用于治疗或预防粘膜相关疾病的材料
阅读：671发布：2020-06-28
专利汇可以提供用于治疗或预防粘膜相关疾病的材料专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种透明质酸组合物用于 治疗 或 预防 粘膜相关病变或 疾病 ，该透明质酸组合物包含具有不同平均分子量及不同流变(rheology)、分离(isolation)、组织 支架 (tissue scaffold)及降解性(degradation)的透明质酸混合物。其剂型运用被证实在治疗及预防粘膜相关病变或疾病上附着、组织支架及治疗时间之间可取得适当的平衡。该粘膜相关病变或疾病包括结膜炎、 耳 炎、过敏性鼻炎、 牙龈 炎 、 口腔 溃疡、支气管炎、胃食管逆流症（gastroesophageal reflux disease，GERD）、食道炎、胃炎、肠炎、消化性溃疡、发炎性肠疾（inflammatory bowel disease，IBD）、刺激性肠综合症（irritable bowel syndrome，IBS）、尿道炎、膀胱炎和 阴道 炎。，下面是用于治疗或预防粘膜相关疾病的材料专利的具体信息内容。
1.一种用于治疗或预防粘膜相关病变或疾病的组合物，其包含治疗有效剂量的透明质酸混合物，该透明质酸混合物包含低重量平均分子量透明质酸(LMWHA)及高重量平均分子量透明质酸(HMWHA)，其中低重量平均分子量透明质酸的重量平均分子量是介于5万道尔顿至150万道尔顿之间，高重量平均分子量透明质酸的重量平均分子量是介于150万道尔顿至500万道尔顿之间，其中低重量平均分子量透明质酸与高重量平均分子量透明质酸的重量平均分子量之间间隔至少50万道尔顿，同时低重量平均分子量透明质酸与高重量平均分子量透明质酸的重量混合比例为20：80至80：20。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中低重量平均分子量透明质酸的重量平均分子量是介于10万道尔顿至150万道尔顿之间。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中低重量平均分子量透明质酸的重量平均分子量是介于10万道尔顿至50万道尔顿之间。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中高重量平均分子量透明质酸的重量平均分子量是介于150万道尔顿至350万道尔顿之间。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中高重量平均分子量透明质酸的重量平均分子量是介于150万道尔顿至250万道尔顿之间。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中低重量平均分子量透明质酸与高重量平均分子量透明质酸的重量混合比例是1：1。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中该治疗有效剂量是介于0.05毫克/毫升至50毫克/毫升之间。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中该治疗有效剂量是介于0.05毫克/毫升至5毫克/毫升之间。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中粘膜相关病变或疾病的症状包含溃疡、发炎、过敏反应或流血。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中粘膜是眼睛的粘膜、耳朵的粘膜、鼻子的粘膜、口腔的粘膜、呼吸道的粘膜、肠胃道的粘膜、尿道的粘膜或生殖道的粘膜。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中粘膜相关病变或疾病是结膜炎、耳炎、过敏性鼻炎、牙龈炎、口腔溃疡、支气管炎、胃食管逆流症、食道炎、胃炎、肠炎、消化性溃疡、发炎性肠疾、刺激性肠综合症、尿道炎、膀胱炎或阴道炎。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中肠炎是急性肠炎、慢性肠炎、感染性肠炎、缺血性肠炎、放射性肠炎或药物诱发的肠炎。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中消化性溃疡是胃溃疡、十二指肠溃疡、食道溃疡或梅尔氏憩室溃疡。
14.根据权利要求11所述的组合物，其中发炎性肠疾是克隆氏症或溃疡性结肠炎。
15.根据权利要求11所述的组合物，其中刺激性肠综合症是腹腔疾病、果糖吸收不良、温和感染、诸如梨形鞭毛虫症的寄生虫感染、慢性官能性便秘、腹泻或慢性官能性腹痛。
16.根据权利要求1所述的组合物，其中该组合物进一步包含赋形剂，该赋形剂是用于将组合物调配成适用于眼睛、耳朵、口腔、鼻子、呼吸道、肠胃道或局部使用的剂型。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中适用于口腔的剂型是选自下列由固态剂型、溶液包括悬浮液、片剂包括缓释型片剂及胶囊所组成的群组。
18.根据权利要求16所述的组合物，其中适用于肠胃道的剂型是选自下列由固态剂型、灌注液、灌肠剂、栓剂及包括悬浮液的溶液所组成的群组。
19.根据权利要求16所述的组合物，其中适用于局部使用的剂型是选自下列由灌注液、灌肠剂、栓剂、喷剂、吸入剂及点滴所组成的群组。
20.根据权利要求1的组合物，其中该透明质酸组合物是固态剂型且该治疗有效剂量为每天50毫克至1000毫克的透明质酸之间。
21.根据权利要求11所述的组合物，其中过敏性鼻炎或支气管炎是以该组合物作为佐剂结合药物进行治疗，该药物是抗组织胺药、抗过敏药、抗充血药、类固醇或抗气喘药。
22.根据权利要求12所述的组合物，其中肠炎是以该组合物作为佐剂结合药物进行治疗，该药物是抗生素或镇痉药。
23.根据权利要求13所述的组合物，其中消化性溃疡是以该组合物作为佐剂结合药物进行治疗，该药物是凝血剂、抗生素、抗酸剂、H2阻断剂、钾氢离子泵阻断剂、细胞保护剂或粘膜保护剂。
24.根据权利要求14所述的组合物，其中发炎性肠疾是以该组合物作为佐剂结合药物进行治疗，该药物是类固醇、免疫抑制剂、抗生素、5-胺柳酸及其衍生物或抗发炎药。
