一种四价流感病毒疫苗可溶性微针贴及其制备方法
阅读：294发布：2020-05-22
专利汇可以提供一种四价流感病毒疫苗可溶性微针贴及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种四价流感 疫苗 可溶性微针贴，包括针体和背衬，针体由基质材料、耐热保护剂、四价流感疫苗和 溶剂 组成，其中，基质材料为甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物、 硫酸 软骨素、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷 酮 中至少两种的混合；耐热保护剂为海藻糖；溶剂为去离子 水 。本发明制备的四价流感疫苗可溶性微针贴，针体机械强度适中，能有效刺入 皮肤 ，且疫苗在皮内溶解快；而且，本发明制备的微针，针体内疫苗的长期 稳定性 良好。，下面是一种四价流感病毒疫苗可溶性微针贴及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种四价流感病毒疫苗可溶性微针贴，包括针体和背衬，其特征在于，所述的针体由四价流感病毒疫苗、基质材料、海藻糖组成，所述的基质材料为甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物与硫酸软骨素的混合，甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物：硫酸软骨素的质量比＝(3：1)～(2：1)。
2.根据权利要求1所述的四价流感病毒疫苗可溶性微针贴，其特征在于，所述的甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物选自Gantrez S-97。
3.根据权利要求2所述的四价流感病毒疫苗可溶性微针贴，其特征在于，所述的基质材料由质量比为3：1的Gantrez S-97与硫酸软骨素混合而成。
4.根据权利要求3所述的四价流感病毒疫苗可溶性微针贴，其特征在于，所述的海藻糖与基质材料的质量比为1：4。
5.根据权利要求1所述的四价流感病毒疫苗可溶性微针贴，其特征在于，所述的四价流感病毒疫苗的载药量为45％～50％。
6.根据权利要求1所述的四价流感病毒疫苗可溶性微针贴，其特征在于，所述的背衬选自韧性高分子材料，为聚乙烯醇、羟丙甲纤维素、聚乙二醇、羧甲基纤维素中的一种。
7.根据权利要求1～6任一项所述的四价流感病毒疫苗可溶性微针贴，其特征在于，所述的针体由如下质量占比的组分构成：四价流感病毒疫苗50％，Gantrez S-97占比30％，硫酸软骨素占比10％，海藻糖占比10％。
8.一种如权利要求1～6任一项所述的四价流感病毒疫苗可溶性微针贴的制备方法，包括如下步骤：
(1)第一次真空入模
将处方量的四价流感病毒疫苗、基质材料、海藻糖分别用溶剂溶解、混合成均匀的针体液，取适量针体液涂覆于用激光打孔法制成的阴模上，置于真空干燥箱中抽真空，使针体液进入阴模的孔洞；然后，取出阴模，刮净孔洞外的溶液；
(2)第二次真空入模
将背衬材料用溶剂溶解成均匀的背衬液，取适量背衬液涂覆于步骤(1)所得的阴模上，置于真空干燥箱中抽真空，使背衬液进入阴模的孔洞；再将其放入烘箱，于37℃下干燥后取出，脱模，即得成品。
9.根据权利要求8所述的四价流感病毒疫苗可溶性微针贴的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)和步骤(2)中，溶剂选自去离子水。
10.根据权利要求8所述的四价流感病毒疫苗可溶性微针贴的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)和步骤(2)中，抽真空的工艺条件为：于真空度0.08MPa下抽真空5min。
一种四价流感病毒疫苗可溶性微针贴及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 流行性感冒是由流感引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。目前的流感疫苗一般都是通过针头注射给药，患者顺应性差，因此亟待一种新型的疫苗给药途径。人体皮肤作为人体最大的器官，表皮层含有丰富的抗原呈递细胞，比如存在表皮中的朗格罕氏细胞占所有表皮细胞的3％-5％。然而皮肤的角质层障碍使得大分子药物与水溶性小分子的递送成为了难题。
[0003] 可溶性微针属于微针的一类，它可以刺破人体皮肤的角质层障碍，进入人体的表皮层而不触及真皮层的神经组织，实现无痛给药。与其他微针不同的是，可溶性微针刺入人体皮肤后可自行溶解，避免了固体实心微针针头断裂以及涂层微针载药量小等问题，是目前微针研究的热门领域。微针的出现使得蛋白质类大分子疫苗的递送成为了可能。
