技术领域
[0001] 本
发明涉及一种穿心莲内酯类化合物、其异构体、前药、
溶剂化物或药学上可接受的盐、其药物组合物、制备方法及应用。
背景技术
[0002] 穿心莲内酯(andrographolide)是穿心莲提取物中含量最高的成分之一。其具有多靶点作用机制，因此，具有广泛的药理活性，例如解热、抗炎、
镇痛、抗菌、降血糖等，随着对穿心莲内酯药理作用的不断深入研究，发现其在免疫调节、抗病毒和抗
肿瘤等方面均具有广泛的应用(戴桂馥等，中成药，2006,28(7):1032)。穿心莲内酯具体结构如下：
[0003]
[0004] 目前，有文献及
专利报道(Lin HQ,et al.Biol.Pharm.Bull.2006,29(2):220，CN101012211B，CN1666985A，US20050215628A1)，穿心莲内酯及其衍
生物可以抑制LPS诱导的TNF-α、IL1β和IL-6的表达，从而抑制
机体的炎性反应。TNF-α是一种前体
炎症细胞因子，参与许多炎症反应过程。通过抑制TNF-α可用于
治疗多种自身免疫性
疾病(类
风湿性关节炎、克罗恩病、系统性红斑狼疮、
银屑病等)、神经系统疾病(阿兹海默症、
帕金森病、
艾滋病痴呆综合症、
抑郁症)、癌症及
呼吸道病毒感染等(Ogata H,Hibi T.et al.Curr Pharm Des.2003,9(14):1107；Sack M.et al.Pharmacol Ther.2002,94(1-2):123-135；Barnes PJ.Et al.Annu Rev Pharmacol Toxicol.2002,42:81；Goldring MB.Et al.Expert Opin Biol Ther.2001Sep；1(5):817)。IL1β是由单核巨噬细胞、树突细胞和
纤维母细胞等产生的细胞因子，可刺激T细胞及B细胞的增殖和分化，参与炎症反应。抑制IL1β可用于治疗包括病毒感染在内的各种炎症反应(Taylor PC.et al.Curr Pharm Des.2003；9(14):1095；Dellinger RP et al Clin Infect Dis.2003May 15；36(10):1259)。IL-6又称为B细胞刺激因子，多种细胞能自发或在其它刺激下产生IL-6，其在外周和中枢神经系统发育、分化、再生和变性中起重要作用。
[0005] 另外，近些年发现穿心莲内酯及其衍生物在抗病毒感染方面有一定的作用，其在治疗和
预防艾滋病、
肝炎和手足口病病毒感染方面取得了一些进展。例如CN103739575A和CN103739597A公开了穿心莲内酯衍生物的抗乙肝病毒作用。CN104042621A公开了穿心莲内酯类药物-喜炎平具有预防和减缓手足口病病毒感染所造成的严重后果，但是喜炎平是穿心莲内酯的磺化产物，并非单一结构，因此采用单一结构的小分子化合物以进一步明确机理，对其药效及其毒理学研究具有重要意义。
[0006] 综上可知，尽管穿心莲内酯类化合物已取得一些研发成果，但是对于多种疾病，尤其抗炎和抗病毒领域仍然没有特别有效的穿心莲内酯类似物用于临床。经检索，未发现有将穿心莲内酯17位双键重排到二萜环内，并在14位羟基处引入酯键或醚键形成新的类似物，并用于抗炎和抗病毒领域的报道。
发明内容
[0007] 本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种新型穿心莲内酯类化合物、其制备方法、药物组合物及应用。本发明的穿心莲内酯类化合物具有良好的抗炎作用，可以有效治疗炎症疾病。本发明所指的炎症疾病包括但不限于可能由细菌，病毒等病原体引起的，由自身免疫造成的，或放射线损伤引起的多种炎症性疾病。
[0008] 本发明提供了一种穿心莲内酯类化合物(I)、其异构体、前药、
溶剂化物或药学上可接受的盐；
[0009]
[0010] 其中，
[0011] a和b分别独立地为单键或者双键，并且a和b不同时为双键或单键；
[0012] X为-OR5或-SR6；
[0013] Y和Z分别独立地选自-O-或-NH-；
[0014] R1和R2分别独立地选自氢或烷基；
[0015] R3和R4分别独立地选自氢、烷基、卤代烷基、-Si(Rc)3、-C(O)Rc、-SO3M；M为氢、钠或
钾；或者R3和R4相互连接形成5-8元杂环烷基，所述杂环烷基还可以进一步含有1～2个选自Si、S(O)0-2、或N
原子的杂原子或基团；所述杂环烷基为未取代或者进一步被1～4个选自烷基、卤素、卤代烷基、羟基烷基、烷
氧基烷基、烷氧基、
氨基、氨基烷基或氧代基的取代基取代在任意
位置；
[0016] R5为取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的杂环烷基烷基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、Ra、-C(O)Rb、-C(O)NRbRc、-C(O)ORc、-S(O)2Rb、-S(O)2NRcRd、-NRcRd、-(CH2)nORa；
[0017] R6为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的杂环烷基烷基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基、-C(O)Rb、-C(O)NRbRc、-C(O)ORc、或-(CH2)nORa；
[0018] R5或R6中，当所述取代的烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的环烷基烷基、取代的杂环烷基烷基、取代的芳基烷基或者取代的杂芳基烷基被取代时可被1～4个选自卤素、C1-4烷基、卤代C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤代C1-3烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、3-6元杂环烷基、苯基、5-6元杂芳基、-NO2、-CN、-ORc、-SRc、-OC(O)Rc、-OC(O)NRcRd、-NRcRd、-N(Rc)C(O)Rd、-N(Rc)S(O)2Rd、-N(Rc)S(O)2NRcRd、-N(Rc)C(O)NRcRd、-S(O)2NRcRd、-S(O)0-2Rc、-OP(O)(O-Rc)2、-C(O)Rc、-C(O)ORc、或-C(O)NRcRd的取代基取代在任意位置；n为1～6的整数；
[0019] Ra为甘氨酰-、L-丙氨酰-、L-亮氨酰-、L-缬氨酰-、L-异亮氨酰-、等氨基酸残基；
