发明背景

种子油含量在传统上是通过植物育种来加以改进的。使用重组DNA技术改 变种子油组分可以加速这一过程，并能在某些情况下以单用育种无法实现的方法 改变种子油。通过修饰大量脂质代谢基因的表达，芸苔属的油组成已经得到显著 改变。改进种子油组分的这些操作注重于改变内源性组分脂肪酸的比例。例如， 反义阻遏转基因油菜籽中的Δ12-去饱和酶基因已经导致油酸增加至高达83％。 Topfer等人，1995年Science 268：681-686。

在修饰转基因植物种子油组分上，通过导入允许产生宿主植物以前不能合成 的脂肪酸的新基因，已有一些成功的尝试。Van de Loo等人，(1995 Proc.Natl.Acad. Sci.USA 92：6743-6747)已经能够将Δ12-羟化酶基因导入转基因烟草中，从而将 新的脂肪酸—蓖麻油酸导入其种子油中。已报道携带构建物植物的油累积是中等 程度的，其中羟化酶基因的转录在花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的控制下。 类似地，将烟草植物进行基因工程改造成为能通过芫荽酰基-ACP去饱和酶的表 达来产生低含量的岩芹酸(Cahoon等人，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11184-11188)。

长链脂肪酸(C18和更长)作为营养学上和医学上重要的食物以及工业产品， 具有显著的经济价值(Ohlrogge，J.B.1994 Plant Physiol.104：821-826)。亚油酸(18∶2 Δ9，12)和α亚麻酸(18∶3 Δ9，12，15)是许多种子油中发现的基本脂肪酸。现已通过育 种和生物技术来操纵油籽植物中这些脂肪酸的含量(Ohlrogge等人，191 Biochim. Biophys.Acta 1082：1-26；Topfer等人，1995 Science 268：681-686)。另外，种子油中 产生的新脂肪酸可广泛用于人类健康和工业用途。

现认为摄取富含γ亚麻酸(GLA)(18：3 Δ6，9，12)的植物油可以缓解与易感冠心 病相关的高胆固醇血症和其它相关的临床疾病(Brenner R.R.1976 Adv.Exp.Med. Biol.83：85-101)。食用GLA的治疗效果可能是由于它起着前列腺素合成前体的作 用(Weete，J.D.1980″真菌和其它生物体的脂质生物化学″Plenum Press编辑，New York，59-62页)。亚油酸(18∶2)(LA)通过酶Δ6-去饱和酶转化成γ亚麻酸 (18∶3)(GLA)。

很少的种子油含有GLA，尽管含有高含量的前体-亚油酸。这是因为大多数 植物中缺少Δ6-去饱和酶活性。例如，只有琉璃苣(Borago officinalis)、月见草 (Oenothera Biennis)和黑茶簏子(Ribes nigrum)产生相当数量的亚麻酸。在这三种植 物中，只有月见草和琉璃苣被作为GLA商品来源进行培育。如果通过引入异源 Δ6-去饱和酶基因，将农业种子油基因工程改造成产生大量GLA，那么将会获益。 如果与脂肪酸合成和脂质代谢有关的其它表达产物也能在植物中产生足够高的 水平，从而能进行特定表达产物的商品化生产，那么这也会获益。

如美国专利No.5,552,306中所公开的，最近分离获得了蓝澡目细菌Δ6-去饱 和酶基因。这些蓝藻目细菌基因在转基因烟草中的表达产生了明显的但低水平的 GLA累积。(Reddy等人，1996 Nature Biotech.14：639-642)。申请人的待批美国申 请No.08,366,779公开了从植物琉璃苣分离获得Δ6-去饱和酶及其在CaMV35S启 动子控制下在烟草中的表达。这些表达在种子内导致了明显的但低含量的GLA 和十八碳四烯酸(ODTA或OTA)的累积。因此，需要有一种启动子，该启动子能 在植物中起作用并能始终指导脂质代谢基因在转基因植物种子中的高水平表 达。

向日葵胚累积两种主要储藏蛋白。它们是可溶于1M NaCl的11S球蛋白和可 溶于水的2S白蛋白(Youle等人，1981 Am J.Bot 68：44-48)。在欧洲油菜(Crouch等 人，1983 J.Mol.Appl.Genet.2：273-284；Ericson等人，1986 J.Biol.Chem. 261：14576-14581)、豌豆(Higgins等人，1986 Plant Mol.Biol.8：37-45)、萝卜 (Laroche-Raynal等人，1986 Eur.J.Biochem.157：321-327)、蓖麻子(Lord J.M.，1985 Eur.J.Biochem 146：403-409)和巴西坚果(Sun等人，1987 Eur.J.Biochem 162：477- 483)中已经深入研究了2S白蛋白种子蛋白的合成、加工和累积。这些研究的主要 结论是：成熟种子中发现的特征为低分子量的二硫键连接的白蛋白多肽从胚体形 成时合成的较大前体延伸加工而来。确定2S白蛋白种子储藏蛋白的其它两个特 征是高的酰胺含量和高频率的半胱氨酸残基(Youle等人，1981)。

在向日葵中，2S白蛋白占种子中蛋白的50％以上(Youle等人，1981)，并且由 两个或三个紧密相关的、分子量约为19kDa的多肽组成(Cohen，E.A.，1986″向日 葵2S种子储藏蛋白基因的分析″MS thesis，Texas A&M University；Allen等人， 1987 Plant Mol Biol5：165-173)。向日葵白蛋白在表观上通过分子内二硫键维持在 致密结构内，因而当用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在非还原性条件下 分析时，以表观分子量14kDa呈迅速迁移的物质。在还原条件下，该物质以19kDa 多肽迁移(Cohen，E.A.，1986)。相反，其它大多数2S蛋白都由大的和小的从一个 前体获得的通过分子间二硫键连接的亚单位多肽组成，(Crouch等人，1983 J.Mol. Appl.Genet.2：273-284；Ericson等人，1986 J.Biol.Chem.261：14576-14581；Sun等 人，1987，Eur.J.Bioch.162：477-483)。

向日葵胚中白蛋白多肽可在授粉后(DPF)5天检测到，在可检测到半日花素 (helianthinin)前2天，并在种子成熟期继续累积。向日葵白蛋白mRNA也首先在 5DPF时检测到，并在向日葵胚体中迅速累积，在12和15DPF间达到最高。此后， 白蛋白转录物的会计师降低，其动力学与半日花素的RNA观察到的类似(Allen 等人，1987)。在干种子、发芽籽苗或叶子(Cohen 1986)中没有检测到功能性向日 葵白蛋白mRNA(Cohen 1986)。

已经从不同植物种类(包括向日葵(Allen等人，1987 Mol-Gen Genet.210：211- 218)和豌豆(Higgins等人，1986 J.Biol.Chem 261：11124-11130))中分离出许多白蛋 白cDNA和基因组克隆。和其它类种子蛋白如欧洲油菜(Crouch等人，1983；Ericson 等人，1986)一样，2S白蛋白种子蛋白由小基因家族编码。

本发明提供了向日葵白蛋白基因的5′调控序列，该序列指导脂质代谢基因在 转基因植物中高水平表达。本发明提供了嵌合构建物，该构建物包含的向日葵白 蛋白5′调控区与脂质代谢基因(如Δ6-去饱和酶基因)的编码序列操作性相连。包含 本发明嵌合构建物的转基因植物将GLA累积至C18脂肪酸的大约10％。这在月 见草(GLA的主要商品化来源)的GLA累积范围内。