[0004] 我们目前常用的流感疫苗为三价流感疫苗，包含A型的H1N1和H3N2亚型和B型Victoria株三种抗原组分，但对B型Yamagata株无效；而四价流感病毒疫苗是三价流感疫苗的升级版，增加了B型Yamagata抗原组分，通用性更强些。现有的国内外文献，涉及有三价流感疫苗开发微针新剂型的技术，但四价流感病毒疫苗载入微针的技术尚未检索到。
[0005] 如，如有研究者将三价流感疫苗载入可溶性微针，通过制剂的处方优化解决了疫苗的稳定性问题(Mistilis M J,Joyce J C,Esser E S,et al.Long-term stability of influenza vaccine in a dissolving microneedle patch[J].Drug delivery and translational research,2017,7(2):195-205)，其由PVA和蔗糖作为处方制备微针主体部分，但文中没有具体给出微针的机械性能参数以及进行微针机械强度的考察实验。该技术方案的不足之处在于：由于PVA和蔗糖都属于韧性材料，相对于脆性材料机械强度可能不足，故存在微针尖端不能有效穿刺皮肤的隐患，参考依据为文献《用于构建可溶性微针的基质材料及其复合材料》(章捷,马凤森,占浩慧等,材料导报,2017,31(19):129-134.)[0006] 另外，还有国外研究者将三价流感疫苗作为涂层涂覆在微针上，但是涂层微针与可溶性微针在处方工艺以及载药方式上均有差异，难以借鉴(Kim Y C,Lee S H,Choi W H,et al.Microneedle delivery of trivalent influenza vaccine to the skin induces long-term cross-protection[J].Journal of drug targeting,2016,24(10):943-951)。
[0007] 又如，公开号为CN105579059A的中国发明专利，公开了一种热稳定的疫苗配制物、工艺和包含疫苗配制物的微针，该专利中将流感疫苗载入可溶性微针，通过添加稳定性的赋形剂来解决流感疫苗的热稳定性问题，但该专利并未涉及具体疫苗对应的可溶性微针的基质材料处方。
[0008] 众所周知，四价流感病毒疫苗相比于三价流感疫苗成分发生了变化，使得疫苗的理化性质有差异，通过文献《用于构建可溶性微针的基质材料及其复合材料》(章捷,马凤森,占浩慧等,材料导报,2017,31(19):129-134.)可知，构筑可溶性微针的基质材料根据材料的力学性能可以分为韧性材料以及脆性材料，不同的材料与疫苗药物的组合，会导致疫苗可溶性微针的机械性能、皮内溶解性能存在效果差异，故，借鉴现有的三价流感疫苗微针处方用于开发四价流感病毒疫苗微针，仍充满许多不确定性。
[0009] 综上所述，如何开发出一种处方适宜、能有效穿刺皮肤、皮内溶解快、疫苗稳定性高的四价流感病毒疫苗可溶性微针贴，是本领域技术人员急需解决的技术难题。
发明内容
[0011] 本发明所采用的技术方案具体如下：
[0012] 一种四价流感病毒疫苗可溶性微针贴，包括针体和背衬，针体由四价流感病毒疫苗、基质材料、海藻糖组成，基质材料为甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物与硫酸软骨素的混合，甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物：硫酸软骨素的质量比＝(3：1)～(2：1)。
[0013] 优选的，甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物选自Gantrez S-97。
[0014] 更优选的，基质材料由质量比为3：1的Gantrez S-97与硫酸软骨素混合而成。
[0015] 更优选的，海藻糖与基质材料的质量比为1：4。因此，本发明中海藻糖与Gantrez S-97、CS的质量比经换算，应为(3：8：4)～(1：3：1)。
[0016] 优选的，四价流感病毒疫苗的载药量为45％～50％。
[0018] 优选的，一种四价流感病毒疫苗可溶性微针贴，包括针体和背衬，针体由如下质量占比的组分构成：四价流感病毒疫苗50％，Gantrez S-97占比30％，硫酸软骨素占比10％，海藻糖占比10％。
[0019] 一种如前所述的四价流感病毒疫苗可溶性微针贴的制备方法，包括如下步骤：
[0020] (1)第一次真空入模
[0021] 将处方量的四价流感病毒疫苗、基质材料、海藻糖分别用溶剂溶解、混合成均匀的针体液，取适量针体液涂覆于用激光打孔法制成的阴模上，置于真空干燥箱中抽真空，使针体液进入阴模的孔洞；然后，取出阴模，刮净孔洞外的溶液；
[0022] (2)第二次真空入模
