培养皿中进行培养，达到融合后再继续培养14日。此后，将各细胞以阿辛蓝染色。在图7的b中表示以阿辛蓝染色的结果。从该结果可明确，相比于MDF，软骨细胞样细胞被阿辛蓝强烈染色，可知即使细胞数增加到某种程度，软骨细胞样细胞也保持作为软骨细胞的特征。

[0208] 7.软骨组织的制作

[0209] 用以下所示的方法，使用克隆化的细胞(MK-3)和MDF进行软骨组织的制作。

[0210] 使用胶原培养试剂盒(Nitta Gelatin Inc.生产)，按照该试剂盒中所示表示的方案进行胶原培养。首先，以胰蛋白酶/EDTA消化软骨细胞样细胞(MK-3)和MDF。接着，在7
以4℃制备的0.25％的Ⅰ型酸溶解胶原液中添加细胞并悬浮，使其为2×10cells/ml。在
6孔板的各孔中央添加细胞悬液(500μl的液滴)，以37℃使之凝胶化。以3ml含有10％FBS的DMEM培养基覆盖所得到的凝胶-细胞复合物，在5％CO2的条件下以37℃培养。每隔1日将培养基更换为新鲜的培养基。培养3周后，在以10％甲醛固定胶原-细胞复合物后，在石蜡中包埋。将这样处理过的凝胶-细胞复合物的一部分以阿辛蓝和核坚牢红染色。
另外，将凝胶-细胞复合物的一部分以针对Ⅱ型胶原的1次抗体(来自山羊的多克隆抗体)(Santa-Cruz Biotechnoligy，Inc.，1∶200 dilution)进行处理，洗净后再以二次抗体Alexa Fluor 488 Rabbit Anti-goat IgG(Invitorgen)进行处理。

[0211] 在图7的c中表示结果。通过在Ⅰ型胶原凝胶中MK-3的三维培养物的组织学分析，确认以被阿辛蓝染色的物质包围的小腔构成的组织结构，可知在上述凝胶-细胞复合物中形成软骨样组织。另外，在包含MK-3的凝胶-细胞复合物中，显示了对于抗Ⅱ型胶原抗体的免疫活性，但在包含MDF的凝胶-细胞复合物中不能确认该活性。

[0212] 8.在体内的软骨组织制作

[0213] 使用和上述相同的方法，在MDF中导入c-Myc、Klf4和SOX9进行诱导，将具有软骨细胞样形态的细胞(MK-5：软骨细胞样细胞)克隆化。其中，使用重组有GFP cDNA的逆转录病毒载体，将GFP也导入该MK-5中

[0214] 以胰蛋白酶/EDTA消化软骨细胞样细胞(MK-5)。接着，在含有10容量％FBS的7
DMEM培养基中添加细胞并悬浮，使其为1×10cells/ml，制备了细胞悬液。将0.1ml该细胞悬液注入裸小鼠(6周龄，雌，BALB/cA Jcl-nu/nu)背部皮下。

[0215] 从细胞悬液投与4周后，观察小鼠背部的荧光显色，在注入了MK-5细胞悬液的皮下可以确认表达GFP的块(图8的A和B)。接着，摘出注入了细胞悬液的部位，在以4％甲醛固定后，在石蜡中包埋。将经过这样处理的连续组织片进行番红O染色，以抗GFP抗体进行免疫染色。在图8的C中表示结果。确认在注入了MK-5的小鼠的皮下脂肪组织内，在被番红O染色为红色的基质中细胞分散存在的组织，可知在裸小鼠的皮下形成了软骨组织。另外，可以认为GFP阳性细胞表示注入的软骨细胞样细胞，该范围与被番红O染色的软骨组织的区域完全一致。这表示注入存活的MK-5细胞完全分化为软骨组织，形成了软骨组织。
在图8的D中表示以图8的C中方框包围部分的放大。由该结果确认，即使脚手架不存在，软骨细胞样细胞也具有形成软骨组织的能力，能够在软骨组织的再生中实用化。

[0216] 9.综合考察

[0217] 从以上的结果可知，通过组合导入c-Myc、Klf-4和Sox9，能够得到具有增殖能力且具备和软骨细胞同样特性的细胞(软骨细胞样细胞)。在实际中确认这样得到的软骨细胞样细胞，通过与胶原凝胶共同培养或通过直接向机体内投与，也能够形成三维结构的软骨组织。