发明概述

本发明涉及向日葵白蛋白基因的5′调控区。该5′调控区在与异源基因的编码 序列或与天然植物基因互补的序列操作性相连时，指导了异源基因或互补序列在 植物种子中的表达。

因此本发明提供了表达盒和表达载体，它们包含的白蛋白5′调控区与异源基 因或天然植物基因的互补序列操作性相连。

本发明还提供了含有该表达盒和表达载体的植物转化载体，以及用这些载体 转化的植物细胞，以及含有该载体的植物及其子代。

在本发明的一个实例中，该异源基因或互补序列是脂肪酸合成基因或脂质代 谢基因。

在本发明的另一个方面，提供了一种生产脂肪酸合成或脂质代谢基因产物水 平增加的植物的方法。

特别是，提供了一种生产脂肪酸合成或脂质代谢基因产物水平增加的植物的 方法，此方法是用本发明的表达盒和表达载体转化植物，该表达盒和表达载体包 含白蛋白5′调控区以及脂肪酸合成或脂质代谢基因的编码序列。

在本发明的另一个方面，提供了一种共同抑制天然脂肪酸合成或脂质代谢基 因的方法，该方法是用本发明的表达盒和表达载体转化植物，该表达载体包含白 蛋白5′调控区以及脂肪酸合成或脂质代谢基因的编码序列。

本发明的另一个方面提供了减少天然植物基因(如脂肪酸合成基因或脂质代 谢基因)产生的方法，该方法是用表达载体转化植物，该表达载体包含的白蛋白5′ 调控区与天然植物基因互补的核酸序列操作性相连。

本发明还提供了调节异源基因或天然植物基因(如脂肪酸合成或脂质代谢基 因)水平的方法，该方法是用本发明的表达盒和表达载体转化植物。

附图简述

图1显示了琉璃苣Δ6-去饱和酶基因(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列和对应的氨 基酸序列。细胞色素b5血红素结合基序用方框表示，推定的金属结合、富含组 氨酸基序(HRM)用下划线表示。引物(PCR分析)识别的基序用下划虚线表示，即 tgg aaa tgg aac cat aa；和gag cat cat ttg ttt cc。

图2是显示琉璃苣Δ6-去饱和酶与其它膜结合去饱和酶相似性的树状图。用 Gene Works(IntelliGenetics)比较了琉璃苣Δ6-去饱和酶与其它已知去饱和酶的氨 基酸序列。数值与所比较的亚组之间的相对种系间距相关。

图3A提供了从野生型烟草′xanthi′的叶组织衍生的脂肪酸甲酯(FAMES)的气 液色谱曲线。

图3B提供了从烟草植物叶组织获得的FAMES的气液色谱曲线，该植物用 在CaMV 35S启动子控制下的琉璃苣Δ6-去饱和酶cDNA(pAN2)转化。图示的峰对 应于亚油酸甲酯(18∶2)、γ-亚麻酸甲酯(18∶3γ)、α-亚麻酸甲酯(18∶3α)和十八碳四烯 酸甲酯(18∶4)。

图4是HaG5调控区的核苷酸序列。转录起始位点(+1)由粗体T标出。有下 划线的BamHI限制性位点通过PCR引入。

图5显示了向日葵白蛋白HaG5调控区/Δ6-去饱和酶基因表达载体的构建方 案。

图6A是琉璃苣叶、根和12dpp胚组织中分离的5微克RNA样品上进行的 RNA凝胶印迹分析，采用了标记的琉璃苣Δ6-去饱和酶cDNA作为杂交探针。

图6B显示了对应于图6所示试验的Northern分析结果图。

图7是显示琉璃苣Δ6-去饱和酶基因存在于油籽油菜转化植物中的PCR分 析。泳道1、3和4中加入和植物DNA进行的PCR反应物，该植物经与油质蛋 白5′调控区相连的琉璃苣Δ6-去饱和酶基因转化；泳道2：连接白蛋白5′调控区的 琉璃苣Δ6-去饱和酶基因转化的植物的DNA；泳道5和6：未转化植物的DNA； 泳道7：分子量标记(1kb序列梯，Gibco BRL)；泳道8：PCR没有加入模板DNA； 泳道9：根癌农杆菌EHA105的DNA对照，含有质粒pAN3，琉璃苣A6-去饱和 酶基因与油质蛋白5′调控区相连。

发明详述

本发明提供了编码向日葵白蛋白基因5′调控区的分离的核酸。根据本发明， 该5′调控区在与异源基因编码序列或天然植物基因互补序列操作性相连时，指导 编码序列或互补序列在植物种子中表达。本发明的白蛋白5′调控区可用来构建表 达盒，该表达盒从5′到3′方向包括本发明的白蛋白5′调控区、在该调控区控制下 的异源基因或与天然植物基因互补的序列，以及3′终止序列。该表达盒可以插入 各种自主复制的载体，从而构建一个表达载体。

根据本发明，已经惊奇地发现，本发明表达载体转化的植物可累积GLA至 C18脂肪酸的大约10％。这种累积在月见草(GLA的主要商品化来源)的GLA累 积范围内。

本文所用的术语“盒(cassette)”指能表达特定基因的核苷酸序列，如果所述 基因的插入与该核苷酸序列中存在的一个或多个调控区操作性相连。因此，例 如，表达盒可包含希望在植物种子内表达的异源编码序列。因此，本发明的表达 盒和表达载体可用来指导任何数量的异源基因的种子特异性表达。本文所用的术 语“种子特异性表达”指在植物种子不同部位(如胚乳和胚体)中表达。

编码向日葵白蛋白基因的5′调控区的分离的核酸可按下述方式提供。用代表 白蛋白mRNA的cDNA(或其部分)筛选向日葵基因组DNA文库，分离获得白蛋 白重组基因组克隆。已经分离出许多不同的白蛋白cDNA。用来分离这些cDNA 和核苷酸以及对应氨基酸序列的方法已公开。Higgins等人，1986 J.Biol.Chem. 261：11124-11130；Allen等人，1987 Molecular Approaches to Developmental Biology， Alan R.Liss，Inc.，415-424页。

例如，在Sambrook等人1989年《分子克隆实验手册》(Cold Spring Harbor，NY) 或许多关于重组DNA技术的试验手册中提供了认为可用以获得白蛋白基因组重 组DNA的方法，这些方法已广泛用于测定核苷酸序列，本领域普通技术人员可 采用并知道多种技术。例如，含有白蛋白调控区的限制性片段可被亚克隆到测序 载体(如pBluescript(Stratagene))的多接头位点中。然后，可以用双链双脱氧法(Chen 和Seeburg，1985，DNA 4：165)对这些pBluescript亚克隆测序。

在一个较佳的实例中，向日葵白蛋白调控区包含图4的核苷酸860至+29(SEQ ID NO：2的核苷酸1-895)。对SEQ ID NO：2所示白蛋白调控区的修饰(维持指导 种子特异性表达的特性)在本发明范围内。这些修饰包括一个或多个核苷酸的插 入、缺失和替代。

本发明的5′调控区可从限制性内切酶或外切酶消化白蛋白基因组克隆来获 得。因此，例如，将分离的白蛋白基因编码区的已知核苷酸或氨基酸序列与分离 的白蛋白基因组克隆的核酸或推定的氨基酸序列以及分离的白蛋白基因组克隆5′ 侧接序列(即编码区翻译起始密码子上游序列)作序列对比。