[0023] 将背衬材料用溶剂溶解成均匀的背衬液，取适量背衬液涂覆于步骤(1)所得的阴模上，置于真空干燥箱中抽真空，使背衬液进入阴模的孔洞；再将其放入烘箱，于37℃下干燥后取出，脱模，即得成品。
[0024] 优选的，步骤(1)和步骤(2)中，溶剂选自去离子水。
[0025] 优选的，步骤(1)和步骤(2)中，抽真空的工艺条件为：于真空度0.08MPa下抽真空5min。
[0026] 本发明提供的四价流感病毒疫苗可溶性微针贴及其制备方法，与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0027] ①本发明选择特定的组分与含量比的复合材料(Gantrez S-97+硫酸软骨素)作为基质材料与四价流感病毒疫苗结合，使得微针的机械性能达到最优，易于刺入皮肤给药。
[0028] ②本发明选择特定含量比的海藻糖作为耐热保护剂，既能保证材料的韧脆性，又能保证疫苗在微针中的稳定性。
[0029] ③本发明的微针，在皮内可以快速溶解，使得疫苗释药快，起效快。
[0030] ④本发明的微针，采用柔性材料制作背衬层，更易贴合人体皮肤。
[0032] 图1为制备微针模具的流程示意图；
[0033] 图2为制备本发明四价流感病毒疫苗微针的流程示意图。
[0034] 图3为本发明制得的微针刺入离体皮肤后的组织切片图。。
具体实施方式
[0035] 为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明中的附图，对本实施例中的技术方案进行具体说明。必须说明的是，下述实施例仅用来解释本发明，而不是对发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入到了本发明的保护范围。
[0036] 实施例1四价流感病毒疫苗微针的阴模制备
[0037] 如图1，本发明采用激光打孔法制备四价流感病毒疫苗微针的阴模，步骤如下：
[0038] 1)制备PDMS模具
[0039] 将聚二甲氧基硅氧烷(PDMS)与固化剂按质量比10:1混合后，浇注到长方体容器中；将容器置于真空干燥箱，于真空度0.08MPa下抽真空5min，使得混合液中的气泡去除；再放入烘箱，于60℃下干燥5～10h后取出，得到成型的PDMS模具。
[0040] 2)激光打孔PDMS模具
[0042] 本发明中，阴模的空洞大小可根据四价流感病毒疫苗微针的实际所需数量而定，激光打孔的参数设定如下：镜头焦点参数为1.5英寸，焦点直径为75微米。
[0043] 实施例2四价流感病毒疫苗微针的制备
[0044] 如图2，本发明采用二次真空入模法制备四价流感病毒疫苗微针，步骤如下：
[0045] 1)将Gantrez S-97、CS、海藻糖、四价流感病毒疫苗按处方比例混合后，用溶剂(去离子水)分别溶解、混合成均匀的针体液，取适量针体液装入离心管，置于离心沉淀器，离心使得针体液中的气泡去除，静置备用。
[0046] 2)取步骤1)离心后所得的针体液，浇注于本发明实施1制备的PDMS模具上，再将PDMS模具置于真空干燥箱，于真空度0.08MPa下抽真空5min，使得针体液注入模具的孔洞中；抽真空后，取出模具，去除模具表面的溶液仅保留孔洞中的溶液；
[0047] 3)将背衬层材料用溶剂(去离子水)溶解成均匀的背衬液，取适量背衬液装入离心管，置于离心沉淀器，离心使得背衬液中的气泡去除，静置备用。
[0048] 4)取步骤3)离心后所得的背衬液，浇注于步骤2)所得的PDMS模具上，再将PDMS模具置于真空干燥箱，于真空度0.08MPa下抽真空5min，使得背衬液注入模具的孔洞；抽真空后，取出模具，放入烘箱，于37℃下干燥10h后取出，脱模，即得成品四价流感病毒疫苗微针贴。
[0049] 本发明中，针体部分的最佳处方为：四价流感病毒疫苗50％，Gantrez S-97占比30％，硫酸软骨素占比10％，海藻糖占比10％。
[0050] 实施例3基质材料的组分对微针性能的影响实验
[0051] 假定基质材料在针体总质量中的占比为一定值，仅改变基质材料的组分，考察如表1所示的不同组合的基质材料对微针性能的影响，本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。
[0052] 表1 不同的基质材料组分构成的微针处方
[0053]No 基质材料 海藻糖 四价流感病毒疫苗
1 40％PVP 15％ 45％
2 40％Gantrez S-97 15％ 45％
3 40％CS 15％ 45％
4 40％PVA 15％ 45％
5 20％PVP+20％Gantrez S-97 15％ 45％
6 20％CS+20％PVA 15％ 45％
7 20％Gantrez S-97+20％CS 15％ 45％
8 20％PVP+20％PVA 15％ 45％
9 20％CS+20％PVP 15％ 45％