25.根据权利要求15所述的组合物，其中刺激性肠综合症是以该组合物作为佐剂结合药物进行治疗，该药物是抗过敏药、镇痉剂、止泻药、神经组织崩解剂、镇定剂、镇痛剂、抗忧郁剂或血清素拮抗剂。
用于治疗或预防粘膜相关疾病的材料
技术领域
[0001] 本发明提供一种用于治疗及预防粘膜相关病变或疾病的透明质酸组合物，其中粘膜相关病变或疾病的症状包含溃疡、发炎、过敏反应及流血。
背景技术
[0002] 透明质酸具有不同的英文名词(hyaluronic acid、hyaluronan、hyaluronate及sodium hyaluronate)，可简称为HA，是一种天然的糖胺聚多糖(glycosaminoglycan)，其是由交替的N-乙酰-D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)及D-葡萄糖醛酸(glucuronic acid)组成，此双糖由交替的β-1,3及β-1,4糖苷键链结。天然的透明质酸通常具有高粘滞度，其分子量介于5万道尔顿(Dalton，Da)至数百万道尔顿之间。
[0003] 天然的透明质酸为粘弹性流体，填充于细胞与胶原蛋白纤维空隙之中且覆盖在某些表皮组织上。主要用来保护及润滑细胞，提供一平台来运输调节性T细胞，稳定胶原蛋白网状结构，以及保护它免于受到机械性的破坏。透明质酸在肌腱、肌腱鞘及粘滑膜表面也是一种主要的润滑剂，此是借由其润滑特性及高吸震能力。透明质酸也有助于组织流变力学(rheological mechanics)，运动和细胞增殖(参照Delpech,B.,Girard,N.,Bertrand,P.,Courel,M.-N.,Chauzy,C.,Delpech,A.,1997.J.Intern.Med.242,41-48)。并参与一些细胞表面的受体交互作用(receptor interaction)，特别指主要的受体－CD44。CD44已被广泛接受为一种淋巴球细胞活化的标记(参照Teder P,Vandivier RW,Jiang D,Liang J,Cohn L,Pure E,Henson PM,Noble PW.Science2002;296:155-158)。
[0004] 近来透明质酸常以其钠盐形态应用于临床治疗中，主要用于眼科、皮肤科、整形外科、一般外科、关节炎、动脉治疗及化妆品中。含碱金属离子、碱土金属离子(例如镁)、铝离子、铵离子及经取代铵离子的盐类的透明质酸可充作辅助药物吸收的载体(参照比利时专利第904,547号)。在透明质酸的重金属盐类中，银盐被用为杀霉菌剂；而金盐可用以治疗类风湿性关节炎(参照PCT专利WO87/05517)。
[0005] 美国专利第5,888,986号揭露使用有效浓度透明质酸治疗膀胱炎的方法及相关结构，其中透明质酸的重量平均分子量(Mw)超过20万道尔顿。在实施例中仅运用特定重量平均分子量的单一透明质酸。例如，利用重量平均分子量65万道尔顿或190万道尔顿的透明质酸来治疗膀胱炎，但特定重量平均分子量的单一透明质酸，无法兼顾治疗速效及持久的效果。
[0006] 美国专利申请案第2005/0080037号揭露透明质酸治疗急性和过度扭伤和应变，其中透明质酸的重量平均分子量仅介于90万道尔顿至120万道尔顿间，特定重量平均分子量的单一透明质酸无法兼顾治疗速效及持久的效果。
[0007] 美国专利第7,354,910号揭露重量平均分子量介于60万道尔顿至120万道尔顿间的透明质酸能用来治疗发炎性肠疾病（inflammatory bowel disease,IBD）。然而，仅单一重量平均分子量的透明质酸，在其注射入病人的体内后，无法兼顾速效及持久的效果，因此在临床上对病人而言非常不方便。
[0008] 欧洲专利第1369119号揭露了重量平均分子量介于60万道尔顿至300万道尔顿间的透明质酸能用来治疗自体免疫疾病。然而，该专利仅利用具特定重量平均分子量的单一透明质酸，而无法兼顾治疗速效及持久的效果。
[0009] 黏膜(mucous membrane,mucosa)覆盖在大部分的内皮表面，表皮表面，并具有吸收(于肠胃道)及分泌(于肠胃道及呼吸道)功能。粘膜覆盖在对外部环境曝露及内部器官的凹陷表面，及伴随着皮肤覆盖在身体的一部份：鼻孔、嘴、嘴唇、眼睑、耳朵、生殖道及肛门。由粘膜及腺体分泌具有粘性的浓厚液体称为粘液(mucus)，而依据粘膜在身体的不同部份有不同的称呼，同时粘膜未必皆会分泌粘液。
[0010] 眼睛：结膜炎(conjunctivitis)是结膜发炎，(结膜是眼睛的最外层及眼睑的内部表面)最常起因于感染或过敏反应(参照Richards A,May2010.“结膜炎("Conjunctivitis")”.Pediatr Rev31(5):196–208)。
[0011] 耳朵：耳炎(otitis)是人类及其他动物耳朵发炎或感染的一般名词。可分为：外耳炎、中耳炎及内耳炎。
[0012] 过敏性鼻炎：鼻炎是鼻粘膜发炎，其特征为复合性症状包括以下任一种的结合：打喷嚏、鼻塞、发痒及流鼻涕。眼睛、耳朵、鼻窦及喉咙皆包含在内。过敏性鼻炎是鼻炎的最常见起因，同时影响了20%的族群。过敏性鼻炎并非是威胁性命的疾病，然而会产生并发症且会明显影响生活品质，间接导致出许多生活花费(参照Bousquet J et al.“过敏性鼻炎管理手册(Allergic rhinitis management pocket reference)”2008.Allergy2008Aug;63(8):990-996)。美国专利申请案第2005/0107330号揭露一种用来局部治疗鼻炎的医药组合物，其包含至少一个酸性糖胺聚多糖。该发明亦包含至少一个适宜局部施用的拟交感药物或生理上可接受的盐类或衍生物，其具有对粘膜的血管收缩或消肿的作用，且其并未揭露或教导结合两种不同重量平均分子量的透明质酸。
[0013] 嘴巴：口腔粘膜位于口腔的表皮。口腔溃疡是口腔内部的开放性溃疡，或在少数例子中，会造成嘴唇上或口腔周围的粘膜或表皮的裂开。溃疡的类型歧异，具有多重相关的原因：物理性的磨损、酸性水果、感染、其他医学状态、给药方法以及癌症的(cancerous)和非专一性进程(nonspecific processes)。一旦形成，溃疡可能因发炎及/或第二次感染而持续。两种常见形态为口腔溃疡及嘴唇疱疹(cold sores)。嘴唇附近的嘴唇疱疹是由病毒所导致(参照J.M.Casiglia,et al.,October2006.“口腔溃疡(Aphthous stomatitis)”.Emedecine)。
