组织特异性表达和杂种植物生成
阅读：785发布：2023-01-23
专利汇可以提供组织特异性表达和杂种植物生成专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公 开关 注内源 植物 RNAi机制用于优先或特异性地降低转基因表达的用途。在一些实施方案中，本公开关注特异性降低雄性植物组织中的转基因表达，以便，例如，提供经济的雄性不育杂种 种子 生产系统。，下面是组织特异性表达和杂种植物生成专利的具体信息内容。
1.一种具有表达盒的核酸，所述表达盒包含：
具有至少一种sRNA分子的内部靶位点的感兴趣的基因。
2.权利要求1的核酸，其中所述感兴趣的基因是与植物启动子可操作连接的农艺学性状基因、除草剂抗性基因或选择标志物基因，并且其中所述靶位点的长度介于约20和约25个核苷酸之间。
3.一种转基因植物细胞，其包含权利要求2的核酸，其中所述感兴趣的基因是异源的，并且其中所述至少一种sRNA分子是所述植物的内源sRNA。
4.权利要求3的转基因植物细胞，其中所述内源sRNA在所述植物中以组织特异性或组织优选性方式表达。
5.一种转基因植物组织、植物部分或植物，其包含权利要求4的转基因植物细胞。
6.权利要求5的转基因植物组织、植物部分或植物，其中所述内源sRNA主要在雄性植物组织中表达。
7.权利要求6的转基因植物组织、植物部分或植物，其中所述感兴趣的基因是除草剂抗性基因，并且其中对所述植物组织、植物部分或植物施用所述除草剂选择性地损害或破坏雄性组织。
8.一种生成转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
提供包含除草剂抗性基因的核酸，其中所述除草剂抗性基因包含小RNA(sRNA)的靶位点；和
用所述核酸转化植物细胞，其中所述植物细胞表达所述sRNA。
9.根据权利要求8的方法，其中所述sRNA与从所述除草剂抗性基因转录的mRNA杂交，并且由此降低所述除草剂抗性基因的表达。
10.根据权利要求8的方法，其中所述sRNA是在所述植物细胞中以组织优选性、组织特异性、细胞类型特异性、或诱导型方式表达的内源sRNA。
11.根据权利要求10的方法，其中所述sRNA是miR529。
12.根据权利要求8的方法，其中所述sRNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸与所述植物细胞的基因组中的非组成性启动子可操作连接。
13.根据权利要求12的方法，其中所述非组成性启动子是组织优选性、组织特异性、细胞类型特异性或诱导型启动子。
14.根据权利要求12的方法，其中所述非组成性启动子是组织特异性启动子。
15.根据权利要求14的方法，其中所述组织特异性启动子选择性地在雄性植物组织中启动所述sRNA的转录。
16.一种植物组织，其包含通过根据权利要求8的方法生成的植物细胞。
17.一种植物，其包含权利要求16的植物组织。
18.一种生成转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
提供包含基因的核酸，所述基因包含小RNA(sRNA)的靶位点；
提供植物细胞，其中所述sRNA主要在雄性植物组织中表达；并且
用所述核酸转化所述植物细胞。
19.权利要求1的核酸，其中靶位点选自：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
20.根据权利要求1的方法，其中所述sRNA是miR156。
21.根据权利要求1的方法，其中所述sRNA靶位点为了所述感兴趣的基因的部分下调或增加的下调而被修饰。
22.一种具有表达盒的核酸，所述表达盒包含：
由与非组成性启动子可操作连接的多核苷酸编码的除草剂基因，其在雄性生殖组织中具有不提供除草剂耐受性的非优先表达。
23.权利要求22的核酸，其中所述非组成性启动子是SCBV启动子。
组织特异性表达和杂种植物生成
[0002] 本申请要求2013年12月31日提交的美国临时专利申请流水号61/922,603，和2014年12月19日提交的美国临时专利申请流水号14/577,887的提交日权益，两个申请的题目都为“组织特异性表达和杂种植物生成”(Tissue-Specific Expression and Hybrid Plant Production)。发明领域
[0003] 本公开涉及用于控制植物中的基因表达的构建体和方法。本文中的具体实施方案涉及利用植物细胞的天然RNA抑制(RNAi)机构实现感兴趣的基因的组织特异性表达(例如在雄性植物组织中)的构建体和方法。
[0004] 发明背景
[0005] 杂种作物品种的开发已经为增加作物的生产率创造了条件，这主要是得益于杂种优势和一致性的提高。大多数作物都显示杂种优势，但是，只有当可靠且成本经济的授粉控制系统可用时，杂种的商业生产才是可行的；杂种种子生产需要可防止不期望的自花授粉的系统。
[0006] 防止自花授粉的可用方法包括机械除去花药或雄花、应用雄性特异性杀配子剂、和使用遗传细胞质或核编码雄性不育。机械去雄耗费高昂，还会导致植物损伤从而不期望地降低作物产率。就细胞质雄性不育(CMS)品系的使用而言，这些品系在其线粒体基因组中具有突变，并且因此雄性不育以显性、母本遗传的性状遗传。细胞质雄性不育需要在给定作物中有CMS突变体和核恢复者(nuclear restorer)可用。Perez-Prat and van Lookeren Campagne(2002)Trends Plant Sci.7:199-203。
[0007] 鉴于前述考虑，商业杂种玉米种子的生产通常在孤立的田地中将雄性和雌性近交系种植在不同行或地块中，以减少污染的可能性。然后，在花粉散布前对雌性近交系去雄，确保雄性近交系的异花授粉。从异花授粉的雌性近交系的雌花穗(ears)收获杂种种子并处理。手动或机械去雄对杂种玉米种子的高成本推波助澜。此外，杂种种子的产率一般较低，进一步导致收入和盈利偏低。
[0008] RNA干扰(RNAi)是一种利用内源细胞途径的方法，其中对靶基因序列特异性的干扰RNA(iRNA)分子(例如dsRNA分子)导致由靶基因序列编码的mRNA的降解。近年来，已经使用RNAi在许多物种和实验系统中进行基因了“敲低”；例如秀丽隐杆线虫(C.elegans)、植物、昆虫胚胎、和组织培养中的细胞。参见例如Fire等(1998)Nature 391:806-11；Martinez等(2002)Cell 110:563-74；McManus and Sharp(2002)NatureRev.Genetics 3:737-47。
[0009] RNAi藉由内源途径，包括切丁酶蛋白复合物实现mRNA的降解。切丁酶将长的dsRNA分子切割成约20个核苷酸的短双链片段。抑制性双链RNA被解开成两条单链RNA：过客链和引导链。过客链被降解，并且引导链被掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。在引导链特异性结合mRNA分子的互补序列并且诱导Argonaute(RISC复合物的催化组分)的切割时发生转录后基因沉默(翻译抑制)。
[0010] 植物微小RNA(miRNA)通常从具有部分双链结构(例如“发夹”)的折回结构生成，并且通常是与靶位点几乎完全互补性的，靶位点最经常在基因组的蛋白质编码区中找到。因此，植物miRNA功能一般发挥功能以引导mRNA切割。Watson等(2005)FEBS Lett.579:5982-7。比较而言，动物miRNA含有相对低水平的与其靶位点的互补性，并且因此一般不引导切割，而是发挥功能以在转录或共翻译水平上抑制表达。Watson等(2005),同上；Tomari and Zamore(2005)Genes Dev.19(5):517-29。虽然miRNA序列在植物和动物之间并不保守，但是利用这些基因的RNAi途径是高度相似的。Millar and Waterhouse(2005)
Funct.Integr.Genomics 5:129-35。例如，虽然植物中的miRNA的生物起源是由一组与动物miRNA的生物起源不同的相关酶实现的，但是miRNA分子自身具有能够实现mRNA切割或翻译抑制的特征性结构，这取决于其与靶基因的序列互补性的程度。同上。
Funct.Integr.Genomics 5:129-35。例如，虽然植物中的miRNA的生物起源是由一组与动物miRNA的生物起源不同的相关酶实现的，但是miRNA分子自身具有能够实现mRNA切割或翻译抑制的特征性结构，这取决于其与靶基因的序列互补性的程度。同上。
[0011] 除了miRNA外，植物还生成21-25个核苷酸的内源小抑制性RNA(siRNA)。它们中的大多数与miRNA的不同之处它们源自双链RNA(而不是不完全的折回结构)，双链RNA在一些情况下是由RNA依赖性RNA聚合酶(RDR)的活性产生的。
[0012] 大多数植物含有4种切丁酶样(DCL)蛋白，其中的一种(DCL1)是大多数miRNA前体的成熟所必需的。Kurihara and Watanabe(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:12753-8。动物miRNA前体加工依次需要DROSHA和切丁酶的核溶解活性。Lee等(2003)Nature 425:
415-9。在动物中，输出蛋白-5(ExpS)调节pre-miRNA从核到细胞质的转运。Bohnsack等(2004)RNA 10:185-91。
415-9。在动物中，输出蛋白-5(ExpS)调节pre-miRNA从核到细胞质的转运。Bohnsack等(2004)RNA 10:185-91。
[0013] RNAi仅切割并降解与siRNA和/或miRNA互补的RNA转录物，因此mRNA表达的敲低是序列特异性的。RNAi的基因沉默效应可持续数天，在实验条件下可以导致靶定转录物的丰度下降90％以上，由此降低相应的蛋白质的水平。
[0014] 发明概述
[0015] 本文中描述了组合物和方法，用于一种通过新的植物小RNA(sRNA)介导的途径生成转基因植物(例如杂种)。该途径利用特定组织中表达的sRNA(例如内源siRNA和miRNA)实现(反式)基因表达的靶向阻抑或敲低。在一些实施方案中，sRNA的靶位点融合在赋予除草剂耐受性的转基因序列内。组织中的sRNA(例如内源sRNA)的组织特异性表达导致转基因的下调，赋予特定组织对除草剂的敏感性，而其它植物组织仍然是耐受的。
[0016] 在一些实施方案中，sRNA在植物的雄性组织中特异性表达，从而阻抑/敲低转基因的表达，并且从而消除手动去雄的需要。具体的实施方案包括任何转基因在植物中的sRNA介导的组织特异性表达，为定时诱导雄性不育创造了条件。举例而言，转基因是除草剂耐受性基因，并且在抽雄期之前或期间对植物应用除草剂可防止雄穗形成和自花授粉。在一些实施方案中，sRNA在例如植物的根组织中特异性或优先表达，从而特异性或优先降低组织中的转基因表达。
[0017] 本文中描述了核酸表达构建体，该构建体包含具有至少一个sRNA分子的内部靶位点的感兴趣的基因。在实施方案中，在构建体导入植物细胞时可能从感兴趣的基因体内转录RNA，该RNA然后被该sRNA分子控制下的RNAi机制降解。在具体的实施方案中，感兴趣的基因是农艺学性状基因、除草剂耐性基因或选择标志物基因。在具体的实施方案中，例如，内部sRNA靶向位点的长度是20-25个核苷酸。
[0018] 本文中还描述了转基因植物细胞、植物组织、和植物，其包含至少一种前述的核酸表达构建体。在具体的实施方案中，所述sRNA分子在不同植物细胞和组织中差异表达。例如，编码sRNA分子的基因(例如转基因)可以与非组成性启动子(例如组织特异性启动子)可操作连接。在具体的实施方案中，sRNA是植物细胞的内源sRNA。在某些例子中，sRNA是主要在雄性植物组织中表达的内源sRNA，该sRNA指导从感兴趣基因转录的RNA特异性地在雄性组织中降解，其中从感兴趣基因转录的RNA在其它组织中的表达基本上不受影响。
[0019] 本文中进一步描述了授粉控制系统，其包含前述构建体和/或植物细胞、植物组织、和包含此类构建体的植物。
[0021] 附图简述
[0022] 图1包括具体实施方案的图，其中作为授粉控制系统的一部分，对转基因玉米植物赋予雄性组织特异性的除草剂易感性。
[0023] 图2包括显示不成熟的玉米胚中的AAD1瞬时表达的数据。
[0024] 图3A和3B包括显示雄穗中的AAD1表达的数据。
[0025] 图4A和4B包括显示叶中的AAD1表达的数据。
[0026] 图5A和5B包括显示叶(图5A)和雄穗(图5B)中的AAD1 RNA表达的数据。
[0028] 如37 C.F.R.§1.822中定义，使用核苷酸碱基的标准字母缩写显示所附序列表中列出的核酸序列。仅显示了每个核酸序列的一条链，但是应当理解对展示链的任何指称也包括了互补链。在所附序列表中：
[0029] SEQ ID NO:1以5’至3’方向显示了示例性的miR156 RNA：
[0030] UGACAGAAGAGAGUGAGCAC
[0031] SEQ ID NO:2以5’至3’方向显示了示例性的miR529 RNA：
[0032] AGAAGAGAGAGAGUACAGCCU
[0033] SEQ ID NO:3显示了示例性的miR319 RNA：
[0034] UUGGACUGAAGGGUGCUCCC
[0035] SEQ ID NO:4显示了tsh4 miR529-156 DNA靶位点：
[0036] GACTCCAGCTGTGCTCTCTCTCTTCTGTCAACTCA
[0038]ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCCCTCTCTCCCAACGCTTTGAGAGAATAGCTGTCCAGCCACTCACTGGTGTCCTTGGTGCTGAGATCACTGGAGTGGACTTGAGGGAACCACTTGATGACAGCACCTGGAATGAGATATTGGATGCCTTCCACACTTACCAAGTCATCTACTTTCCTGGCCAAGCAATCACCAATGAGCAGCACATTGCATTCTCAAGAAGGTTTGGACCAGTTGATCCAGTGCCTCTTCTCAAGAGCATTGAAGGCTATCCAGAGGTTCAGATGATCCGCAGAGAAGCCAATGAGTCTGGAAGGGTGATTGGTGATGACTGGCACACAGACTCCACTTTCCTTGATGCACCTCCAGCTGCTGTTGTGATGAGGGCCATAGATGTTCCTGAGCATGGCGGAGACACTGGGTTCCTTTCAATGTACACAGCTTGGGAGACCTTGTCTCCAACCATGCAAGCCACCATCGAAGGGCTCAACGTTGTGCACTCTGCCACACGTGTGTTCGGTTCCCTCTACCAAGCACAGAACCGTCGCTTCAGCAACACCTCAGTCAAGGTGATGGATGTTGATGCTGGTGACAGAGAGACAGTCCATCCCTTGGTTGTGACTCATCCTGGCTCTGGAAGGAAAGGCCTTTATGTGAATCAAGTCTACTGTCAGAGAATTGAGGGCATGACAGATGCAGAATCAAAGCCATTGCTTCAGTTCCTCTATGAGCATGCCACCAGATTTGACTTCACTTGCCGTGTGAGGTGGAAGAAAGACCAAGTCCTTGTCTGGGACAACTTGTGCACCATGCACCGTGCTGTTCCTGACTATGCTGGCAAGTTCAGATACTTGACTCGCACCACAGTTGGTGGAGTTAGGCCTGCCCGCTGAGTAGTTAGCTTAATCACCTAGAGCTCGGTAACCTTTAAAC
[0039] SEQ ID NO:6显示了示例性多核苷酸，其包含AAD-1编码区(加下划线)，接着是天然的tsh4 miR529-156靶位点(加双下划线)，该位点位于AAD-1编码区的末端与ZmPer5 3’UTR(斜体)之间：
[0040]ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCCCTCTCTCCCAACGCTTTGAGAGAATAGCTGTCCAGCCACTCACTGGTGTCCTTGGTGCTGAGATCACTGGAGTGGACTTGAGGGAACCACTTGATGACAGCACCTGGAATGAGATATTGGATGCCTTCCACACTTACCAAGTCATCTACTTTCCTGGCCAAGCAATCACCAATGAGCAGCACATTGCATTCTCAAGAAGGTTTGGACCAGTTGATCCAGTGCCTCTTCTCAAGAGCATTGAAGGCTATCCAGAGGTTCAGATGATCCGCAGAGAAGCCAATGAGTCTGGAAGGGTGATTGGTGATGACTGGCACACAGACTCCACTTTCCTTGATGCACCTCCAGCTGCTGTTGTGATGAGGGCCATAGATGTTCCTGAGCATGGCGGAGACACTGGGTTCCTTTCAATGTACACAGCTTGGGAGACCTTGTCTCCAACCATGCAAGCCACCATCGAAGGGCTCAACGTTGTGCACTCTGCCACACGTGTGTTCGGTTCCCTCTACCAAGCACAGAACCGTCGCTTCAGCAACACCTCAGTCAAGGTGATGGATGTTGATGCTGGTGACAGAGAGACAGTCCATCCCTTGGTTGTGACTCATCCTGGCTCTGGAAGGAAAGGCCTTTATGTGAATCAAGTCTACTGTCAGAGAATTGAGGGCATGACAGATGCAGAATCAAAGCCATTGCTTCAGTTCCTCTATGAGCATGCCACCAGATTTGACTTCACTTGCCGTGTGAGGTGGAAGAAAGACCAAGTCCTTGTCTGGGACAACTTGTGCACCATGCACCGTGCTGTTCCTGACTATGCTGGCAAGTTCAGATACTTGACTCGCACCACAGTTGGTGGAGTTAGGCCTGCCCGCTGAGTAGTTAGCTTAATCACCTAGAGCTC
GGTAACCTTTAAAC
GGTAACCTTTAAAC
[0041] SEQ ID NO:7显示了示例性的修饰tsh4靶位点，其包含天然miR529靶位点及突变的miR156靶位点：
[0042] GACTCAGGCTGTACTCTCTTACTTCACAAAGTACTCA
[0043] SEQ ID NO:8显示了另一个示例性的修饰tsh4靶位点，其包含天然的miR529靶位点及突变的miR156靶位点：
[0044] GACTCAGGCTGTACTCTCTCTCTTCACAAAGTACTCA
[0045] SEQ ID NO:9显示了示例性的多核苷酸，其包含AAD-1编码区(加下划线)，接着是示例性的修饰tsh4靶位点(加双下划线)，所述修饰tsh4靶位点包含天然的miR529靶位点及突变的miR156靶位点，位于AAD-1编码区的末端和ZmPer5 3’UTR(斜体)之间：
[0046]ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCCCTCTCTCCCAACGCTTTGAGAGAATAGCTGTCCAGCCACTCACTGGTGTCCTTGGTGCTGAGATCACTGGAGTGGACTTGAGGGAACCACTTGATGACAGCACCTGGAATGAGATATTGGATGCCTTCCACACTTACCAAGTCATCTACTTTCCTGGCCAAGCAATCACCAATGAGCAGCACATTGCATTCTCAAGAAGGTTTGGACCAGTTGATCCAGTGCCTCTTCTCAAGAGCATTGAAGGCTATCCAGAGGTTCAGATGATCCGCAGAGAAGCCAATGAGTCTGGAAGGGTGATTGGTGATGACTGGCACACAGACTCCACTTTCCTTGATGCACCTCCAGCTGCTGTTGTGATGAGGGCCATAGATGTTCCTGAGCATGGCGGAGACACTGGGTTCCTTTCAATGTACACAGCTTGGGAGACCTTGTCTCCAACCATGCAAGCCACCATCGAAGGGCTCAACGTTGTGCACTCTGCCACACGTGTGTTCGGTTCCCTCTACCAAGCACAGAACCGTCGCTTCAGCAACACCTCAGTCAAGGTGATGGATGTTGATGCTGGTGACAGAGAGACAGTCCATCCCTTGGTTGTGACTCATCCTGGCTCTGGAAGGAAAGGCCTTTATGTGAATCAAGTCTACTGTCAGAGAATTGAGGGCATGACAGATGCAGAATCAAAGCCATTGCTTCAGTTCCTCTATGAGCATGCCACCAGATTTGACTTCACTTGCCGTGTGAGGTGGAAGAAAGACCAAGTCCTTGTCTGGGACAACTTGTGCACCATGCACCGTGCTGTTCCTGACTATGCTGGCAAGTTCAGATACTTGACTCGCACCACAGTTGGTGGAGTTAGGCCTGCCCGCTGAGTAGTTAGCTTAATCACCTAGAGCTC
