本发明涉及通过给予生长激素释放肽或其拮抗剂来降低肿瘤细胞增 殖的方法。

生长激素(GH)的分泌由两类下丘脑肽调节：GH-释放激素(GHRH)， 其对生长激素的释放具有刺激作用，以及生长激素释放抑制因子，其对 生长激素的释放具有抑制作用。在过去的几年中，几种研究证明GH的 分泌还可受到合成低聚肽(又称GH-释放肽(GHRP))的刺激，例如海 噻瑞林(Hexarelin)及各种海噻瑞林的类似物(Ghigo等人，European Journal of Endocrinology，136，445-460，1997)。这些化合物通过与 GHRH明显不同的机理发挥作用(C.Y.Bowers，“异种生物生长激素促 分泌素”，Eds.B.Bercu和R.F.Walker，pg.9-28，Springer-Verlag，New York 1996)并且与位于下丘脑的特异性受体及垂体腺体具有相互作用 ((a)G.Muccioli等人，Journal of Endocrinology，157，99-106，1998； (b)G.Muccioli，“GHRP受体在人体中的组织分布”，Abstracts IV European Congress of Endocrinology，Sevilla，Spain，1998)。最近证 明GHRP受体不仅存在于下丘脑-垂体系统中，而且甚至存在于各种通常 与GH释放无关的人类组织中(G.Muccioli等人，参见上文(a))。

在下列出版物中描述了GHRPs及其拮抗剂：C.Y.Bowers，Supra， R.Deghenghi，“生长激素释放肽”，Ibidem，1996，pg.85-102；R. Deghenghi等人，“作为生长激素强释放剂的小分子肽”，J.Ped.End. Metab.，8，pg.311-313，1996；R.Deghenghi，“作为生长激素促分泌 素的不可透过肽类的发展”，Acta Paeditr.Suppl.，423，pg.85-87，1997； K.Veeraraganavan等人，“与猪前垂体和下丘脑膜有关的生长激素释放 肽(GHRP)”，Life Sci.，50，pg.1149-1155，1992；及T.C.Somers等 人，“低分子量的仿肽生长激素促分泌素”，WO 96/15148(1996年5月 23日)。

本发明涉及治疗哺乳动物体内肿瘤的方法，所述的方法包括给予需要 治疗的哺乳动物治疗有效剂量的生长激素释放肽(GHRP)或其拮抗剂。 另外根据本发明，所用的化合物可以定义为生长激素促分泌素或其拮抗 剂。所用化合物的量可有效地降低或抑制哺乳动物体内肿瘤发生细胞的 增殖。在另一个实施方案中，这些化合物被赋予了如下特征：即它们从 哺乳动物含肿瘤的组织中取代了放射活性标记物125I-Tyr-Ala- His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2(125I-Tyr-Ala-海噻瑞林)。

这里所公开的化合物显示了与肿瘤发生组织的结合，并且已经发现它 们能在给药后象特异性的受体一样发挥作用，从而使得肿瘤发生细胞的 数量有所降低。优选地，所治疗的肿瘤为肺肿瘤、乳腺肿瘤、甲状腺肿 瘤或胰腺肿瘤。

上述提到的化合物包括一些已知的化合物(参见上文)，但其它用于 本发明的化合物是以前未公开的，包括螺旋内酰胺、双环或三环仿肽单 位。本发明所用所有化合物一个共同的特征是至少存在一个赖氨酸单位。