[0014] 支气管炎：支气管是用于将气流从气管输送到肺脏的呼吸道。支气管炎为支气管的粘膜发炎，可分为两种：急性及慢性。每一种都有独特的病因、病征及疗法。急性支气管炎经常在如感冒或流感的急性病毒疾病进程中发生。慢性支气管炎最常发展于吸入性刺激所导致的气管的再发性损伤。吸烟是最常见的起因，接着为空气污染及职业性暴露刺激源(occupational exposure to irritants)(Cohen,Jonathan and William Powderly.“感染性疾病(Infectious Diseases.)”2nd ed.Mosby(Elsevier),2004.“第三章气管、支气管以及囊性纤维化(Chapter33:Bronchitis,Bronchiectasis,and Cystic Fibrosis)”)。美国专利申请案第2003/0171332号揭露一种借由能结合CD44的多醣(polysaccharide)来治疗呼吸道疾病的方法，但只利用单一种透明质酸。
[0015] 肠胃道粘膜：包覆消化腔或管道内开放空间的肠胃壁的最内层是粘膜。此层是直接与食物团接触，并负责吸收、消化及分泌等消化作用的重要过程。
[0016] 粘膜在每个消化道器官是高度特殊化的，其在胃中面对低pH、在小肠中吸收多种不同的物质，而同样在大肠中吸收一定份量的水。为反映出这些器官的不同需求，粘膜的结构能由分泌腺体的套迭(如胃小凹，gastric pits)所组成，或为了增加表面积呈折迭状(Abraham L.Kierszenbaum,2002,“组织学以及细胞生物学：从导论至病理学(Histology and Cell Biology:an introduction to pathology)”。
[0017] 消化道粘膜在身体与同时含有营养物及潜在致病性微生物及毒素的消化腔之间形成一道屏障。粘膜的挑战在于当需要将进入体内的有害分子及有机体(organisms)强力排开时，同时允许有效的传输营养物穿透表皮入人体内。胃及肠粘膜的排除特性称之为“肠胃道屏障(gastrointestinal barrier)”。一般而言，毒素及微生物皆能突破单一的表皮细胞层而毫无阻碍的进入体循环。
[0018] 胃食道逆流症（gastroesophageal reflux disease,GERD）是一种胃酸从胃逆流至食道所致的慢性症状或粘膜损伤，典型的症状是心口灼热。胃食道逆流症通常是导因于胃与食道间屏障的变化，其包括：下食道括约肌(lower esophageal sphincter)的不正常放松，在正常情况下，该下食道括约肌会保持胃的顶部呈封闭状；食道受损始于胃逆流的驱逐作用；或者横隔膜疝气(hiatal hernia)。这些变化可能是永久的或暂时的(参照DeVault KR,1999.“胃食道逆流症的诊断与治疗的最新指引─美国胃肠病学会的执业参数委员会(Updated guidelines for the diagnosis and treatment of gastroesophageal reflux disease.The Practice Parameters Committee of the American College of Gastroenterology)”.Am J Gastroenterol94(6):1434–42)。
[0019] 消化性溃疡(peptic ulcer)：消化性溃疡是一种肠胃道的区域的溃疡，其定义为粘膜糜烂等于或大于0.5公分，该区域通常是酸性的，而因此导致特别疼痛。几乎70-90%的溃疡与幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)有关，该菌呈螺旋状生活在胃的酸性环境中。溃疡也会因药物而产生或恶化，例如阿司匹林(aspirin)、氯吡格雷(Plavix)、异丁苯丙酸(ibuprofen)及其他的非甾体抗炎剂(non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDs)。
[0020] 与通常认为相反，消化性溃疡在十二指肠比在胃里更易发生。大约4%的胃溃疡是起因于恶性肿瘤，且需要多种活组织检验来排除其是癌症。十二指肠溃疡(duodenal ulcer)一般而言是良性的。消化性溃疡是借由发作部位予以分类：胃(称为胃溃疡)、十二指肠(称为十二指肠溃疡)、食道(称为食道溃疡)、梅克尔氏憩室(Meckel's Diverticulum，称为梅克尔氏憩室溃疡)。
[0021] 上述实施例皆代表粘膜相关病变或疾病但不受限于上述实施例。所揭露的病变或疾病至今可能用一些不同药物或治疗方法来治疗，但这些治疗手段大部分是借由高度特别的制造方法所制成的复杂成份药物来达成，而非属简单及安全的治疗手段。除了本发明的发明人外，并未有先前技术教导或预测结合两个具有不同重量平均分子量的透明质酸(LMWHA，低重量平均分子量透明质酸；HMWHA，高重量平均分子量透明质酸)，而该两个透明质酸的分子量是以150万道尔顿来做界限区分。此代表在本技术领域技术人员无法借由结合任何其他现有技术导出本发明的混合物应用的概念。
发明内容
[0022] 为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种用于治疗粘膜相关病变的方法，借由施予受体所需有效治疗剂量的透明质酸混合物，该混合物包含至少两个不同重量平均分子量的透明质酸，用以缓和或排除先前提到的问题。
[0023] 本发明的目的是使用至少两个不同平均分子量的透明质酸或药学上可接受的盐以治疗粘膜相关病变或疾病。低重量平均分子量透明质酸及高平均重量分子量透明质酸具有不同粘性、绝缘功能及降解速度。平均分子量低于150万道尔顿的透明质酸被归类为低重量平均分子量透明质酸(LMWHA)，平均分子量高于150万道尔顿的透明质酸被归类为高重量平均分子量透明质酸(LMWHA)。因此，混合低重量平均分子量透明质酸及高平均重量分子量透明质酸可形成所需的组合物，其中低重量平均分子量透明质酸可快速覆盖于发炎表面以治疗或预防粘膜相关病变或疾病[例如：结膜炎、耳炎、过敏性鼻炎、牙龈炎、口腔溃疡、支气管炎、胃食管逆流症(gastroesophageal reflux disease,GERD）、食道炎、胃炎、肠炎、消化性溃疡(peptic ulcer,PU)、发炎性肠疾(inflammatory bowel disease,IBD)、刺激性肠综合症(irritable bowel syndrome,IBS)、尿道炎、膀胱炎和阴道炎。]，而高重量平均分子量透明质酸可延长治疗效果。因此，治疗可迅速且长效地进行。