GGTAACCTTTAAAC
GGTAACCTTTAAAC
[0047] SEQ ID NO:10显示了示例性的多核苷酸，其包含AAD-1编码区(加下划线)，接着是另一示例性的修饰tsh4靶位点(加双下划线)，所述修饰tsh4靶位点包含天然的miR529靶位点及突变的miR156靶位点，位于AAD-1编码区的末端和ZmPer5 3’UTR(斜体)之间：
[0048]ATGGCTCATGCTGCCCTCAGCCCTCTCTCCCAACGCTTTGAGAGAATAGCTGTCCAGCCACTCACTGGTGTCCTTGGTGCTGAGATCACTGGAGTGGACTTGAGGGAACCACTTGATGACAGCACCTGGAATGAGATATTGGATGCCTTCCACACTTACCAAGTCATCTACTTTCCTGGCCAAGCAATCACCAATGAGCAGCACATTGCATTCTCAAGAAGGTTTGGACCAGTTGATCCAGTGCCTCTTCTCAAGAGCATTGAAGGCTATCCAGAGGTTCAGATGATCCGCAGAGAAGCCAATGAGTCTGGAAGGGTGATTGGTGATGACTGGCACACAGACTCCACTTTCCTTGATGCACCTCCAGCTGCTGTTGTGATGAGGGCCATAGATGTTCCTGAGCATGGCGGAGACACTGGGTTCCTTTCAATGTACACAGCTTGGGAGACCTTGTCTCCAACCATGCAAGCCACCATCGAAGGGCTCAACGTTGTGCACTCTGCCACACGTGTGTTCGGTTCCCTCTACCAAGCACAGAACCGTCGCTTCAGCAACACCTCAGTCAAGGTGATGGATGTTGATGCTGGTGACAGAGAGACAGTCCATCCCTTGGTTGTGACTCATCCTGGCTCTGGAAGGAAAGGCCTTTATGTGAATCAAGTCTACTGTCAGAGAATTGAGGGCATGACAGATGCAGAATCAAAGCCATTGCTTCAGTTCCTCTATGAGCATGCCACCAGATTTGACTTCACTTGCCGTGTGAGGTGGAAGAAAGACCAAGTCCTTGTCTGGGACAACTTGTGCACCATGCACCGTGCTGTTCCTGACTATGCTGGCAAGTTCAGATACTTGACTCGCACCACAGTTGGTGGAGTTAGGCCTGCCCGCTGAGTAGTTAGCTTAATCACCTAGAGCTC
GGTAACCTTTAAAC
GGTAACCTTTAAAC
[0049] SEQ ID NO:11显示了一种人工miRNA，在本文中称为CMSRF9973.1：GGATCCCAGCAGCAGCCACAGCAAAATTTGGTTTGGGATAGGTAGGTGTTATGTTAGGTCTGGTTTTTTGGCTGTAGCAGCAGCAGAGAAGAGAGAGAGTACAGCCTCAGGAGATTCAGTTTGAAGCTGGACTTCACTTTTGCCTCTCTAGGCTCTACACTCTCTCTTCTTTCCTGCTGCTAGGCTGTTCTGTGGAAGTTTGCAGAGTTTATATTATGGGTTTAATCGTCCATGGCATCAGCATCAGCAGCATTTAAATGAGCTCGGTAACC
[0050] SEQ ID NO:12显示了本文中的某些例子中利用的SCBV启动子：
[0051] TCGGAAGTTGAAGACAAAGAAGGTCTTAAATCCTGGCTAGCAACACTGAACTATGCCAGAAACCACATCAAAGCATATCGGCAAGCTTCTTGGCCCATTATATCCAAAGACCTCAGAGAAAGGTGAGCGAAGGCTCAATTCAGAAGATTGGAAGCTGATCAATAGGATCAAGACAATGGTGAGAACGCTTCCAAATCTCACTATTCCACCAGAAGATGCATACATTATCATTGAAACAGATGCATGTGCAACTGGATGGGGAGCAGTATGCAAGTGGAAGAAAAACAAGGCAGACCCAAGAAATACAGAGCAAATCTGTAGGTATGCCAGTGGAAAATTTGATAAGCCAAAAGGAACCTGTGATGCAGAAATCTATGGGGTTATGAATGGCTTAGAAAAGATGAGATTGTTCTACTTGGACAAAAGAGAGATCACAGTCAGAACTGACAGTAGTGCAATCGAAAGGTTCTACAACAAGAGTGCTGAACACAAGCCTTCTGAGATCAGATGGATCAGGTTCATGGACTACATCACTGGTGCAGGACCAGAGATAGTCATTGAACACATAAAAGGGAAGAGCAATGGTTTAGCTGACATCTTGTCCAGGCTCAAAGCCAAATTAGCTCAGAATGAACCAACGGAAGAGATGATCCTGCTTACACAAGCCATAAGGGAAGTAATTCCTTATCCAGATCATCCATACACTGAGCAACTCAGAGAATGGGGAAACAAAATTCTGGATCCATTCCCCACATTCAAGAAGGACATGTTCGAAAGAACAGAGCAAGCTTTTATGCTAACAGAGGAACCAGTTCTACTCTGTGCATGCAGGAAGCCTGCAATTCAGTTAGTGTCCAGAACATCTGCCAACCCAGGAAGGAAATTCTTCAAGTGCGCAATGAACAAATGCCATTGCTGGTACTGGGCAGATCTCATTGAAGAACACATTCAAGACAGAATTGATGAATTTCTCAAGAATCTTGAAGTTCTGAAGACCGGTGGCGTGCAAACAATGGAGGAGGAACTTATGAAGGAAGTCACCAAGCTGAAGATAGAAGAGCAGGAGTTCGAGGAATACCAGGCCACACCAAGGGCTATGTCGCCAGTAGCCGCAGAAGATGTGCTAGATCTCCAAGACGTAAGCAATGACGATTGAGGAGGCATTGACGTCAGGGATGACCGCAGCGGAGAGTACTGGGCCCATTCAGTGGATGCTCCACTGAGTTGTATTATTGTGTGCTTTTCGGACAAGTGTGCTGTCCACTTTCTTTTGGCACCTGTGCCACTTTATTCCTTGTCTGCCACGATGCCTTTGCTTAGCTTGTAAGCAAGGATCGCAGTGCGTGTGTGACACCACCCCCCTTCCGACGCTCTGCCTATATAAGGCACCGTCTGTAAGCTCTTACGATCATCGGTAGTTCACCAAGGC
[0052] SEQ ID NO:13显示了本文中的某些例子中利用的合成5’UTR：
[0053] CTGAAGGCTCGACAAGGCAGTCCACGGAGGAGCTGATATTTGGTGGACAAGCTGTGGATAGGAGCAACCCTATCCCTAATATACCAGCACCACCAAGTCAGGGCAATCCCCAGATCACCCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAGTACACACACATGTATATATGTATGATGTATCCCTTCGATCGAAGGCATGCCTTGGTATAATCACTGAGTAGTCATTTTATTACTTTGTTTTGACAAGTCAGTAGTTCATCCATTTGTCCCATTTTTTCAGCTTGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTTGGTCTAATAACTGAGTAGTCATTTTATTACGTTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTTCAGCTAGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTTGGACTAATAACTGATTAGTCATTTTATTACATTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTCAGCTAGGAAGTTCGGATCTGGGGCCATTTGTTCCAGGCACGGGATAAGCATTCAG[0054] SEQ ID NO:14显示了玉米转化酶(INV)基因(GenBankTM登录号U16123)。
[0055] SEQ ID NO:15显示了玉米延伸因子1α(EF1α)基因(GenBankTM登录号AF136823.1)。
[0056] SEQ ID NO:16-31显示了本文中的某些例子中利用的寡核苷酸。
[0057] 发明详述
[0058] I.几个实施方案的概述
[0059] 本文中的实施方案利用sRNA的组织特异性表达来阻抑/敲低特定组织中的转基因表达。已经显示了sRNA调节多种多样的发育过程，包括器官分离、极性、和同一性，并且调控其自身的生物起源和功能。在本文中的实施方案中，利用sRNA介导的基因调节的精确性和特异性来实现转基因的组织特异性表达。举例而言，将组织特异性sRNA(例如内源组织特异性sRNA)的靶位点工程构建到转基因中以降低或消除该转基因在组织中的表达。可以利用本文中的实施方案来将任何转基因的表达靶向至任何特定的组织。
[0060] 本文中的具体实施方案可用于例如优先阻抑除草剂选择基因在雄性组织(例如雄穗、花粉、花药、和雄蕊)中的表达，以便藉由施用除草剂来诱导雄性不育。此种新的细胞工程化方法的例子会节约巨大的资源，例如通过降低或消除杂种种子生产过程中对昂贵的手动去雄程序的需求。另外，一些实例避免由于去雄过程期间发生的植物损伤所致的产率损失。
[0061] II.缩写
[0062] dsRNA 双链核糖核酸
[0063] GI 生长抑制
[0064] NCBI 美国国家生物信息中心
[0065] gDNA 基因组DNA
[0066] iRNA 抑制性核糖核酸
[0067] ORF 可读框
[0068] RNAi 核糖核酸干扰
[0069] miRNA 微小抑制性核糖核酸
[0070] sRNA 小核糖核酸
[0071] siRNA 小抑制性核糖核酸，或短干扰性核糖核酸
[0072] hpRNA 发夹核糖核酸
[0073] UTR 非翻译区
[0074] PCR 聚合酶链式反应
[0075] RISC RNA诱导的沉默复合物
[0076] III.术语
[0078] 回交：回交方法可以用于将核酸序列导入植物中。几十年以来已经广泛使用回交技术来将新性状引入植物中。Jensen,N.编Plant Breeding Methodology,John Wiley&Sons,Inc.,1988。在一个典型的回交方案中，将感兴趣的初始品种(轮回亲本)与携带要转移的感兴趣基因的第二品种(非轮回亲本)杂交。然后，将来自此杂交的所得后代与轮回亲本再次杂交，并重复该过程，直到获得如下的植物，其中在来自非轮回亲本的转移基因外，在转化植物中恢复回归植物的基本上所有期望的形态学和生理学特征。
[0079] 表达：如本文中使用的，编码序列(例如基因或转基因)的“表达”指核酸转录单元(包括例如基因组DNA或cDNA)的编码信息被转化成细胞的操作性、非操作性、或结构性部分的过程，经常包括蛋白质的合成。基因表达可以受到外部信号影响；例如细胞、组织或生物体暴露于提高或降低基因表达的药剂。基因的表达也可以在从DNA至RNA至蛋白质的途径中的任何地方受到调节。例如，基因表达的调节藉由作用于转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子诸如mRNA的降解的控制，或者藉由特定蛋白质分子在它们已经被生成后的活化、失活、区室化、或降解，或者通过其组合发生。可以通过本领域中已知的任何方法在RNA水平或蛋白质水平上测量基因表达，所述方法包括但不限于Northern印迹、RT-PCR、Western印迹、或体外、原位或体内蛋白质活性测定法。
[0080] 遗传材料：如本文中使用的，术语“遗传材料”包括所有基因，和核酸分子，诸如DNA和RNA。
[0081] 抑制：如本文中使用的，术语“抑制”在用于描述对编码序列(例如基因)的影响时，指从编码序列转录的mRNA和/或编码序列的肽、多肽、或蛋白质产物的细胞水平的可测度的降低。在一些例子中，编码序列的表达可以受到抑制而使得表达基本上被消除(例如表达降低到其在对照细胞中的表达的小于10％,9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)。
[0082] 分离的：“分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白质)已经与该组分天然存在的生物体的细胞中的其它生物学组分(即，其它染色体和染色体外DNA和RNA，和蛋白质)基本上分开，脱离所述其它生物学组分而生成，或者从所述其它生物学组分纯化出来，同时实现该组分的化学或功能变化(例如，核酸可以通过打断连接核酸与染色体中的其余DNA的化学键而从染色体分离)。已经得到“分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质，其中已经有核酸或蛋白质的化学或功能变化。该术语还涵盖通过在宿主细胞中的重组表达制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。
[0083] 核酸分子：如本文中使用的，术语“核酸分子”可以指核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA的有义链和反义链两者、cDNA、基因组DNA、和合成的形式和上述物质的混合聚合物。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任一类型的核苷酸的经修饰的形式。如本文中使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义的。核酸分子的长度通常是至少10个碱基，除非另有规定。按照惯例，从分子的5’至3’端阅读核酸分子的核苷酸序列。核苷酸序列的“互补物”指与核苷酸序列的核碱基形成碱基对(即A-T/U，和G-C)的核碱基的从5’至3’的序列。核酸序列的“反向互补物”指与核苷酸序列的核碱基形成碱基对的核碱基的3’至5’的序列。
[0084] “核酸分子”包括DNA的单链和双链形式；RNA的单链形式；和RNA的双链形式(dsRNA)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”指作为单独的单链或在双链体中的核酸的有义链和反义链两者。术语“核糖核酸”(RNA)包括iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、sRNA(小RNA)、siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微小RNA)、hpRNA(发夹RNA)、mRNA(信使RNA)、tRNA(转运RNA)、和cRNA(互补RNA)。术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA、基因组DNA、和DNA-RNA杂合物。本领域技术人员会将术语“多核苷酸”理解为结构术语，该结构术语由其核苷酸序列限定，并且包括基因组序列、核糖体RNA序列、转移RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列、和较小的工程化核苷酸序列。
[0085] 小RNA(sRNA)：sRNA是非编码RNA，其通过与蛋白质编码基因的信息配对以引导mRNA切割或生成性翻译的阻抑而调节基因表达。Dugas and Bartel(2004)Curr.Opin.Plant Biolo.7:512-20。如本文中使用的，术语“小RNA”(sRNA)包括例如微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、反式作用小干扰RNA(tasiRNA)、和其它sRNA引导切割、翻译阻抑、和/或基因沉默。
[0086] 小干扰RNA(siRNA)：约21-25个核苷酸的RNA，其通过切丁酶酶(在动物中)或DCL酶(在植物中)从dsRNA加工而来。初始的切丁酶或DCL产物是双链的，其中两条链的长度通常是21-25个核苷酸，并且在每个3’端含有两个未配对的碱基。双链siRNA结构内的各单独链是分开的，并且典型地，siRNA之一会与多亚基复合物，即RNAi诱导的沉默复合物(RISC)缔合。siRNA的典型功能是基于碱基对互补性将RISC引导到靶标。
[0087] (要抑制的)靶核酸：如本文中使用的，术语“靶标”在指多核苷酸时，是指含有与miRNA或siRNA相互作用的序列、或者具有产生与miRNA或siRNA相互作用的序列的潜力(例如藉由基因座的转录)的任何核酸。靶标可以是细胞核酸，如编码必需或非必需蛋白质的mRNA，或外来核酸，如病毒衍生的或转基因衍生的RNA分子。例如，靶标可以是对应于启动子的DNA序列，或者对应于基因组的任何表达区域的序列。
[0088] 寡核苷酸：寡核苷酸是短核酸分子。寡核苷酸可以通过切割较长的核酸区段，或者通过聚合个别的核苷酸前体形成。自动化测序仪允许合成寡核苷酸，直至长度为几百个碱基对。由于寡核苷酸可以结合互补的核苷酸序列，它们可以用作探针以检测DNA或RNA。可以在PCR(一种用于扩增小DNA序列的技术)中使用由DNA(寡脱氧核糖核苷酸)构成的寡核苷酸。在PCR中，寡核苷酸通常称为“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸，并且复制互补链。
[0089] 核酸分子可以包含通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸联接连接在一起的天然存在的和/或经修饰的核苷酸。核酸分子可以是化学或生物化学修饰的，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，如本领域技术人员容易领会的。此类修饰包括例如标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如不带电荷的联接：例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电荷的联接：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂模块：例如，肽；插入剂：例如，吖啶、补骨脂素(psoralen)等；螯合剂；烷化剂；和经修饰的联接：例如，α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑学构象，包括单链、双链、部分双链体的、三链体的、发夹的、环状、和挂锁的构象。
[0090] 如本文中就DNA而言使用的，术语“编码序列”指当置于合适的调节序列的控制下时被转录成RNA的核苷酸序列。“蛋白质编码序列”是藉由转录和mRNA，最终被翻译成多肽的核苷酸序列(DNA或RNA)。就RNA而言，术语“编码序列”指被翻译成肽、多肽或蛋白质的核苷酸序列。编码序列的边界由5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子决定。编码序列包括但不限于：基因组DNA；cDNA；EST；和重组核苷酸序列。
[0091] 基因组：如本文中使用的，术语“基因组”指细胞核内发现的染色体DNA，并且也指细胞的亚细胞组分内发现的细胞器DNA。在本发明的一些实施方案中，可以将DNA分子导入植物细胞中，使得DNA分子整合到植物细胞的基因组中。在这些和其它实施方案中，可以将DNA分子整合到植物细胞的核DNA中，或者整合到植物细胞的叶绿体或线粒体的DNA中。