在此描述中，使用了下列缩写：D为右旋对映体，GH为生长激素， Mrp为2-甲基-Trp，IMA为咪唑基乙酰基，GAB为γ-氨基丁酰基，INIP 为isopecotinyl，AIB为氨基异丁酰基，Nal为β-荼基丙氨酸，TXM为 tranexamyl，即4-(氨基甲基)-环己基羰基，D-HNH为D-1，2，3，4，5，6- 六氢-降哈尔满(norharman)-3-羧酸酯(盐)，HAIC为(2S，5S)-5-氨 基-1，2，4，5，6，7-六氢-氮杂并[3，2，1-hi]吲哚-4-酮-2-羧酸酯(盐)，ATAB 为2-R-(2β，5β，8β)-8-氨基-7-氧-4-硫杂-1-氮杂-双环[3.4.0]壬烷-2-羧酸酯 (盐)，并且Ala、Lys、Phe、Trp、His、Thr、Cys、Thr、Leu和Ile 分别代表丙氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、苏氨酸、半胱 氨酸、酪氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

在本发明优选的实施方案中，所给予的有用化合物具有下列通式I：

                    AA1-AA2-AA3-AA4-Lys-R    (I)

其中

AA1为IMA，GAB，INIP，TXM，AIB，HIs-D-Trp-，His-D-Mrp， Thr-D-Trp，

Thr-D-Mrp，D-Thr-D-Trp，D-Thr-D-Mrp，D-Ala-D-Nal，IMA-D- Trp，IMA-D-Mrp，

D-Thr-His-D-Trp，D-Thr-His-D-Mrp，Cys-Tyr-GAB，Ala-His- Trp，

Ala-His-D-Mrp，Tyr-Ala-His-D-Trp，Tyr-Ala-His-D-Mrp，D- Ala-D-Trp，

或D-Ala-D-Mrp；

AA2为Ala，D-Nal，D-Lys，D-Mrp，或Trp；

AA3为D-Trp，D-Nal，D-Trp，Mrp，D-Mrp、Phe，或D-Phe；

AA4为D-Trp，Mrp，D-Mrp，Phe，或D-Phe；和

R为-NH2，Thr-NH2，或D-Thr-NH2

含有D-Mrp单位的化合物是优选的。

在另一个实施方案中，有用的化合物包括那些在U.S.权利申请 No.09/089,954(1998年6月3日申请)中所述的化合物。这些化合物是 具有通式II的肽类化合物：

                        A-B-D-Mrp-C-D    (II)