SEQ ID NO：2所示白蛋白5′调控区(图4的核苷酸-860至+29)可以从具有越 过5′侧接序列或编码序列的基因组克隆通过外切核酸酶III介导的缺失来产生。 这通过用外切核酸酶III(exoIII)消化合适制备的DNA并在消化期间在时间间隔渐 增中除去各个等份来实现。可对连续获得的较小的DNA片段进行测序，以确定 缺失的确切端点。现有几种商品化系统采用外切核酸酶III(exoIII)来产生这种缺 失系列，例如Promega Biotech、“Erase-A-Base”系统。另外，可确定PCR引物 来直接扩增本发明的5′调控区。

采用同一方法学，普通技术人员可产生SEQ ID NO：2所示核苷酸1-895的一 个或多个缺失片段。包含SEQ ID NO：2所示核苷酸毗邻部分并保留指导种子特 异性表达能力的任一和所有缺失片段均是本发明所考虑的。

指导种子特异性表达、包含SEQ ID NO：2核苷酸1-895的白蛋白5′调控序列 及其修饰或缺失片段的鉴定可以这样来实施：使特异性序列与异源基因的编码序 列转录融合，将嵌合基因转移到合适宿主中，并检测异源基因的表达。用来检 测表达的试验取决于异源序列的特征。例如，通常用报道基因(典型的是氯霉素乙 酰转移酶和β-葡糖醛酸酶(GUS))来评价嵌合构建物的转录和翻译能力。可用标准 试验来灵敏地检测转基因生物体中的报道酶。β-葡糖醛酸酶(GUS)基因可用作转 基因植物中的启动子活性报道物，因为该酶在植物细胞中高度稳定，高等植物中 没有内在的β-葡糖醛酸酶活性，并可利用定量荧光试验和组织化学定位技术。 Jerfferson等人(1987 EMBO J 6：3901)已经建立了检测植物组织中GUS活性的生物 化学和组织化学标准程序。生物化学试验这样进行：将植物组织裂解液与4-甲基 伞形基(umberlliferyl)-β-D-葡糖苷酸(GUS的荧光底物)，37℃培育1小时，然后测 定所产生的4-甲基伞形酮的荧光。GUS活性的组织化学定位这样来测定：将植物 组织样品培育在5-溴-4-氯-3-吲哚基-葡糖苷酸(X-Gluc)中37℃约18小时，观察 X-Gluc的染色图形。这些嵌合基因的构建能确定特异性调控序列，并证明这些序 列能指导异源基因以种子特异性方式表达。

本发明的另一个方面涉及一种嵌合植物基因，该基因包含指导种子特异性表 达的白蛋白基因5′调控区，其与异源基因的编码序列操作性相连，从而使调控元 件能控制异源基因编码的产物的表达。异源基因可以是除白蛋白外的其它任何基 因。如果需要，嵌合构建物中可包括附加的调控元件、或足以导致产生有效量异 源基因编码多肽表达的这些元件的部分。

因此，本发明提供了嵌合基因，该基因包含的白蛋白5′调控区序列赋予了种 子特异性表达，并与异源基因(如脂质代谢酶)编码序列操作性相连。用于实践本 发明的脂质代谢和脂肪酸合成基因的例子包括脂质去饱和酶，如Δ6-去饱和酶、 Δ12-去饱和酶、Δ15-去饱和酶和其它相关去饱和酶，如硬脂酰-ACP去饱和酶、 酰基载体蛋白(ACP)、硫酯酶、乙酰转酰酶、乙酰辅酶A羧化酶、酮酯酰合成酶、 丙二酰转酰酶和延伸酶(elongase)。这些脂质代谢和脂肪酸合成基因已经从许多不 同细菌和植物种类中得到分离和鉴定。它们的核苷酸编码序列以及分离这些编码 序列的方法揭示在公开的文献中，并且是本领域那些技术人员能广泛获得的。

特别是，美国专利No.5,552,306和申请人待批美国申请No.08/366,779(1994 年12月30日提交，纳入本文作参考)中揭示的Δ6-去饱和酶基因被认为是特别适 用于实施本发明的脂质代谢基因。

本发明的嵌合基因通过连接白蛋白基因组DNA的5′调控区和异源基因的编 码序列来构建。这些序列的并置可通过各种方式来实现。在一个较佳的实例中， 序列顺序(从5′到3′)是白蛋白5′调控区(包括启动子)、编码序列、包括聚腺苷酸位 点的终止序列。

构建这些嵌合基因的标准技术是本领域普通技术人员所熟知的，并可在诸如 Sambrook等人(1989年)的参考文献中找到。可采用各种策略来连接DNA片段， 策略的选择取决于DNA片段末端的性质。本领域普通技术人员知道，为了使异 源基因表达，构建物需要启动子元件和使转录物有效聚腺苷酸化的信号。因此， 可将含有共有启动子序列(称为TATA盒)的白蛋白5′调控区可与无启动子异源编 码序列直接连接。

将含有白蛋白TATA盒的限制性或缺失片段正向连接于无启动子的异源基 因(如β-葡糖醛酸(GUS)的编码序列)。本领域技术人员知道，本发明的白蛋白5′ 调控区可以其它方式提供，例如化学或酶法合成。异源编码序列的3′末端可任选 地连接于一个终止序列，该终止序列包含一个聚腺苷酸化位点，典型的是(但不局 限于)胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化位点、或章鱼氨酸T-DNA基因7聚腺苷酸化位 点。或者，聚腺苷酸位点可以由异源基因提供。

本发明还提供了增加植物种子中异源基因水平的方法。根据这些方法，将本 发明的表达盒和表达载体导入植物中，以实现异源基因的有效表达。例如，提供 了一种脂肪酸合成酶或脂质代谢基因产物水平有所增加的植物的生产方法，此方 法是用表达载体转化植物细胞，该表达载体含有的白蛋白5′调控区与脂肪酸合成 或脂质代谢基因操作性相连，重新产生所述脂肪酸合成或脂质代谢基因产物水平 有所增加的植物。

本发明另一方面提供了减少植物天然基因产物水平的方法，该方法包括用表 达载体转化植物细胞，该载体包含的本发明的白蛋白调控区与该天然植物基因互 补性核酸序列操作性相连。这样，天然植物基因的内源性产物水平通过称为反义 调节的机制而减少。因此，例如通过用表达载体(该载体包含的本发明的白蛋白5′ 调控区和编码脂肪酸合成的核酸序列或脂质代谢基因互补的核酸序列操作性相 连)转化植物，减少了脂肪酸合成基因或脂质代谢基因产物的水平。

本发明还提供了协同抑制植物中天然存在的基因的方法，该方法包括用表达 载体转化植物细胞，该载体包含的本发明白蛋白调控区与编码天然植物基因的核 酸序列操作性相连。这样，天然植物基因内源性产物的水平通过称为协同抑制的 机制而减少。因此，例如，通过用一表达载体(该载体所含本发明白蛋白5′调控区 与编码植物天然脂肪酸合成或脂质代谢基因的核酸序列操作性相连)转化植物，就 可减少脂肪酸合成基因或脂质代谢基因的产物水平。尽管对协同抑制的确切机理 还不完全了解，但本领域技术人员对于报道的协同抑制试验条件和结果的公开研 究工作(Napoli等人，1990 The Plant Cell 2：270-298；Van der Krol 1990 The Plant Cell 2：291-299)是熟知的。