[0024] 据此，本发明提供一种用于治疗或预防粘膜相关病变或疾病组合物，该组合物用于哺乳类动物或人类，且包含：
[0025] 有效治疗剂量的透明质酸混合物(hyaluronic acid mixture,HA mixture)，其包括一低重量平均分子量透明质酸(LMWHA)及一高重量平均分子量透明质酸(HMWHA),其中低重量平均分子量透明质酸是介于5万至150万道尔顿之间，高重量平均分子量透明质酸是介于150万至500万道尔顿之间，低重量平均分子量透明质酸与高重量平均分子量透明质酸的分子量差距至少50万道尔顿。低重量平均分子量透明质酸与高重量平均分子量透明质酸的混合比例为重量比20：80至80：20之间。
[0026] 本发明的整体概念首先需理解到透明质酸会被透明质酸水解酶(hyaluronidase,HAase)分解。而线状透明质酸(linear HA)(LMWHA)及球状透明质酸(globular HA)(HMWHA)会被分解成小片段，只有其中球状透明质酸因空间立体结构，而能在降解后补充线状透明质酸，因此有助于治疗效果，同时能延长作用时间。减少需不断补充线状透明质酸的困扰。已知透明质酸水解酶的活性能被用来作为发炎的标记。简述如下：
低及高重量平均分子量的透明质酸的混合，被用于产生结合治疗效果且长时间作用。因此，较短的透明质酸减少后，可不断地被补充用于持续的伤口治疗或提供一种软性障壁使组织免于损伤或进一步损伤。以下将详细描述本发明的概念。
低及高重量平均分子量的透明质酸的混合，被用于产生结合治疗效果且长时间作用。因此，较短的透明质酸减少后，可不断地被补充用于持续的伤口治疗或提供一种软性障壁使组织免于损伤或进一步损伤。以下将详细描述本发明的概念。
[0027] 本发明所述的用于治疗或预防粘膜相关病变或疾病的组合物包含有效治疗剂量的透明质酸混合物，其包含低重量平均分子量透明质酸及高重量平均分子量透明质酸。低重量平均分子量透明质酸是重复的双糖单元而形成线状结构(如图1所示)。然而，通过透明质酸和胺的反应的高重量平均分子量透明质酸，一般据信是线状透明质酸高分子的羧基(carboxylic group)与二/三/聚胺反应形成酰胺键(amide linkage)，并同时形成分子间键桥或分子内键桥(inter-or intra-molecular bridge)。基于此反应，开始缠绕的透明质酸结构会转形成球状纳米粒子(spherical nanoparticle)(参照美国专利第7,879,818号)。不同的分子量有不同的流变、粘附、组织支架的功能及在水溶液中的降解性，因此透明质酸混合物能平衡药物功效及降解速度，以利于治疗及预防粘膜相关病变或疾病，同时达成适宜的及延长的治疗效果。
[0028] Tranchepain F.等人揭露了透明质酸的所以会有不同的生物功能是基于其分子量。从物理化学的观点，借由小牛睪丸透明质酸水解酶催化透明质酸水解的研究指出，动力学参数是依赖透明质酸链的长度。获得不同分子量的透明质酸的新工艺是借由透明质酸水解酶催化透明质酸水解(参照Tranchepain F et al.,“借由透明质酸水解酶水解的一完整系列透明质酸片段：借由简单高性能液相层析仪研究透明质酸质量的应用(A complete set of hyaluronan fragments obtained from hydrolysis catalyzed by hyaluronidase:Application to studies of hyaluronan mass distribution by simple HPLC devices.)”Anal Biochem.2006Jan15;348(2):232-42.)。相似的，同一批研究团队亦公开了透明质酸的所以具有不同的生物功能是强烈依赖其链长。一般认为透明质酸水解酶催化透明质酸水解是参与控制较长链与较短链透明质酸间的平衡。较短链透明质酸似乎因太短而无法形成一个稳定的复合物，而较长链透明质酸也在形成复合物上遭遇困难，这可能是因为立体构造上的阻碍(steric hindrance)。
[0029] 数篇报告阐述透明质酸水解酶参与了发炎反应。滑液(Synovial fluid,SF)透明质酸水解酶的活性能用来作为滑膜炎症(Synovial inflammation)的标记(参照Nagaya H et al.,“评估风湿性关节炎及骨关节炎病人作为关节标记分子的滑液及血清透明质酸水解酶活性(Examination of synovial fluid and serum HAase activity as a joint marker in rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients.)”Ann Rheum Dis.,1999,58(3):186-8)。透明质酸是牙周韧带(periodontal ligament,PDL)的细胞外基质(extracellular matrix)的主要成份，能促进其结构及功能的完整。透明质酸有助于咀嚼期间牙周韧带的缓冲效用，同时在发炎及伤口愈合上亦占有重要地位。研究指出牙周韧带纤维母细胞能释出透明质酸水解酶，并于生理状态及发炎状态下，能产生细胞外透明质酸代谢所需的透明质酸水解酶的活性(Ohno S et al.,“透明质酸水解酶于人类牙周韧带纤维母细胞的表现及活性(Expression and activity of hyaluronidase in human periodontal ligament fibroblasts.)”J Periodontol.,2002,,73(11):1331-7）。透明质酸水解酶作用后产生的较短透明质酸片段参与了发炎反应及血管生成(angiogenesis)，然而原生的(native)透明质酸却不会(Tranchepain F et al.,同上述)。