[0092] 内源的：术语“内源的”在本文中应用于核酸(例如多核苷酸、DNA、RNA和基因)时，指通常在其特定的环境或背景内存在(例如在相同类型和物种的野生型细胞中)的一种或多种核酸。例如，内源基因是通常在所讨论的特定细胞中和在相同背景(例如就调节序列而言)中找到的基因。内源核酸与外源和/或异源可以通过例如但不限于下述方式区分：在后者中检测细菌质粒的重组而带来的序列；鉴定非典型的密码子偏好；和在从野生型细胞中表征的引物在PCR反应中扩增出非典型的序列。
[0093] 外源：如本文中应用于核酸，术语“外源”指通常不存在于其特定环境或背景内的一种或多种核酸。例如，若用自然界中不存在于未转化的宿主细胞中的核酸转化宿主细胞，则所述核酸对于宿主细胞而言是外源的。如本文中使用的，术语“外源”还指与已经存在于宿主细胞中的核酸在序列上相同，但是位于与已经存在于宿主细胞中的具有相同序列的核酸不同的细胞或基因组背景中的一种或多种核酸。例如，下述核酸对于宿主细胞是外源的：所述核酸与通常整合在宿主细胞的基因组中的具有相同序列的核酸在不同位置中整合在宿主细胞的基因组中。此外，在宿主细胞中存在于质粒或载体中的核酸(例如DNA分子)当具有相同序列的核酸通常仅存在于宿主细胞的基因组中时对于宿主细胞是外源的。
[0094] 异源的：如本文中应用于核酸(例如多核苷酸、DNA、RNA和基因)，术语“异源的”意指不同起源的。例如，若用自然界中不存在于未转化的宿主细胞中的核酸转化宿主细胞，则所述核酸对于宿主细胞是异源的(且外源的)。此外，转化核酸的不同元件(例如启动子、增强子、编码序列、终止子等)彼此和/或对于经转化的宿主可以是异源的。如本文中使用的，术语异源也可以应用于与已经存在于宿主细胞中的核酸在序列上相同，但是现在与不同其它序列连接和/或以不同拷贝数存在等的一种或多种核酸。
[0095] 序列同一性：如本文中在两种核酸或多肽序列的背景中所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”可以指两种序列中在规定的比较窗里为了实现最大对应性而比对时相同的残基。
[0096] 如本文中所使用的，术语“序列同一性百分比”可以指通过在比对窗口里比较两个最佳比对序列(例如核酸序列和氨基酸序列)测定的数值，其中为了实现两个序列的最佳比对，比较窗口中序列的部分与参照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通过测定两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比来计算百分比。
[0097] 用于比对比较序列的方法是本领域中公知的。各种程序和比对算法记载于例如：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；
Higgins and Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；
Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等(1992)Comp.Appl.Biosci.8:
155-65；Pearson等(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细讨论可以参见例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
Higgins and Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；
Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等(1992)Comp.Appl.Biosci.8:
155-65；Pearson等(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细讨论可以参见例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
[0098] 美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLASTTM；Altschul等(1990))可获自几种来源，包括国立生物技术信息中心(Bethesda,MD)，以及在互联网上可获得(关于与几种序列分析程序结合使用)。
如何使用此程序测定序列同一性的描述可在互联网上BLASTTM的“帮助”部分下获得。为了比TM
较核酸序列，可以使用缺省参数，采用BLAST (Blastn)程序的“Blast 2 sequences”功能。
与参照序列具有甚至更大相似性的核酸序列当通过此方法评估时会显示增加的百分比同一性。
如何使用此程序测定序列同一性的描述可在互联网上BLASTTM的“帮助”部分下获得。为了比TM
较核酸序列，可以使用缺省参数，采用BLAST (Blastn)程序的“Blast 2 sequences”功能。
与参照序列具有甚至更大相似性的核酸序列当通过此方法评估时会显示增加的百分比同一性。
[0099] 可特异性杂交/特异性互补：如本文中使用的，术语“可特异性杂交”和“特异性互补”是指示足够的互补性程度，使得核酸分子和靶标核酸分子之间发生稳定且特异性的结合的术语。两个核酸分子之间的杂交牵涉两个核酸分子的核酸序列之间的反向平行排列的形成。然后，两个分子能够与相反链上的相应碱基形成氢键以形成双链体分子，所述双链体分子在其足够稳定的情况下使用本领域中公知的方法可检出。核酸分子不需要与要特异性可杂交的其靶标序列是100％互补的。然而，为了使杂交为特异性而必须存在的序列互补性的量是使用的杂交条件的函数。
[0100] 产生特定严格性程度的杂交条件会随选择的杂交方法的性质及杂交核酸序列的组成和长度而有所变化。一般地，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg++浓度)会决定杂交严格性，尽管清洗次数也影响严格性。关于获得特定严格性程度需要的杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知的，并且例如在Sambrook等(编)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,第9章和第11章；及Hames和Higgins(编)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985中讨论。关于核酸杂交的更为详细的用法说明书和指导可以参见例如Tijssen,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,”于Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第I部分,第2章,Elsevier,NY,1993；和Ausubel等编,Current Protocols in Molecular Biology,第2章,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995。
[0101] 如本文中使用的，“严格条件”涵盖仅在杂交分子与靶核酸分子内的同源序列之间存在有小于20％错配时发生杂交的条件。“严格条件”包括其它特定的严格性水平。因此，如本文中使用的，“中等严格性”条件是具有超过20％序列错配的分子不会杂交的那些条件；“高严格性”条件是具有超过10％错配的序列不会杂交的那些条件；并且“非常高的严格性”条件是具有超过5％错配的序列不会杂交的那些条件。
[0102] 以下是代表性的非限制性的杂交条件。
[0103] 高严格性条件(检测共享至少90％序列同一性的序列)：在5x SSC缓冲液中于65℃杂交16小时；在2x SSC缓冲液中于室温清洗两次，每次15分钟；和在0.5x SSC缓冲液中于65℃清洗两次，每次20分钟。
[0104] 中等严格性条件(检测共享至少80％序列同一性的序列)：在5x-6x SSC缓冲液中于65-70℃杂交16-20小时；在2x SSC缓冲液中于室温清洗两次，每次5-20分钟；和在1x SSC缓冲液中于55-70℃清洗两次，每次30分钟。
[0105] 非严格对照条件(共享至少50％序列同一性的序列会杂交)：在6x SSC缓冲液中于室温至55℃杂交16-20小时；在2x-3x SSC缓冲液中于室温至55℃清洗至少两次，每次20-30分钟。
[0106] 如本文中使用的，术语“基本上同源”或“实质性同源性”就多核苷酸而言，指在严格条件下与参照核酸序列杂交的多核苷酸。例如，与参照DNA编码序列基础上同源的多核苷酸是在严格条件(例如上文列出的中等严格性条件)下与参照DNA编码序列杂交的那些多核苷酸。基本上同源的序列可以具有至少80％序列同一性。例如，基本上同源的序列可以具有约80％至100％序列同一性，诸如约81％；约82％；约83％；约84％；约85％；约86％；约87％；约88％；约89％；约90％；约91％；约92％；约93％；约94％；约95％；约96％；约97％；约98％；
约98.5％；约99％；约99.5％；和约100％。实质性同源性的特性与特异性杂交紧密相关。例如，当有足够的互补性程度以避免在期望特异性结合的条件下，例如在严格杂交条件下核酸与非靶标序列的非特异性结合核酸分子可特异性杂交。
约98.5％；约99％；约99.5％；和约100％。实质性同源性的特性与特异性杂交紧密相关。例如，当有足够的互补性程度以避免在期望特异性结合的条件下，例如在严格杂交条件下核酸与非靶标序列的非特异性结合核酸分子可特异性杂交。
[0107] 如本文中使用的，术语“直向同源物”指已经从共同的祖先核苷酸序列进化，并且可以在两种或更多种物种中保留相同功能的两种或更多种物种中的基因。
[0108] DNA具有两条反向平行链，即5’—＞＞3’链，称为正链，和3’—＞＞5’链，称为负链。由于RNA聚合酶以5’—＞＞3’方向添加核酸，DNA的负链在转录期间充当RNA的模板。因此，RNA转录物会具有与负链互补，并且与正链相同(只是用U替代T)的序列。
[0109] 反义分子是与RNA或DNA的正链可特异性杂交或特异性互补的分子。有义分子是与DNA的负链可特异性杂交或特异性互补的分子。反基因分子是针对DNA靶标的反义或有义分子。反义RNA是与有义(编码)核酸分子互补的RNA分子。
[0110] 如本文中使用的，当以5’至3’方向读出的序列的每个核苷酸与在以3’至5’方向读出时另一个序列的每个核苷酸互补时，称两个核酸序列分子展现出“完全互补性”。与参照核苷酸序列互补的核苷酸序列会展现出与参照核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这些术语和描述是本领域中定义明确的，并且是本领域普通技术人员容易理解的。
[0111] 如本文中使用的，术语“基本上相同”可以指超过85％相同的核苷酸序列。例如，基本上相同的核苷酸序列可以与参照序列至少85.5％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；
至少98％；至少99％；或至少99.5％相同。
至少98％；至少99％；或至少99.5％相同。
[0112] 可操作连接的：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系中时，第一核苷酸序列与第二核酸序列可操作连接。当重组生成时，可操作连接的核酸序列一般是连续的，并且在有必要连接两个蛋白质编码区的情况下，在相同可读框中(例如在多顺反子ORF中)。然而，可操作连接的核酸不需要是连续的。
[0113] 术语“可操作连接”当提及调节序列和编码序列使用时意指调节序列影响连接的编码序列的表达。“调节序列”或“控制元件”指影响转录的时机和水平/量、RNA加工或稳定性、或结合的编码序列的翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子；翻译前导序列；内含子；增强子；茎-环结构；阻遏物结合序列；终止序列；聚腺苷酸化识别序列等。特定的调节序列可以位于与其可操作连接的编码序列上游和/或下游。还有，与编码序列可操作连接的特定的调节序列可以位于双链核酸分子的结合的互补链上。
[0114] 启动子：如本文中使用的，术语“启动子”指可以在转录起始上游，并且可以参与RNA聚合酶和其它蛋白质的识别和结合以启动转录的DNA区域。启动子可以与在细胞中表达的编码序列可操作连接，或者启动子可以与编码信号序列的核苷酸序列可操作连接，所述编码信号序列的核苷酸序列可以与在细胞中表达的编码序列可操作连接。
[0115] 本文中的一些实施方案包括“植物启动子”。植物启动子是能够在植物细胞中启动转录的启动子。
[0116] 本文中的一些实施方案包括“组织优选性启动子”。组织优选性启动子是能够在发育控制下启动转录的启动子，并且包括例如但不限于：优先启动叶、花粉、雄穗、根、种子、纤维、木质导管、管胞、和厚壁组织中的转录的启动子。基本上仅在某些组织中启动转录的启动子称为“组织特异性”。“细胞类型特异性”启动子主要在一个或多个器官中的某些细胞类型，例如根或叶中的维管细胞中驱动表达。“诱导型”启动子可以是可以在环境控制下的启动子。可以通过诱导型启动子启动转录的环境条件的例子包括厌氧条件和光的存在。组织特异性、组织优选性、细胞类型特异性、和诱导型启动子构成“非组成性”启动子的类别。
[0117] 可以在本发明的一些实施方案中使用任何诱导型启动子。参见Ward等(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。凭借诱导型启动子，转录速率响应诱导剂而增加。例示性的诱导型启动子包括但不限于：响应铜的来自ACEI系统的启动子；响应苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因；来自Tn10的Tet阻遏物；和来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可以通过糖皮质类固醇激素诱导(Schena等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10421-5)。
[0118] 与非组成性启动子形成对比，“组成性”启动子是在大多数环境条件下有活性的启动子。例示性的组成性启动子包括但不限于：来自植物病毒的启动子，诸如来自CaMV的35S启动子；来自稻肌动蛋白基因的启动子；泛素启动子；pEMU；MAS；玉米H3组蛋白启动子；和ALS启动子、在欧洲油菜(Brassica napus)ALS3结构基因5’的Xba1/NcoI片段(或与所述Xba1/NcoI片段的核苷酸序列类似物)(PCT国际专利公开文本No.WO 96/30530)。
[0119] 另外，在本发明的一些实施方案中，可以利用任何组织特异性或组织优选性启动子。用核酸分子转化的植物可以仅仅或优先在特定的组织中产生编码序列的产物，所述核酸分子包含与组织特异性启动子可操作连接的编码序列。示例性的组织特异性或组织优选性启动子包括但不限于：根优选性启动子，如来自菜豆球蛋白基因；叶特异性和光诱导的启动子，如来自cab或rubisco；花药特异性启动子，如来自LAT52；花粉特异性启动子，如来自Zm13；和小孢子优选性启动子，如来自apg。
[0120] 性状或表型：术语“性状”和“表型”在本文中可互换使用。为本公开的目的，特别感兴趣的性状包括农艺学重要的性状，其可以例如在作物植物中表达。在一些例子中，特别感兴趣的性状是雄性不育。
[0121] 转化：如本文中使用的，术语“转化”指将一种或多种核酸分子转移到细胞中。当核酸分子被细胞稳定复制(通过将核酸分子掺入细胞基因组中，或者通过附加体复制)时，细胞被导入细胞中的核酸分子“转化”。如本文中使用的，术语“转化”涵盖所有可以将核酸分子导入此类细胞中的技术。例子包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm等(1986)Nature 319:791-3)；脂质转染(Felgner等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller等(1978)Cell 15:579-85)；土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转移(Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-
7)；直接的DNA摄取；和微粒轰击(Klein等(1987)Nature 327:70)。
7)；直接的DNA摄取；和微粒轰击(Klein等(1987)Nature 327:70)。
[0122] 转基因：转基因是外源核酸序列。在一些例子中，转基因可以是编码dsRNA分子的一条或两条链的序列，所述dsRNA分子包含与靶核酸互补的核苷酸序列。在一些例子中，转基因可以是反义核酸序列，其表达抑制靶核酸的表达。仍在其它例子中，转基因可以是基因序列(例如除草剂抗性基因)、编码工业或药学上有用的化合物的基因、或编码期望的农业性状的基因。在这些和其它例子中，转基因可以含有与转基因的编码序列可操作连接的调节序列(例如启动子)。
[0123] 载体：载体指如导入细胞中，例如以产生经转化的细胞的核酸分子。载体可以包含允许它在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体的例子包括但不限于：质粒；粘粒；噬菌体；和携带外源DNA到细胞中的病毒。载体还可以包含一种或多种基因、反义分子、和/或选择标志物基因和本领域中已知的其它遗传元件。载体可以转导、转化、或感染细胞，由此使细胞表达由载体编码的核酸分子和/或蛋白质。任选地，载体包含帮助实现核酸分子进入细胞中的材料(例如脂质体、蛋白质包层材料等)。
[0124] 如本文中使用的，除非明示或暗示，术语“一个/一种”和“所述/该”表示“至少一个/种”。
[0125] 除非另有明确解释，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。分子生物学中的常见术语的定义可以参见例如B.Lewin,Genes V,Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(编),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和R.A.Meyers(编),Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。所有百分比按重量计，并且所有溶剂混合物比例按体积计，除非另有记录。所有温度以摄氏度计。
[0126] IV.核酸和系统
[0127] 植物和动物使用sRNA来指导靶基因的转录后和表观遗传调节。许多miRNA及其相应的靶序列是高度保守的。例如，植物中被不同物种的相关miRNA识别的靶序列经常仅相差几个核苷酸。因此，靶位点的计算机预测是可能的。Jones-Rhoades and Bartel(2004)Mol.Cell 14:787-99。另外，来自一个植物物种的功能性sRNA靶位点在表达靶向sRNA的不同植物物种中可能有功能。例如，来自拟南芥属(Arabidopsis)的miRNA靶基因在烟草属(Nicotiana)中异源表达后，被内源烟草属miRNA切割。Llave等(2002)Science 297:2053-6。
[0128] 本文中的实施方案包括这样的核酸，其包含至少一种sRNA分子的靶位点。例如，sRNA分子的靶位点的长度可以是约20-30个核苷酸。例如，此类靶位点的长度可以是约20-25或20-21个核苷酸。在具体的例子中，靶位点的长度可以是19、约20、约21、约22、约23、约
24、约25、约26、约27、约28、约29、约30或31个核苷酸。可以使用计算机来鉴定或设计构建特定sRNA的靶位点，其使用的程序参数可由本领域技术人员裁量选择。可以鉴定或设计构建以被单一sRNA特异性靶向、或者被一组相关的sRNA靶向的靶位点。
24、约25、约26、约27、约28、约29、约30或31个核苷酸。可以使用计算机来鉴定或设计构建特定sRNA的靶位点，其使用的程序参数可由本领域技术人员裁量选择。可以鉴定或设计构建以被单一sRNA特异性靶向、或者被一组相关的sRNA靶向的靶位点。
[0129] 具体的实施方案包括这样的核酸，其包含，例如，感兴趣的基因或编码区，所述感兴趣的基因或编码区包含sRNA靶位点(例如位于基因或编码区的转录部分内的内部靶位点)，从而基因或编码区与靶向sRNA在细胞中的共表达导致该基因或编码区的表达降低或基本上消除。此类核酸可以是，例如但不限于，细胞(例如植物细胞)基因组中的异源或外源核酸，或载体。