为了调节异源或天然基因的表达，用本发明的嵌合基因构建物转化植物。基 因转移的方法是本领域中熟知的。可通过叶圆片转化-再生程序(如Horsch等人 (1985)Science 227：1229所述)将嵌合基因导入植物内。也可采用其它转化方法， 如原生质体培育(Horsch等人，1984，Scienc 223：496，DeBlock等人，1984 EMBO J. 2：2143，Barton等人，1983，Cell 32：1033)，这也在本发明范围内。在一个较佳的实 例中，用例如Klett等人(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38：467中描述的农杆菌衍 生载体转化植物。还可用其它熟知的方法将本发明的嵌合基因插入植物细胞内。 这些替换方法包括生物分解方法(Klein等人，1987 Nature 327：70)、电穿孔、化学 诱导的DNA摄取和用病毒或花粉作为载体。

当需要转化方法时，本发明的嵌合基因可以插入植物转化载体中，例如Bevan， M.1984 Nucl.Acids Res.12：8711-8721中描述的双元载体中。植物转化载体可通 过修饰根癌农杆菌的天然基因转移系统获得。该天然系统包括大的Ti(肿瘤诱导) 质粒，该质粒含有转移到转化植物中的称为T-DNA的大节段。Ti质粒的另一节 段vir区域起转移T-DNA的作用。T-DNA区域的边界是末端重复序列。在修饰 的双元载体中，肿瘤诱导基因已经被删除，并利用vir区域的功能来转移以T-DNA 边界序列为边界的外来DNA。T区域还含有可选择抗生素抗性标记，和用来插入 转移序列的多个克隆位点。这些经工程改造的菌株称为“缺臂(disarmed)”根癌农 杆菌株，它允许将以T区域为界的序列有效地转移到植物细胞核基因组中。

用含有外源DNA的“缺臂”根癌农杆菌接种表面灭菌的叶圆片或其它易感 组织，培育数天，然后转移到含抗生素培养基中。然后，在含有合适抗生素的培 养基中生根后，选择转化的芽，转移到土壤中。对转基因植物授粉，收集这些植 物的种子并在抗生素培养基上生长。

可用免疫学、组织化学或活性试验，监测发育的种子、幼苗和成熟植物中异 源基因或报道基因的表达。如本文所讨论的，测定嵌合基因表达的试验的选择取 决于异源编码区的特征。例如，如果有合适的核苷酸探针，则可用Northen分析 来评价转录。如果能获得抗异源基因编码多肽的抗体，则可用Western分析和免 疫组织化学定位法来评价多肽的生产和位置。根据异源基因，可以采用合适的生 物化学试验。例如，通过测定标准底物的乙酰化可以检测乙酰转移酶。通过分析 脂肪酸甲酯(FAMES)可以测定脂质去饱和酶基因的表达。

本发明另一方面提供了含有本发明的嵌合基因的转基因植物或这些植物的 后代。单子叶和双子叶植物均被考虑在内。利用上述任一植物转化方法用嵌合基 因来转化植物细胞。转化的植物细胞通常是愈伤组织培养物、叶圆片或整个植物 的形式(通过Bechtold等人，1993 C.R.Acad.Sci.Paris，316：1194-1199所述的真空 渗入方法)，利用本领域普通技术人员熟知的方法(例如Horsh等人，1985 Science 227：1129)将细胞再生成完整的转基因植物。在一个较佳的实例中，转基因植物是 向日葵、棉花、油籽油菜、玉米、烟草、拟南芥菜属、花生或大豆。由于转化植 物的子代遗传继承了嵌合基因，因此用转化植物的种子或插条来维持转基因系。

下列实施例进一步描述了本发明。

                             实施例1

        膜结合多核糖体RNA的分离和琉璃苣cDNA文库的构建

用Larkins和Davies(1975 Plant Phys.55：749-756)针对豌豆建立的方法，在琉 璃苣种子授粉后12天分离获得膜结合多核糖体。如Mechler(1987，Methods in Enzymology 152：241-248，Academic Press)所述的那样，从多核糖体抽提出RNA。 用Oligotex-dTTM珠粒(Qiagen)从膜结合多核糖体RNA中分离出Poly-A+RNA。

用Stratagene的ZAP cDNA合成试剂盒制备对应的cDNA。用λZAP II试剂 盒将cDNA文库构建到λZAP II载体中。用Gigapack II Gold包装抽提物 (Stratagene)包装原代文库。

                             实施例2

                      从琉璃苣分离Δ6-去饱和酶cDNA

杂交程序

以低密度(150mm Petri皿上500pfu)接种扩增的琉璃苣cDNA文库。通过筛选 对应的cDNA，减少高含量的种子储藏蛋白cDNA(从总cDNA中减去)。

用Ausubel等人(1994， Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，N.Y.)描述的随机引导DNA合成技术产生用来筛选琉璃苣cDNA文 库的杂交探针，并与以前已经鉴定的丰富表达的种子储藏蛋白cDNA对应。用 G-50旋转柱(Boehringer Manheim)除去未结合的核苷酸。通过在水浴中沸腾5分 钟，使杂交探针变性，然后在冰上迅速冷却。携带固定的重组噬菌体的硝酸纤维 素滤膜在杂交溶液[4X SET(600mM NaCl，80mM Tris-HCl，4mM Na2EDTA；pH7.8)， 5X Denhardt′s试剂(0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，和0.1％聚乙烯吡咯烷酮)， 100μg/ml变性的鲑精DNA，50μg/ml聚腺嘌呤和10μg/ml聚胞苷]中60℃预杂交 2-4小时。用加入变性放射活性探针(2ng/ml杂交溶液)的新鲜杂交溶液代替该溶 液。60℃培育滤膜搅拌过夜。随后用4X、2X和1X SET(150mM NaCl，20mM Tris-HCl，1mM Na2EDTA；pH7.8)于60℃依次洗滤膜15分钟。空气干燥滤膜，然 后用增感屏于-80℃暴光X射线胶片24小时。

用Stratagene的切除方法和试剂切除未杂交的噬斑。用所得细菌菌落接种液 体培养基，并人工或用ABI自动测序仪测序。

琉璃苣种子12(DPP)膜结合多核糖体文库的cDNA的随机测序

将对应于未杂交噬斑的每个cDNA测序一次，从200-300碱基对产生一个序 列标记。所有测序用循环测序法(Epicentre)进行。产生了超过300个表达的序列 标记(EST)。用BLAST算法(Altschul等人，1990 J.Mol.Biol.215：403-410)将每个 序列标记与GenBank数据库比较。鉴定出许多脂质代谢基因，包括Δ6-去饱和酶。

用BLASTX搜索GenBank数据库，带有cDNA克隆mbp-65的数据库搜索结 果与以前分离的集胞藻属Δ6-去饱和酶明显匹配。然而，测得mbp-65并不是全长 cDNA。用mbp-65分离出全长cDNA，以筛选琉璃苣膜结合多核糖体文库。所得 克隆命名为pAN1，用循环测序法对pAN1的cDNA插入物测序。用Geneworks (Intellig Genetics)蛋白序列比较程序将由开放读框(图1，SEQ ID NO：1)推导出的 氨基酸序列与其它已知的去饱和酶进行比较。序列对比表明，pAN1的cDNA插 入物是琉璃苣Δ6-去饱和酶基因。