[0030] 依据本发明的定义，具有重量平均分子量低于150万道尔顿的透明质酸被归类为低重量平均分子量透明质酸(LMWHA)。优选的，所述的低重量平均分子量透明质酸平均分子量范围是介于5万至150万道尔顿之间。更优选的，所述的低重量平均分子量透明质酸平均分子量范围是介于10万至150万道尔顿之间。最优选的，所述的低重量平均分子量透明质酸平均分子量范围是介于10万至50万道尔顿之间。具有重量平均分子量高于150万道尔顿的透明质酸被归类为高重量平均分子量透明质酸(HMWHA)。较优选的，所述的高重量平均分子量透明质酸平均分子量范围是介于150万至500万道尔顿之间。最优选的，所述的高重量平均分子量透明质酸平均分子量范围是介于150万至250万道尔顿之间。将组合低重量平均分子量透明质酸及高重量平均分子量透明质酸的混合物给予至一需要治疗的目标时，低重量平均分子量透明质酸可快速地覆盖发炎部位来治疗粘膜相关病变或疾病，且高重量平均分子量透明质酸可延长治疗效果。因此，治疗可迅速且长效地进行。透明质酸的一般化学结构式如图1所示。
[0031] 透明质酸的量化并非仅得以用分子量表示，也可以利用特性粘度(intrinsic viscosity,η)来表示。其与聚合物的分子量直接相关。借由Mark-Houwink-Sakurada(MHS)方程式表达：[η]=KMα。对透明质酸而言，在0.15M氯化钠(NaCl)磷酸盐缓冲液(phosphate buffer)、pH7.5、20℃中，K是0.00057，指数α为0.75（“用以作为生物医学及组织工程医药产品应用的起始物的透明质酸鉴定及测试标准指南(Standard Guide for Characterization and Testing of Hyaluronan as Starting Materials Intended for Use in Biomedical and Tissue Engineered Medical Product Applications)”,ASTM Designation:F2347-03）。
[0032] 本发明的结果显示无论在透明质酸水解酶(图2)或人造胃液(图3)中，高重量平均分子量透明质酸都能持续补充低重量平均分子量透明质酸以保持其长效。如图2所示，在透明质酸水解酶存在的环境中，所有三种透明质酸滞留时间（retention time）会随着降解的增加而明显增加。如图3所示，在酸性环境中，所有三种透明质酸的滞留时间会随着降解的增加而缓慢增加。实验参数是模拟生理环境，但真实的生理环境却可能因相当复杂而导致与实验结果间有些许的差异。只有透明质酸降解的趋势却不会因此改变，因为其天然分子特征是高重量平均分子量透明质酸能补充低重量平均分子量透明质酸。
[0033] 本发明混合物的另一优选的实施例包含，但不限于：依重量比1：1(w/w)混合高、低重量平均分子量透明质酸，混合比例的优选实施例可以依据临床需求调整为重量比20：80至80：20之间。具有较高比例低重量平均分子量的透明质酸混合物对于加速治疗更有帮助。相反地，较高比例高重量平均分子量的透明质酸混合物能提供较长的降解时间而因此延长治疗效果。
[0034] 如本发明所使用的用语粘膜包含，但不限于：眼睛的粘膜、耳朵的粘膜、鼻子的粘膜、口腔的粘膜、呼吸道的粘膜、肠胃道的粘膜、尿道的粘膜及生殖道的粘膜。本发明的粘膜相关病变或疾病的症状是包含溃疡、发炎反应、过敏反应或流血。粘膜相关病变或疾病的优选实施例包括但不限于：结膜炎、耳炎、过敏性鼻炎、牙龈炎、口腔溃疡、支气管炎、胃食管逆流症(gastroesophageal reflux disease,GERD)、食道炎、胃炎、肠炎、消化性溃疡(peptic ulcer,PU)、发炎性肠疾(inflammatory bowel disease,IBD)、刺激性肠综合症(irritable bowel syndrome,IBS)、尿道炎、膀胱炎和阴道炎。肠炎的更优选实施例包括但不限于：急性肠炎、慢性肠炎、感染性肠炎、缺血性肠炎(ischemic enteritis)、放射性肠炎(radioenteritis)及药物诱发的肠炎。消化性溃疡的更优选实施例包括但不限于：胃溃疡、十二指肠溃疡、食道溃疡及梅尔氏憩室溃疡(Meckel's Diverticulum ulcer)。发炎性肠疾(IBD)的更优选实施例包括但不限于：克隆氏症(Crohn's disease)及溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)。刺激性肠综合症(IBS)的更优选实施例包括但不限于：腹腔疾病(coeliac disease)、果糖吸收不良(fructose malabsorption)、温和感染、诸如梨形鞭毛虫症(giardiasis)的寄生虫感染、慢性官能性便秘及慢性官能性腹痛。
[0035] 本发明结果显示，如图4所示，相同重量平均分子量的透明质酸在受伤的结肠组织中被吸收的程度明显高于在正常的结肠组织(P<0.01)。比较三种不同重量平均分子量的透明质酸在受伤的结肠组织中被吸收的程度，其中由荧光指数显示的35万道尔顿透明质酸被受伤结肠组织所吸收的量，明显高于另外二个重量平均分子量透明质酸(100万及200万道尔顿)。进一步言，100万道尔顿透明质酸被正常或受伤结肠组织所吸收的荧光指数高于200万道尔顿透明质酸。此结果解释了低重量平均分子量透明质酸快速散布及覆盖的效果，其是提供快速的伤口愈合及保护组织免于进一步受伤。结合上述数据，本发明是提供一种快速及持续治疗或预防粘膜相关病变或疾病的方法。
[0036] 本发明组合物的另一优选实施例包括加入赋形剂(excipient)使之形成下列适用于各部位或方式的剂型：眼睛、耳朵、口腔、鼻子、呼吸道、肠胃道或局部使用。本发明口服剂型的更优选实施例是选自下列由固态剂型、溶液包括但不限于悬浮液、片剂包括但不限于缓释型片剂、及胶囊包括但不限于肠溶性胶囊(enteric-coated capsule)所组成的群组。口服固态剂型的最优选实施例是每日服用50毫克至1000毫克之间的剂量。肠胃道剂型的更优选实施例是选自下列由固态剂型、灌注液(perfusion)、灌肠剂(enema)、栓剂及包括悬浮液的溶液所组成的群组。局部使用剂型的更优选实施例是选自下列由灌注液、灌肠剂、栓剂、喷剂、吸入剂及点滴所组成的群组。