[0020] Rb为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基烷基、取代或未取代的杂环烷基烷基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷基；当所述取代的烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的环烷基烷基、取代的杂环烷基烷基、取代的芳基烷基或者取代的杂芳基烷基被取代时可被1～4个选自卤素、C1-4烷基、卤代C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤代C1-3烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、3-6元杂环烷基、苯基、5-6元杂芳基、-NO2、-CN、-ORc、-SRc、-OC(O)Rc、-OC(O)NRcRd、-NRcRd、-N(Rc)C(O)Rd、-N(Rc)S(O)2Rd、-N(Rc)S(O)2NRcRd、-N(Rc)C(O)NRcRd、-S(O)2NRcRd、-S(O)0-2Rc、-c c c c dOP(O)(O-R)2、-C(O)R、-C(O)OR、或-C(O)NRR的取代基取代在任意位置；
[0021] Rc和Rd分别独立地选自氢、C1-6烷基、卤代C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤代C1-3烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、3-6元杂环烷基、苯基、或5-6元杂芳基。
[0022] 或者，Rc和Rb或Rd与它们共同连接的N原子一起形成3-8元杂环烷基，所述杂环烷基还可进一步含有1～3个选自N、O、S、S(O)2的杂原子，所述3-8元杂环烷基为未取代或者进一步被1～3个选自烷基、卤素、卤代烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、烷氧基、氨基、氨基烷基或氧代基的取代基取代在任意位置。
[0023] 所述R1优选为氢或C1-6烷基；所述R1更优选为H。
[0024] 所述R2优选为氢或C1-6烷基；所述R2更优选为甲基。
[0025] 所述R3优选为氢、C1-6烷基、卤代C1-3烷基、-Si(Rc)3、-C(O)Rc、-SO3M；M为氢、钠或钾；所述R3更优选为氢。
[0026] 所述R4优选为氢、C1-6烷基、卤代C1-3烷基、-Si(Rc)3、-C(O)Rc、-SO3M；M为氢、钠或钾；所述R4更优选为氢。
[0027] 或者所述R3和R4相互连接形成5-8元杂环烷基，所述杂环烷基还可以进一步含有1-2个选自Si、S(O)0-2、或N原子的杂原子；所述杂环烷基为未取代或者进一步被1-3个选自C1-4烷基、卤素、卤代C1-3烷基、羟基C1-3烷基、C1-3烷氧基C1-3烷基、C1-3烷氧基、氨基、氨基C1-3烷基或氧代基的取代基中的一个或多个取代在任意位置。
[0028] 所述R5优选为取代或未取代的C1-6烷基、取代或未取代的C3-8环烷基、取代或未取代的3-8元杂环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的5-6元杂芳基、取代或未取代的C3-8环烷基C1-3烷基、取代或未取代的3-8元杂环烷基C1-3烷基、取代或未取代的苯基C1-3烷基、取代或未取代的5-6元杂芳基C1-3烷基、Ra、-C(O)Rb、-C(O)NRbRc、-C(O)ORc、-S(O)2Rb、-Sc d c d a(O)2NRR、-NRR、或-(CH2)nOR。
[0029] 所述R6优选为取代或未取代的C1-6烷基、取代或未取代的C3-8环烷基、取代或未取代的3-8元杂环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的5-6元杂芳基、取代或未取代的C3-8环烷基C1-3烷基、取代或未取代的3-8元杂环烷基C1-3烷基、取代或未取代的苯基C1-3烷基、取代或未取代的5-6元杂芳基C1-3烷基、-C(O)Rb、-C(O)NRbRc、-C(O)ORc、或-(CH2)nORa。
[0030] 所述Rb优选为取代或未取代的C1-6烷基、取代或未取代的C3-8环烷基、取代或未取代的3-8元杂环烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的5-6元杂芳基、取代或未取代的C3-8环烷基C1-3烷基、取代或未取代的3-8元杂环烷基C1-3烷基、取代或未取代的苯基C1-3烷基、或取代或未取代的5-6元杂芳基C1-3烷基。
[0031] 如式(I)所示的穿心莲内酯类化合物、其异构体、前药、
水合物、溶剂化物或药学上可接受的盐；
[0032] 在其中一种优选实施方案中，当a为双键、b为单键时；
[0033] 在其中一种优选实施方案中，当a为单键、b为双键时。
[0034] 在本发明优选的一个实施方案中，所述穿心莲内酯类化合物(I)、其异构体、前药、溶剂化物或药学上可接受的盐，其通式更优选为如下结构：
[0035]
[0036] 其中，*表示为R构型或S构型；
[0037] R2、R3、R4和R5的定义均同前所述；
[0038] 以下各种情况均包括在结构式(IA)的定义中：
[0039] 在其中一种优选实施方案中，R2为CH3；
[0040] 在其中一种优选实施方案中，R3为H，R4为H。
[0041] 在本发明优选的一个实施方案中，所述穿心莲内酯类化合物(I)、其异构体、前药、溶剂化物或药学上可接受的盐，其通式更优选为如下结构：
[0042]
[0043] 其中，*表示为R构型或S构型；
[0044] A环为苯环或5-6元杂芳环；
[0045] R7为卤素、C1-4烷基、卤代C1-3烷基、C1-3烷氧基、卤代C1-3烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、c c cC3-6环烷基、3-6元杂环烷基、苯基、5-6元杂芳基、-NO2、-CN、-OR 、-SR 、-OC(O)R 、-OC(O)NRcRd、-NRcRd、-N(Rc)C(O)Rd、-N(Rc)S(O)2Rd、-N(Rc)S(O)2NRcRd、-N(Rc)C(O)NRcRd、-S(O)
2NRcRd、-S(O)0-2Rc、-OP(O)(O-Rc)2、-C(O)Rc、-C(O)ORc、或-C(O)NRcRd；
[0046] t为1、2或3；