所得树状图(图2)显示Δ15-去饱和酶和Δ12-去饱和酶包含两组。新分离出的琉 璃苣序列和以前分离出的集胞藻属Δ6-去饱和酶(美国专利No.5,552,306)形成了第 三个明显不同的组。去饱和酶常见的氨基酸基序与被认为参与催化金属结合的氨 基酸基序的比较表明，琉璃苣基因编码的蛋白与通常的去饱和酶尤其是集胞藻属 Δ6-去饱和酶整体相似(表1)。同时，比较表1的基序表明，该蛋白和其它植物去 饱和酶间有明显不同。而且，琉璃苣序列也与已知的植物膜结合脂肪酸去饱和酶 明显不同，其在细胞色素b5蛋白内存在保守的血红素结合基序(Schmidt等人，1994 Plant Mol.Biol.26：631-642)(图1)。因此，尽管这些结果明显说明分离的cDNA是 琉璃苣Δ6-去饱和酶基因，但还需要进一步的确认。为了确认琉璃苣Δ6-去饱和酶 cDNA的身份，将pAN1的cDNA插入物克隆到表达盒内稳定表达。制备载体 pBI121(Jefferson等人，1987 EMBO J.6：3901-3907)用于连接，方法是通过BamHI 和EcoICR I(SacI的一种同裂酶，它产生平头；从Promega获得)消化切除GUS编 码区留下完整的35S启动子和NOS终止子。通过BamHI和XhoI消化从重组质 粒(pAN1)中切除琉璃苣Δ6去饱和酶cDNA。进行DNA聚合酶I的Klenow片段 催化的补平反应将XhoI末端变平。然后将该片段克隆到pBI121.1的 BamHI/EcoICR I位点中，产生质粒pAN2。

                              表1

             膜结合去饱和酶中常见氨基酸基序的比较

去饱和酶           脂质盒           金属盒1             金属盒2

琉璃苣Δ6         WIGHDAGH          HNAHH              FQIEHH

                (SEQ ID NO：3)    (SEQ ID NO：9)    (SEQ ID NO：17)

集胞藻属Δ6       NVGHDANH          HNYLHH             HQVTHH

                (SEQ ID NO：4)    (SEQ ID NO：10)   (SEQ ID NO：18)

拟南芥菜属         VLGHDCGH           HRTHH             HVIHH

叶绿体Δ15     (SEQ ID NO：5)    (SEQ ID NO：11)   (SEQ ID NO：19)

水稻Δ15          VLGHDCGH           HRTHH             HVIHH

                (SEQ ID NO：5)    (SEQ ID NO：11)   (SEQ ID NO：19)   甘氨酸叶绿体Δ15    VLGHDCGH           HRTHH             HVIHH

                (SEQ ID NO：5)    (SEQ ID NO：11)   (SEQ ID NO：19)

拟南芥菜属         VLGHDCGH           HRTHH             HVIHH

fad3(Δ15)     (SEQ ID NO：5)    (SEQ ID NO：11)   (SEQ ID NO：19)   芸苔属fad3(Δ15     VLGHDCGH           HRTHH             HVIHH

                (SEQ ID NO：5)    (SEQ ID NO：11)   (SEQ ID NO：19)  琉璃苣Δ12(P1-81)*  VIAHECGH           HRRHH             HVAHH

                (SEQ ID NO：6)    (SEQ ID NO：12)   (SEQ ID NO：20)

拟南芥菜属         VIAHECGH           HRRHH             HVAHH

fad2(Δ12)     (SEQ ID NO：6)    (SEQ ID NO：12)   (SEQ ID NO：20)

拟南芥菜属         VIGHDCAH           HDRHH             HIPHH

叶绿体Δ12     (SEQ ID NO：7)    (SEQ ID NO：13)   (SEQ ID NO：21)   甘氨酸质体Δ12      VIGHDCAH           HDRHH             HIPHH

                (SEQ ID NO：7)    (SEQ ID NO：13)   (SEQ ID NO：21)

 菠菜质体          VIGHDCAH           HDQHH             HIPHH   (plastidial)n-6   (SEQ ID NO：7)    (SEQ ID NO：14)   (SEQ ID NO：21)

集胞藻属Δ12      VVGHDCGH           HDHHH             HIPHH

                (SEQ ID NO：8)    (SEQ ID NO：15)   (SEQ ID NO：21)

鱼腥藻属Δ12      VLGHDCGH           HNHHH             HVPHH

                (SEQ ID NO：5)    (SEQ ID NO：16)   (SEQ ID NO：22)

*P1-81是全长cDNA，由EST分析鉴定，表现出与拟南芥菜属Δ12去饱和酶 (fad2)非常类似。

                         实施例3

      转基因植物的产生以及脂肪酸甲酯(FAME)的制备和分析

根据标准程序(Horsch等人，1985 Science 227：1229-1231；Bogue等人，1990 Mol.Gen.Genet.221：49-57)，通过根癌农杆菌用表达质粒pAN2转化烟草 (Nicotiana tabacum cv.xanthi)，只是在100微克/毫升卡那霉素上选择最初的转化 体。

在液氮中冷冻转基因植物组织并冻干过夜。FAME的制备如Dahmer等人， (1989)J.Amer.Oil.Chem.Soc.66：543-548中所述。在某些情况下，再次蒸发溶 剂，将FAME重悬于乙酸乙酯中，用去离子水抽提一次，以除去所有水溶性污染 物。如前所述(Reddy等人，1996 Nature Biotech.14：639-642)，用Tracor-560气液 色谱分析FAME。

如图3所示，含有琉璃苣cDNA的转基因烟草叶产生了GLA和十八碳四烯 酸(OTA)(18：4 Δ6，9，12，15)。因此，这些结果证明分离的cDNA编码了琉璃苣Δ6- 去饱和酶。

                          实施例4

             Δ6-去饱和酶在琉璃苣中的表达

用Northern试验分析琉璃苣组织中获得的RNA，检查Δ6-去饱和酶的天然表 达。按照Chang等人1993 Plant Mol.Biol.Rep.11：113-116中的方法，从发育的 琉璃苣胚体中分离出RNA。按照标准方法(Brown T.，1996，《现代分子生物学方 法》Auselbel等人编辑，[Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York]4.9.1-4.9.14页)，在甲醛琼脂糖凝胶上电泳分离RNA，通过毛细管转移印迹 到尼龙膜上，并80℃烘培固定30分钟。滤膜预先在42℃含有50％去离子甲酰胺、 5X Denhardt′s试剂、5X SSPE(900mM氯化钠；50mM磷酸钠，pH7.7；5mM EDTA)、0.1％SDS和200微克/毫升变性鲑精DNA的溶液中培育。2小时后，将 滤膜加入组成相同并加入了变性放射活性杂交探针的新鲜溶液中。在此例中，所 用探针为琉璃苣豆球蛋白cDNA(图16A)、琉璃苣油质蛋白cDNA(图16B)和琉璃 苣Δ6-去饱和酶cDNA(pAN1，实施例2)(图16C)。用EST克隆分离琉璃苣豆球蛋 白和油质蛋白cDNA，并用实施例2所述的BLAST算法与GenBank数据库比较 来鉴定。通过标准化至琉璃苣EF1αmRNA水平来校正加样偏差。通过与实施例 2所述EST分析获得的对应cDNA相关连，鉴定EF1αmRNA。使滤膜于42℃杂 交12-20小时，然后如上所述洗涤(只是温度为65℃)、空气干燥并暴光X-射线胶 片。