[0037] 本发明的用于治疗过敏性鼻炎或支气管炎的优选实施例是使用本发明的组合物作为结合药物的佐剂(adjuvant)，其中药物包括抗组织胺药、抗过敏药、抗充血药、类固醇或抗气喘药。本发明用于治疗肠炎的优选实施例是使用本发明的组合物作为结合药物的佐剂，其中药物包括抗生素或镇痉剂(antispasmodic)。本发明的用于治疗消化性溃疡的优选实施例是使用本发明的组合物作为结合药物的佐剂，其中药物包括凝血剂(coagulant)、抗生素、抗酸剂(antacid)、H2阻断剂(H2blocker)、钾氢离子泵阻断剂(potassium hydrogen ion pump blocker,PPI)、细胞保护剂或粘膜保护剂。本发明用于治疗发炎性肠疾的优选实施例是使用本发明的组合物作为结合药物的佐剂，其中药物包括类固醇、免疫抑制剂(immunosuppressive agent)、抗生素、5-胺柳酸(5-aminosalicylic acid,5-ASA)及其衍生物或抗发炎药。
[0038] 本发明阐述了借由不同重量混合比例的透明质酸来治疗发炎性肠疾，其是借由大鼠的平均体重变化来作指标。如图5A及5B所示，A组代表高重量平均分子量(HMWHA)：低重量平均分子量(LMWHA)的重量混合比例为8：2。B组代表HMWHA：LMWHA的重量混合比例为1：1。C组代表对照组，其中的透明质酸由磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)代替。虽然统计显著性仅在第5及第6天发生，但本图式的重点是在于每一组从第1天至第14天的趋势变化。随着实验天数增加，实验趋势显示A组及B组皆具缓和结肠炎(属于炎症性肠疾病的一种)的效应。如图5A所示，相较对照组与A、B组的大鼠平均体重变化，经过整个实验流程直到第14天，可看出透明质酸治疗结肠炎的使用会导致A、B组的大鼠平均体重持续高于比对照组。有意义的是，该趋势亦显示B组一般而言比A组有较优选的治疗效应，代表较高比例的低重量平均分子量透明质酸有较优选的治疗效果。此结果支持本发明利用高重量平均分子量透明质酸来补充低重量平均分子量透明质酸以延长治疗效应的概念。
[0039] 本发明利用大鼠磨擦鼻子来作为过敏症状的指标及利用磨擦鼻子次数的减少来作为改善过敏的指标。如图6所示，结果显示在第28天时，对照组(仅给予PBS)与透明质酸组的结果具有显著差异，代表过敏症状已被成功的诱发。虽然第30天时，结果并未有统计上显著差异，但过敏症状在对照组与A组之间仍然有明显的减少。因此，改善过敏症状的趋势可借由给予本发明透明质酸混合物的实验结果高度证实。
[0040] 或许本发明的各个实验结果有些许不同，然而需留意的是由本发明的概观趋势仍能推导出本发明的混合物具有改善包括过敏的粘膜相关病变或疾病的能力。本发明借由数个相关实验予以证实，而为了适当的显示结果，本发明采取较短的实验时间。因此在实际运用本发明概念至动物体或人体时，应会需要比实验更长的时间。基于理论及本发明的结果，高重量平均分子量透明质酸应足以对体内低重量平均分子量透明质酸的紧急治疗效果提供长期的辅助，及/或补偿。
[0041] 本发明用于治疗刺激性肠综合症(IBS)的优选实施例是使用本发明的组合物作为结合药物的佐剂，其中药物包括抗过敏药、镇痉剂、止泻药(antidiarrheal)、神经组织崩解剂(neurolytic)、镇定剂(transquilizer)、麻醉镇痛剂(narcotic analgesic)、抗忧郁剂(antidepressant)或血清素拮抗剂(serotonin antagonist)。
[0042] 口服剂型(例如肠溶衣锭，enteric coating tablet)的优选实施例中，肠溶衣在胃里提供较佳的抗溶解及抗消化的能力。直到抵达肠道及结肠时，肠溶包衣才会溶解使得透明质酸混合物释放出来形成结肠发炎部位(位于升结肠或横结肠的部位)的保护膜。此目的是为了加速治愈发炎部位，并借由长降解速度来延长治疗时间。
[0043] 栓剂的优选实施例中，可将含透明质酸混合物的栓剂投予至肛门，使得混合物可在直肠溶解并散布至结肠的其他部位(例如降结肠)，以在结肠发炎部位形成保护膜，而能达到加速治疗及持续释放的效果。
[0044] 灌注液(例如灌肠剂)的优选实施例中，透明质酸混合物在此为主要的活性成份并与赋形剂混合(例如PBS缓冲液)，可直接使用或将上述透明质酸混合物置于软管中并注射于结肠。透明质酸混合物将会灌注入结肠并扩散至结肠的其他部位(例如降结肠)，以便形成一于结肠发炎部位的保护膜，进而加速治疗发炎部位，并达到持续释放的效果。
[0046] 依照以上描述，混合至少两种药学上可接受的不同重量平均分子量的透明质酸盐类后，可达到快速覆盖受伤或发炎表面，同时缩短治疗周期及拉长降解的时间以便延长覆盖的周期。因此，快速的治疗及持续的释放效应将可同时达成。本发明提供一种较简单及安全的方法来治疗前述病变或疾病，并可降成本以提供更佳的选择来帮助相关病人。
[0047] 本发明所提供的仅为最优选实施例，本技术领域技术人员一般而言皆可运用本发明的构想对本发明做出转换、修饰及变化。然这些动作的核心概念应已由本发明所公开。因此，这些转换、修饰及变化接落入本案申请专利范围的范畴。本文所述以及附图公开的皆用作例示说明而非限制。
附图说明
[0048] 图1是透明质酸的一般化学结构式。
[0049] 图2是借由凝胶透过层析仪显示的透明质酸滞留时间；其中纵轴代表在GPC里的滞留时间，横轴代表透明质酸在透明质酸水解酶(HAase)溶液中的降解时间。
[0050] 图3是借由GPC显示的透明质酸滞留时间，其中纵轴代表在GPC里的滞留时间，横轴代表透明质酸在人造胃酸(artificial gastric juice)溶液中的降解时间。
[0051] 图4是借由荧光指数展现的透明质酸在正常及受伤结肠组织的附着性。
[0052] 图5A是透明质酸混合物在治疗结肠炎的效果，其是在实验第1至9天由大鼠的平均体重来展示。
[0053] 图5B是透明质酸混合物在治疗结肠炎的效果，其是在实验第1至14天由大鼠的平均体重来展示。
[0054] 图6是借由卵白蛋白(10μg/10μl/鼻孔)诱发大鼠磨擦鼻子以观察透明质酸减*少大鼠鼻子过敏的效果，第28天时，透明质酸组及对照组间具有显著差异（p<0.05）。
具体实施方式
[0055] 实施例1：透明质酸于每毫升1U(U/ml)的透明质酸水解酶（HAase）中的降解[0056] 步骤：
[0057] 1.将0.25克高重量平均分子量透明质酸钠粉末(标示为HHA，高重量平均分子量，分子量：2百万道尔顿，购自Freda)及0.25克低重量平均分子量透明质酸钠粉末(标示为LHA，低重量平均分子量，分子量：35万道尔顿，购自Freda)分别加入50毫升磷酸盐缓冲液中，以形成浓度为0.5%的溶液，接着搅拌6小时直到粉末完全溶解。