[0130] 在一些实施方案中，包含具有sRNA靶位点的感兴趣的基因或编码区的核酸进一步包含与感兴趣的基因或编码区可操作连接的一种或多种调节序列，从而实现感兴趣的基因或编码区在细胞中的转录；即表达构建体。举例而言，细胞是植物细胞。在具体的实施方案中，感兴趣的基因或编码区与表达构建体中的组成性植物启动子可操作连接。通过例如用此类表达构建体转化植物细胞或组织，并且从植物细胞或组织再生植物，可以生成转基因植物，其中感兴趣的基因或编码区在该植物的每个细胞中，或基本上每个细胞中被转录。
[0131] 在实施方案中，感兴趣的基因或编码区可以是编码感兴趣的多肽的农艺学基因或核苷酸序列，或者/并且可以包含，例如但不限于：赋予对除草剂，诸如抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮或磺酰脲，的抗性的基因(此类别中的示例性的基因编码突变体ALS和AHAS酶，如例如分别由Lee等(1988)EMBO J.7:1241及Miki等(1990)Theor.Appl.Genet.80:449描述)；草甘膦抗性，如由例如突变体5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)基因赋予(藉由导入重组核酸和/或天然EPSP基因的体内诱变的各种形式)；
aroA基因和草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因)；其它膦酰基(phosphono)化合物，诸如来自链霉菌属(Streptomyces)物种，包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和绿色产色链霉菌(Streptomyces viridichromogenes))的草丁磷(glufosinate)膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)基因；和吡啶氧基(pyridinoxy)或苯氧基丙酸和环异己酮(cyclohexones)(ACC酶抑制剂编码基因)。参见例如美国专利4,940,835和6,248,876(可以对植物赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列)。可以在ATCC登录号39256下获得编码突变体aroA基因的DNA分子。
还可参见美国专利No.4,769,061(突变体aroA基因的核苷酸序列)。欧洲专利申请No.0 333
033和美国专利No.4,975,374公开了谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列，其可以赋予对除草剂，诸如L-膦丝菌素的抗性。在欧洲申请No.0 242 246和DeGreef等(1989)Bio/Technology 7:61(表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物的生成)中提供了示例性PAT基因的核苷酸序列。赋予对苯氧基丙酸和环异己酮，诸如稀乐定(sethoxydim)和氟吡甲禾灵(haloxyfop)的抗性的示例性基因包括由Marshall等(1992)Theor.Appl.Genet.83:
435描述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。能够赋予草甘膦抗性的GAT基因记载于例如WO
2005012515。赋予对2,4-D、苯氧基丙酸和吡啶氧基生长素除草剂的抗性的基因记载于例如WO 2005107437。
aroA基因和草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因)；其它膦酰基(phosphono)化合物，诸如来自链霉菌属(Streptomyces)物种，包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和绿色产色链霉菌(Streptomyces viridichromogenes))的草丁磷(glufosinate)膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)基因；和吡啶氧基(pyridinoxy)或苯氧基丙酸和环异己酮(cyclohexones)(ACC酶抑制剂编码基因)。参见例如美国专利4,940,835和6,248,876(可以对植物赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列)。可以在ATCC登录号39256下获得编码突变体aroA基因的DNA分子。
还可参见美国专利No.4,769,061(突变体aroA基因的核苷酸序列)。欧洲专利申请No.0 333
033和美国专利No.4,975,374公开了谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列，其可以赋予对除草剂，诸如L-膦丝菌素的抗性。在欧洲申请No.0 242 246和DeGreef等(1989)Bio/Technology 7:61(表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物的生成)中提供了示例性PAT基因的核苷酸序列。赋予对苯氧基丙酸和环异己酮，诸如稀乐定(sethoxydim)和氟吡甲禾灵(haloxyfop)的抗性的示例性基因包括由Marshall等(1992)Theor.Appl.Genet.83:
435描述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。能够赋予草甘膦抗性的GAT基因记载于例如WO
2005012515。赋予对2,4-D、苯氧基丙酸和吡啶氧基生长素除草剂的抗性的基因记载于例如WO 2005107437。
[0132] 包含编码感兴趣的多肽的农艺学基因或核苷酸序列的核酸还可以包括，例如但不限于：赋予对抑制光合作用的除草剂的抗性的基因，诸如三嗪(psbA和gs+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。参见例如Przibila等(1991)Plant Cell 3:169(用编码突变体psbA基因的质粒转化衣藻属(Chlamydomonas))。美国专利4,810,648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，含有这些基因的DNA分子可在ATCC登录号53435；67441；和67442下获得。还可参见Hayes等(1992)Biochem.J.285:173(编码谷胱甘肽-S-转移酶的DNA的克隆和表达)。
[0133] 并且/或者，本文中的实施方案包括核酸组，其中该组包括至少一种这样的核酸：该核酸包含至少一种sRNA分子的靶位点。在一些实施方案中，核酸组进一步包含至少一种编码至少一种sRNA分子的核酸，所述sRNA分子靶向包含其靶位点的核酸。在具体的实施方案中，可以用所述组的核酸转化植物细胞(在一步中或在多步中)。举例而言，当从经转化的植物细胞再生出转基因植物组织或植物时，除了那些表达sRNA分子的细胞外的基本上所有细胞中均表达包含至少一种sRNA分子的靶位点的核酸。因此，当核酸组包含在组织特异性启动子控制下编码sRNA分子的核酸时，在除了启动子指导sRNA分子表达的组织细胞外的基本上所有的细胞中均表达包含至少一种sRNA分子的靶位点的核酸。
[0134] V.方法
[0135] 在本文中的一些实施方案中，可以通过本领域中已知的导入异源分子的几种方法之任一种遗传修饰植物细胞、植物部分、和/或植物，使之包含至少一种这样的核酸，所述核酸包含至少一种sRNA分子的靶位点，从而生成非天然的转基因植物细胞、植物部分或植物。在本文中的具体实施方案中，将异源分子导入植物细胞、植物部分、和/或植物中所使用的方法选自，例如但不限于：转化和选择性育种(例如回交育种)。
[0136] 在一些实施方案中，如此选择所述的核酸，使得靶位点是异源核酸导入植物的内源sRNA的靶标。在具体的实施方案中，靶位点是这样的植物内源sRNA的靶位点：所述内源sRNA在植物中以组织优选性或组织特异性方式内源表达。
[0137] 根据具体的靶基因和sRNA的生成水平，本文中的实施方案可以提供靶基因的表达或功能的部分或完全丧失。不同实施方案中的对靶基因表达的抑制是对靶基因表达的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％抑制。可以遗传修饰任何植物物种或植物细胞以包含本文中的异源核酸。在一些实施方案中，如此遗传修饰的植物细胞能够再生以产生植物。在一些实施方案中，遗传修饰的植物细胞(例如宿主植物细胞)包含来自例如但不限于高等植物、双子叶植物、单子叶植物、可消费植物、作物植物、和在其油类方面利用的植物(例如种子油植物)的细胞。此类植物包括例如但不限于：苜蓿；大豆；棉；油菜(芥花)；亚麻籽；玉米；稻；臂形草属(brachiaria)；小麦；红花；高粱；甜菜；向日葵；烟草；和草(例如，草地草)。在具体的例子中，本文中的经遗传修饰的植物细胞或植物包括例如但不限于：欧洲油菜；印度芥(芥菜(Brassica juncea))；埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)；芜菁(Brassica rapa)；卷心菜(甘蓝(Brassica oleracea))；大豆(Glycine max)；亚麻(Linum usitatissimum)；玉米(Zea mays)；红花(Carthamus tinctorius)；向日葵(Helianthus annuus)；烟草(Nicotiana tabacum)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)，巴西坚果(Betholettia excelsa)；蓖麻(Ricinus communis)；椰子(Cocus nucifera)；芫荽子(Coriandrum sativum)；棉属(Gossypium spp.)；落花生(Arachis hypogaea)；希蒙得木(Simmondsia chinensis)；油棕(Elaeis guineeis)；橄榄(Olea eurpaea)；稻(Oryza sativa)；南瓜(Cucurbita maxima)；大麦(Hordeum vulgare)；甘蔗(Saccharum officinarum)；小麦物种(Triticum spp.)(包括硬粒小麦(Triticum durum)和普通小麦(Triticum aestivum))；和浮萍(浮萍科(Lemnaceae sp.))。在一些实施方案中，植物可以具有特定的遗传背景，如对于良种栽培种、野生型栽培种、和商业上可区分的品种而言的。
[0138] 根据本领域中已知的方法，可以将核酸导入基本上任何植物中。本文中的实施方案可以采用本领域中已知的许多用于转化植物(和生成经遗传修饰的植物)的方法之任一种。此类方法包括例如但不限于用于双子叶植物及单子叶植物的生物学和物理转化方案。参见例如Goto-Fumiyuki等(1999)Nat.Biotechnol.17:282-6；Miki等(1993)Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology(B.R.Glick and J.E.Thompson,Eds.),CRC Press,Inc.,Boca Raton,FL,pp.67-88。另外，用于植物细胞和组织转化和植物再生的载体和体外培养方法记载于例如Gruberand Crosby(1993)Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,见上文,在89-119页。
[0139] 可用于将核酸导入植物宿主细胞中的植物转化技术包括例如但不限于：使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)作为转化剂用解除的T-DNA转化；磷酸钙转染；聚凝胺(polybrene)转化；原生质体融合；电穿孔(D’Halluin等(1992)Plant Cell 4:1495-505)；超声方法(例如声孔处理)；脂质体转化；显微注射；与裸DNA接触；与质粒载体接触；与病毒载体接触；生物射弹学(例如DNA颗粒轰击(参见例如Klein等(1987)Nature 327:70-3)和微粒轰击(Sanford等(1987)Part.Sci.Technol.5:27；Sanford(1988)Trends Biotech.6:299,Sanford(1990)Physiol.Plant 79:206；及Klein等(1992)Biotechnology 10:268)；基于碳化硅WHISKERS的转化(Kaeppler等(1990)Plant Cell Rep.9:415-8)；纳米颗粒转化(参见例如美国专利公开文本No.US2009/0104700A1)；
气溶胶射束(beaming)；和聚乙二醇(PEG)介导的摄取。在具体的例子中，可以将异源核酸直接导入植物细胞的基因组DNA中。
气溶胶射束(beaming)；和聚乙二醇(PEG)介导的摄取。在具体的例子中，可以将异源核酸直接导入植物细胞的基因组DNA中。
[0140] 一种广泛利用的将表达载体导入植物中的方法基于土壤杆菌的天然转化系统。Horsch等(1985)Science 227:1229。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是已知可用于遗传转化植物细胞的植物病原性土壤细菌。根癌土壤杆菌的Ti质粒和发根土壤杆菌的Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。Kado(1991)Crit.Rev.Plant.Sci.10:1。关于土壤杆菌载体系统和用于土壤杆菌介导的基因转移的方法的详情在例如,Gruber等,见上文,Miki等,见上文,Moloney等(1989)Plant Cell Reports 8:238和美国专利No.4,940,838和5,464,763中也可获得。
[0141] 若使用土壤杆菌进行转化，通常将要插入的DNA克隆到特殊的质粒中；克隆到中间载体或二元载体中。中间载体在土壤杆菌中不能复制自身。可以依靠辅助质粒(接合)将中间载体转移到根癌土壤杆菌中。日本烟草超二元(Japan Tobacco Superbinary)系统是此类系统的一个例子(由Komari等(2006)Methods in Molecular Biology(K.Wang,ed.)ndNo.343；AgrobacteriumProtocols,2 Edition,Vol.1,Humana Press Inc.,Totowa,NJ,pp.15-41；及Komori等(2007)Plant Physiol.145:1155-60综述)。二元载体可以在大肠杆菌和土壤杆菌两者中复制自身。二元载体包含选择标志物基因和接头或多接头，它们以右和左T-DNA边界区为框架。可以将它们直接转化到土壤杆菌中(Holsters,1978)。土壤杆菌包含携带vir区的质粒。Ti或Ri质粒也包含对于T-DNA的转移必需的vir区。Vir区对于将T-DNA转移到植物细胞中是必需的。可以含有另外的T-DNA。
[0142] 当使用二元T DNA载体(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12:8711-21)或共培养规程(Horsch等(1985)Science 227:1229-31)通过细菌感染细胞时，根癌土壤杆菌宿主的毒力功能会指导含有构建体和邻近标志物的T链插入植物细胞DNA中。一般地，使用土壤杆菌转化系统工程化改造双子叶植物。Bevan等(1982)Ann.Rev.Genet.16:357-84；Rogers等(1986)Methods Enzymol.118:627-41。也可以使用土壤杆菌转化系统转化以及转移核酸到单子叶植物和植物细胞。参见美国专利No.5,591,616；Hernalsteen等(1984)EMBO J.3:3039-41；Hooykass-Van Slogteren等(1984)Nature 311:763-4；Grimsley等(1987)Nature
325:1677-9；Boulton等(1989)Plant Mol.Biol.12:31-40；及Gould等(1991)Plant Physiol.95:426-34。
325:1677-9；Boulton等(1989)Plant Mol.Biol.12:31-40；及Gould等(1991)Plant Physiol.95:426-34。
[0143] 可以使用标准遗传技术和筛选实施本文中的重组宿主的遗传操作，并且可以在适合于遗传操作的任何宿主细胞中实施。在一些实施方案中，重组宿主细胞可以是适合于遗传修饰和/或重组基因表达的任何生物体或微生物宿主。在一些实施方案中，重组宿主可以是植物。本文使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域中公知的，并且记载于例如但不限于：Sambrook等(1989),见上文；Silhavy等(1984)Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；及Ausubel等(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience,New York,NY。
[0144] 在将核酸导入植物细胞中后，可以培养植物细胞，并且在出现分化的组织，诸如芽和根时，可以产生成熟的植物。在一些实施方案中，可以产生多个植物。用于再生植物的方法是本领域普通技术人员已知的，并且可以参见例如：Plant Cell and Tissue Culture(Vasil and Thorpe,Eds.),Kluwer Academic Publishers,1994。可以在发酵培养基中培养或者在合适的介质，诸如土壤中种植本文中描述的经遗传修饰的植物。在一些实施方案中，适合于高等植物的生长培养基可以是用于植物的任何生长介质，包括例如但不限于；土壤、沙、支持根生长的任何其它颗粒介质(例如蛭石。珍珠岩等)或水培培养，以及合适的光、水和促进高等植物生长的营养补充物。
[0145] 可以培养通过任何上述转化技术生成的经转化的植物细胞以再生拥有经转化的基因型，且因此具备期望的表型的完整植物。此类再生技术依赖于组织培养生长培养基中的某些植物激素的操作，通常依赖于已经与期望的核苷酸序列一起导入的杀生物剂和/或除草剂标志物。从培养的原生质体的植物再生记载于Evans等(1983)“Protoplasts Isolation and Culture,”于Handbook of Plant Cell Culture,Macmillian Publishing Company,New York,pp.124-176；及Binding(1985)Regeneration of Plants,Plant Protoplasts,CRC Press,Boca Raton,pp.21-73。也可以从植物愈伤组织、外植体、器官、花粉、胚或其部分实施载体。此类再生技术一般记载于Klee等(1987)Ann.Rev.Plant Phys.38:467-86。
[0146] 在其它实施方案中，被转化的植物细胞不能够再生而生成植物。此类细胞可以用于，例如，开发具有相关表型，例如除草剂抗性和/或雄性不育的植物细胞系。
[0147] 可以通过对工程化的植物材料选择或筛选由存在于转化的DNA上的标志物基因编码的性状，来鉴定并分离经转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过在培养基上培养工程化的植物材料实施选择，所述培养基含有抑制量的抗生素或除草剂，转化基因构建体赋予对所述抗生素或除草剂的抗性。此外，也可以通过筛选可存在于重组核酸构建体上的任何可见标志物基因(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶或gfp基因)的活性鉴定经转化的植物和植物细胞。此类选择和筛选方法是本领域技术人员公知的。
[0148] 可以藉由选择育种，例如通过使包含分子的第一亲本植物和第二亲本植物有性杂交从而产生多个第一后代植物，来生成包含本文中的异源分子的转基因植物。然后，可以选择对选择标志物(例如草甘膦，对草甘膦的抗性可以通过本文中的异源分子赋予后代植物)有抗性的第一后代植物。然后，可以自交第一后代植物，从而产生多个第二后代植物。然后，可以选择对选择标志物有抗性的第二后代植物。这些步骤可以进一步包括将第一后代植物或第二后代植物与第二亲本植物或第三亲本植物回交。