其中

A为H或Tyr；

B为具通式III的螺内酰胺

其中的R1为H或Tyr，R2为任意一个天然存在的氨基酸侧链，*处的构 型为(R)，(S)或其混合物；式IV三环化合物

其中的R3为H或Tyr，*处的构型为(R)，(S)或其混合物；式V双 环化合物

其中的R4为H或Tyr，*处的构型为(R)，(S)或其混合物；

D-Mrp为右旋-2-甲基-Trp；

C为

Trp-Phe-Lys，D-Trp-Phe-Lys，Mrp-phe-Lys，D-Mrp-Phe- Lys，Trp-Lys，

D-Trp-Lys，Mrp-Lys，D-Mrp-Lys，Ala-Trp-D-Phe-Lys，Ala- Mrp-D-Phe-Lys，

Ala-D-Mrp-D-Phe-Lys，D-Lys-Trp-D-Phe-Lys，D-Lys-Mrp-D- Phe-Lys，

D-Lys-D-Mrp-D-Phe-Lys，

或式VI三环化合物

其中的R5为H或SO2Me，并且*处的构型为(R)，(S)或其混合物；

且

E为Lys-NH2或-NH2，条件是C为前面定义的三环化合物VI时，E为 Lys-NH2。

根据本发明，现已发现，GH释放化合物及不释放GH的化合物均对 肿瘤的治疗有作用。根据本发明，优选的可治疗肿瘤包括肺肿瘤、乳腺 肿瘤、甲状腺肿瘤或胰腺肿瘤。

特别优选的具式I的GH释放化合物包括以下化合物：

His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

His-D-Trp-Ala-Mrp-D-Phe-Lys-NH2，

D-Thr-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

IMA-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2，

IMA-D-Mrp-D-Nal-Phe-Lys-NH2，

GAB-D-Mrp-D-Mrp-D-Mrp-Lys-NH2，

D-Ala-D-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

INIP-D-Nal-D-Nal-Phe-Lys-NH2，

INIP-D-Nal-D-Trp-Phe-Lys-NH2，

IMA-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

INIP-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2，

INIP-D-Mrp-D-Nal-Phe-Lys-NH2，

GAB-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2，

TXM-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2，

GAB-D-Mrp-Mrp-Phe-Lys-NH2，

Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-Thr-NH2，

His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

D-Thr-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

GAB-D-Mrp-D-Nal-Phe-Lys-NH2，

GAB-D-Mrp-D-Mrp-Mrp-Lys-NH2，

Cys-Tyr-GAB-D-Mrp-D-Mrp-Mrp-Lys-NH2，

Tyr-Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，和

D-Ala-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

优选的具通式I的不释放GH的化合物包括：

His-D-Trp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

His-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

His-Ala-D-Trp-Lys-Mrp-D-Phe-Lys-NH2，

His-D-Mrp-D-Lys-Mrp-D-Phe-Lys-NH2，

His-Ala-D-Trp-Ala-Mrp-D-Phe-Lys-NH2，和

His-D-Trp-Ala-Mrp-D-Phe-Lys-NH2，

优选的具通式II的化合物包括：

[S，S-Spiro(Pro-Leu)]-D-Mrp-D-Trp-Phe-Lys-NH2，

(S，S-Spiro(Pro-Leu)]-D-Mrp-Mrp-Lys-NH2，

[S，S-Spiro(Pro-Leu)]-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

(S，S-Spiro(Pro-Leu)]-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

Tyr-[S，S-Spiro(Pro-Leu)]-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

[S，S-Spiro(Pro-Ile)]-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

[S，S-Spiro(Pro-Leu)]-D-Mrp-D-HNH-(SO2CH3)-Phe-Lys-NH2，

HAIC-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH2，和

ATAB-D-Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH2，

其中的S，S-螺(Pro-Leu)和S，S-螺(Pro-Ile)相应地为4-甲基-2S[6’- 氧-(5’-S)1’，7’-二氮杂螺[4，4]壬烷-7’-基-]戊酸酯(盐)和3-甲基-2S[6’- 氧-(5’-S)1’，7’-二氮杂螺[4，4]壬烷-7’-基-]戊酸酯(盐)。

这些单位具有下式：

其中的R1为H且R2为Leu或Ile的侧链(参见P.Ward等人，J.Med. Chem.，33，1848(1990)。同样，对具有下式的相应的四氢降哈尔满-3- 羧酸进行常规的氢化反应，可以得到三环化合物HNH

根据式III，IV，V和VI，这些单位构成仿肽单位，它们的优势在于 它们锁于β-构型，从而可以模仿天然氨基酸。

如有所需，还可以使用这些化合物制药上可接受的盐类。这些盐类包 括有机或无机加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乙酸 盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐、苯甲酸盐、苹果酸 盐、富马酸盐、硬脂酸盐或双羟荼酸盐。

根据肽化学中常用的方法可以方便地合成所有的化合物，例如通过固 相肽合成方法(参见E.Atherton和R.C.Sheppard在1989年由牛津大 学出版社IRL出版的“固相肽合成”中的描述)，或通过溶液相合成方法 (参见J.Jones在“肽类的化学合成”，Clarendon出版社，牛津1994中 的描述)，或通过本领城内已知的固相-和液相方法的组合。

固相合成从化合物的C末端开始。将需要的保护α-氨基酸连接到氯 代甲基化的树脂、羟甲基化树脂、二苯甲基胺树脂(BHA)或对-甲基- 二苯甲基树脂(p-Me-BHA)上，可以制备得到合适的起始物质。例如， 市售的氯代甲基化的树脂来自BioRad Laboratories，Richmond， California的Biobeads SX1。羟甲基化树脂的制备可以按照Bodansky等 人在Chem.Ind.(London)，38，15997(1966)中所述的方法进行。BHA 树脂的制备方法可以参见Pietta和Marshall，在Chem.Comm.，650 (1970)中的描述，并可以在Peninsula Laboratories Inc.，Belmont， California购得。