[0218] 实施例2 由软骨细胞样细胞形成软骨组织

[0219] <方法>

[0220] 以与上述实施例1同样的方法，通过在MDF中转导c-Myc、Klf4和Sox9，取得了11个软骨细胞样细胞(MK-5～MK-15)。这些软骨细胞样细胞内，以胰蛋白酶/EDTA消化2株7
(MK-7和MK-10)，接着，在含有10容量％的FBS的DMEM培养基中悬浮，准备了1×10cells/ml的细胞悬液。将该细胞悬液0.1ml注射入裸小鼠(雌，6周龄，BALB/cA Jcl-nu/nu)的背部皮下。注射了MK-7细胞的小鼠在注射后16周，注射了MK-10细胞的小鼠在注射后8周摘出注射部分，在以4％甲醛固定后，以石蜡包埋。接着，制作组织切片，以番红O、快绿和铁苏木精染色。

[0221] <结果>

[0222] 在图9中表示得到的结果。由该结果确认，在分别注入了MK-7或MK-10细胞的小鼠的皮下脂肪组织内，在被番红O染色为红色的基质中细胞分散存在的组织，确认在裸小鼠的皮下形成软骨组织。另外，在MK-7或MK-10细胞的注入部位中，不能确认肿瘤的形成。

[0223] 由以上结果可以确认，通过本发明的方法能够得到至少16周不使肿瘤形成的软骨细胞样细胞。

[0224] 实施例3 软骨细胞样细胞的基因组DNA的分析

[0225] <结果>

[0226] 对于在上述实施例1中取得的软骨细胞样细胞(MK-1、-3和-4)和在上述实施例2中取得的软骨细胞样细胞(MK-5、-7、-10和-15)，为了评价细胞的同一性，进行以下的实验。

[0227] 首先，按照通常方法从软骨细胞样细胞获取基因组DNA，以EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ消化所得到的基因组DNA，将其片段化。在琼脂糖凝胶中通过电泳将被片段化的基因组DNA展开，转移到在尼龙膜上后，使用Klf4 cDNA探针进行Southern杂交(DNA杂交)。

[0228] 在图10中表示得到的结果。如从图10可知，在实施例1-2中得到的软骨细胞样细胞，每株细胞都显示不同的条带谱，表示作为各自独立的细胞株被树立。

[0229] 实施例4 从来自脂肪组织的间质细胞制造软骨细胞样细胞

[0230] <方法>

[0231] 来自脂肪组织的间质细胞(ADSC)以与参考文献5同样的方法从皮下脂肪组织分离。具体而言，首先从与在上述实施例1中制成的同样的3～6月龄的Col11a2-βgeo转基因小鼠取出皮下脂肪片，切碎后，在37％以0.2％胶原酶处理2～4小时。将通过胶原酶处理而游离的细胞以尼龙微孔滤膜(微孔尺寸70μm：Tokyo Screen，Tokyo，Japan)过滤。分离得到的细胞通过离心分离(200×g，4℃，10分钟)回收。接着，将细胞悬浮在含有新鲜的5％FBS的DMEM培养基中，此后，再次通过离心分离(200×g，4℃，10分钟)回收细胞。
接着，在60mm或100mm培养皿中培养所得到的细胞，由此得到ADSC(第1代)。

[0232] 接着，以与上述实施例1同样的方法，在皮下脂肪细胞中导入c-Myc、Klf4和Sox9，在10ml包含500μg/ml的G418的含有5％FBS的DMEM培养基中进行培养。

[0233] 对于经过这样处理的细胞，以与上述实施例1同样的方法进行阿辛蓝染色和结晶紫染色，另外，也进行了形状观察。

[0234] 另外，为了比较，使用在pMXs载体中重组有GFP cDNA的逆转录病毒载体，以与上述同样的方法进行向皮下脂肪的转染、转染细胞的评价。

[0235] <结果>

[0236] 在图11中表示结果。如果在ADSC中导入c-Myc、Klf-4和Sox9，则在每个10cm培养皿中可以确认约380个G418耐性细胞集落。另外，这些细胞集落的约60％被阿辛蓝染色。该细胞集落的约20％由圆形或多边形的软骨细胞样形态的细胞构成。另一方面，在导入了GFP的来自脂肪组织的间质细胞中，不能确认细胞集落的形成。

[0237] 由以上结果强烈暗示，即使在对来自皮下脂肪的细胞导入c-Myc、Klf-4和Sox9的情况下，也与实施例1的MEF与MDF的情况同样地能够得到具有增殖能力且与软骨细胞具备同样特性的软骨细胞样细胞。