如图15A和15B所示，Δ6-去饱和酶主要在琉璃苣种子中表达。琉璃苣种子 在授粉后(dpp)18-20天之间达到成熟。整个收集时间(8-20dpp)内均有Δ6-去饱和酶 mRNA表达，但是在授粉后10-16天出现最大值。该表达曲线与琉璃苣油质蛋白 和12S种子储藏蛋白mRNA所见曲线类似(图16A、16B和16C)。

                       实施例5

                向日葵白蛋白cDNA的分离

用叶和12DPF(开花后天数)胚体的cDNA探针差别性筛选向日葵cDNA文 库，分离出向日葵白蛋白cDNA(Ha5)。获得1011bp的cDNA(Cohen E.A.″向日葵 2S种子储藏蛋白基因的分析″MS thesis，Texas A&M University，Allen等人， 1987a，《发育生物学的分子方法》415-424页)。尽管不是全长，该cDNA包含 了向日葵2S白蛋白的大多数编码序列。Northern和斑点印迹分析表明，该基因 只在发育的向日葵种子中表达。白蛋白转录物和蛋白首先于开花后5天检测到， 比半日花素(11S)早整整两天，并在开花后大约12-15天达到最大(Allen等人， 1987a)。

                       实施例6

               向日葵白蛋白5′调控区的分离

用Ha5 cDNA作为探针筛选向日葵基因组DNA文库，分离出基因组克隆。 限制酶消化显示，四个独立的基因组克隆是相同的。因此，选择一个克隆(HaG5) 作更详细的分析。

对2.3kb EcoRI/DraI片段进行测序(Allen等人，1987b Mol.Gen.Genet. 210：211-218)。HaG5白蛋白基因含有两个外显子。第一个外显子(外显子1)的长 度为575核苷酸，第二个外显子(外显子2)的长度为310个核苷酸。一个190个 核苷酸的内含子将这两个外显子分开。核酸酶保护试验显示，转录起始位点位于 翻译起始位点上游30个核苷酸处(Allen等人，1987b，图2)。Southern法分析基因 组DNA，经彻底筛选只分离出一个基因，这表明HaG5在向日葵基因组中是单拷 贝基因。

通过几步从HaG5中克隆了889bp的上游调控区(图4的-860至+29；SEQ ID NO：2)。将1.1kb EcoRI片段亚克隆到PBluescriptTM(Stratagene)产生pHaG5RI。用 引物在pHaG5RI上进行PCR，导致白蛋白5′调控区5′和3′端分别侧接EcoRI和 BamHI位点。将该限制性片段克隆到pBluescriptTM的EcoRI/BamHI位点内产生 pHaG5EB。对各个克隆进行测序，检查可能的PCR突变以及其插入物的方向。 白蛋白5′调控区的序列显示在图4中(SEQ ID NO：2)。切下该构建物的SalI/BamHI 片段克隆到pAN3(含有质粒的亲代琉璃苣Δ6-去饱和酶)，产生pAN4。pAN4以及 参与其构建的中间载体的图谱显示在图5中。pAN1在实施例2中有所描述。 pBI101.1在Jefferson等人，1987 EMBO J.6：3901-3907中有所描述。

                        实施例7

    Δ6-去饱和酶在向日葵白蛋白5′调控区控制下的表达

用白蛋白5′调控区来推动琉璃苣Δ6-去饱和酶基因在拟南芥菜属中的表达。 用Bechtold等人1993 C.R.Acad.Sci.Paris 316：1194-1199中的真空渗入方法，用 pAN4转化拟南芥菜属。通过用实施例3所述的方法测定其反应产物的对应脂肪 酸甲酯(γ-亚麻酸(GLA)和十八碳四烯酸(OTA))，来监测Δ6-去饱和酶活性水平。转 基因种子中的GLA和OTA水平范围分别达到C18脂肪酸的10.2％(平均为4.4％) 和3.6％(平均为1.7％)。在这些植物的叶子上没有检测到GLA或OTA。相比，35S 启动子/Δ6-去饱和酶转基因植物在叶中产生了高达C18脂肪酸的3.1％的GLA水 平(平均为1.3％)，而在种子中不能检测到OTA。这些数据归纳在表2中。

                        表    2

           琉璃苣Δ6-去饱和酶在转基因植物中的表达   启动子   植物     种子            叶   GLA*  范围     OTA*     范围 GLA   范围   OTA   范围 花椰菜花叶 病毒35S   烟草   1.3    0.7-.31        n.d. 20    19-22  9.7   8-11 向日葵 白蛋白   拟南芥菜属   4.4    3.1-     1.7      0.63-3.6          10.2    n.d.         n.d.

*平均值表示成C18脂肪酸的百分数；n.d.，未测定

                                实施例8

             用包含连接于琉璃苣Δ6-去饱和酶基因的白蛋白

                   5′调控区的表达盒转化油籽油菜 用含有质粒pAN4(即在向日葵白蛋白启动子控制下的琉璃苣Δ6-去饱和酶- 实施例6)的根癌农杆菌株EHA105转化油籽油菜(cv.Wester)。

使Westar的末端节间与诱导的根癌农杆菌株EHA105共培育2-3天(Alt- Moerbe等人，1988 Mol.Gen.Genet.213：1-8；James等人，1993 Plant Cell Reports 12：559-563)，然后转移到再生培养基中(Boulter等人，1990 Plant Science 70：91-99； Fry等人，1987 Plant Cell Reports 6：321-325)。将再生芽转移到生长培养基中 (Pelletier等人，1983 Mol.Gen.Menet.191：244-250)，在叶子片段上进行聚合酶链 反应(PCR)试验，以评价基因的存在。

按照K.M.Haymes等人，(1996)Plant Molecular Biology Reporter，14(3)：280- 284所述的方法从叶中分离出DNA，重悬于100微升水中，不用RNA酶处理。 用5微升抽提物进行PCR反应，最终体积为50微升。反应在Perkin-Elmer 9600 热循环仪上进行下列循环：

1轮：95℃，5分钟

30轮：95℃，45秒；52℃，45秒

      72℃，1分钟

1轮：72℃，5分钟 采用下列引物(从金属盒区域附近序列衍生而得，如图1和SEQ ID NO：1所示)：

5′TGG AAA TGG AAC CAT AA 3′

5′GGA AAC AAA TGA TGC TC 3′

DNA的扩增揭示了预计的549碱基对的PCR片段(图7)。

将阳性新芽转移到延伸培养基中，然后转移到生根培养基中(DeBlock等人， 1989 Plant Physiol.91：694-701)。将根系统发育良好的嫩枝转移到温室内。当植物 发育完善时，收集叶子进行Southern分析以便评价基因拷贝数。