[0047] R1、R2、R4、Rc和Rd的定义如前所述。
[0048] 以下各种情况均包括在结构式(IB)的定义中：
[0049] 在其中一种优选实施方案中，R2为CH3；
[0050] 在其中一种优选实施方案中，R3为H，R4为H。
[0051] 在本发明优选的一个实施方案中，所述穿心莲内酯类化合物(I)、其异构体、前药、溶剂化物或药学上可接受的盐，其通式更优选为如下结构：
[0052]
[0053] 其中，*表示为R构型或S构型；
[0054] R2、R3、R4、Rb和Rc的定义均同前所述；
[0055] 以下各种情况均包括在结构式(IC)或(ID)的定义中：
[0056] 在其中一种优选实施方案中，R2为CH3；
[0057] 在其中一种优选实施方案中，R3为H，R4为H。
[0058] 所述穿心莲内酯类化合物(I)、其异构体、前药、溶剂化物或药学上可接受的盐最佳地为如下任一结构：
[0059]
[0060]
[0061] 本发明还提供了所述穿心莲内酯类化合物(I)、其异构体、前药、溶剂化物或药学上可接受的盐的制备方法，其为如下任一一种方法：
[0062] 方法1：
[0063]
[0064]
[0065] 其中，R’为苯基，R”为H；或者R’和R”均为甲基；*、Rb或Rc的定义如前所述。
[0066] 方法1中包括如下步骤：步骤1，溶剂中，将化合物1.2和取代的氨基甲酰氯或酰氯在
碱性条件下，在非质子性溶剂中反应得到化合物I-1或I-2；步骤2，溶剂中，酸性条件下，I-1或I-2通过脱双羟基保护基得到化合物Ia或Ib。
[0067] 方法1中，所述的反应的条件和步骤可为本领域常规的条件和步骤，本发明特别优选以下反应条件：步骤1，所述的碱优选为三乙胺，所述的非质子性溶剂优选二氯甲烷，所述非质子性溶剂的用量优选1～50mL/mmol化合物1.2，
温度优选0℃-室温，反应时间优选0-24小时，化合物1.2与N(Rb)(Rc)COCl或RbCOCl的摩尔比优选1:1～1:3，所述1.2与三乙胺的摩尔比优选1:1～1:10，为加快反应速度，还可在反应体系中加入0.1～1当量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)；步骤2，所述脱保护基反应为本领域常规脱保护条件，例如，可以在酸性条件下脱除，R’和R”均为甲基时，优选
醋酸水溶液；所述醋酸水溶液优选体积百分数为75～85％的醋酸水溶液；所述醋酸水溶液的用量优选5～20mL/mmol化合物I-2或I-3，所述反应温度优选20～50℃，反应时间优选0.2～2小时。R’为苯基，R”为H时，优选在
乙醇溶液中，在一水合
对甲苯磺酸存在下进行脱保护反应，其中，所述乙醇的用量优选为1～50mL/mmol化合物I-1或I-2；化合物I-1或I-2与一水合对甲苯磺酸的摩尔比优选为1:1～1:3，更优选为1:2；所述反应温度优选20～70℃，反应时间优选1～3天。
[0068] 方法2：
[0069]
[0070] 其中，R’为苯基，R”为H；或者R’和R”均为甲基；*、A环、R7和t的定义如前所述。
[0071] 方法2中包括如下步骤：步骤1，溶剂中，将化合物1.2和 通过Mitsunobu反应得到化合物I-3；步骤2，溶剂中，酸性条件下，将I-3脱双羟基保护基得到化合物Ic。
[0072] 方法2中，所述的反应的条件和步骤可为本领域常规的条件和步骤，本发明特别优选以下反应条件：步骤1，所述的Mitsunobu反应优选三苯基膦和偶氮二
甲酸二异丙酯(DIAD)组合，所述化合物1.2和 摩尔比优选1:0.9～1:2；所述三苯基膦、DIAD和摩尔比优选1:1:1～1:2:2；反应温度优选0℃～室温；步骤2，所述脱保护基反应为本领域常规脱保护条件，例如，可以在酸性条件下脱除，R’和R”均为甲基时，优选醋酸水溶液；所述醋酸水溶液优选体积百分数为75～85％的醋酸水溶液；所述醋酸水溶液的用量优选5～20mL/mmol化合物I-2或I-3，所述反应温度优选20～50℃，反应时间优选0.2～2小时。
R’为苯基，R”为H时，优选在乙醇溶液中，在一水合对甲苯磺酸存在下进行脱保护反应，其中，所述乙醇的用量优选为1～50mL/mmol化合物I-1或I-2；化合物I-1或I-2与一水合对甲苯磺酸的摩尔比优选为1:1～1:3，更优选为1:2；所述反应温度优选20～70℃，反应时间优选1～3天。
[0073] 在方法一或二中，所述化合物1.2合成方法如下：
[0074]
[0075] 其中，R’为苯基，R”为H；或者R’和R”均为甲基；
[0076] 所述化合物1.2合成方法包括如下步骤：步骤1，溶剂中，将穿心莲内酯在溴化氢的作用下17位双键发生重排反应得到化合物1.1；步骤2，将化合物1.1的3位和19位羟基保护，通常优选用丙
酮和2,2-二甲氧基丙烷体系，或苯甲
醛二甲缩醛和对甲苯磺酸吡啶
盐酸盐体系。
[0077] 化合物1.2合成方法中，所述的反应的条件和步骤可为本领域常规的条件和步骤，本发明特别优选以下反应条件：步骤1，所述溶剂优选乙醇，所述溶剂的用量优选1～50mL/mmol穿心莲内酯，所述溴化氢优选
质量百分比，46～48％的溴化氢水溶液，所述的溴化氢水溶液和溶剂的体积比优选0.5:1～1:1，所述反应温度优选0℃～室温，反应时间优选1～24小时；步骤2，所述羟基保护反应为本领域常规脱保护条件。优选用丙酮和2,2-二甲氧基丙烷体系，所述丙酮的用量优选0.5～5mL/mmol化合物1.1，所述2,2-二甲氧基丙烷的用量优选1～10mL/mmol化合物1.1，温度优选30～60℃，反应时间优选2～10小时；优选用
苯甲醛二甲缩醛和对甲苯磺酸吡啶盐酸盐体系，其中溶剂优选为二氯甲烷；所述苯甲醛二甲缩醛和化合物1.1的摩尔比优选为1:1～1:3，更优选为1:2；所述对甲苯磺酸吡啶盐酸盐的用量为催化量，和化合物1.1的摩尔比优选为1:0.02～1:0.1，温度优选室温，反应时间优选10～24小时；
[0078] 所述穿心莲内酯类化合物(I)的药学上可接受的盐可通过一般的化学方法合成。
[0079] 一般情况下，盐的制备可以通过游离碱或酸与等化学当量或者过量酸(
无机酸或
有机酸)或碱(无机碱或有机碱)在合适的溶剂或溶剂组合物中反应制得。
[0080] 本发明还提供了一种药物组合物，其包括
治疗有效量的活性组分以及药学上可接受的辅料；所述活性组分包括穿心莲内酯类化合物(I)、其异构体、前药、溶剂化物和药学上可接受的盐中的一种或多种。
[0081] 所述药物组合物中，所述活性组分还可包括抑制炎症、或病毒感染等的其它治疗剂。