[0149] 还应当理解，也可以将两种不同的转基因植物交配以生成含有两个独立分离的、加合的、外源的基因的后代。合适的后代的自交可以产生对这两种加合的外源基因而言均为纯合的植物。还想到了与亲本植物的回交和与非转基因植物的异交，以及营养繁殖。其它通常用于不同性状和作物的育种方法是本领域中已知的。回交育种向来用于将简单遗传、高度可遗传的性状的基因转移到作为轮回亲本的期望的纯合栽培种或近交系中。所得的植物预期具有轮回亲本(例如栽培种)的属性以及从供体亲本转移而来的期望性状。在初始杂交后，选择拥有供体亲本的表型的个体，并且与轮回亲本重复杂交(回交)。预期所得的亲本具有轮回亲本(例如栽培种)的属性和从供体亲本转移的期望的性状。
[0150] 也可以藉由同源重组将核酸导入植物基因组的预先确定的区域中。本领域内已经描述了藉由同源重组在植物细胞的特定染色体位点内稳定整合多核苷酸序列的方法。例如，如美国专利申请公开文本2009/0111188 A1中描述的位点特异性整合涉及使用重组酶或整合酶以介导供体多核苷酸序列导入染色体靶标。另外，PCT国际专利公开文本WO 2008/021207描述了锌指介导的同源重组以在基因组的特定位置内稳定整合一种或多种供体多核苷酸序列。可以利用重组酶，诸如美国专利6,720,475中描述的FLP/FRT，或美国专利5,
658,772中描述的CRE/LOX，将多核苷酸序列稳定整合到特定的染色体位点中。最后，Puchta等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5055-60记载了大范围核酸酶用于将供体多核苷酸靶向到特定染色体位置中的用途。
658,772中描述的CRE/LOX，将多核苷酸序列稳定整合到特定的染色体位点中。最后，Puchta等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5055-60记载了大范围核酸酶用于将供体多核苷酸靶向到特定染色体位置中的用途。
[0151] 其它各种用于植物细胞内的位点特异性整合的方法一般是已知并且可适用的。Kumar等(2001)Trends Plant Sci.6(4):155-9。此外，已在几种原核和低等真核生物体中鉴定的位点特异性重组系统可以在植物中应用。此类系统的例子包括但不限于：来自酵母鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的pSR1质粒的R/RS重组酶系统(Araki等(1985)J.Mol.Biol.182:191-203)，和噬菌体Mu的Gin/gix系统(Maeser and Kahlmann(1991)Mol.Gen.Genet.230:170-6)。
[0152] 各种测定法可以结合本文中的某些实施方案的核酸分子使用。除了表型观察外，以下技术也可用于检测植物细胞中的核酸分子的存在。例如，可以通过使用序列的引物或探针、检测编码蛋白质的ELISA测定法、检测蛋白质的Western印迹、或检测RNA或DNA的Northern或Southern印迹测定分子的存在。也可以使用别的技术，诸如原位杂交、酶染色和免疫染色检测特定植物器官和组织中的重组构建体的存在或表达。
[0153] Southern分析是一种常用的检测方法，其中用限制性内切核酸酶切割DNA，并且在琼脂糖凝胶上分级以通过分子量分开DNA，然后转移到尼龙膜。然后，将它与用32P(或其它探针标记物)放射性标记的探针片段杂交，并且在SDS溶液中清洗。
[0154] 同样地，Northern分析部署一种类似的方案，其中用限制性内切核酸酶切割RNA，并且在琼脂糖凝胶上分级以通过分子量分开RNA，然后转移到尼龙膜。然后，将它与用32P(或其它探针标记物)放射性标记的探针片段杂交，并且在SDS溶液中清洗。对从感兴趣的组织分离的RNA(例如mRNA)的分析可以指示相对表达水平。通常，若存在mRNA或mRNA的量已经增加，则可以假设在表达相应的转基因。可以使用Northern分析，或其它mRNA分析方案测定导入的转基因或天然基因的表达水平。
[0155] 可以使用本文中的核酸，或其区段设计用于PCR扩增的引物。在实施PCR扩增中，引物和模板之间可以容忍某种程度的错配。可以通过普通技术人员已知的方法在给定的引物中引入突变、插入和缺失。
[0156] 水解探针测定法，又称为 (Life Technologies,Foster City,Calif.)，是另一种检测和量化DNA序列的存在的方法。简言之，设计FRET寡核苷酸探针，一个寡聚物在转基因内并且一个在侧翼基因组序列中，用于事件特异性检测。在存在热稳定性聚合酶和dNTP的情况下循环FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列中并且一个在侧翼基因组序列中)。FRET探针的杂交导致荧光模块的切割和释放，远离FRET探针上的淬灭模块。荧光信号指示由于成功的扩增和杂交所致的侧翼/转基因插入序列的存在。
[0157] VI.植物
[0158] 本文中的一些实施方案提供了包含至少一种核酸的转基因植物，所述核酸包含至少一种sRNA分子的靶位点，这样的植物例如可以从稳定转化的植物细胞或组织再生，或者可以通过此类核酸自供体系渐渗而生成。此类植物可以以任何方式使用或栽培，其中感兴趣的转化多核苷酸的存在是期望的。因而，可以通过转化工程化改造转基因植物以特别具有一种或多种期望的性状(例如雄性不育)，然后可以通过本领域技术人员已知的任何方法播种并栽培。本文中的具体实施方案提供此类转基因植物的部分、细胞、和/或组织。植物部分包括但不限于种子、胚乳、胚珠和花粉。在一些实施方案中，植物部分是种子。
[0159] 代表性的非限定性的示例植物包括拟南芥；大田作物(例如、苜蓿、大麦、豆、三叶草、玉米、棉、亚麻、小扁豆、玉蜀黍、豌豆、油菜/芥花、稻、黑麦、红花、高粱、大豆、向日葵、烟草、小麦)；蔬菜作物(如芦笋、甜菜、芸苔属(Brassica)、椰菜、芽甘蓝(Brussels sprouts)、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、黄瓜(葫芦)、茄子、生菜、芥菜、洋葱、辣椒、马铃薯、南瓜、萝卜、菠菜、倭瓜(squash)、芋头、番茄、和西葫芦(zucchini))；水果和坚果作物(如、杏仁、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可、木薯、樱桃、柑桔、椰子、酸果蔓、海枣、榛、葡萄、葡萄柚、番石榴、猕猴桃、柠檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、橙、木瓜、西番莲果(passion fruit)、桃、花生、梨、菠萝、阿月浑子(pistachio)、李树(plum)、悬钩子、草莓、橘子、胡桃、西瓜)；树林和观赏植物(如、桤木、岑树、白杨、杜鹃花、桦树、黄杨、山茶、康乃馨、菊花、榆树、冷杉、常春藤、茉莉、杜松、橡树、棕榈、白杨、松树、红杉、杜鹃花属(rhododendron)、玫瑰、和橡胶)。
[0160] 为了确认感兴趣的转化多核苷酸在再生植物中的存在，可以实施多种测定法。此类测定法包括例如但不限于：生物化学测定法，诸如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫学手段(ELISA和/或Western印迹)或者通过酶促功能；植物部分测定法(例如叶或根测定法)；和对植物的表型分析。
[0161] 任何新的、期望的植物种质的开发中有许多步骤，可以以产生转基因作物植物作为开端。在一些实施方案中，可以在植物育种和/或种质形成程序中使用包含至少一种核酸的转基因植物，所述核酸包含至少一种sRNA分子的靶位点(例如雄性不育植物)。
[0162] 植物育种首先要分析和明确目前种质的问题和弱点，建立程序目标，并和定义特定育种目的。下一步是选择拥有满足程序目标的性状的种质。程序目标是将来自亲本种质的期望性状组合在单一品种中。这些重要的性状可包括较高的种子产率、对疾病和昆虫的抗性、较好的茎和根、对干燥和热的耐受性、和较好的农艺学质量。
[0163] 育种或选择方法的选择取决于植物繁殖的模式、要改善的性状的遗传力、和商业使用的栽培种的类型(例如F1杂种栽培种、纯系栽培种，等等)。对于高遗传力的性状，选择在单独一个地方评估的优秀植物个体可能是有效的，而对于低遗传力的性状，应当基于从相关植物的家族的重复评估获得的平均值进行选择。普通的选择方法包括谱系选择、改良的谱系选择、混合选择和轮回选择。
[0164] 遗传的复杂性影响育种方法的选择。使用回交育种将高遗传力性状的一种或几种有利的基因转移到期望的栽培种。已经广泛使用此方法来育种疾病抗性栽培种。使用各种轮回选择技术改善由多种基因控制的数量遗传性状。在自花授粉作物中使用轮回选择依赖于易于授粉、来自每次授粉的成功杂种的频率、和来自每次成功杂交的杂种后代的数目。
[0165] 每种育种程序应当包括对种规程效率的定期客观评估。评估标准随目的和目标而变化，但是应当包括：每年从选择的获益(基于与合适的标准的比较)、高代育种系的总体价值、和每单位输入(例如，每年、花费的每一美元，等等)产生的成功栽培种的数目。
[0166] 彻底测试有希望的高代育种系，并且在代表商业靶标区域的环境中与合适的标准比较3年以上。最佳的品系是新商业栽培种的候选物；那些在几种性状方面仍有缺陷的品系可以用作亲本以产生新群体用于进一步选择。
[0167] 这些过程，最后通向销售和流通步骤，从第一次杂交的时间起通常花费8至12年。因此，新栽培种的开发是一个费时的过程，其需要精确的向前计划、高效的资源利用、和最小的方向变化。
[0168] 使用谱系育种和轮回选择育种方法从育种群体开发栽培种。育种程序将来自两种或更多种栽培种、或来自各种广泛基础的资源的期望性状组合成育种池，可以从所述育种池中通过自交和选择期望的表型开发栽培种。评估新的栽培种以测定哪些具有商业潜力。
[0169] 谱系育种通常用于改善自花授粉作物。将两个拥有有利的互补性状的亲本杂交，以产生F1。通过杂交一个或几个F1产生F2群体。最佳个体的选择可以在F2群体中开始；然后，从F3起，选择最佳家族中的最佳个体。可以在F4世代中开始对家族的重复测试，以改善遗传力低的性状的选择效率。在育种的高代阶段(即，F6和F7)，对最佳品系或表型相似品系的混合物测试作为新栽培种推出的潜力。
[0170] 可以使用混合选择和轮回选择改善自花授粉或异花授粉作物的群体。通过杂交几种不同亲本鉴定或创建杂合个体的遗传可变群体。基于个体优越性、突出的后代、或卓越的组合能力来选择最佳植物。使选定的植物互交以产生新群体，其中继续进行进一步的选择循环。
[0171] 回交育种向来用于将简单遗传的高度可遗传的性状的基因转移到作为轮回亲本的期望的纯合栽培种或近交系中。要转移的性状的来源称作供体亲本。预期所得的植物具有轮回亲本(例如栽培种)的属性和从供体亲本转移的期望的性状。在初始杂交后，选择拥有供体亲本的表型的个体，并且与轮回亲本重复杂交(回交)。预期所得的植物具有轮回亲本(例如栽培种)的属性和从供体亲本转移的期望的性状。
[0172] 单颗种子后代(single-seed descent)程序，在严格意义上，指种植分离的群体，每个植物收获一个种子的样品，并且使用一颗种子样品来种植下一代。当群体从F2推进到期望的近交水平后，每个用于衍生品系的植物可以分别追溯到不同的F2个体。由于一些种子无法萌发或者一些植物无法产生至少一颗种子，群体中的植物数目逐代下降。因此，当完成世代推进时，并非所有最初在群体中取样的F2植物都会某一后代所代表。
[0173] 在本文中的实施方案中，可以将包含至少一种sRNA分子的靶位点的转基因导入植物种质中，以便，例如，开发以在sRNA分子控制下的转基因的组织特异性表达为特征的新近交系。此类开发程序可能有这样一个优势，即由于RNAi途径的普遍性，转基因表型外显率比通过其他方式(例如通过其它控制机制)可达到的转基因表型外显率更高。在某些实施方案中，将包含sRNA分子的靶位点的除草剂耐受性基因导入植物种质中，使得雄性不育的性状得到稳定遗传，并且在实现杂种生产的同时花费最少的有价值的资源。
[0174] 提供了以下实施例以例示某些具体的特征和/或实施方案。实施例不应解释为将公开内容限于例示的具体特征或实施方案。实施例
[0175] 实施例1：组织特异性miRNA
[0176] 许多植物miRNA具有独特的发育和组织特异性表达样式。例如，拟南芥miR171(先前称为miR39)主要在花序组织中积累。miR171自染色体III中的基因间区域生成，并且与编码推定的转录因子的Scarecrow样(SCL)家族的几个成员的mRNA靶标功能互作。Llave等(2002)Science 297:2053-6。该互作导致靶标mRNA的组织特异性切割，切割发生在miR171和天然基因mRNA之间的互补性区域内。携带靶位点序列的转基因mRNA也被识别和切割。
[0177] 类似地，玉蜀黍(玉米)miR156(SEQ ID NO:1)和miR529(SEQ ID NO:2)以发育及组织特异性方式表达。Chuck等(2010)Development 137:1243-50；Zhang等(2009)PloS Genetics Nov.5。miR156受时序调节，主要在早期营养阶段期间表达，但是在繁殖阶段期间几乎检测不到。与之相反，miR529在营养阶段期间不被检出，但是可以在根中并且在生殖组织中在繁殖阶段期间被检出。Zhang等(2009),见上文。miR156和miR529共享14至16个核苷酸的同源性，并且两者都靶向tasselsheath4(在本文中称为tsh4)mRNA。tsh4调节玉米中的苞片发育和分生组织边界的建立。Chuck等(2010),见上文。
[0178] 各种玉米组织中的miRNA微阵列：使用来自玉米近交系B104的组织进行miRNA概貌分析。收集叶组织(在V2、V8和旗叶期(flag leaf stages))；未成熟的雄穗组织(0.5至2.5cm长度)；成熟的雄穗组织(轮生体中可见的雄穗)；未成熟的雌穗组织(0.5至2cm长度)；
和成熟的雌穗组织(可见的穗芽(ear shoot))，立即在液氮中浸没，并且在-80℃贮存。使用mirVanaTM miRNA分离试剂盒(invitrogen；Carlsbad,CA)遵循制造商的用法说明提取总RNA和低分子量RNA。基于通过NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific；Wilmington,DE)测量光密度和凝胶电泳评估RNA质量和数量。由提供商(LC SCIENCES；Houston,TX)使用微流体寡核苷酸微阵列技术实施miRNA微阵列。Zhou等,(2012)Methods
Mol.Biol.822:153-82。将MiRBaseTM(mirbase.org)中所有可用的独特植物miRNA序列印刷在阵列上，用于miRNA概貌分析。
和成熟的雌穗组织(可见的穗芽(ear shoot))，立即在液氮中浸没，并且在-80℃贮存。使用mirVanaTM miRNA分离试剂盒(invitrogen；Carlsbad,CA)遵循制造商的用法说明提取总RNA和低分子量RNA。基于通过NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific；Wilmington,DE)测量光密度和凝胶电泳评估RNA质量和数量。由提供商(LC SCIENCES；Houston,TX)使用微流体寡核苷酸微阵列技术实施miRNA微阵列。Zhou等,(2012)Methods
Mol.Biol.822:153-82。将MiRBaseTM(mirbase.org)中所有可用的独特植物miRNA序列印刷在阵列上，用于miRNA概貌分析。
[0179] 表1中显示了关于miR156、miR529和miR319(SEQ ID NO:3)的miRNA表达的数据。数据证明了miR529在未成熟的雄穗中以高水平表达，在成熟的雌穗和成熟的雄穗中有中等表达，在叶和未成熟的雄穗中有表达非常低，而miR156在除了未成熟的雌穗和未成熟的雄穗外的所有被检查的组织中以高或中等水平表达。鉴于miR529在雄穗和雌穗组织中的优先表达，选择miR529识别位点以作为组织特异性工程化的示例。
[0180] 表1：玉米植物中的miR529、miR156和miR319的miRNA微阵列表达概貌分析。数字代表相对表达水平。
[0181]组织 miR529 miR156 miR319
叶V2 199 4648 13
叶V8 34 1337 8
旗叶 30 1657 16
未成熟的雌穗 90 112 3905
未成熟的雄穗 3174 78 2078
成熟的雌穗 1405 1595 4616
成熟的雄穗 1512 2810 1566
叶V2 199 4648 13
叶V8 34 1337 8
旗叶 30 1657 16
未成熟的雌穗 90 112 3905
未成熟的雄穗 3174 78 2078
成熟的雌穗 1405 1595 4616
成熟的雄穗 1512 2810 1566
[0182] 实施例2：植物转化载体
[0183] 为了调查内源sRNA分子是否可以用于赋予雄性不育，设计构建并制备了以下核酸构建体。
[0184] 瞬时转化构建体：pDAB112375(ZmUbi1v2/AAD1 v3/天然WT miR529-156位点/ZmPer5 3′UTR)；pDAB112376(ZmUbi1v2/AAD1 v3/WT miR529靶位点及突变的miR156位点/ZmPer5 3′UTR)；pDAB112377(ZmUbi1v2/AAD1 v3/miR529完全靶位点及突变的miR156位点/ZmPer5 3′UTR)；和pDAB113016(ZmUbi1v2/AAD1 v3/ZmPer5 3′UTR)(非miRNA靶标对照)。
[0185] 稳定转化构建体(所有构建体含有T-DNA内的ZmPer5 3′UTR/OsAct1 v2/PATv9/Zm Lip 3′UTR)：pDAB113018(ZmUbi1v2/AAD1 v3/天然WT miR529-156位点/ZmPer5 3′UTR)；pDAB113019(ZmUbi1v2/AAD1 v3/WT miR529靶位点及突变的miR156位点/ZmPer5 3′UTR)；
pDAB113020(ZmUbi1v2/AAD1 v3/miR529完全靶位点及突变的miR156位点/ZmPer5 3′UTR)；
和pDAB113021(ZmUbi1v2/AAD1 v3/ZmPer5 3′UTR)(非miRNA靶标对照)。
pDAB113020(ZmUbi1v2/AAD1 v3/miR529完全靶位点及突变的miR156位点/ZmPer5 3′UTR)；
和pDAB113021(ZmUbi1v2/AAD1 v3/ZmPer5 3′UTR)(非miRNA靶标对照)。
[0186] miRNA靶位点：miR156和miR529的miRNA靶位点序列获自MiRBaseTM。使用玉米tsh4基因内的天然靶位点(Chuck等(2010),见上文)来设计用于本公开的靶位点。设计的tsh4靶位点(SEQ ID NO:4)在编码区的3’端含有重叠的miR156和miR529结合位点。表2A。大部分(68％)的tsh4转录物切割发生在miR529的微小RNA预测结合位点的碱基对10和11之间(表2A、2B和2C中的tsh4序列中的加下划线的CT碱基)，而31％发生在miR156的预测切割位点附近(miR529的碱基对5和7之间)。Chuck等(2010),见上文。设计改造天然的tsh4靶位点序列，在不干扰miR529结合和切割位点的前提下突变tsh4序列内的miR156结合位点。表2A显示了具有对miR156或mR529特异性的结合位点的天然tsh4靶位点，其用于构建pDAB112375。在表
2A、2B和2C中，错配显示为“星”(*)，而点(·)标示“G-U”摆动。表2B和表2C显示了tsh4靶位点中进行的修饰(小写)，分别在pDAB112376和pDAB112377的构建体中使用。
2A、2B和2C中，错配显示为“星”(*)，而点(·)标示“G-U”摆动。表2B和表2C显示了tsh4靶位点中进行的修饰(小写)，分别在pDAB112376和pDAB112377的构建体中使用。
[0187] 表2：玉米转化中使用的天然tsh4结合位点和突变形式的序列；pDAB112375(表2A)、pDAB112376(表2B)和pDAB112377(表2C)。错配显示为“星”(*)，而点(·)标示“G-U”摆动。
[0188] A.