在起始连接之后，通过不同的酸试剂除去α-氨基酸的保护基团，例 如室温下溶于有机溶剂中的三氟乙酸(TFA)或盐酸(HCl)。除去α-氨 基酸的保护基团之后，可以按照需要的顺序一步一步地使剩余的保护天 然氨基酸或相应于通式III、IV、V和VI单位的羧酸(其本身即构成氨 基酸)进行偶联。通常使用约3倍过量的合适羧基活化基团(例如溶解 于二氯甲烷(CH2Cl2)、二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物中的二环己 基碳化二亚胺(DCC)或二异丙基碳化二亚胺(DIC))使每一个保护氨 基酸进行反应。在完成所需的氨基酸序列之后，通过用氟化氢(HF)等 试剂进行处理，使需要的化合物从支持树脂上断裂下来，上述试剂不仅 使化合物从树脂上断裂下来，而且使外侧链的保护基团断裂下来。当采 用氯代甲基化的树脂时，采用HF的处理导致了具有终端酸基团化合物 的形成，并且该化合物以游离形式存在。当采用BHA或p-Me-BHA树 脂时，采用HF的处理直接导致了具有终端酰胺基团化合物的形成，并 且该化合物以游离形式存在。

可用来治疗哺乳动物(包括人类)肿瘤的药物包括本发明化合物及其 制药上可接受的盐类，或本发明化合物及其制药上可接受盐类任意地与 载体、赋形剂、媒介物、稀释剂、基质或缓释包衣相混合物的组合物。 这些载体、赋形剂、媒介物、稀释剂的实例可在Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th，A.R.Gennaro，Ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA 1990中找到。

本领域技术人员可将本发明中的任意化合物配成适合于经过非肠道、 颊、直肠、阴道、皮透、肺或口服等途径给药的药物。

根据需要的释放速率，可以选择含有化合物药物的配方类型，例如， 如果需要化合物迅速释放，可以采取鼻腔或静脉途径。

可以治疗有效剂量给予哺乳动物(包括人类)这些药物，本领域技术 人员可以很容易地决定所述的治疗有效剂量，并需要根据物种、年龄、 性别、治疗患者或对象的体重以及给药途径对该剂量进行适当的变化。 例如对于人类而言，当采取静脉给药时，优选的剂量下降至约1-25μg总 化合物/Kg体重。当采取口服给药时，通常需要较高的剂量。例如在人 类进行口服给药时，典型的剂量水平约为30-1000μg总化合物/Kg体重。 根据上述公开，可以根据经验决定药物的准确剂量。

实施例

下列实施例将说明用于治疗本发明肿瘤的最优选化合物的效力。

1.方法和材料

a)化学品

海噻瑞林(His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2)，Ala-海噻瑞林 (Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2)，Tyr-Ala-海噻瑞林(Tyr- Ala-His-D-Mrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2)，MK0677(N-[1(R)([1，2- 二氢-1-甲磺酰基螺-(3H-吲哚，3，4’-哌啶)-1’基l-2-(苯基甲氧基)乙基]-2- 氨基-甲基丙酰胺-甲磺酸酯(盐))，EP80317(HAIC-D- Mrp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH2)和D-(Lys)3-GHRP6(His-D- Trp-D-Lys-Trp-D-Phe-Lys-NH2)由Europeptides(Argenteuil，法国) 提供.人类GHRH(GHRH 1-44)和生长激素释放抑制因子(生长激素 释放抑制因子1-14)可从Bachem(Bubendorf，Switzerland)购买。人 类重组表皮生长因子(EGF)以及所有的组织培养试剂可从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO，USA)购买。3H-胸腺嘧啶可从 Pharmacia-Amersham Italia(Milan，Italy)购买。