[0082] 所述药物组合物中，所述药学上可接受的辅料可包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
[0083] 根据治疗目的，可将药物组合物制成各种类型的
给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等，优选液体、悬浮液、乳液、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等。
[0084] 为了使片剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋形剂。例如，载体，如乳糖、白糖、
氯化钠、
葡萄糖、尿素、
淀粉、
碳酸
钙、
高岭土、结晶
纤维素和
硅酸等；
粘合剂，如水、乙醇、丙醇、普通糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液，
羧甲基纤维素、紫胶、甲基纤维素和
磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉和海带粉，
碳酸氢钠、碳酸钙、聚乙烯脱水山梨醇的
脂肪酸酯、十二烷基
硫酸钠、
硬脂酸单甘酯、淀粉和乳糖等；崩解
抑制剂，如白糖、甘油三硬脂酸酯、
椰子油和氢化油；
吸附促进剂，如季胺碱和十二烷基硫酸钠等；润湿剂，如甘油、淀粉等；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、
膨润土和胶体
硅酸等；以及
润滑剂，如纯净的滑石，硬脂酸盐、
硼酸粉和聚乙二醇等。还可以根据需要选用通常的涂渍材料制成糖衣片剂、涂明胶膜片剂、肠衣片剂、涂膜片剂、双层膜片剂及多层片剂。
[0085] 为了使丸剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋形剂，例如，载体，如乳糖，淀粉，椰子油，硬化
植物油，高岭土和滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯树胶粉，黄蓍胶粉，明胶和乙醇等；崩解剂，如琼脂和海带粉等。
[0086] 为了使栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋性剂，例如，聚乙二醇，椰子油，高级醇，高级醇的酯，明胶和半合成的甘油酯等。
[0087] 为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液或悬浮液消毒后(最好加入适量的氯化钠，葡萄糖或甘油等)，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可使用本领域内任何常用的载体。例如，水，乙醇，丙二醇，乙氧基化的异硬脂醇，聚氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可加入通常的溶解剂、缓冲剂和止痛剂等。
[0088] 本发明中，所述的组合物在药物组合物中的含量无特殊限制，其中所述穿心莲内酯类化合物(I)、其异构体、前药、溶剂化物、或药学上可接受的盐可在很宽的范围内进行选择，其安全、有效剂量根据治疗对象的年龄、体重、病情、病程、给药途径等具体情况来确定，通常可为质量百分比的5～95％，较佳的为质量百分比30～80％。
[0089] 本发明中，所述药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据病人年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂或胶囊口服给药；针剂可以单独给药，或者和注射用输送液(如葡萄糖溶液及氨基
酸溶液)混合进行静脉注射；栓剂为给药到直肠。
[0090] 本发明还提供了所述穿心莲内酯类化合物(I)、其异构体、前药、溶剂化物、或药学上可接受的盐，或所述药物组合物，在制备治疗炎症，包括由细菌、病毒等病原体感染造成的炎症，自身免疫反应造成的炎症疾病，以及放射线损伤引起的炎症等的药物中的用途。其中所述病毒包括：手足口病的各种病毒(例如，导致手足口病的最常见的肠病毒EV71、柯萨奇病毒CA16等)、各种肝炎病毒(例如，甲肝、乙肝、丙肝病毒)、艾滋病病毒等。
[0091] 所述的自身免疫反应造成的炎症疾病，包括：类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、混合性结缔组织病(MCTD)、系统硬皮病(包括：CREST综合症)、皮肌炎、结节性脉管炎、肾病(包括：
肺出血肾炎综合症、急性肾小球肾炎、原发性膜增殖性肾小球肾炎等)、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性胆管炎、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、炎性肠病(IBD)(包括：克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC))、慢性阻塞性肺病等。
[0092] 所述
放射性炎症疾病，包括：放射性食管炎、
放射性肠炎、放射性甲状腺炎、放射性骨炎、放射性
口腔炎、放射性胸膜炎、放射性皮炎、放射性肺炎、放射性
阴道炎、放射性膀胱炎等。
[0093] 本发明还提供了所述穿心莲内酯类化合物(I)、其异构体、前药、溶剂化物、或药学上可接受的盐和一种或多种其它种类治疗剂联合用于治疗炎症、病毒感染、
自身免疫性疾病、和/或放射性性损伤。
[0094] 本发明还提供了所述穿心莲内酯类化合物(I)、其异构体、前药、溶剂化物、或药学上可接受的盐和一种或多种其它种类治疗剂联合用于制备治疗炎症、病毒感染、自身免疫性疾病、或放射线损伤的药物中的应用。
[0095] 所述其它种类的治疗剂可以和所述的穿心莲内酯类化合物(I)、其异构体、前药、溶剂化物、或药学上可接受的盐，或所述药物组合物，做成单一给药的治疗剂型，或者分别先后给药的治疗剂型。
[0096] 本发明中，除非另有说明，取代基名称前未冠有“取代或未取代的”定义的均指未取代的情况，例如：“烷基”是指未取代的烷基，“环烷基”是指未取代的环烷基。
[0097] 除非另有说明，在本发明
说明书和
权利要求书中出现的以下术语具有下述含义：
[0098] 术语“烷基”是指包含1-20个碳原子的饱和直链或支链