按照Bouchez等人(1996)Plant Molecular Biology Reporter 14：115-123中的方 法抽提基因组DNA，用限制性酶Bgl I和/或Cla I消化，在琼脂糖凝胶上电泳分 离(Maniatis等人，1982，《分子克隆实验手册》Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor/NY)，按照生产商说明书制备，用于转移到尼龙膜(Nytran膜， Schleicher & Schuell)上。然后用20XSSC通过毛细管作用过夜将DNA转移到膜 上(Maniatis等人，1982)。转移后用UV(Stratagene)使膜交联30秒，在65℃杂交烘 箱(Appligene)中在玻璃管中含6XSSC、0.5％SDS和2.25％w/w脱水脱脂奶的15 毫升溶液中预杂交1小时。使膜在含有变性杂交探针的相同溶液中杂交过夜，该 探针用随机引物方法以32p放射性标记至比活为108cpm/微克(用从Pharmacia获得 的Ready-To-Go试剂盒)。该探针代表了琉璃苣Δ6-去饱和酶基因的PCR片段(用 上述条件和引物获得)。杂交后，于65℃用2XSSC、0.1％SDS洗滤膜15分钟， 用0.2XSSC、0.1％SDS洗15分钟。然后将膜包在Saran-Wrap中，在-70℃、不透 光的盒中用增感屏暴光Kodak XAR胶片。暴光时间通常为3天。

获得的结果确认了基因的存在。根据基因构建物，Bgl I或Cla I消化的每一 DNA泳道中的条带数量代表了植物基因组DNA中存在的Δ6-去饱和酶基因数。 Bgl I和Cla I的消化共同产生了3085bp的片段。

术语“包含”或“包括”定义成权利要求中所的特征、整体、步骤或组分， 但是不排除一个或多个其它特征、整体、步骤或组分或其组合的存在或增加。

                           序列表 (1)一般信息：

(i)申请人：Rhone Poulenc Agro

           Thomas，Terry L

           Nunberg，Andrew N

           Beremand，Phillip D

(ii)发明名称：用来修饰植物种子的脂质组成的向日葵白蛋白5′调控区

(iii)序列数目：22

(iv)通信地址：

     (A)收件人：Scully，Scott，Murphy & Presser

     (B)街道：400 Garden City Plaza

     (C)城市：Garden City

     (D)州：New York

     (E)国家：USA

     (F)邮编：11530

 (v)计算机可读形式：

     (A)记录介质类型：软盘

     (B)计算机：IBM PC兼容型

     (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

     (D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30

 (vi)本申请资料：

     (A)申请号：08/831,570

     (B)申请日：1997年4月9日

     (C)分类：

 (viii)律师/代理人信息：

     (A)姓名：DiGiglio，Frank S.

     (B)登记号：31,346

     (C)参考/案卷号：10545

 (ix)通讯信息：

     (A)电话：(516)742-4343

     (B)电传：(516)743-4366 (2)SEQ ID NO：1的信息：

 (i)序列特征：

     (A)长度：1684碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：双链

     (D)拓扑结构：线性

 (ii)分子类型：DNA(基因组)

 (ix)特征：

     (A)名称/关键：CDS

     (B)位置：43..1387

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1： ATATCTGCCT ACCCTCCCAA AGAGAGTAGT CATTTTTCAT CA ATG GCT GCT CAA    54

                                           Met Ala Ala Gln

                                             1 ATC AAG AAA TAC ATT ACC TCA GAT GAA CTC AAG AAC CAC GAT AAA CCC  102 Ile Lys Lys Tyr Ile Thr Ser Asp Glu Leu Lys Asn His Asp Lys Pro   5                  10                  15                  20 GGA GAT CTA TGG ATC TCG ATT CAA GGG AAA GCC TAT GAT GTT TCG GAT  150 Gly Asp Leu Trp Ile Ser Ile Gln Gly Lys Ala Tyr Asp Val Ser Asp

             25                  30                  35 TGG GTG AAA GAC CAT CCA GGT GGC AGC TTT CCC TTG AAG AGT CTT GCT  198 Trp Val Lys Asp His Pro Gly Gly Ser Phe Pro Leu Lys Ser Leu Ala

         40                  45                  50 GGT CAA GAG GTA ACT GAT GCA TTT GTT GCA TTC CAT CCT GCC TCT ACA  246 Gly Gln Glu Val Thr Asp Ala Phe Val Ala Phe His Pro Ala Ser Thr

     55                  60                  65 TGG AAG AAT CTT GAT AAG TTT TTC ACT GGG TAT TAT CTT AAA GAT TAC  294 Trp Lys Asn Leu Asp Lys Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys Asp Tyr

 70                  75                  80 TCT GTT TCT GAG GTT TCT AAA GAT TAT AGG AAG CTT GTG TTT GAG TTT  342 Ser Val Ser Glu Val Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu Val Phe Glu Phe  85                  90                  95                 100 TCT AAA ATG GGT TTG TAT GAC AAA AAA GGT CAT ATT ATG TTT GCA ACT  390 Ser Lys Met Gly Leu Tyr Asp Lys Lys Gly His Ile Met Phe Ala Thr

            105                 110                 115 TTG TGC TTT ATA GCA ATG CTG TTT GCT ATG AGT GTT TAT GGG GTT TTG     438 Leu Cys Phe Ile Ala Met Leu Phe Ala Met Ser Val Tyr Gly Val Leu

        120                 125                 130 TTT TGT GAG GGT GTT TTG GTA CAT TTG TTT TCT GGG TGT TTG ATG GGG     486 Phe Cys Glu Gly Val Leu Val His Leu Phe Ser Gly Cys Leu Met Gly

    135                 140                 145 TTT CTT TGG ATT CAG AGT GGT TGG ATT GGA CAT GAT GCT GGG CAT TAT     534 Phe Leu Trp Ile Gln Ser Gly Trp Ile Gly His Asp Ala Gly His Tyr

150                 155                 160 ATG GTA GTG TCT GAT TCA AGG CTT AAT AAG TTT ATG GGT ATT TTT GCT     582 Met Val Val Ser Asp Ser Arg Leu Asn Lys Phe Met Gly Ile Phe Ala 165                 170                 175                 180 GCA AAT TGT CTT TCA GGA ATA AGT ATT GGT TGG TGG AAA TGG AAC CAT     630 Ala Asn Cys Leu Ser Gly Ile Ser Ile Gly Trp Trp Lys Trp Asn His

            185                 190                 195 AAT GCA CAT CAC ATT GCC TGT AAT AGC CTT GAA TAT GAC CCT GAT TTA     678 Asn Ala His His Ile Ala Cys Asn Ser Leu Glu Tyr Asp Pro Asp Leu

        200                 205                 210 CAA TAT ATA CCA TTC CTT GTT GTG TCT TCC AAG TTT TTT GGT TCA CTC     726 Gln Tyr Ile Pro Phe Leu Val Val Ser Ser Lys Phe Phe Gly Ser Leu

    215                 220                 225 ACC TCT CAT TTC TAT GAG AAA AGG TTG ACT TTT GAC TCT TTA TCA AGA     774 Thr Ser His Phe Tyr Glu Lys Arg Leu Thr Phe Asp Ser Leu Ser Arg

230                 235                 240 TTC TTT GTA AGT TAT CAA CAT TGG ACA TTT TAC CCT ATT ATG TGT GCT     822 Phe Phe Val Ser Tyr Gln His Trp Thr Phe Tyr Pro Ile Met Cys Ala 245                 250                 255                 260 GCT AGG CTC AAT ATG TAT GTA CAA TCT CTC ATA ATG TTG TTG ACC AAG     870 Ala Arg Leu Asn Met Tyr Val Gln Ser Leu Ile Met Leu Leu Thr Lys