b)人类组织

从Turin大学生物医学科学和人类肿瘤学系(病理学分部)采集外科 肿瘤标本.将邻近用于医院病理学诊断的肿瘤切片立即冷冻在-80℃下， 并储存2-6个月，直至进一步加工用于结合研究。采用13个侵入乳腺癌 样品(10个为导管的，3个为小叶的)，14个非内分泌肺癌样品(5个鳞 状细胞和9个腺癌细胞)，11个内分泌肺肿瘤样品，9个内分泌胰腺肿瘤 样品以及12个甲状腺肿瘤样品(7个卵泡起源的，5个髓起源的)。同时 对每一个肿瘤样品相应器官非肿瘤正常组织进行平行分析。

c)肿瘤细胞系

从ATCC(Rockville，MD，USA)购买人类肺肿瘤细胞样品 (CaLul)、T47D和MDA-MB231以及人类雌激素依赖和不依赖乳腺癌 细胞系。在37℃并5％CO2和95％的湿度下于25cm3烧瓶中供济有 10％FCS的RPMI中对细胞进行常规培养。当达到亚融合状态时，用胰 蛋白酶/EDTA从烧瓶中分离出细胞。

d)GHRP受体分析

按照G.Muccioli等人在Journal of Endocrinology，157，99-106，1998 中所述的方法，采用125I-Tyr-Ala-海噻瑞林作为配体，可以测定肿瘤膜 上的GHRP受体。计算在缺乏和有过量未标记Tyr-Ala-海噻瑞林存在下 特异性结合的差异，并用加入的放射活性的百分比来表示。用GraphPAD Prism 2程序(GraphPAD Software，San Diego，CA，USA)对饱和及 竞争性结合研究进行分析。

e)细胞繁殖研究

按照G.Muccioli等人在Journal of Endocrinology，153，365-371， 1997中所述的3H-胸腺嘧啶混入方法对DNA合成进行评价。在缺乏和有 不同浓度(10-8-10-6mol/l)海噻瑞林、Ala-海噻瑞林、Tyr-Ala-海噻瑞林、 MK0677、D-(Lys)3-GHRP6或EP80317存在下，用单独培养基(基 线)或带有EGF(1ng/ml)的培养基对饥饿细胞进行培养。培养20小时 后，加入3H-胸腺嘧啶，继续培养4小时。终止反应，将细胞收集于玻璃 纤维滤纸条上。用闪烁计数器测定3H-胸腺嘧啶的混入。

按照P.Cassoni等人在Virchows Archiv，425，467-472，1994中所描 述的方法进行细胞生长研究。在24多孔平皿中种植细胞，密度为 5,000-10,000细胞/ml，共3份平行样品。种植24小时后，改变培养基。 在需要处加入海噻瑞林或Ala-海噻瑞林，浓度为10-8-10-6mol/l。每48小 时改变培养基。采用血细胞计，由两个独立的调查者以双盲分析的方式， 在处理48、72、96小时对细胞进行计数。

f)统计分析

除非另有说明，数据以平均值或平均值±S.E.M.表示。采用 Mann-Whitnry检验或单道ANOVA来决定统计显著性。所有的实验至少 做3份平行样。

2.结果

a)在不同人类肿瘤中GHRP及其拮抗剂受体的鉴别

肺和乳腺非内分泌肿瘤以及胰腺和甲状腺(小叶型)内分泌肿瘤显示 出中等程度的特异性结合值，从统计学角度而言，高于在相应的非肿瘤 正常组织中得到的结果。相反，在正常组织和肺或甲状腺(髓型)内分 泌肿瘤之间在特异性结合值方面却没有差异。

b)GHRP及其拮抗剂受体的生化特征

为了测定125I-Tyr-Ala-海噻瑞林与肿瘤膜的结合是否显示配体-受体相 互作用的典型性质，在肺起源的非内分泌肿瘤(其显示出最高的特异性 结合值)中对放射示踪物的结合进行了更加详细的调查。此项研究揭示 了可饱和的特异性结合的证据，并且Scatchard分析显示出存在单类的高 亲和力部位。