烃基，优选1-10个碳原子，更优选1-8，1-6，1-4，1-3个碳原子，烷基的代表性例子包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、4,4-二甲基戊基、2,2,4-三甲基戊基、十一烷基、十二烷基，及它们的各种异构体等。当“烷基”作为其它基团的连接基团时，如-(CH2)m-，它可以是直链或支链，例子包括但不限于-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-。
[0099] 术语“环烷基”是指包含3-20个碳原子的饱和或部分不饱和(包含1或2个双键)的单环或多环基团。优选3-12元环烷基。“单环环烷基”优选3-10元单环烷基，更优选3-8元单环烷基，例如：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、环十二烷基、环己烯基。“多环环烷基”包括“桥环基”、“稠合环烷基”和“螺环烷基”，“桥环基”的代表性例子包括但不限于：
冰片基、双环[2.2.1]庚烯基、双环[3.1.1]庚烷基、双环[2.2.1]庚烷基、双环[2.2.2]辛烷基、双环[3.2.2]壬烷基、双环[3.3.1]壬烷基、双环[4.2.1]壬烷基和金刚烷基等。“稠合环烷基”包含稠合到苯基、环烷基、或杂芳基上的环烷基环，稠合环烷基包括但不限于：苯并环丁烯、2,3-二氢-1-H-茚、2,3-环戊烯并吡啶、5,6-二氢-4H-环戊基[B]噻吩、十氢
萘等。“螺环烷基”的代表性例子包括但不限于：螺[2,4]庚烷基、螺[4,5]癸烷基等。单环环烷基或多环环烷基可以通过环上任意的碳原子链接到母体分子上。
[0100] 术语“杂环烷基”指由碳原子以及选自氮、氧或硫等杂原子组成的饱和或部分不饱和(包含1或2个双键)的非芳香环状基团，此环状基团可为单环或多环基团，在本发明中，杂环烷基中杂原子个数优选1、2、3或4，杂环烷基中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化。氮原子可任选进一步被其他基团取代而形成叔胺或季铵盐。“单环杂环烷基”优选3-10元单环杂环烷基，更优选3-8元单环杂环烷基。例如：氮丙啶基、四氢呋喃-2-基、吗啉-4-基、硫代吗啉-4-基、硫代吗啉-S-氧化物-4-基、哌啶-1-基、N-烷基哌啶-4-基、吡咯烷-1-基、N-烷基吡咯烷-2-基、哌嗪-1-基、4-烷基哌嗪-1-基等。“多环杂环烷基”包括“稠合杂环烷基”、“螺杂环基”和“桥杂环烷基”。“稠合杂环烷基”包含稠合到苯基、环烷基、杂环烷基或杂芳基的单环杂环烷基环，稠合杂环烷基包括但不限于：2,3-二氢苯并呋喃基、1,3-二氢异苯并呋喃基、二氢吲哚基、2,3-二氢苯并[b]噻吩基、二氢苯并哌喃基、1,2,3,4-四氢喹啉基等。单环杂环烷基和多环杂环烷基可以通过环上任意的环原子链接到母体分子上。上述环原子特指组成环骨架的碳原子和/或氮原子。
[0101] 术语“环烷基烷基”是指环烷基与母核结构之间通过烷基连接。由此，“环烷基烷基”包含上述烷基和环烷基的定义。
[0102] 术语“杂环烷基烷基”是指杂环烷基与母核结构之间通过烷基连接。由此，“杂环烷基烷基”包含上述烷基和杂环烷基的定义。
[0103] 术语“烷氧基”指通过氧桥连接的具有所述碳原子数目的环状或者非环状烷基，包含烷基氧基、环烷基氧基和杂环烷基氧基。由此，“烷氧基”包含上述烷基、杂环烷基和环烷基的定义。
[0104] 术语“烷氧基烷基”是指烷基上任意一个氢原子被烷氧基所取代。由此，“烷氧基烷基”包含上述烷基和烷氧基的定义。
[0105] 术语“羟基烷基”是指烷基上任意一个氢原子被羟基所取代，包括但不限于：-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2CH2C(CH3)2OH。
[0106] 术语“烯基”指含有至少1个碳碳双键的直链、支链或者环状非芳香烃基。其中可以存在1-3个碳碳双键，优选存在1个碳碳双键。术语“C2-4烯基”是指具有2-4个碳原子的烯基，术语“C2-6烯基”是指具有2-6个碳原子的烯基，包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、2-甲基丁烯基和环己烯基。所述的烯基可以被取代。
[0107] 术语“炔基”是指含有至少1个碳碳三键的直链、支链或者环状烃基。其中可以存在1-3个碳碳三键，优选存在1个碳碳三键。术语“C2-6炔基”是指具有2-6个碳原子的炔基，包括乙炔基、丙炔基、丁炔基和3-甲基丁炔基。
[0108] 术语“芳基”是指任何稳定的6-10元单环或双环芳香族基团，例如：苯基、萘基、四氢萘基、2,3-二氢化茚基或联苯基等。
[0109] 术语“杂芳基”是指至少1个环上的碳原子被选自氮、氧或硫的杂原子置换所形成的芳香环基团，其可为5-7元单环结构或7-12元双环结构，优选5-6元杂芳基。在本发明中，杂原子个数优选1、2或3，包括:吡啶基、嘧啶基、哒嗪-3(2H)-酮基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、恶唑基、异恶唑基、1,2,5-恶二唑基、1,2,4-恶二唑基、1,2,4-三氮唑基、1,2,3-三氮唑基、四氮唑基、吲唑基、异吲唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并[d][1,3]二氧戊环基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基等。
[0110] 术语“芳基烷基”是指芳基与母核结构之间通过烷基连接。由此，“芳基烷基”包含上述烷基和芳基的定义。
[0111] 术语“杂芳基烷基”是指杂环烷基与母核结构之间通过烷基连接。由此，“杂芳基烷基”包含上述烷基和杂芳基的定义。
[0112] 术语“卤素”表示氟、氯、溴或碘。
[0113] 术语“卤代烷基”是指被卤素任意取代的烷基。由此，“卤代烷基”包含以上卤素和烷基的定义。
[0114] 术语“卤代烷氧基”是指被卤素任意取代的烷氧基。由此，“卤代烷氧基”包含以上卤素和烷氧基的定义。
[0115] 术语“氨基”是指-NH2，术语“烷氨基”是指氨基上至少一个氢原子被烷基所取代，包括但不限于：-NHCH2、-NHCH2CH3。术语“氨基烷基”是指烷基上任意一个氢原子被氨基所取代，包括但不限于：-CH2NH2、-CH2CH2NH2。由此，“氨基烷基”和“烷氨基”包含上述烷基和氨基的定义。
[0116] 术语“氨基酸残基”是指含有氨基的
羧酸片段通过羧基与母体分子形成酰基相互连接，所述氨基酸残基包括天然或非天然存在的氨基酸残基。优选天然存在的氨基酸残基，所述氨基酸包括但不限于：丙氨酰-、缬氨酰-、L-丙氨酰-、L-亮氨酰-、L-异亮氨酰-、脯氨酰-、苯丙氨酰-、色氨酰-、蛋氨酰-、甘氨酰-、丝氨酰-、苏氨酰-、半胱氨酰-、酪氨酰-、天冬酰酰--、谷氨酰酰-、赖氨酰-、精氨酰-、组氨酰-、天冬氨酰-、或谷氨酰-。