[0058] 2.将0.05克LHA粉末及0.2克HHA粉末(比例为2：8，中间重量平均分子量，MHA)加进50毫升PBS缓冲液中，接着搅拌6小时直到粉末完全溶解。
[0059] 3.凝胶透过层析仪(gel permeation chromatograph,GPC)系统的移动相溶液由下列方式制备：(1)将35.49克的磷酸氢二钠(Na2HPO4)粉末加入450毫升的去离子蒸馏水(deionized-distilled water,dd water)，在室温中搅拌30分钟后以形成0.5体积摩尔浓度(M)Na2HPO4溶液；(2)将18克NaH2PO4粉末加入250毫升的去离子蒸馏水，在室温中搅拌30分钟后以形成0.5M NaH2PO4溶液。
[0060] 4.将透明质酸水解酶粉末于4℃加入磷酸盐缓冲液中，以制备1U/ml透明质酸水解酶。
[0061] 5.将2毫升透明质酸样本、1毫升10U/ml透明质酸水解酶及7毫升磷酸盐缓冲液混合加入于15毫升玻璃管中，剧烈振荡3分钟。
[0062] 6.将该玻璃管放在水浴槽中以50rpm的转速摇晃。分别在15、30、45、60、75、90、105及120分钟时各取1毫升的溶液，然后在上述时间点分别加入1毫升的透明质酸水解酶。所述的每一个1毫升溶液是以0.45微米(μm)孔径的滤膜过滤。取20微升(μl)溶液注射入GPC系统中，然后记录图谱。
[0064] 8.所有显示的数值是指观察的平均数。组织学指数(histological index)是利用Student t检验（Student’s t-test）分析。
[0065] 结果：
[0066] 图2显示GPC图谱的透明质酸滞留时间。纵轴代表在GPC中的滞留时间，水平轴代表在含有透明质酸水解酶溶液中的透明质酸的滞留时间。水平虚线从上到下分别代表200万、100万、35万及1.7万道尔顿分子量的透明质酸滞留时间。随着三种透明质酸降解的增加，滞留时间也明显地随之增加。历经15分钟的降解后，HHA及MHA的重量平均分子量降解至大约100万道尔顿。历经37分钟的降解后，HHA及MHA的重量平均分子量降解至大约35万道尔顿。历经90分钟的降解后，HHA、MHA及LHA的重量平均分子量降解至三者之间没有明显差异存在，且皆大于1.7万道尔顿。
[0067] 实施例2：透明质酸在0.1当量浓度（N）的盐酸（HCl）中的降解
[0068] 步骤：
[0069] 1.LHA、MHA及HHA的制备皆同于实施例1。
[0070] 2.GPC系统的移动相溶液的制备同于实施例1。
[0071] 3.将5.72毫升的17.5N HCl及90毫升的去离子蒸馏水混合并搅拌10分钟以制备人造胃液(0.1N HCl)作为储备溶液。
[0072] 4.在15毫升玻璃管中，将2毫升的HHA、MHA及LHA分别与8毫升人造胃液混合并剧烈搅拌3分钟。
[0073] 5.将该玻璃管放在水浴槽中，在37℃下以50rpm的转速摇晃。分别在6、12、24及48小时各取1毫升的溶液，然后在上述时间点分别加入1毫升的人造胃液。以0.45微米孔径的滤膜过滤每一个1毫升溶液。取20微升溶液注射入GPC系统中，然后记录图谱。
[0074] 6.所有显示的数值是指观察的平均数。组织学指数(histological index)是利用Student t检验（Student’s t-test）分析。
[0075] 结果：
[0076] 图3显示GPC图谱的透明质酸滞留时间。纵轴代表在GPC中的滞留时间，水平轴代表在含有人造胃液中的透明质酸的滞留时间。水平虚线从上到下分别代表200万、100万、35万及17万道尔顿分子量的透明质酸滞留时间。随着三种透明质酸降解的增加，滞留时间也缓慢地随之增加。历经7小时的降解后，HHA及MHA的重量平均分子量降解至大约100万道尔顿。历经31小时的降解后，MHA的重量平均分子量降解至大约35万道尔顿。历经35小时的降解后，HHA的重量平均分子量也降解至大约35万道尔顿。上述数据皆指出透明质酸在人造胃液中是缓慢地降解，而HHA及MHA的重量平均分子量历经6小时的降解后皆大于100万道尔顿，而HHA及MHA的重量平均分子量历经24小时的降解后皆大于35万道尔顿。
[0077] 实施例3：透明质酸在结肠组织的粘附性（透过第三版IVIS图像系统）[0078] 步骤：
[0079] 1.LHA及HHA的制备如同实施例1。将MHA(分子量：100万道尔顿，购自Freda)加入50毫升的磷酸盐缓冲液，然后搅拌6小时直到粉末完全溶解，以便接下来步骤的使用。
[0080] 2.荧光透明质酸(HA-f)由下列方式制备：(1)将0.39克MES游离酸[2-(N-吗啉)-乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid),购自Calbiochem]溶解于100毫升的去离子蒸馏水中。(2)溶液A：将65毫克的胺基荧光(fluoresceinamine)粉末(异构物I，购自Fluka公司)溶于9毫升95%酒精溶液并避光搅拌10分钟。(3)溶液B：将359毫克[N-(3-二甲胺基丙基)-N-乙基碳二酰亚胺氯化氢][N-(3-Dimethylamino propyl)-N-ethyl carbodiimide hydrochloride,EDC](购自Sigma)粉末溶于9毫升MES缓冲液，并搅拌10分钟。(4)溶液C：216毫克N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydroxysuccinimde,NHS)粉末(购自Sigma)溶于9毫升MES缓冲液，并搅拌10分钟。(5)将3毫升溶液A缓慢地滴入50毫升0.5%的透明质酸溶液，并于避光下搅拌10分钟。(6)将3毫升B溶液及5毫升C溶液分别滴入步骤(5)的溶液，并于避光下搅拌10分钟。(7)将0.02M MES缓冲液缓慢地滴入步骤(6)的溶液直到体积达到100毫升，并于室温并避光下搅拌24小时。(8)将反应后的产物倒入透析管中(分子量：12000-14000)，以5公升的去离子蒸馏水作为透析液，并于4℃下避光搅拌5天，期间每12小时换一次透析液，直到透析液中没有荧光为止。(9)透析后的液体以50毫升塑胶离心管分装，接着保存在-20℃冰箱隔夜。之后在避光下以冷冻干燥机干燥。(10)干燥的HA-f粉末保存在-20℃冰箱。(11)将50毫克HA-f粉末缓慢地加入10毫升磷酸盐缓冲液中，并搅拌6小时，直到粉末完全溶解。