通过测定不同化合物与放射配体竞争肿瘤结合部位的能力，可以建立 125I-Tyr-Ala-海噻瑞林结合的特异性。放射示踪物的结合以剂量依赖方式 被海噻瑞林、Ala-海噻瑞林、Tyr-Ala-海噻瑞林以及GHRP拮抗剂所取 代，所述的拮抗剂例如有D-(Lys)3-GHRP6和EP80317(一种海噻瑞 林的(氨基-氮杂-吲哚)D-(Lys)3衍生物，其在新生大鼠中不释放 GH)。在MK0677(一种与垂体GHRP受体结合的非肽基GHRP模仿物) 存在下，观察到不可忽略的取代。相反，在GHRP或生长激素释放抑制 因子存在下，没有观察到竞争。

c)GHRP及其拮抗剂对3H-胸腺嘧啶混入的作用

浓度为10-6mol/l的海噻瑞林可以抑制人类肺肿瘤细胞中基本的和 EGF-刺激的3H-胸腺嘧啶混入。当在有10-6mol/l的Ala-海噻瑞林、Tyr- Ala-海噻瑞林或GHRP拮抗剂所取代(例如D-(Lys)3-GHRP6和 EP80317)存在下对细胞进行培养时，也观察到这种抗增殖作用。相反， 在MK0677存在下，仅观察到轻微的抑制。采用增加浓度的海噻瑞林、 Ala-海噻瑞林、Tyr-Ala-海噻瑞林、D-(Lys)3-GHRP6和EP80317的实 验揭示这些化合物抑制了EGF对人类肺肿瘤细胞的增殖作用，所述的肺 肿瘤细胞以剂量-依赖方式被抑制。EP80317的EC50值为5.6×10-8mol/ l，Tyr-Ala-海噻瑞林的EC50值为6.5×10-8mol/l，海噻瑞林的EC50 值为8×10-8mol/l，D-(Lys)3-GHRP6的EC50值为9×10-8mol/l， Ala-海噻瑞林的EC50值为1×10-7mol/l。

d)GHRP对细胞生长的作用

在人类肺肿瘤细胞中，与具有显著作用的对照相比(-47％)，仅在 96小时后浓度为10-8mol/l的海噻瑞林可以引起细胞数量的下降。这种 作用在10-7mol和10-6mol时会进一步增加，并可以在任意的实验时间 点被观察到。

在人类乳腺癌T47D细胞中，与具有显著作用的对照相比(-54％)， 仅在96小时后浓度为10-8mol/l的海噻瑞林可以引起细胞数量的下降。 这种作用在10-7mol和10-6mol时会进一步增加，并可以在任意的实验 时间点被观察到。Ala-海噻瑞林对这些肿瘤细胞也显示出相似的抗增殖作 用。

在人类乳腺癌MDA-MB231细胞中，与具有显著作用的对照相比 (-33％)，仅在72小时后浓度为10-8mol/l的海噻瑞林可以引起细胞数 量的下降。这种作用在10-7mol和10-6mol时会进一步增加，并可以在 任意的实验时间点被观察到。Ala-海噻瑞林对这些肿瘤细胞也显示出相似 的抗增殖作用。

这些实验结果证明，合成的生长激素释放肽及其拮抗剂可以在体外 抑制人类肿瘤细胞的生长。这种抗增殖作用是由特异性的受体介导的。

本申请是中请日为1999年11月11日、申请号为99813361.2、发明名 称为“通过给予生长激素释放化合物或其拮抗剂来治疗肿瘤”的中国发 明专利申请的分案申请。