[0117] 符号“＝”表示双键；
[0118] 本发明所述“室温”是指15-30℃。
[0119] 所述的“前药”是指化合物在体内代谢后转换成原始活性化合物。代表性地讲，前药为非活性物质，或者比活性母体化合物活性小，但可以提供方便的操作、给药或者改善代谢特性。
[0120] 本发明所述的“溶剂化物”是指包含化学计量或非化学计量溶剂的溶剂添加形式。一些化合物在结晶固体状态下倾向于捕捉固定摩尔比例的溶剂分子，因此形成了溶剂化物。如果溶剂是水，形成的溶剂化物即为“水合物”，如果溶剂是乙醇时，形成的溶剂化物即为乙醇化物。水合物是由一个或一个以上水分子与该物质结合形成水合物，其中，水分子的状态为H2O，这样的结合能够形成包含一个或多个水分子的水合物。
[0121] 本发明所述的“药学上可接受的盐”在Berge，et al.，“Pharmaceutically acceptable salts”，J.Pharm.Sci.,66,1-19(1977)中有讨论，并对药物化学家来说是显而易见，所述的盐是基本上无毒性的，并能提供所需的药代动
力学性质、适口性、吸收、分布、代谢或排泄等。本发明所述化合物可以具有酸性基团、碱性基团或两性基团，典型的药学上可接受的盐包括通过本发明化合物和酸反应制备得到的盐，例如：盐酸盐、
氢溴酸盐、
硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、
磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、
硝酸盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、
甲酸盐、
丙烯酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、
草酸盐、
丙二酸盐、
琥珀酸盐、辛二酸盐、
苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、
马来酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、(D，L)-
酒石酸，
柠檬酸，马来酸，(D，L)-苹果酸，富马酸，丁二酸、琥珀酸盐、乳酸盐、三氟甲磺酸盐、萘-1-磺酸盐、
扁桃酸盐、丙
酮酸盐、硬脂酸盐、
抗坏血酸盐、水杨酸盐。当本发明化合物含有酸性基团时，其药学上可接受的盐还可以包括：碱金属盐，例如钠或
钾盐；碱土金属盐，例如钙或镁盐；有机碱盐，例如和氨、烷基氨类、羟基烷基氨类、氨基酸(赖氨酸、精氨酸)、N-甲基葡糖胺等形成的盐。
[0122] 本发明所述“异构体”是指本发明的式(I)化合物可以有不对称中心和外消旋体、外消旋混合物和单个非对映异构体，所有这些异构体，包括立体异构体、几何异构体均包含在本发明中。其中，本发明所述“异构体”优选为“立体异构体”。在本发明中，式(I)化合物或其盐以立体异构的形式(例如，其含有一个或多个不对称碳原子)存在时，单独的立体异构体(对映异构体和非对映异构体)以及它们的混合物包括在本发明的范围内。本发明还包括式(I)表示的化合物或盐的单独异构体，以及与其中一个或多个
手性中心反转的异构体的混合物。本发明的范围包括：立体异构体的混合物，以及纯化的对映异构体或对映异构体/非对映异构体富集的混合物。本发明包括所有对映异构体及非对应异构体所有可能的不同组合的立体异构体的混合物。本发明包括上文定义的所有具体基团的立体异构体的全部组合和子集。本发明还包括式(I)化合物或其盐的几何异构体，所述几何异构体包括顺反异构体。
[0123] 在不违背本领域常识的
基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0124] 本发明所用
试剂和原料均市售可得。
附图说明
[0125] 图1：穿心莲内酯及本发明化合物抑制LPS诱导的BV2细胞培液中IL6和TNFα水平，本发明化合物在10μM浓度下均能一定程度减少IL6和TNFα的产生，效果优于穿心莲内酯。
具体实施方式
[0126] 下面通过
实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0127] 本发明所有化合物的结构可通过
核磁共振(1H NMR)和/或质谱检测(MS)鉴定。
[0128] 1H NMR化学位移(δ)以PPM记录(10-6)。NMR通过Bruker AVANCE-400
光谱仪进行。合适的溶剂是氘代氯仿(CDCl3)，氘代甲醇(CD3OD)，氘代二甲亚砜(DMSO-d6)，四甲基硅烷作为内标(TMS)。
[0129] 低
分辨率质谱(MS)由Agilent 1200HPLC/6120质谱仪测定，使用XBridge C18，4.6×50mm，3.5μm，梯度洗脱条件一：80-5％溶剂A1和20-95％溶剂B1(1.8分钟)，然后95％溶剂B1和5％溶剂A1(3分钟以上)，百分数为某一溶剂占总溶剂体积的体积百分数。溶剂A1：0.01％三氟乙酸(TFA)的水溶液；溶剂B1：0.01％三氟乙酸的乙腈溶液；百分数为溶质占溶液的体积百分数。梯度洗脱条件二：80-5％溶剂A2和20-95％溶剂B2(1.5分钟)，然后95％溶剂B2和5％溶剂A2(2分钟以上)，百分数为某一溶剂占总溶剂体积的体积百分数。溶剂A2：
10mM的碳酸氢铵的水溶液；溶剂B2：乙腈。
[0130] 本发明化合物的纯化可以使用常规的硅胶板、硅胶柱层析或使用高效液相色谱(prep-HPLC)进行分离纯化。
[0131] 高效液相色谱仪(prep-HPLC)使用岛津LC-20制备液相色谱，色谱柱为：waters xbridge Pre C18，10um，19mm*250mm。流动相A：0.05％三氟乙酸水溶液(百分数为体积百分数)，流动相B：乙腈；检测
波长：214nm&254nm；流速：15.0mL/分钟。
[0132] 薄层硅胶板(TLC)是烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板。硅胶柱层析一般使用烟台黄海200-300目硅胶作为载体。
[0133] 实施例1：化合物1-1的合成
[0134]
[0135] 步骤1：将穿心莲内酯(40g，0.11mol)和乙醇(100mL)加入到三口瓶(500mL)中，搅拌至溶解澄清状态，降温至0-10℃，加入溴化氢(70mL，w/w：48％)，保持该温度条件下，反应24小时，停止反应，加入氢氧化钠水溶液(6.0M)调节pH值至6-7之间，加入乙酸乙酯(350mL)，搅拌12小时，析出大量白色固体，过滤，