[0081] 3.将7-8周大的史-道二氏大鼠(Sprague-Dawley,SD)的结肠组织切下后，以磷酸盐缓冲液冲洗，再切成3-4公分长，最后浸泡在磷酸盐缓冲液中。
[0082] 4.受伤的结肠组织是以牙刷纵向刷20次制备，之后浸泡在磷酸盐缓冲液中。
[0083] 5.将正常与受伤的结肠组织放入12孔培养盘中，每孔分别加入1毫升0.5%HA-f溶液，然后在室温下摇晃2小时。过多的HA-f溶液在2小时后以微吸管吸除，再浸泡至磷酸盐缓冲液10分钟后，移除磷酸盐缓冲液。重复上述步骤三次。
[0084] 6.将干净的结肠组织的衬膜组织（lining tissue）朝上放置在12孔培养盘中，然后放在IVIS(活体分子影像系统，in vivo image system,XENOGEN公司)的平台(dock)上。出厂参数是设定为绿荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)，激发(excitation)波长设定为465纳米(nm)，而发射(emission)波长设定为500纳米，影像再由软件捕捉。
[0085] 7.所有显示的数值是指观察的平均数。组织学指数(histological index)是利用Student t检验（Student’s t-test）分析。
[0086] 结果：
[0087] 图4显示荧光指数的定量及排列结果。正常结肠组织的荧光指数定义为1。其他结肠组织再依据定义的数值作校准。结果显示相同重量平均分子量的透明质酸，粘附在受伤的结肠组织明显比在正常结肠组织多(P<0.01)。比较三种不同重量平均分子量透明质酸粘附在受伤结肠组织的结果后，被吸收的35万道尔顿透明质酸的荧光指数明显高过其他二种透明质酸(200万与100万道尔顿)。甚至，不论在正常或受伤结肠组织中，被吸收的100万道尔顿透明质酸的的荧光指数高过200万道尔顿透明质酸。
[0088] 实施例4：针对结肠炎给予或不给予透明质酸的大鼠体重变化
[0089] 步骤：
[0090] 1.测试目的：为了评估以重量比例混合两种不同重量平均分子量透明质酸来治疗或预防结肠炎的效果，以三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)在无特定病原(specific-pathogen-free,SPF)等级的史-道二氏大鼠中诱发出结肠炎。
[0091] 2.测试样本：IBD98，其包含低重量平均分子量(LMWHA)及高重量平均分子量(HMWHA)，其中HMWHA是200万道尔顿透明质酸，LMWHA是35万道尔顿透明质酸，混合比例为8：2(归类为A组)及1：1(归类为B组)。溶于磷酸盐缓冲液中产生0.125%(w/v)浓度的透明质酸溶液。
[0092] 3.方法：(1)测试目标：挑选8周大的大鼠，并将其分成三组：A组代表透明质酸混合比例8：2；B组代表透明质酸混合比例1：1；C组代表以磷酸盐缓冲液代替透明质酸的对照组。(2)动物实验：所有实验组(A、B组)的大鼠先使其空腹两天。在实验第1天，大鼠麻醉后经由直肠给予浓度为每毫升50毫克的1毫升三硝基苯磺酸。从第4至第14天，每天将A与B组的大鼠，经由直肠分别投予1毫升的两种IBD98。在第九天，观察A与B组一半大鼠的体重。在第14天观察另一半大鼠的体重变化。所有对照组的大鼠先使其空腹两天。在实验第1天，大鼠麻醉后经由直肠给予浓度为每毫升50毫克的1毫升三硝基苯磺酸。从第4至第14天，每天经由直肠给予1毫升磷酸盐缓冲液。在第九天，观察C组一半大鼠的体重。在第14天观察另一半大鼠的体重变化。
[0093] 结果：
[0094] 1.发炎指标：本发明利用平均体重的变化来观察结肠炎(IBD)改善的结果。对于确认治疗结果而言，体重的变化是一种较方便且直接的指标。
[0095] 2.观察A组与B组的趋势可发现，如图5A及图5B所示，从第1天至第14天代表发炎症肠疾(IBD)的结肠炎，在两组皆有缓和的结果。观察对照组与实验组的平均体重变化可发现，如图5B所示，透过给予透明质酸结肠炎的治疗效果会使实验组的平均体重，在全部实验期间即使直到第14天，皆保持的比对照组的平均体重来得高。
[0096] 实施例5：透明质酸对过敏性疾病的治疗效果
[0097] 步骤：
[0098] 1.测试目的：在无特定病原等级的史-道二氏大鼠中诱导出过敏性疾病，在此为过敏性鼻炎。
[0099] 2.测试样本：IBD98，其包含低重量平均分子量及高重量平均分子量，其中HMWHA是200万道尔顿透明质酸，LMWHA是35万道尔顿透明质酸，混合比例为1：1，溶于磷酸盐缓冲液中产生0.125%(w/v)浓度的透明质酸溶液。
[0100] 3.方法：(1)测试目标：挑选8周大的大鼠9只，随机分类为二组：由4只大鼠组成的对照组（磷酸盐缓冲液）及由5只大鼠组成的实验组(透明质酸)。(2)动物实验：从实验第1天至第7天，每天通过腹腔内注射(intra-peritoneally,IP)内含1毫克卵白蛋白(ovalbumin)及10毫克明矾(alum)的生理盐水。从第8天至第13天只做观察。从第14天至第27天，每天将内含卵白蛋白的盐水)10μg/10μl/每个鼻孔)利用微量移液管(micropipette)滴入大鼠的两侧鼻孔。经过诱发过敏的抗原反应后，透明质酸对鼻子上症状的治疗效果分别在第28天及第30天做评估。在滴入卵白蛋白的1小时前，大鼠先滴入透明质酸溶液或磷酸盐缓冲液(25μl/每个鼻孔)。在内含卵白蛋白的盐水(10μg/10μl/每个鼻孔)滴入两侧的鼻孔后，大鼠被放置在观察笼里(1只大鼠/每笼)，且其30分钟过程中磨擦鼻子的次数被计数。磨擦鼻子的频率是以每30分钟磨擦鼻子的次数计算。
[0101] 结果：
[0102] 1.过敏改善指标：本发明利用大鼠磨擦鼻子的次数来做为过敏症状改善的指标。
[0103] 2.如图6所示，透明质酸样本对于抗原诱发的鼻子症状的治疗效果。因卵白蛋白所诱发的平均磨擦鼻子频率，在第28天是56.25±16.1次/30分钟，在第30天是70.0±41.3次/30分钟。与对照组比较起来，实验组磨擦鼻子的频率在第28天有统计意义的显著减少，然而在第30天，仍然有明显的减少。
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