[0189]
[0190] B.
[0191]
[0192] C.
[0193]
[0194] 通过标准分子克隆方法构建 (INVITROGEN)入门载体，并且用作表达载体以在玉米细胞中进行瞬时mRNA表达。起始载体表达盒(pDAB113016)包含序列(SEQ ID NO:5)，其包含AAD1 v3编码区，接着是包含来自玉米过氧化物酶5基因的3’非翻译区(UTR)(ZmPer5 3′UTR v2；美国专利6,699,984)的片段。AAD1是一种除草剂耐受性基因，其编码芳基氧基链烷酸加双氧酶( 美国专利7 ,838 ,733 ；Wright等( 2010 )
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:20240-5)，并且藉此赋予对除草剂化合物，诸如氟吡甲禾灵和喹禾灵(Quizalofop)的耐受性。在用质粒pDAB113016(及下述的衍生质粒)的DNA转化的植物细胞中，此编码区的表达处于下述者的控制之下：1拷贝的玉米泛素1启动子，及关联的内含子1(美国专利5,510,474)和包含来自玉米过氧化物酶5基因的3′UTR(如上文)的片段。
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:20240-5)，并且藉此赋予对除草剂化合物，诸如氟吡甲禾灵和喹禾灵(Quizalofop)的耐受性。在用质粒pDAB113016(及下述的衍生质粒)的DNA转化的植物细胞中，此编码区的表达处于下述者的控制之下：1拷贝的玉米泛素1启动子，及关联的内含子1(美国专利5,510,474)和包含来自玉米过氧化物酶5基因的3′UTR(如上文)的片段。
[0195] 其它入门载体/植物转化载体作为pDAB113016的衍生物来构建。例如，pDAB112375包含序列(SEQ ID NO:6)，其包含pDAB113016的AAD1编码区，接着是天然的tsh4 miR529-156靶位点(SEQ ID NO:4；表3)，其位于所述AAD1编码区的末端与ZmPer5 3′UTR之间。质粒pDAB112376是pDAB113016的进一步的衍生物，包含序列(SEQ ID NO:7)，该序列包含pDAB113016的AAD1编码区，接着是修饰的tsh4靶序列，该修饰的tsh4靶序列包含天然的miR529结合位点及突变miR156结合位点(SEQ ID NO:8；表3)，位于所述AAD1编码区的末端与ZmPer5 3′UTR之间。进一步，质粒pDAB112377是pDAB113016的衍生物，包含序列(SEQ ID NO:9)，其包含pDAB113016的AAD1编码区，接着是修饰的tsh4靶位点，该修饰的tsh4靶位点包含天然的miR529结合位点及第二种形式的突变miR156结合位点(SEQ ID NO:10；表3)，位于所述AAD1编码区的末端和ZmPer5 3′UTR之间。
[0196] 构建另一种植物转化质粒，pDAB112378，来表达包含miR529序列(SEQ ID NO:2)的人工miRNA。将含有miR529序列的DNA片段插入稻miR528前体序列中以建立人工miRNA序列CMSRF9973.1(SEQ ID NO:11)。miRNA CMSRF9973.1转录物在1拷贝的玉米泛素1启动子及内含子1(如上文)和包含来自玉米过氧化物酶5基因的3′UTR(如上文)的片段的控制下生成。
[0197] 阴性对照质粒(pDAB112330)包含Cry34Ab1蛋白编码区(美国专利8,273,535)，处于1拷贝的玉米泛素1启动子、及内含子1(如上文)和包含来自玉米泛素1基因的3′UTR(基本上如在GENBANK登录号S94464.1中)的片段的表达控制之下。
[0198] 另一阴性对照质粒pDAB100286包含黄色荧光蛋白(YFP)标志物基因编码区(Shagin等(2004)Mol.Biol.Evol.21:841-50)，处于1拷贝的玉米泛素1启动子及内含子1(如上文)和包含来自玉米过氧化物酶5基因的3′UTR(如上文)的片段的表达控制之下。
[0199] 表3：示例性的miRNA靶位点。
[0200]SEQ ID NO:4 GACTCCAGCTGTGCTCTCTCTCTTCTGTCAACTCA
SEQ ID NO:7 GACTCAGGCTGTACTCTCTTACTTCACAAAGTACTCA
SEQ ID NO:8 GACTCAGGCTGTACTCTCTCTCTTCACAAAGTACTCA
SEQ ID NO:7 GACTCAGGCTGTACTCTCTTACTTCACAAAGTACTCA
SEQ ID NO:8 GACTCAGGCTGTACTCTCTCTCTTCACAAAGTACTCA
[0201] 采用典型的目的二元载体(pDAB101849)和入门载体，使用标准的克隆方法和重组反应构建转化/表达载体，用于如上文描述的土壤杆菌介导的玉米胚转化。二元目的地载体pDAB101849包含除草剂耐受性基因(膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)；Wehrmann等(1996)Nat.Biotechnol.14:1274-8)，处于稻肌动蛋白启动子及关联的内含子1和5′UTR(基本上如以GenBank登录号EU155408.1的碱基12至1411公开)的表达控制之下。PAT mRNA的转录用包含来自玉米脂肪酶基因的3′UTR(ZmLip 3′UTR,美国专利7,179,902)的片段来终止。使用 重组反应将具有或没有miR529和miR156靶位点的ZmUbi1/AAD-1 v3/
ZmPer5 3′UTR表达盒转移入目的二元载体中T-DNA边界之间，且在PAT表达盒上游。
ZmPer5 3′UTR表达盒转移入目的二元载体中T-DNA边界之间，且在PAT表达盒上游。
[0202] 表4：二元载体的miRNA tsh4靶标内容。
[0203]二元载体 进入/WHISKERS载体 tsh4靶序列
pDAB113018 pDAB112375 SEQ ID NO:4
pDAB113019 pDAB112376 SEQ ID NO:7
pDAB113020 pDAB112377 SEQ ID NO:8
pDAB113021 pDAB113016 无
pDAB113018 pDAB112375 SEQ ID NO:4
pDAB113019 pDAB112376 SEQ ID NO:7
pDAB113020 pDAB112377 SEQ ID NO:8
pDAB113021 pDAB113016 无
[0204] 另外，采用典型的二元目的地载体(pDAB101847)藉由使用标准 重组反应构建了转化载体pDAB109812。二元目的载体pDAB101847包含处于甘蔗杆状病毒(SCBV)启动子(SEQ ID NO:12)的表达控制下的AAD1除草剂耐受性编码区(如上文)；基本上如美国专利6,093,569中描述。SCBV启动子区段的3’端与AAD1编码区的起始密码子之间是一段合成
5′UTR序列(SEQ ID NO:13)，来自玉米线条病毒(MSV)壳体蛋白基因5′UTR和来自玉米醇脱氢酶1(ADH1)基因的内含子6的序列构成。AAD1 mRNA的转录使用一段包含来自玉米脂肪酶基因的3′UTR(如上文)的片段来终止。通过标准的分子克隆和 重组反应，将黄色荧光蛋白标志物基因盒(含有马铃薯内含子ST-LS1的Phi-YFPTM编码区，来自Evrogen,Moscow,Russia)加入pDAB101847，构建了转化载体pDAB109812。载体pDAB109812中Phi-YFPTM的表达处于玉米泛素1启动子及关联的内含子1(如上文)和玉米ZmPer5 3′UTR(如上文)的控制下。
5′UTR序列(SEQ ID NO:13)，来自玉米线条病毒(MSV)壳体蛋白基因5′UTR和来自玉米醇脱氢酶1(ADH1)基因的内含子6的序列构成。AAD1 mRNA的转录使用一段包含来自玉米脂肪酶基因的3′UTR(如上文)的片段来终止。通过标准的分子克隆和 重组反应，将黄色荧光蛋白标志物基因盒(含有马铃薯内含子ST-LS1的Phi-YFPTM编码区，来自Evrogen,Moscow,Russia)加入pDAB101847，构建了转化载体pDAB109812。载体pDAB109812中Phi-YFPTM的表达处于玉米泛素1启动子及关联的内含子1(如上文)和玉米ZmPer5 3′UTR(如上文)的控制下。
[0205] 通过限制酶消化物确认了所有质粒的结构，并且通过标准分子生物学技术验证了相关区域的DNA碱基序列的确定结果。
[0206] 实施例3：AAD1的瞬时表达
[0207] 近交系B104表达含有mRNA内miRNA靶位点的AAD1 mRNA，从这样的近交系B104制备了玉米胚。还制备了在AAD1 mRNA中没有miRNA靶位点，或者没有AAD1基因表达盒的对照组织。还制备了仅具有YFP基因表达盒(并且没有AAD1构建体)的其它对照组织。通过颗粒轰击转化将如实施例2中所述构建的植物转化DNA分子的制备物递送到玉米B104未成熟胚中。
[0208] 通过标准技术从大肠杆菌分离并纯化pDAB112375、pDAB112376、pDAB112377、pDAB113016、pDAB100286、pDAB112378和pDAB112330的质粒DNA，并且在TE缓冲液(10mM Tris HCl加上1mM EDTA,pH 8)中稀释到1.0μg/μL。
[0209] 金颗粒储液制备：金颗粒储液制备如下：称取50mg 1μm金微载体(Bio-Rad Laboratories,Richmond,CA)到无菌2.0mL微离心管中，用100％乙醇清洗3次，并且在微型离心机中以1500x g离心沉淀2分钟，。然后，用无菌水清洗颗粒3次，如上文。最终，向管中的金颗粒加入500μL无菌50％甘油，悬浮液贮存于-20℃。
[0210] 胚分离和培养：(第1天)使用经表面灭菌的B104未成熟雌穗(授粉后10至12天)分离胚。将从3至4个雌穗切下的未成熟胚合并到含有2.0mL液体培养基(LS基础培养基(Linsmaier and Skoog,(1965)Physiologia Plantarum 18:100-27)，其含有CHU N6维生素(Chu等(1975)Scientia Sinica 18:659-68)、700mg/L L-脯氨酸、68.5gm/L蔗糖、36gm/L D(+)葡萄糖、和1.5mg/L 2,4-D)的2mL微量离心管中。在胚分离后，取出并且弃去液体培养基。将胚取出，并且置于含有半固体渗透培养基(MS基础培养基(Murashige and Skoog,(1962)Physiologia Plantarum 15:473-497)、2mg/L甘氨酸、500μg/L硫胺素、500μg/L吡哆醇、50μg/L烟酸、120gm/L蔗糖、100mg/L肌肉肌醇和2.4gm/L Gelrite)的板(每块板40个胚)上。将胚排列在用于颗粒轰击的靶标区域内的6x7栅格中。对于要测试的每种构建体，制备三个重复板。在颗粒轰击前，将所有板于28℃在连续低光(50μEm-2sec-1)下温育24小时。
[0211] 用DNA包被金颗粒：(第2天)在冰上融化冷冻的金颗粒甘油储液的管几分钟，然后以高速旋涡振荡2分钟，直至生成均一的金悬浮液。将金悬浮液移液到无菌微量离心管(各50μL)中，管与管之间对颗粒储液进行中间旋涡振荡以维持悬浮液的均一。包括适当的质粒DNA各2.5μg。添加2.5μL适当的DNA(1μg/μL)、50μL冰冷的无菌2.5M CaCl2、和20μL无菌0.1M亚精胺(以该次序)，与之同时温和涡旋振荡微量离心管以即时混合各实验组分。然后，于4℃以高速涡旋振荡管20分钟。然后，用100％乙醇清洗金/DNA颗粒3次，最终在30μL 100％乙醇中悬浮。将管置于冰上，并且在从制备时间起的2小时内使用。
[0212] 用金/DNA微载体制备大载体(macrocarrier)：在层流通风橱中实施以下操作。将用于生物射弹PDS-1000/He颗粒递送系统(Bio-Rad Laboratories,Inc.)的无菌大载体放置在无菌培养皿中。涡旋振荡金/DNA微载体的管，并且将5μL金/DNA悬浮液快速涂布到合适的大载体上。让载有金/DNA的大载体干燥10分钟，之后用于颗粒轰击。
[0213] 颗粒轰击转化：将1100psi安全膜(rupture disk)快速浸没到70％异丙醇中将它们灭菌，然后将安全膜插入膜保持帽(disc retaining cap)中。将大载体和无菌停止屏(stopping screen)装载到发射装置中，置入小室中。将各块排放有胚的板以6cm距离放置在小室架上。然后，将小室抽到并且保持于28mm Hg真空，并且按住“开火”按钮，直至安全膜爆裂。然后，释放真空，盖住靶标板，并用3MTM MicroporeTM医用胶带密封。然后，将所有板在50μEm-2sec-1连续光照下于28℃温育24小时。
[0214] 在实验的第3天，以40个胚/取样管的批次从板分批取出胚，送至蛋白质和分子分析。
[0215] 实施例4：AAD1的稳定表达
[0216] 使用土壤杆菌介导的转化将嵌合基因稳定整合入植物基因组中，产生了生成AAD1 mRNA的转基因玉米细胞、组织、和植物，所述AAD1 mRNA具有mRNA内的miRNA靶位点。还生成了在AAD1 mRNA中没有miRNA靶位点的对照组织。通过其在含有氟吡甲禾灵或双丙氨磷(Bialaphos)的培养基上生长的能力选择出转化的组织。
[0217] 土壤杆菌培养启动：提供包含项目用载体的根癌土壤杆菌宿主菌株DAt13192(PCT国际专利公开文本No.WO2012/016222A2)的甘油储液。将土壤杆菌培养物从甘油储液划线到含有合适的抗生素的AB基本培养基(Watson,等(1975)J.Bacteriol.123:255-64)上，并且在黑暗中于20℃温育3天。然后，将培养物划线到具有抗生素的YEP培养基(g/L：酵母提取物，10；蛋白胨，10；NaCl，5)的板上，并且在黑暗中于20℃温育1天。
[0218] 在实验当天，根据构建体数目制备合适体积的制备接种培养基与乙酰丁香酮的混合物(Frame等(2011)Methods Mol.Biol.710:327-41)，移液到无菌一次性250mL烧瓶中。接种培养基含有：2.2g/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素(Frame等(2011),见上文)68.4g/L蔗糖；36g/L葡萄糖；115mg/L L-脯氨酸；和100mg/L肌醇；pH 5.4)。添加100％二甲亚砜中的1M乙酰丁香酮储备溶液到含有接种培养基的烧瓶中，至乙酰丁香酮终浓度200μM。
[0219] 对于每种构建体，将1或2个满接种环的来自YEP板的土壤杆菌悬浮在无菌一次性50mL离心管内部的15mL接种培养基/乙酰丁香酮混合物中，并且在分光光度计中测量550nm的溶液的光密度(OD550)。然后，使用额外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬浮液稀释到
0.3至0.4的OD550。然后，在室温下将土壤杆菌悬浮液的管水平放置在设置为约75rpm的平台摇动器上，在使用前振摇1至4小时。
0.3至0.4的OD550。然后，在室温下将土壤杆菌悬浮液的管水平放置在设置为约75rpm的平台摇动器上，在使用前振摇1至4小时。
[0220] 雌穗灭菌和胚分离：在温室中产生玉米栽培种B104的雌穗，并且在授粉后10至12天收获。将收获的穗去壳，并且在商业漂白剂(Ultra Germicidal Bleach,6.15％次氯酸钠；两滴TWEENTM 20)的20％溶液中浸没20分钟，接着在层流通风橱内部的无菌去离子水中漂洗三次，完成表面灭菌。从每个穗中无菌切出未成熟的合子胚(长1.8至2.2mm)，分配到一个或多个装有已经添加2μL 10％ S233表面活性剂(Evonik Industries；Essen,Germany)的2.0mL土壤杆菌悬浮液的微量离心管中。
[0221] 土壤杆菌共培养：在分离后，将胚置于振荡平台上5分钟。然后，将管的内容物倒到共培养培养基(4.33g/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30g/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；3.3mg/L在KOH中的麦草畏(Dicamba)(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；
100mg/L肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/L AgNO3；200μM乙酰丁香酮的DMSO溶液；和
3g/L琼脂(SIGMA-ALDRICH，测试的植物细胞培养物)，在pH 5.8)的板上。用无菌一次性移液器取出液体土壤杆菌悬浮液，并且将含有胚的共培养板在盖子半开的状态下放置于在层流通风橱的后部30分钟，在这段时间后，借助于显微镜使用无菌镊子将胚以盾片面朝上定向。
将板放回到层流通风橱的后方，在盖子半开的状态下再持续15分钟。然后，将板盖上，用3MTM MicroporeTM医用带密封，并且在约60μEm-2sec-1光强度的连续光照下置于25℃培养箱中。
100mg/L肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/L AgNO3；200μM乙酰丁香酮的DMSO溶液；和
3g/L琼脂(SIGMA-ALDRICH，测试的植物细胞培养物)，在pH 5.8)的板上。用无菌一次性移液器取出液体土壤杆菌悬浮液，并且将含有胚的共培养板在盖子半开的状态下放置于在层流通风橱的后部30分钟，在这段时间后，借助于显微镜使用无菌镊子将胚以盾片面朝上定向。
将板放回到层流通风橱的后方，在盖子半开的状态下再持续15分钟。然后，将板盖上，用3MTM MicroporeTM医用带密封，并且在约60μEm-2sec-1光强度的连续光照下置于25℃培养箱中。