10 20％PVA+20％Gantrez S-97 15％ 45％
1 40％PVP 15％ 45％
2 40％Gantrez S-97 15％ 45％
3 40％CS 15％ 45％
4 40％PVA 15％ 45％
5 20％PVP+20％Gantrez S-97 15％ 45％
6 20％CS+20％PVA 15％ 45％
7 20％Gantrez S-97+20％CS 15％ 45％
8 20％PVP+20％PVA 15％ 45％
9 20％CS+20％PVP 15％ 45％
10 20％PVA+20％Gantrez S-97 15％ 45％
[0054] 对表1中的6个微针处方，参照本发明的实施例1和实施例2的方法制成可溶性微针后，按如下方法检测微针的成型性、机械强度、吸潮性：
[0056] ②置于物性分析仪下进行压变性能测试，从压变曲线中计算出微针的断裂力，断裂力越大则机械强度越大，来判断微针的成型性；
[0058] 测试结果，见表2。
[0059] 表2 不同的基质材料组分对微针性能的影响
[0060]
[0061]
[0062] 按照文献《用于构建可溶性微针的基质材料及其复合材料》(章捷,马凤森,占浩慧等,材料导报,2017,31(19):129-134.)中的材料分类，表1中的PVP和Gantrez S-97属于脆性材料，PVA和CS属于韧性材料，结合表1和表2可知：单一材料所制得的微针难以同时满足上述三个指标(处方1～4)，例如韧性材料机械强度差、脆性材料脱模容易断裂、单独PVP材料容易吸潮等，而基质复合材料(处方5～10)不论是脆性+脆性的组合，还是韧性+韧性的组合，或是脆性+韧性的组合，不同的材料组合后也会导致微针的性能存在差异。
[0063] 从表2中可知，处方7(即韧性材料CS+脆性材料Gantrez S-97的组合)制得的微针，成型性、机械强度、吸潮性都最佳，其余处方或多少存在性能劣势，故综合考虑后，选择处方7作为基质复合材料的组分。
[0064] 实施例4基质材料的含量对微针性能的影响实验
[0065] 假定基质材料在针体总质量中的占比为一定值，且基质材料的组分固定，仅改变基质材料的含量，考察如表3所示的不同比例的基质材料对微针性能的影响。
[0066] 同理，本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。对表3中各微针处方的性能检测，测试步骤参照本发明的实施例3。
[0067] 表3 不同含量的基质材料构成的微针处方
[0068]No 基质材料Gantrez S-97+CS 海藻糖 四价流感病毒疫苗
1 Gantrez S-97：CS＝4：1 15％ 45％
2 Gantrez S-97：CS＝3：1 15％ 45％
3 Gantrez S-97：CS＝2：1 15％ 45％
4 Gantrez S-97：CS＝1：1 15％ 45％
1 Gantrez S-97：CS＝4：1 15％ 45％
2 Gantrez S-97：CS＝3：1 15％ 45％
3 Gantrez S-97：CS＝2：1 15％ 45％
4 Gantrez S-97：CS＝1：1 15％ 45％
[0069] 测试结果，见表4。
[0070] 表4 不同含量的基质材料对微针性能的影响
[0071]No 成型性 机械强度 吸潮性
1 +++ ++ ++
2 +++++ ++++++ +++
3 +++++ +++++ +++
4 ++++ ++ +++
1 +++ ++ ++
2 +++++ ++++++ +++
3 +++++ +++++ +++
4 ++++ ++ +++
[0072] 结合表3和表4可知，当基质材料中Gantrez S-97：CS为4:1或1:1(即处方1和处方4)时，复合材料由于过脆或过韧，使得机械强度不合格。
[0073] 仅有当基质材料中Gantrez S-97：CS＝(3:1)～(2:1)时，即处方2和处方3制得的微针，成型性、机械强度、吸潮性均符合要求，而且Gantrez S-97与CS的比值为处方2的3：1时，微针性能最佳。
[0074] 实施例5耐热保护剂的含量对微针性能的影响实验
[0075] 假定四价流感病毒疫苗在针体总质量中的占比为一定值，且基质材料的组分与配比固定，仅改变耐热保护剂海藻糖与基质材料的比例，考察如表5所示的不同配比的海藻糖与基质材料对微针性能的影响。
[0076] 同理，本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。对表5中各微针处方进行性能检测，测试步骤参照本发明的实施例3。
[0077] 测试结果，见表5。
[0078] 表5 不同比例的耐热保护剂构成的微针处方对微针性能的影响
[0079]No 海藻糖：(Gantrez S-97+CS) 成型性 机械强度 吸潮性