滤饼用乙酸乙酯(100mL)重结晶，过滤，滤饼干燥后得到化合物1.1(35g，产率：88％)为白色固体。
[0136] 步骤2：将化合物1.1(35g，0.10mol)、丙酮(70mL)和2,2-二甲氧基丙烷(175mL)加入到三口瓶(500mL)中，加热升温至40-50℃,保持该温度下,搅拌5-6小时,TLC监控(正己烷/乙酸乙酯＝1/1)，直至原料消失，反应结束后，反应液转移至单口瓶(500mL)中，浓缩至干；向残留物中加入乙酸乙酯(175mL)，加热至50～60℃溶解，保温条件下，滴加正己烷(175mL)，滴加完毕后，降温至20～30℃，析出大量白色固体，过滤，滤饼干燥后得到化合物1.2(20g，产率：51％)为白色固体粉末。
[0137] 步骤3：将化合物1.2(390mg，1.00mmol)，三乙胺(303mg，3.00mmol)和DMAP(122mg，1.00mmol)溶于二氯甲烷(4mL)中，反应体系室温搅拌0.5小时后，加入N-乙基-N-甲基甲酰氯(242mg，2.00mmol)，反应体系室温搅拌3小时，反应液浓缩得粗品化合物1.3，直接用于下一步。
[0138] 步骤4：化合物1.3混于醋酸(4mL)和水(1mL)的混合溶剂中，反应体系室温搅拌20分钟，反应液浓缩，用prep-HPLC纯化得化合物1-1(35mg，两步产率：8％)为白色固体。
[0139] 1H NMR(400MHz,CD3OD):δ6.81(td,J＝6.8,1.6Hz,1H),5.97(d,J＝5.6Hz,1H),4.80-4.86(m,2H,overlapped with water signal),4.58(dd,J＝11.0,6.0Hz,1H),4.31(d,J＝11.2Hz,1H),4.11(d,J＝11.2Hz,1H),3.33-3.42(m,2H),3.02-3.19(m,2H),2.91(d,J＝8.6Hz,3H),1.98-2.16(m,2H),1.68-1.88(m,4H),1.58(s,3H),1.43-1.53(m,1H),1.22-
1.32(m,2H),1.20(s,3H),1.08-1.16(m,3H),0.98(s,3H)。
[0140] m/z:[M+NH4]+453.1
[0141] 实施例2：化合物1-2的合成
[0142] 利用实施例1化合物1-1的合成方法，将步骤1中的N-乙基-N-甲基甲酰氯替换为4-吗啉甲酰氯得到化合物1-2:
[0143]
[0144] 1H NMR(400MHz,CD3OD):δ6.82(td,J＝6.8,1.6Hz,1H),6.00(d,J＝5.8Hz,1H),4.58(dd,J＝11.2,5.8Hz,1H),4.34(dd,J＝11.1,1.8Hz,1H),4.11(d,J＝11.2Hz,1H),
3.60-3.70(m,4H),3.35-3.50(m,6H),3.00-3.19(m,2H),2.05-2.11(m,2H),1.74-1.83(m,
4H),1.57(s,3H),1.30-1.53(m,3H),1.21(s,3H),0.97(s,3H)。
[0145] m/z:[M-H]-462.2
[0146] 实施例3：化合物2-1的合成
[0147]
[0148] 步骤1：将化合物1.2(390mg，1.00mmol)，三苯基膦(393mg，1.50mmol)和对甲酸叔丁酯
苯酚(291mg，1.50mmol)溶于干燥的四氢呋喃(4mL)中，冷却至0℃滴加DIAD(303m g,1.50mmol)，反应体系室温搅拌过夜，反应液浓缩，残留物用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)得化合物2.1(410mg，产率：72％)为淡黄色固体。
[0149] 步骤2：化合物2.1(200mg，0.353mmol)混于醋酸(2mL)和水(0.5mL)的混合溶剂中，反应体系室温搅拌20分钟，反应液浓缩，用prep-HPLC纯化得化合物2-1(15mg，产率：6％)为白色固体。
[0150] 1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.96(d,J＝8.8Hz,2H),7.02(d,J＝8.8Hz,2H),6.88(td,J＝6.4,1.2Hz,1H),5.85(d,J＝5.2Hz,1H),4.71(dd,J＝10.8,5.6Hz,1H),4.38(dd,J＝10.8,1.3Hz,1H),4.08(d,J＝11.2Hz,1H),3.32-3.40(m,2H),2.94-3.12(m,2H),1.98-2.10(m,2H),1.72-1.83(m,4H),1.59(s,9H),1.56(s,3H),1.38-1.50(m,1H),1.12-1.26(m,5H),
0.89(s,3H)。
[0151] m/z:[M+NH4]+543.9
[0152] 实施例4：化合物2-2的合成
[0153] 利用实施例3化合物2-1的合成方法，将步骤1中的对甲酸叔丁酯苯酚替换为对氰基苯酚得到化合物2-2:
[0154]
[0155] 1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.74(d,J＝6.8Hz,2H),7.12(d,J＝6.8Hz,2H),6.90(t,J＝6.8Hz,1H),5.87-5.91(m,1H),4.68-4.75(m,1H),4.37(d,J＝10.8Hz,1H),4.09(d,J＝10.4Hz,1H),3.48-3.32(m,2H),2.95-3.14(m,2H),2.04(s,2H),1.72-1.88(m,4H),1.56(s,
3H),1.40-1.52(m,1H),1.15-1.25(m,5H),0.90(s,3H)。
[0156] m/z:[M+NH4]+468.9
[0157] 实施例5：化合物3.2的合成
[0158]
[0159] 步骤1：向4-羟基苯腈(2.0g，0.02mol)的N,N-二甲基甲酰胺(50mL)溶液中依次加入
氯化铵(9.0g，0.16mol)和叠氮化钠(2.2g，0.03mol)，将反应体系在120℃下搅拌过夜。将反应体系冷却至室温，然后倾入冰水中，用盐酸(1M)调节pH到2.5，得到的混合物用乙酸乙酯(50mL×2)萃取，合并有机相，分别用水和饱和食盐水洗涤，分离有机相，用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩得化合物3.1(2.3g，产率：72％)为米黄色固体。