[0222] 愈伤组织选择和转基因事件的再生：在共培养期后，将胚转移到静息培养基(4.33g/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；30g/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；3.3mg/L在KOH中的麦草畏；100mg/L肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/L AgNO3；0.5g/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物；PhytoTechnologies Labr.；Lenexa,KS)；250mg/L头孢噻肟(Cefotaxime)；和7.0gm/L琼脂；在pH 5.8)中。每块板中移入不超过36个胚。用MicroporeTM带包裹板，于约50μmol m-2s-1光强度的连续光照下27℃温育7至10天。然后，将形成愈合组织的胚(<18/板)转移到选择培养基I上，所述选择培养基I由静息培养基(上述)构成，但是仅有6.5g/L琼脂，并且视情况适宜含有100nM R-氟吡甲禾灵酸(0.0362mg/L；用于选择含有AAD1基因的转化体)或5.0mg/L双丙氨磷(用于选择含有PAT基因的转化体)。双丙氨磷以(20％ai)的形式提供。用MicroporeTM带包裹板，并且于27℃在约50μmol m-2s-1光强度的连续光照下温育7天。然后，将形成愈伤组织的胚(<12个/板)转移到选择培养基II上，所述选择培养基II由静息培养基(上述)构成，但是仅有6.5g/L琼脂，并且在视情况适宜含有50nM R-氟吡甲禾灵酸(0.0181mg/L)或5.0mg/L双丙氨磷。将板包裹，在约50μmol m-2s-1光强度的连续光照下27℃温育14天。
[0223] 在此阶段时，将抗性愈伤组织(<9个/板)移到再生前培养基(4.33g/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；45g/L蔗糖；350mg/L L-脯氨酸；100mg/L肌肉肌醇；50mg/L酪蛋白酶水解物；1.0mg/L AgNO3；0.5g/L MES；0.5mg/L萘乙酸的NaOH溶液；2.5mg/L的脱落酸乙醇溶液；1mg/L 6-苄基氨基嘌呤；250mg/L头孢噻肟；5.5g/L琼脂；和50nM R-氟吡甲禾灵酸或3.0mg/L双丙氨磷，视情况适宜；pH 5.8)。将板包裹，在约50μmol m-2s-1光强度的连续光照下27℃温育7天。然后，将再生的愈伤组织(<6个/板)转移到PhytatraysTM(sigma-aldrich)中的再生培养基上，以每天16小时光照/8小时黑暗、约150μmol m-2s-1光强度下28℃温育14天或者到形成芽为止。再生培养基含有4.33g/L MS盐；1X ISU改良的MS维生素；60g/L蔗糖；
0.50g/L MES；125mg/L头孢噻肟；5.5g/L琼脂；和50nM R-氟吡甲禾灵酸或3.0mg/L双丙氨磷，在视情况适宜；pH 5.8。然后，分离具有初生根的小芽，转移到没有选择的伸长培养基(即没有R-氟吡甲禾灵酸或双丙氨磷的再生培养基)中进一步生长。将约6cm或更高的生根小植物移植到土壤中，并且移到生长室以长壮(harden off)。
0.50g/L MES；125mg/L头孢噻肟；5.5g/L琼脂；和50nM R-氟吡甲禾灵酸或3.0mg/L双丙氨磷，在视情况适宜；pH 5.8。然后，分离具有初生根的小芽，转移到没有选择的伸长培养基(即没有R-氟吡甲禾灵酸或双丙氨磷的再生培养基)中进一步生长。将约6cm或更高的生根小植物移植到土壤中，并且移到生长室以长壮(harden off)。
[0224] 转移和温室中定植T0植物以进行测定和种子生成：对于通过其在含有氟吡甲禾灵或双丙氨磷(在适当时)的培养基上生长的能力而选择出的转化植物组织，将其从PhytatraysTM移植到填充有生长培养基(ProMix BX；Premier Tech Horticulture)，且用HumidomesTM(Arco Plastics Ltd.)覆盖的小盆，然后在生长室(28℃白天/24℃黑夜，16小时光周期，50-70％RH，200μEm-2sec-1光强度)中长壮。当植物达到V3-V4阶段时，将它们移植到Sunshine Custom Blend 160土壤混合物中，并且在温室(光暴露类型：光或同化；高光限制：1200PAR；16小时昼长；27℃昼/24℃夜)中培植到开花。使用设计用于检测转基因的相对基因拷贝数的引物，通过定量实时PCR测定法对推定的转基因小植物分析转基因拷贝数，并且将选择推进的事件移植到5加仑盆中。定期采取观察以追踪任何异常表型。
[0225] 通过用从非转基因良种近交系B104的植物收集的花粉对T0转基因植物的须授粉获得T1世代的植物，并且种植所得的种子。在可能时实施互交。
[0226] 实施例5：转基因玉米组织的生物化学和分子分析
[0227] AAD1和PAT蛋白的ELISA定量：使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量玉米细胞和稳定转化的组织中的AAD1和PAT蛋白的生成。分别使用来自Acadia BioSciences(Portland,ME)和Envirologix(Portland,ME)的试剂盒量化AAD1和PAT蛋白。ELISA使用植物提取物的多个稀释物，基本上如供应商提供的试剂和用法说明来进行。
[0228] 植物蛋白提取：在0.6mL含有0.5％BSA(用于AAD1提取)或1％PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮；用于PAT)的PBST(含有0.05％ 20的PBS缓冲液)中从4个叶盘(总共1.3cm2)或40个未成熟的胚(用于瞬时表达研究)提取蛋白质。加入一个2mm钢珠，盖上管帽，在Geno/Grinder(CERTIPREP；Metuchen,NJ)中固定，以1500rpm摇动5分钟。4℃以4000rpm将管离心7分钟，含有可溶性蛋白质的上清液贮存于-80℃直至使用。
[0229] 使用石榴石粉末、1个陶瓷球(0.25英寸直径；MP Biochemicals,Santa Anna,CA)、以及1mL含有5mM EDTA、5mM DTT、10μL用于植物细胞研究的蛋白酶抑制剂混合物VI(Research Products International Corp.,Mt.Prospect,IL)和0.4％ 20的PBS，在Geno/Grinder中以1500rpm研磨0.5mL雄穗组织2分钟，从雄穗提取蛋白质。
[0230] 使用PIERCE 660nm蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific；Rockford,IL)遵循供应商的用法说明测定总蛋白质浓度。
[0231] 用于拷贝数目分析的水解探针qPCR：采用各种类型的分子分析筛选低拷贝简单事件。在转移到土壤前，从生根的推定转基因植物收集叶组织。使用THERMO FISHER KingFisherTM磁性颗粒处理器和供应商推荐的方案用QIAGEN MagAttractTM试剂盒提取DNA。使用针对AAD1和PAT基因的特异性水解探针测定法分析整合的转基因的拷贝数。另外，通过对二元载体主链上携带的壮观霉素抗性基因(Spec)特异性的水解探针测定法检测通过二元载体质粒主链的意外整合的污染。建立了针对内源玉米基因转化酶(GenBankTM登录号U16123；SEQ ID NO:14)和延伸因子1α(EF1α)(GENBANK登录号AF136823.1；SEQ ID NO:15)的水解探针测定法，作为内部参照标准。表5列出了作为水解探针测定组成部分的寡核苷酸序列(由INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES,Coralville,IA合成)。用约10ng DNA依照表6设立双重(Biplex)水解探针PCR反应，测定条件在表7中呈现。
[0232] 表5：用于转基因拷贝数和相对表达检测的正向和反向核苷酸引物和荧光探针的列表。
[0233]
[0234]
[0235] *FAM＝6-羧基荧光素亚磷酰胺；HEX＝六氯荧光素
[0236] 表6：用于转基因DNA拷贝数分析的水解探针PCR混合物。
[0237]
[0238]
[0239] 表7：用于水解探针PCR扩增的热循环仪条件。
[0240]
[0241] 为了扩增，以1X终浓度制备 480探针主预混物(ROCHE APPLIED SCIENCE,Indianapolis,IN)，多重反应体积为10μL，其中含有0.1％PVP、0.4μM每种引物、和
0.2μM每种探针。在465nm激发FAM(6-羧基荧光素亚磷酰胺)荧光模块，并且在510nm测量荧光。HEX(六氯荧光素)荧光模块的相应数值是533nm和580nm，对于 数值是538nm和
554nm。使用ROCHE 480实时PCR系统，根据制造商的推荐，对每个反应分
析产生的荧光水平。通过将未知样品的 480输出的靶标/参照基因数值
与已知拷贝数的标准品(1个拷贝的代表半合子植物，2个拷贝的代表纯合植物)的靶标/参照基因数值比较，确定转基因拷贝数。
0.2μM每种探针。在465nm激发FAM(6-羧基荧光素亚磷酰胺)荧光模块，并且在510nm测量荧光。HEX(六氯荧光素)荧光模块的相应数值是533nm和580nm，对于 数值是538nm和
554nm。使用ROCHE 480实时PCR系统，根据制造商的推荐，对每个反应分
析产生的荧光水平。通过将未知样品的 480输出的靶标/参照基因数值
与已知拷贝数的标准品(1个拷贝的代表半合子植物，2个拷贝的代表纯合植物)的靶标/参照基因数值比较，确定转基因拷贝数。
[0243] 在 拟合点算法软件中，以输入DNA模板浓度的对数对测得的Cp值作图，得到一数据线图。该曲线的斜率是一个期望的比较参数；因此，初始对数输入数目可以是曲线上的任意起始点，条件是输入DNA模板的任意浓度数值能够代表所实际使用的连续稀释物。例如，对于10倍连续稀释系列，实际的输入浓度可以是1000、100、10等，对于这些点，LC480拟合点算法软件以3、2、1等作为输入的对数作图。然后通过线性回归，使用此线的最佳拟合(输入对数对Cp)估计y＝mx+b的方程式的斜率(m)。起始模板量和Cp数值之间存在相反关系，因此斜率(m)总是负数。
[0244] 完全(即效率100％)的PCR反应每个循环倍增总模板。PCR效率(Eff)如下计算：
[0245] Eff＝10e(-1/m)
[0246] 因此，对于完全有效的反应(其效率定义为2.00)，对数输入对Cp的图的斜率(m)会是-3.3219。
[0247] 换言之，如下定义100％有效的PCR反应：
[0248] 2.0＝10e(-1/-3.3219)
[0249] LC480拟合点算法软件用第一个方程式报告效率数值。因此，99％有效反应的Eff值为1.99，而不是0.99。
[0250] 为了将它表示为百分比效率，将此数值减去1并且乘以100。或者，
[0251] ％Eff＝[(10e(-1/m)-1)]x 100
[0252] AAD1相对转录物分析：还使用定量水解探针PCR检测AAD1转录物的相对水平。在VT阶段(即，即将花粉前)收集叶和雄穗组织。使用高性能cDNA合成试剂盒(INVITROGEN)和随机引物T20VN(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN；SEQ ID NO:31，其中V是A、C或G，并且N是A、C、G或T/U)，使用约500ng总RNA(用KingFisherTM总RNA试剂盒提取；THERMO FISHER SCIENTIFIC)合成cDNA。典型地，20μL反应含有2.5U/μL MultiScribeTM逆转录酶、200nM T20VN寡核苷酸和4mM dNTP。通过在25℃温育10分钟启动反应，然后，于37℃实施合成120分钟，并且通过于85℃5分钟灭活。
[0253] 使用新合成的cDNA进行PCR扩增。水解探针qPCR设立、运行条件、和信号捕捉与上文对DNA拷贝数分析所陈述的相同。，使用相对于EF1α的水平的2-ΔΔCt计算AAD1表达数据。
[0254] 微小RNA检测：传统方法，诸如Northern印迹分析，不适合于高通量筛选小RNA，这部分是因为需要大量的RNA。此研究利用一种创新的方法来检测成熟的微小RNA，其采用茎-环状(stem-looped)、钥匙样(key-like)的引物来合成cDNA，随后进行水解探针PCR分析(Chen等(2005)Nucleic Acids Res.33:e179；Yang等(2009)Plant Biotechnol.J.7:621-30；Varkonyi-Gasic等(2007)Plant Methods 3:12)。钥匙样RT-PCR引物包含在5’端上的35个核苷酸的通用序列，用于创建部分双链的茎-环结构；且在3’端上包含8个核苷酸，其被选择为与特定的成熟微小RNA互补，并被用于启动逆转录反应。此茎-环结构引入通用反向PCR引物结合位点和来自Universal Probe Library的相容探针(UPL21,ROCHE DIAGNOSTICS)以进行下游PCR扩增，因此减轻了为扩增短的微小RNA序列设计常规PCR引物这一独特的难题。
[0255] 依靠完全自动化的KingFisherTM提取方法分离的总RNA对于使用水解探针PCR扩增的miRNA检测以及微小RNA分析而言是足够的。所有测定法均包括无模板的阴性对照(仅预混物)。对于标准曲线，来源板中还包含空白(来源孔中的水)以检查样品交叉污染。
[0256] 对于cDNA合成，反应(表9)中包含针对miR156和miR529的钥匙样引物(表8，miR156_RT和miR529_RT)以及针对EF1α的寡核苷酸(EF1a_F和EF1a_R；表5)，反应使用下述温度设置：25℃10分钟预温育，37℃120分钟合成，和85℃5分钟灭活。然后，使用微小RNA特异性正向引物和通用反向引物(表8)扩增RT产物。使用经FAM标记的UPL21产生荧光信号，并且使用EF1α的扩增作为内源参照mRNA。 480实时PCR系统用于循环和信号检测。使用相对于EF1α的2-ΔΔCt计算转录水平。使用LIGHTCYCLERTM软件v1.5，根据供应商的推荐，通过使用二阶导数最大值算法计算Cq值来进行相对定量来分析数据。对于表达分析，使用ΔΔCt法(即2-(Cq靶-Cq参比))计算表达数值，所述ΔΔCt法依赖于两个靶标之间的Cq值差的比较，其中选择2作为基础数值是基于这样的假设：对于优化的PCR反应，每个循环产物倍增。
[0257] 表8：用于cDNA合成和miRNA检测的寡核苷酸(miR156和miR529)。
[0258]
[0259]
[0260] *FAM＝6-羧基荧光素亚磷酰胺
[0261] 表9：用于miR156和miR529的cDNA合成混合物。
[0262]
[0263] 表10：用于miRNA转录物检测的水解探针PCR混合物。
[0264]
[0265] 实施例6：tsh4靶位点介导的AAD1 mRNA和蛋白质生成的降低
[0266] 如实施例2中所述，用含有AAD1构建体或对照质粒的质粒DNA对未成熟的胚进行颗粒轰击后24小时，收获细胞，并且通过ELISA测定生成的AAD1 蛋白的量。表11呈现了AAD1蛋白生成数据，其显示了与接受质粒pDAB112375、pDAB100286的细胞，或未轰击的细胞(阴性对照)相比，在用质粒pDAB113016、pDAB112376和pDAB112377轰击的细胞中生成升高的AAD1蛋白量。AAD1的生成在用pDAB112375(天然tsh4靶位点)转化的细胞中受到抑制，推测是由于玉米未成熟的胚中的miR156的高丰度所致。用不含miRNA靶位点(pDAB113016)或含突变tsh4靶位点(pDAB112377和pDAB112376)的AAD1基因的质粒转化的细胞产生较高水平的AAD1蛋白。在任何处理中均没有观察到pDAB112378所含的人工miRNA构建体或pDAB112330所含的Cry34Ab对照构建体的影响。还可参见图2。
[0267] 表11：颗粒轰击后24小时的玉米未成熟胚中的AAD1蛋白水平。
[0268]
[0269] 使用质粒pDAB113018、pDAB113019、pDAB113020和pDAB113021，通过土壤杆菌介导的程序生成稳定转化的玉米未成熟胚。表4。质粒pDAB113018含有T-DNA边界内的两个选择标志物基因(PAT和AAD1)(实施例2)。从pDAB113018中的AAD1转基因生成的mRNA含有天然tsh4 miR156/miR529靶位点序列。经pDAB113018转化的胚随机分配到含有100nM R-氟吡甲禾灵酸(用于选择含有AAD1基因的转化体)或5.0mg/L双丙氨磷(用于选择含有PAT基因的转化体)的选择培养基I的平板。所有放置在含有氟吡甲禾灵的培养基上的胚变成褐色并且死亡，而在含有双丙氨磷的培养基上的胚照常生长并再生。在用缺乏tsh4靶位点序列的AAD1基因转化时，转基因胚被常规选择，在含有氟吡甲禾灵的培养基上培养并再生。用具有不含miRNA靶位点(pDAB113016)，或含有miR156的经修饰的tsh4靶位点(pDAB112377和pDAB112376)的AAD1基因的质粒转化的未成熟的胚生成较高水平的AAD1蛋白，在含有氟吡甲禾灵的培养基上生长，并且再生转基因植物。由此可见，经pDAB113018转化的细胞生成的AAD1蛋白水平不足以提供氟吡甲禾灵耐受性。据推测，pDAB113018转化的胚在含有氟吡甲禾灵的培养基上的死亡是由于在发育的胚中miR156介导的mRNA切割破坏了AAD1 mRNA。
[0270] 将稳定的转基因T0植物(1至2拷贝的转基因)转移到温室以进行成熟的植物生成。对于每种构建体，对8至12个T0植物测试了AAD1 mRNA和蛋白质的叶表达，并且对4至6个T0植物测试了AAD1 mRNA和蛋白质的雄穗表达。相对于玉米延伸因子mRNA的水平计算AAD1 mRNA水平，如实施例5中描述。表12显示了分析的结果。还可参见图3A-5B。数据的检查显示，与生成不含靶位点的AAD1 mRNA的组织相比，用表达含有miR529靶位点的AAD1 mRNA的质粒(质粒pDAB113018、pDAB113019和pDAB113020)转化的植物的的雄穗组织的mRNA生成被降低到
1/6，且AAD1蛋白质生成被抑制到1/11。然而，在叶组织中，用不同质粒转化的植物之间AAD1 mRNA或蛋白积累的差异非常小。此结果与表1的数据一致，表1的数据显示miR529在未成熟的雄穗组织中的水平是叶中的16至100倍。因此，表11和特别是表12中汇总的结果证实，设计改造mRNA使其包含miRNA靶切割位点可以作为一种机制，用来控制特定mRNA和蛋白质的组织特异性积累。
1/6，且AAD1蛋白质生成被抑制到1/11。然而，在叶组织中，用不同质粒转化的植物之间AAD1 mRNA或蛋白积累的差异非常小。此结果与表1的数据一致，表1的数据显示miR529在未成熟的雄穗组织中的水平是叶中的16至100倍。因此，表11和特别是表12中汇总的结果证实，设计改造mRNA使其包含miRNA靶切割位点可以作为一种机制，用来控制特定mRNA和蛋白质的组织特异性积累。
[0271] 表12：转基因B104植物的叶和雄穗中的AAD1 mRNA和蛋白质水平。使用Tukey-Kramer检验分开均值。
[0272]
[0273]
[0274] *相对于玉米EF1αmRNA.