            265                 270                 275 AGA AAT GTG TCC TAT CGA GCT CAG GAA CTC TTG GGA TGC CTA GTG TTC     918 Arg Asn Val Ser Tyr Arg Ala Gin Glu Leu Leu Giy Cys Leu Val Phe

        280                 285                 290 TCG ATT TGG TAC CCG TTG CTT GTT TCT TGT TTG CCT AAT TGG GGT GAA     966 Ser Ile Trp Tyr Pro Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro Asn Trp Gly Glu

    295                 300                 305 AGA ATT ATG TTT GTT ATT GCA AGT TTA TCA GTG ACT GGA ATG CAA CAA    1014 Arg Ile Met Phe Val Ile Ala Ser Leu Ser Val Thr Gly Met Gln Gln

310                 315                 320 GTT CAG TTC TCC TTG AAC CAC TTC TCT TCA AGT GTT TAT GTT GGA AAG       1062 Val Gln Phe Ser Leu Asn His Phe Ser Ser Ser Val Tyr Val Gly Lys 325                 330                 335                 340 CCT AAA GGG AAT AAT TGG TTT GAG AAA CAA ACG GAT GGG ACA CTT GAC       1110 Pro Lys Gly Asn Asn Trp Phe Glu Lys Gln Thr Asp Gly Thr Leu Asp

            345                 350                 355 ATT TCT TGT CCT CCT TGG ATG GAT TGG TTT CAT GGT GGA TTG CAA TTC       1158 Ile Ser Cys Pro Pro Trp Met Asp Trp Phe His Gly Gly Leu Gln Phe

        360                 365                 370 CAA ATT GAG CAT CAT TTG TTT CCC AAG ATG CCT AGA TGC AAC CTT AGG       1206 Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Lys Met Pro Arg Cys Asn Leu Arg

    375                 380                 385 AAA ATC TCG CCC TAC GTG ATC GAG TTA TGC AAG AAA CAT AAT TTG CCT       1254 Lys Ile Ser Pro Tyr Val Ile Glu Leu Cys Lys Lys His Asn Leu Pro

390                 395                 400 TAC AAT TAT GCA TCT TTC TCC AAG GCC AAT GAA ATG ACA CTC AGA ACA       1302 Tyr Asn Tyr Ala Ser Phe Ser Lys Ala Asn Glu Met Thr Leu Arg Thr 405                 410                 415                 420 TTG AGG AAC ACA GCA TTG CAG GCT AGG GAT ATA ACC AAG CCG CTC CCG       1350 Leu Arg Asn Thr Ala Leu Gln Ala Arg Asp Ile Thr Lys Pro Leu Pro

            425                 430                 435 AAG AAT TTG GTA TGG GAA GCT CTT CAC ACT CAT GGT T AAAATTACCC          1397 Lys Asn Leu Val Trp Glu Ala Leu His Thr His Gly

        440                 445 TTAGTTCATG TAATAATTTG AGATTATGTA TCTCCTATGT TTGTGTCTTG TCTTGGTTCT     1457 ACTTGTTGGA GTCATTGCAA CTTGTCTTTT ATGGTTTATT AGATGTTTTT TAATATATTT     1517 TAGAGGTTTT GCTTTCATCT CCATTATTGA TGAATAAGGA GTTGCATATT GTCAATTGTT     1577 GTGCTCAATA TCTGATATTT TGGAATGTAC TTTGTACCAC GTGGTTTTCA GTTGAAGCTC     1637 ATGTGTACTT CTATAGACTT TGTTTAAATG GTTATGTCAT GTTATTT                   1684 (2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：843碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：双链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2： GAATTCTATC   ACTAGTGACC   ACCCCATCCC   CTTATTTCAA   TAATGGAACA   CAAAAAAATT                60 TTAAAAAATA   GTTGCTGTTA   ATTGTTTAAC   CGTCATTTTC   CAACATTACT   AGCTAATCGT               120 TAATTGATCT   TCATAAAAAA   AAAAATTGCT   ATGGGTACTA   TTGAGATTGT   ATATCTTATC               180 AGTTAGGCCT   AAGGGGGGGG   TCAGTGATAT   TACGAATGAT   ACAAACATCA   ACGCGTGGAA               240 CATTACAAAA   TTCCGTAATT   TTTTCAACGC   CGTGATGGTT   TTTTTTTTTT   TTTTTTTTTT               300 TGATGGTAAT   TGTTGGTTGG   GGGGAAATTA   TTGGGTATGG   TGTTGAGTAT   GACCACCCCC               360 ACTAAAAAAG   GTTGTGAGTG   ATGTAAAAAT   GGTTGCTGAC   ATGACGAAAC   ATAATTGGAT               420 ATTGTGAGTG   ATAAAATTTT   ATCATTAGTG   ACCACCCCGC   CTCCCCTTAT   CATATGTTGT               480 TATCTTCCAT   AGTTGCGGTA   TACCAACATA   TGGTAGTTTT   TATATTTATA   GTTTATATTT               540 TCATTAAACT   CTCTTCGCCA   GGCTACTTGT   ATTGTAATCA   TATGGAATCT   CAACTCCAGT               600 TGGAGCCATT   CCATCATATA   TTTCCATTTC   CAAACAAAGA   GAATTGACAC   CTCATACATA               660 CTCCAAAGCA   TACTTCCACT   TGCTATAATT   TTCATGTAAA   AACTCGTACG   TGTTATTCGA               720 CAATGTTCAT   ATAACGCCAC   CGATTAAACT   CACCTCTCCA   CGTATGAACC   TCCACCCACC               780 ATATATACGC   ACCACCACCA   CACCATAATT   CACACAACCA   CAACACCATC   TCCCACAGGA               840 TCC                                                                                       843 (2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：8氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3： Trp Ile Gly His Asp Ala Gly His 1               5 (2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：8氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4： Asn Val Gly His Asp Ala Asn His 1               5 (2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：8氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5： Val Leu Gly His Asp Cys Gly His 1               5 (2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：8氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEC)ID NO：6： Val Ile Ala His Glu Cys Gly His 1               5 (2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

   (A)长度：8氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7： Val Ile Gly His Asp Cys Ala His 1               5 (2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：8氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8： Val Val Gly His Asp Cys Gly His 1               5 (2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：5氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9： His Asn Ala His His 1               5 (2)SEQ ID NO：10的信息；

(i)序列特征：

   (A)长度：6氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10： His Asn Tyr Leu His His 1               5 (2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：5氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11： His Arg Thr His His 1               5 (2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：5氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12： His Arg Arg His His 1               5 (2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：5氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13： His Asp Arg His His 1               5 (2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：8氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14： His Asp Gln His His 1               5 (2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

   (A)长度：5氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15： His Asp His His His 1               5 (2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：5氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16： His Asn His His His 1               5 (2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：6氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17： Phe Gln Ile Glu His His 1               5 (2)SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：6氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18： His Gln Val Thr His His 1               5 (2)SEQ ID NO：19的信息：

(i)序列特征：

   (A)长度：6氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19： His Gln Val Thr His His 1               5 (2)SEQ ID NO：20的信息：

(i)序列特征：

   (A)长度：5氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20： His Val Ala His His 1               5 (2)SEQ ID NO：21的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：5氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21： His Ile Pro His His 1               5 (2)SEQ ID NO：22的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：5氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22： His Val Pro His His 1               5