[0160] 步骤2：向化合物3.1(2.0g，12.3mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中分别加入三乙胺(2.5g，24.7mmol)和Boc2O(3.0g，13.7mmol)，将反应体系在室温下搅拌12小时。然后用水(10mL×2)洗涤反应体系，分离有机相，用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，残留物用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)纯化得化合物3.2(1.6g，产率：50％)为米黄色固体。
[0161] 实施例6：化合物2-3的合成
[0162]
[0163] 步骤1：将化合物1.1(8.0g，22.8mmol)，苯甲醛二甲缩醛(6.95g，45.6mmol)和对甲苯磺酸吡啶盐酸盐(PPTS)(0.29g，1.4mmol)溶解在二氯甲烷(80mL)中，反应体系在室温下搅拌18小时。然后将反应液用水洗涤，分离有机相，并用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩。残留物用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)纯化得到化合物3.3(5.1g，产率：51％)为白色固体。
[0164] 步骤2：将化合物3.3(200mg，0.46mmol)，三苯基膦(181mg，0.69mmol)和化合物3.2(180mg，0.69mmol)溶于干燥的四氢呋喃(5mL)中，冷却至0℃，然后向上述混合物中滴加DIAD(139.5mg，0.69mmol)，反应体系室温搅拌过夜，然后将反应液浓缩，残留物用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)纯化得化合物3.4(124mg，产率：36％)为淡黄色油状物。
[0165] m/z:[M+H2O]+699.8
[0166] 步骤3：将化合物3.4(20mg，0.029mmol)和一水合对甲苯磺酸(11mg，0.06mmol)溶解在乙醇中，反应体系70℃搅拌3天，然后将反应液浓缩，残留物用prep-HPLC纯化得化合物2-3(0.8mg，产率：6％)为白色固体。
[0167] m/z:[M+H2O]+512.4
[0168] 生物测试实施例：
[0169] 实施例1：LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症模型中的抗炎活性
[0170] 一、细胞处理
[0171] 用于基因表达检测及ELISA：提前～16h铺细胞，24孔板，20万/孔；实验组：100ng/mlLPS+DMSO或相应化合物处理细胞；对照组：与实验组相同量的DMSO处理细胞；培液体积：400μl/孔；
[0172] 二、RNA抽提和RT-PCR
[0173] 1.化合物处理细胞6h后，吸去旧培液，加trizol裂解细胞，500μl/孔，吹匀，转移至EP管；
[0174] 2.加入100μl CHCl3，上下颠倒混匀30次，室温静置10min；
[0175] 3.离心，4℃，12000rpm，15min；
[0176] 4.取200μl上清液至新EP管中，分别加350μl异丙醇，上下颠倒混匀20次，-20℃静置20min；
[0177] 5.离心，4℃，12000rpm，15min；
[0178] 6.弃上清，加入1ml 75％乙醇，上下颠倒几次，洗涤沉淀；
[0179] 7.离心，4℃，12000rpm，5min；
[0180] 8.弃上清，倒置晾干；
[0181] 9.加入30μl DEPC水吹打混匀，置于冰上溶解沉淀，测RNA浓度；
[0182] 10.RT-PCR：
[0183] (1)RT-PCR配方
[0184]试剂 体积
oligo dN6(0.1μg/μl) 1μl
10mM dNTP 1μl
Template RNA 1μg
DEPC H2O 13μl-V(RNA)
合计 15μl
[0185] (2)70℃，5min；冰上放置1min；
[0186] (3)加4μl 5×RT buffer，1μl M-MLVR；混匀；25℃放置10min；
[0187] (4)42℃，50min；
[0188] (5)95℃，5min。
[0189] 三、qPCR
[0190] 1.qPCR配方：
[0191]2×PCR mix 12.5μl
Template(RT产物稀释20倍) 4μl
Primers F/R(2.5μM/2.5μM) 4μl
水 4.5μl
合计 25μl
[0192] 2.反应程序：
[0193]
[0194]
[0195] 四、ELISA(达科为)
[0196] 1.化合物处理细胞24h后，转移培液至EP管；
[0197] 2.离心，12000rpm，5min，上清转移至新EP管；
[0198] 3.按照达科为IL6和TNFαELISA kit说明书进行后续操作。
[0199] 实验结果：LPS处理能引起BV2(小胶质细胞系)发生炎症反应，其中一个典型的表现为炎症因子(IL1β、IL6等)的产生增加。因此，首先利用LPS诱导的BV2炎症模型，通过qPCR检测IL1β和IL6的表达水平来评价本发明化合物的抑炎作用。在此基础上，用ELISA进一步验证了本发明化合物在10μM时对IL6和TNFα生成的作用，结果见表1和图1。
[0200] 表1：百分比为与参照组相比，化合物处理组炎性因子的表达水平；“++”为对炎性因子抑制效果最好，“+”其次，“-”为没有检测到明显效果。
[0201] 表1
[0202]
[0203] 实施例2：细胞毒性试验
[0204] 用于ATP-GLO检测：BV2细胞：提前16h铺细胞，96孔板，3万/孔；实验组：相应化合物处理细胞；对照组：与实验组相同量的DMSO处理细胞；培液体积：200μl/孔
[0205] ATP-GLO测试：
[0206] 1.化合物处理细胞24h后，吸去旧培液，加入ATP-GLO裂解液，100μl/孔；
[0207] 2.室温裂解细胞10min；
[0208] 3.转移裂解液至白色96孔板中，酶标仪检测Cell titer glo luminescence。
[0209] 实验结果：通过ATP-GLO实验检测了本发明化合物对BV2细胞活性的影响，结果显示所有受试化合物在10μM及更低浓度时对细胞活性没有明显影响表明化合物本身没有明显的细胞毒性。