[0275] **ng AAD1蛋白质/mg总可溶性蛋白
[0276] ***不由相同字母连接的水平是显著不同的
[0277] 生成转基因玉米植物，其中在构成未成熟的雄穗的组织或细胞，包括内稃、外稃、雄蕊、花丝、花药、花粉粒、雄性配偶体、精子细胞、管细胞、或影响或控制花粉形成的其它细胞中，包含miRNA(例如miR156、miR529和miR319)靶位点的AAD1 mRNA的积累被miRNA的切割所限制。这样的AAD1 mRNA的积累有限，产生的AAD1蛋白积累水平不足以赋予未成熟的雄穗组织对属于AAD1底物的除草剂，诸如氟吡甲禾灵和喹禾灵的耐受性。因此，在此类转基因植物未成熟雄穗的发育阶段用属于AAD1底物的除草剂处理这些植物可防止雄穗和花粉形成，并且导致植物雄性不育。表1中公开的微小RNA表达概貌分析显示了miR529不是特异性在雄穗组织中表达，而是在发育的晚期阶段中以相似的水平在雄穗和雌穗组织两者中表达。因此，在雄穗发育的早期阶段期间用属于AAD1底物的除草剂处理转基因植物(积累包含所述miRNA靶位点的AAD1 mRNA)可防止雄穗和花粉形成，因此导致雄性不育，且不影响穗组织发育。
[0278] 实施例7：T1玉米植物中的AAD1 mRNA和蛋白质生成
[0279] 每种构建体在温室中种植5个单拷贝的转基因事件，以分析T1表达。对于每种事件；对7至8个植物(每种构建体35-40个植物)测试AAD-1 mRNA的叶表达，并且对2个植物(每种构建体10个植物)测试多个生长阶段中的不同组织中的AAD-1 mRNA和蛋白质的表达。相对于玉米延伸因子mRNA(EF1α转录物)的水平计算AAD-1 mRNA水平，如实施例5中描述的。表13中的数据显示，与用pDAB113121转化的“无miRNA”对照植物相比，miRNA靶位点对用构建体pDAB113019和pDAB113020转化的V6植物的叶中的AAD1表达没有影响。然而，在用含有不带任何突变的天然miRNA靶位点的构建体pDAB113018转基因的植物中，观察到AAD1 mRNA表达的显著降低。这些植物中的AAD1 降低可能是由于在叶组织中以高丰度存在的miR156。这些结果确认了pDAB113019和pDAB113020中做出的miR156位点的突变消除了这些构建体中的miR156结合，由此避免了叶组织中的AAD1的下调。
[0280] 表13：在V6生长阶段时T1转基因B104植物的叶中的AAD1与EF1αmRNA水平的比率。平均值使用Tukey-Kramer检验区分。
[0281]转化质粒 取样的植物的数目 平均mRNA比率
pDAB113021 38 2.31(A)*
pDAB113020 40 2.30(A)
pDAB113019 40 2.09(A)
pDAB113018 37 1.30(B)
pDAB113021 38 2.31(A)*
pDAB113020 40 2.30(A)
pDAB113019 40 2.09(A)
pDAB113018 37 1.30(B)
[0282] *不通过相同字母连接的水平是显著不同的。
[0283] V8阶段中的未成熟的雄穗的蛋白质和RNA表达分析显示，与生成没有靶位点的AAD-1 mRNA(pDAB113021)的组织相比，在表达含有miR529靶位点的AAD-1 mRNA(质粒pDAB113018、pDAB113019、和pDAB113020)的转基因植物中AAD1 mRNA和蛋白质两者均显著下调(表14)。用pDAB113018和pDAB113020转化的植物中有相似的AAD1降低水平，这确认了未成熟雄穗中的AAD1下调是由于miR529所致，并且构建体pDAB113020的miRNA结合位点中的突变不影响miR529的结合。在用pDAB113019转化的植物中有显著但有限的AAD1下调，这表明构建体pDAB113019的miRNA结合位点中的突变对miR529结合有一些影响。这些结果确认，通过对天然miRNA的结合位点的选定操作，可以获得转基因的期望且精确的下调。然而，在V8植物的叶组织中，用含有修饰的miR529靶位点的pDAB113019和pDAB113020转化的植物之间AAD-1 mRNA或蛋白质积累的差异均非常小(表14)。
[0284] 表14：在V8生长阶段时T1转基因B104植物的雄穗和叶中的AAD1与EF1αmRNA水平的比率，及AAD1蛋白的水平。平均值用Tukey-Kramer检验区分。
[0285]
[0286]
[0287] *不被相同字母连接的水平是显著不同的。
[0288] **ng/mg总蛋白
[0289] 类似地，用各种构建体转化的V12阶段植物中的未成熟的穗中，或者用各种构建体转化的R3阶段植物的叶中，AAD1的下调微小或者无AAD1的下调(表15)。然而，与对照“无miRNA靶位点”构建体pDAB113021相比，用pDAB113018、pDAB113019和pDAB113020转化的植物的V6根组织中有AAD1蛋白的实质性减少(表15)。这些结果确认了miR529不在雄穗组织中特异性表达，而是在V6根阶段中以某些水平表达，导致AAD1蛋白的实质性减少。
[0290] 表15：在三个生长阶段的T1转基因B104植物的选定组织中的AAD1蛋白水平(ng/mg总蛋白质)。平均值用Tukey-Kramer检验区分。
[0291]
[0292] 实施例8：除草剂诱导的对花粉生成和雄性不育的控制
[0293] 基本上如实施例4中所述的，用质粒pDAB109812通过土壤杆菌介导的转化生成品系B104的5种转基因玉米T0事件，并且在温室中培植。同时种植空阴性对照植物(无AAD1基因)和等值线阳性对照植物(其中AAD1 mRNA表达由1拷贝的玉米泛素1启动子及关联的内含子1驱动，并且以1拷贝的玉米per5 3′UTR终止，两者如上文描述)。
[0294] 在温室中培养30个T1植物(通过用B104来源的花粉使5个T0事件受精而获得)，在约V2阶段时用每公顷70g酸当量(ae/ha)的 II选择喷雾，以除去无效(null)分离子植物并且提供具有功能性AAD1基因的半合子存活植物。 II含有活性成分喹禾灵P-乙基乙基(R)-2-4-[4-6-氯喹喔啉-2-基氧基)-苯氧基]丙酸盐，由DupontTM Crop Protection,Wilmington,DE生产。商业产品每加仑含有0.88磅活性成分(ai)。)
[0295] 每个事件选择12个半合子植物，在雄穗出现时，根据表16处理心叶(whorl)。以相同的方式处理对照。在单独的5加仑盆中培植植物到成熟。当雄穗部分出现时，小心修剪除去雄穗周围的叶。用1.143％(v/v)或2.286％(v/v)含有1.0％(v/v)油乳油(COC)的II溶液喷雾雄穗。COC是一种可乳化精炼石蜡基油，含有约85％石蜡基油和约15％乳化剂。施药是通过从手持式DeVilbiss球式喷雾器喷施8股喷雾(每次0.1mL)。此方法将0.8mL处理溶液分配到雄穗，对于1.143％和2.286％溶液，分别提供560gm ai/ha和1120gm ai/ha的当量。防护邻近的植物和组织不受喷雾漂移影响。
[0296] 表16：在来自先前基于功能性AAD1基因选择的转基因B104事件的12个半合子T1植物中的处理分布(n＝12)。
[0297]处理* 处理的植物数目
0(未处理) 2
0(1％COC检验) 2
560 4
1120 4
0(未处理) 2
0(1％COC检验) 2
560 4
1120 4
[0298] *g ae/ha II
[0299] 通过目测评估组织死亡占总雄穗组织的百分比来表征雄穗损伤。
[0300] 使用与对雄穗喷雾使用的溶液相同的溶液实施叶涂抹(leaf paint)评估。使用小海绵涂料刷，在叶龄第四老的叶的中部的一个4英寸区段的中脉两侧施加叶涂料(不接触中脉)。
[0301] 在施加后评估雄穗、叶和茎的损伤级别(表17和表18)。5个pDAB109812(即SCBV:AAD1)事件中的4个事件的植物发生了100％雄穗消除，有效诱导了雄性不育。另外，这些植物的叶和茎不受损害。因此，植物在营养和雌性生殖组织中保留了有效的除草剂耐受性。阳性对照植物(驱动AAD1表达的玉米泛素1启动子)不显示任何雄穗或营养损伤，证明了使用SCBV启动子时AAD1的组织特异性表达。无效对照植物(无AAD1基因)显示100％雄穗消除，同时还显示营养损伤，如预期的。
[0302] 表17。事件数据的汇总。
[0303]
[0304]
[0305] *g ai/ha II
[0306] **DAA＝施加后的天数；NA＝不适用；NT＝未测试
[0307] ***雄穗坏死，且不张开
[0308] 雄穗和顶叶死亡
[0309] 表18：对照植物数据的汇总。
[0310]
[0311] *g ai/ha II
[0312] **DAA＝施加后的天数；NA＝不适用；NT＝未测试
[0313] ***雄穗坏死，并且不张开
[0314] 雄穗和顶叶死亡
[0315] 总之，数据显示了对SCBV:AAD1植物定时且定向施用 II可以有效杀死雄性生殖组织，同时仍提供营养耐受性。
[0316] 实施例9：除草剂诱导的雄性不育杂交系统
[0317] 产生已经用在植物启动子和其它植物表达调节元件的控制下的AAD1基因转化的转基因玉米植物。AAD1 mRNA内在含有靶位点序列，例如被miRNA(例如miR156、miR529和miR319)识别的靶位点序列。有利的是，在构成未成熟的雄穗的组织或细胞，包括内稃、外稃、雄蕊、花丝、花药、花粉粒、雄性配偶体、精子细胞、管细胞、或影响或控制花粉形成的其它细胞中，可检出其靶位点被引入AAD1 mRNA中的miRNA的天然表达，尽管表达也可以在穗和根组织中检出(Chuck等(2010)Development 137:1243-50；Zhang等(2009)PloS Genetics Nov.5)。
[0318] 另外，有利的是，用于控制AAD1 mRNA表达的启动子是在构成未成熟的雄穗的组织或细胞，包括内稃、外稃、雄蕊、花丝、花药、花粉粒、雄性配偶体、精子细胞、管细胞、或影响或控制花粉形成和生成的其它细胞中无活性、或仅为弱功能性的启动子。
[0319] 进一步有利的是，在不直接参与花粉生成的其它植物部分(诸如叶、根、茎、形成中的雌穗、须等)中的AAD1 mRNA表达足以产生AAD1蛋白积累，其积累水平足以赋予这些组织对生长抑制水平的属于AAD1底物的除草剂化合物的耐受性，使得这些组织不受该类除草剂化合物的应用(例如通过喷雾)的损伤或其它方面的不利影响。在雄穗发育的早期阶段时对植物应用抑制水平的属于AAD1底物的除草剂化合物可抑制或阻止雄穗和花粉发育，由此生成雄性不育植物。此外，此类植物的发育、生长、形态学、成熟和产率不受用除草剂化合物的处理影响。
[0320] 实施例10：立体特异性除草剂诱导的雄性不育杂交系统
[0321] 生成具有AAD1转基因的转基因玉米植物，其中AAD1转基因的表达在组成性植物表达调节元件，诸如玉米泛素1启动子及关联的内含子1的控制下。用包含在启动子和其它植物表达调节元件的控制下的AAD12编码区(美国专利8,283,522)的植物表达盒二次转化此类AAD1植物，所述其它植物表达调节元件的选择使得AAD12转基因表达和AAD12蛋白仅积累在雄性生殖组织(例如未成熟的雄性穗、内稃、外稃、雄蕊、花丝、花药、花粉粒、雄性配偶体、精子细胞、管细胞、或影响或控制花粉形成和生成的其它细胞)中。
[0322] AAD1和AAD12蛋白利用包含苯环、氧、和丙酸的化合物的对映体底物(分别为R-形式或S-形式)。例如，AAD12蛋白可以使用2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)和吡啶氧基乙酸除草剂化合物作为底物，而AAD1蛋白失活“fops”底物，如氟吡甲禾灵和喹禾灵。在杂种种子生成期间，在早期雄穗阶段(在花粉散布前)用属于AAD12的特异性底物的除草剂化合物类似物(原-除草剂S-形式(pro-herbicide S-form))喷雾雌株行(含有要用作花粉接受者的植物)，而不喷雾雄株行(含有要用作花粉供体的植物)。
[0323] 经喷雾的植物的雄性组织中的AAD12蛋白的活性将S-型的原除草剂化合物转化为活性除草剂化合物，导致对雄性组织的破坏，由此诱导雄性不育。经喷雾的植物的其它组织(由于那些组织中生成AAD1蛋白而缺少AAD12生成)不受S-型的原除草剂化合物影响，并且对fops除草剂化合物(例如氟吡甲禾灵和喹禾灵)进一步有抗性。因此，田间的杂草通过fops除草剂的作用被控制。随后，未喷雾的雄性行中的植物能够生成花粉，并且对雌性行中的植物授粉以生成杂种种子。该方法可避免机器或手动去雄过程中由于植物损伤所致的产率损失，采用除草剂诱导的雄性不育系统，机器或手动去雄不再必要。
[0324] 在一些例子中，在整个植物中表达另一种除草剂耐受性基因(诸如DGT基因(美国专利申请61/593555，2012年2月1日提交))，而AAD12基因仅在雄性组织中表达，得到的最终结果相同，即在植物发育的合适阶段时施用合适的除草剂化合物后诱导雄性不育。在一些例子中，使用其它除草剂耐受性基因。
[0325] 在双子叶植物中，AAD1和AAD12蛋白的作用颠倒：AAD12遍及整个植物组成性表达，而AAD1表达是雄性组织特异性的，并且用R-型原除草剂化合物破坏雄性组织。
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