[0238] 实施例5 从来自人的皮肤成纤维细胞制造软骨细胞样细胞

[0239] <方法>

[0240] 1.质粒的制备

[0241] 向来自人的皮肤成纤维细胞的基因导入使用慢病毒载体体系。分别通过LR CLONASE II PLUS反应(Invitrogen)制备了重组有人c-MYC的慢病毒载体
(pLe6-CMVp-hc-MYC)、重组有人KLF4的慢病毒载体(pLe6-CMVp-hKLF4)、重组有人OCT3/4的慢病毒载体(pLe6-CMVp-hOCT3/4)和重组有人SOX9的慢病毒载体(pLe6-CMVp-F(-)hSOX9)。

[0242] 2.细胞的制备

[0243] 来自成人的正常皮肤成纤维细胞(NHDF)从Lonza公司购入(制品编码CC-2511)。使用在含有10容量％FBS的DMEM培养基中维持的NHDF。

[0244] 3.病毒感染

[0245] 对 6×106cells 的 293FT 细胞 (Invitrogen)，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染3μg的上述各慢病毒载体和9μg的Virapower packaging mix(Invitrogen)。转染48小时后，回收转染子(transfectant)的上清，以0.45μm醋酸纤维素过滤器(Whatman)过滤。对所得到的滤液添加聚凝胺(Nacalai Tesque)，使最终浓度为4mg/ml，制备了病毒溶液。以分别等量包含Le6-CMVp-hc-MYC、pLe6-CMVp-hKLF4、pLe6-CMVp-hOCT3/4和pLe6-CMVp-F(-)hSOX9的方式混合各病毒溶液，制备了混合病毒溶液。

[0246] 在转导的1日前，在100mm培养皿中，在含有10％FBS的DMEM培养基中接种5
5×10cells的NHDF。接着，从100mm培养皿中除去培养基，添加上述混合病毒溶液，以37℃孵育16小时，转导慢病毒载体。孵育后，以胰蛋白酶处理培养皿中的细胞，接着，将细胞分至加入有新鲜的含有10％FBS的DMEM培养基的4个10cm培养皿中，静置培养。转导后静置培养10日，每隔1日以同样组成的培养基进行培养基更换。对经过这样培养的细胞进行阿辛蓝染色。

[0247] 另外，为了比较，使用重组有EGFP cDNA的慢病毒载体，以与上述同样的方法进行向NHDF的转染、转染细胞的评价。

[0248] <结果>

[0249] 在图12中表示结果。在向NHDF导入3个初始化因子(OCT3/4、c-MYC和KLF4)和SOX9时，在很多NHDF中可见细胞死亡。这暗示如果在NHDF中导入上述初始化因子，在很多细胞中诱导细胞死亡。

[0250] 通过向NHDF导入3个初始化因子(OCT3/4、c-MYC和KLF4)和SOX9，生存的细胞形成细胞集落。这些细胞集落中的几个被阿辛蓝强烈染色。另一方面，导入有EGFP的NHDF的培养皿中，细胞不死亡而进行了增殖。导入有EGFP的NHDF不能被阿辛蓝染色(参照图12的a)。另外，通过导入3个初始化因子(OCT3/4、c-MYC和KLF4)和SOX9并进行培养而得到的细胞集落中所包含的细胞形态(参照图12的b)，相比于导入有EGFP的细胞(参照图12的c)，确认近似于人原代软骨细胞(参照图12的d)。

[0251] 由以上结果强烈暗示，通过使用本发明的技术，也能够由人NHDF诱导具有增殖能力且能够形成软骨组织的软骨细胞样细胞。

[0252] 参考文献列表

[0253] ·参考文献1：N.Tsumaki，T.Kimura，Y.Matsui et al.，J.Cell Biol.134(6)，1573(1996).

[0254] ·参考文献2：A Nagy，M Gertsenstein，K Vintersten et al.，Manipulating the Mouse Embryo.，3rd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2003).[0255] ·参考文献3：K.Takahashi and S.Yamanaka，Cell 126(4)，663(2006).[0256] · 参考文献 4：A.Aszodi，E.B.Hunziker，C.Brakebusch et al.，Genes Dev.17(19)，2465(2003).

[0257] · 参考文献5：Bjorntorp，P.et al.Isolation and characterization of cells from rat adipose tissue developing into adipocytes.J.Lipid Res.19，316-324(1978).

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使用合成转录因子的核重编程方法	2020-05-12	105
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软骨细胞样细胞及其制造方法

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