1 ＜(1:8) +++ ++ +++
2 (1:8)～(1:4) +++++ +++++ +++
3 ＞(1:4) ++++ ++++ +++
1 ＜(1:8) +++ ++ +++
2 (1:8)～(1:4) +++++ +++++ +++
3 ＞(1:4) ++++ ++++ +++
[0080] 结合表5可知，处方2相比处方1和3，成型性以及机械强度均较差，原因是呈韧性的海藻糖，过多或过少加入都会导致微针整体韧脆性发生变化；仅当海藻糖与Gantrez S-97和CS的混合材料比例在(1:8)～(1:4)之间各项性能较好，成型性、机械强度以及吸潮性均能符合要求。
[0082] 实施例6耐热保护剂含量对微针中疫苗稳定性的影响
[0083] 上述实施例5已经针对微针的机械性能影响对耐热保护剂的含量进行初步筛选，本实施例将针对微针中疫苗的稳定性影响进一步对耐热保护剂含量进行筛选。
[0084] 同样，假定四价流感病毒疫苗在针体总质量中的占比为一定值，且基质材料的组分与配比固定，仅改变耐热保护剂海藻糖与基质材料的比例，考察如表6所示的不同配比的海藻糖与基质材料对疫苗在微针中稳定性的影响。
[0085] 同理，本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。
[0086] 稳定性测试的方法为：将按表6各处方制得的微针，置于10ml 37℃去离子水中溶解，用ELISA法检测溶液中的疫苗活性，记为初始0月疫苗活性百分比为100％，另将前述同一批次制得的各种微针，放置在温度20℃、相对湿度30％的空气环境中保存6个月后，再用相同的ELISA法检测各微针疫苗相对于初始时的活性百分比。
[0087] 测试结果，见表6。
[0088] 表6 不同剂量耐热保护剂的加入对微针中的疫苗活性影响(mean％±SD％，n＝6)[0089]No 海藻糖：(Gantrez S-97+CS) 四价流感病毒疫苗活性
1 1:8 71.12±2.11
2 1:7 73.48±1.01
3 1:6 79.36±2.15
4 1:5 88.74±1.74
5 1:4 97.19±1.08
1 1:8 71.12±2.11
2 1:7 73.48±1.01
3 1:6 79.36±2.15
4 1:5 88.74±1.74
5 1:4 97.19±1.08
[0090] 由表6可知，随着海藻糖耐热保护剂的剂量上升，四价流感病毒疫苗的活性百分比增加，即疫苗在微针中越稳定。其中，处方5微针中的疫苗在放置6个月后活性下降量小于5％，相对处方1～4最稳定，因此将海藻糖与基质材料的质量配比1：4作为最优处方。
[0091] 实施例7疫苗的载药量对微针性能的影响实验
[0092] 假定基质材料与海藻糖的质量比例为一定值，且基质材料的组分与配比固定，仅改变四价流感病毒疫苗的载药量，考察如表7所示的不同载药量的四价流感病毒疫苗对微针性能的影响。
[0093] 同理，本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。对表7中各微针处方的性能检测，测试步骤参照本发明的实施例3。
[0094] 测试结果，见表7。
[0095] 表7 不同载药量的疫苗构成的微针处方对微针性能的影响
[0096]No 四价流感病毒疫苗占比 成型性 机械强度 吸潮性
1 40％ ++ ++++ +++
2 45％ ++++ ++++ +++
3 50％ +++++ +++++ +++
4 55％ ++ ++ +++
1 40％ ++ ++++ +++
2 45％ ++++ ++++ +++
3 50％ +++++ +++++ +++
4 55％ ++ ++ +++
[0097] 从表7可知，处方1中由于基质材料+海藻糖的占比过高，溶液较难入模，故微针成型性较差，而处方4由于疫苗的占比较高，导致微针的机械性能差。仅当四价流感病毒疫苗占比在(45％-50％)之间时，成型性、机械性能、吸潮性均能符合要求，而处方3相对处方2性能更优，故选择疫苗占比为50％作为最优比例。
[0098] 实施例8微针皮肤穿刺实验
[0100] 切片结果表明：微针已经刺破了角质层进入了表皮层，故，本发明制得的可溶性微针能有效穿刺皮肤。
[0101] 实施例9微针皮内溶解实验
[0102] 按上述实施例1和2的方法制得18片可溶性微针后，利用拇指将微针按入不同的6只大鼠皮内后，分别在0.2min，0.5min，1min，2min，3min，4min时间点将微针拔出，通过显微镜观察微针的皮内溶解情况。
[0103] 实验结果表明：平行测试的18片可溶性微针中，绝大多数微针都可以在3min内完全溶解，说明本发明制得的微针在皮内溶解速度快，实现快速释药。
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