一种棉花异戊烯基转移酶IPT3及其编码基因与应用
阅读：688发布：2023-01-30
专利汇可以提供一种棉花异戊烯基转移酶IPT3及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了 植物 蛋白、其编码基因及其应用。特别提供了一个来源于 棉 花的异戊烯基转移酶(IPT3)及其编码基因，及其在培育抗旱性提高的转基因植物中的应用。，下面是一种棉花异戊烯基转移酶IPT3及其编码基因与应用专利的具体信息内容。
1.棉花的一个异戊烯基转移酶的编码基因，被命名为GhIPT3,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种重组表达载体，其含有权利要求1所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。
3.一种重组细胞，其含有权利要求1所述的基因或者权利要求2所述的重组表达载体。
4.权利要求3所述的重组细胞，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
5.一种改善植物抗旱性的方法，包括：将权利要求1所述的基因或者权利要求2所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达，所述植物是烟草。
6.一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求1所述的基因或者权利要求2所述的重组表达载体的植物或植物组织，其中所述植物是烟草。
7.权利要求1所述的基因、权利要求2所述的重组表达载体或者权利要求3或4所述的重组细胞用于改善植物抗旱性以及用于植物育种的用途，其中所述植物是烟草。
8.权利要求1所述的基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种棉花异戊烯基转移酶IPT3及其编码基因与应用
技术领域
背景技术
[0002] 非生物胁迫，如干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等能够对植物的生长发育造成严重的危害，对作物产量造成极大损失。其中干旱对作物产量的影响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农业发展的瓶颈。据统计，世界干旱、半干旱地区占陆地面积的34％；我国干旱、半干旱地区约占国土面积的52％，年受旱面积达200-270万公顷，全国灌溉区每年缺水约30亿立方米，因缺水而少收粮食350-400亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北，是我国缺水最严重的地区，春旱频繁达到十年九遇。
[0003] 由于植物的耐胁迫性大多属于数量性状，现有可利用的种质资源匮乏，采用常规育种技术改良植物胁迫耐性的难度相当大，培育出真正的耐胁迫品种就尤为困难。近年来，随着对植物抗逆分子机理研究的不断深入和分子生物学技术的迅猛发展，抗逆研究已经从生理水平深入到分子水平，促进了植物抗逆基因工程的发展。当植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应，来降低或消除给植株带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。这些基因及其表达产物可以分为3类：(1)参与信号级联放大系统和转录控制的基因及产物；(2)直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物；(3)与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。近年来，通过转基因技术提高植物对胁迫耐受能力的研究，以及对胁迫具有耐受能力的农作物、旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成果，对胁迫相关基因和信号转导系统也有了更进一步的了解(Liu Q.1998.Two transcription factors，DREB1and DREB2，with an EREBP/AP2DNA binding domain，separate two cellular signal transduction pathways in drought-and low temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell，10：1391-1406；KANG JY.2002.Arabidopsis basic leucine zipper proteins that mediate stress-responsive abscisic acid signaling.Plant Cell，14：343-357；ABE H.2003.Arabidopsis AtMYC2(bHLH)and AtMYB2(MYB)function as transcriptional activators in abscisic acid signaling.Plant Cell，15：63-78.)。
[0004] 但就目前的研究状况而言，由于其机制十分复杂，许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究将对植物抗逆相关的信号传递途径及信号传递网络系统的研究提供重要的基础。
发明内容
[0005] 本发明人利用SSH(抑制差减杂交)与RACE(cDNA末端快速扩增)相结合的方法克隆出了棉花的一个异戊烯基转移酶(本文命名为IPT3)的编码基因，并测定了其DNA序列。并且发现通过转基因将其导入植株后，可明显改善转基因植株的抗旱性，而且这些性状可稳定遗传。
[0006] 本发明第一方面提供棉花的一个异戊烯基转移酶IPT3的编码基因(本文命名为Gh IPT3)，其序列为SEQ ID NO：2。
[0007] 本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述载体为附图2所示的rd29A-GhIPT3-2300载体。
[0008] 本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
[0009] 本发明第四方面提供一种改善植物抗旱性的方法，包括：将本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。
[0010] 本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是烟草。
[0011] 本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物抗旱性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是烟草。
[0012] 本发明第七方面提供本发明第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
附图说明
[0013] 图1是GhIPT3的植物表达载体(rd29A-GhIPT3-2300)的构建流程。
[0014] 图2是GhIPT3的植物表达载体(rd29A-GhIPT3-2300)的质粒图。
[0015] 图3是对照烟草和转基因烟草的抗旱性生长情况(图3a为干旱前，图3b为干旱后)；CK(左)：对照烟草；T1Z6(右)：转基因烟草株系。
[0016] 图4是耐干旱T1代转基因烟草植株和不耐干旱对照烟草植株在转录水平上的验证结果。M为Marker，1-8为耐干旱T1代转基因烟草植株，9为质粒阳性对照，10-13为不耐干旱对照烟草植株。
具体实施方式
[0017] 提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。
[0018] 实施例1.干旱胁迫下棉花SSH文库构建：
[0019] 具体方法为：
[0020] 利用Clontech公司的PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶片中提取的mRNA作为样本(tester)，以未处理的棉花幼苗的叶片中提取的mRNA作为对照(driver)。具体步骤简述如下：
[0021] (1)供试材料：
[0022] 非洲棉(国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号：ZM-06838)播种到灭过菌的蛭石上，在25℃、光周期16h光照/8h黑暗(光强2000-3000Lx)条件下培养，每周浇1/2MS培养基(含有9.39mM KNO3，0.625mM KH2PO4，10.3mM NH4NO3，0.75mM MgSO4，1.5mM CaCl2，50μM KI，100μM H3BO3，100μM MnSO4，30μM ZnSO4，1μM Na2MoO4，0.1μM CoCl2，100μM Na2EDTA，100μM FeSO4)一次。当苗株高达25-30cm时用于实验。
[0023] (2)材料处理：
[0024] 将供试幼苗分为2组，每组4盆，每盆1株。第一组为对照组，在25℃、光周期16h光照/8h黑暗(光强2000-3000Lx)培养，正常浇灌。第二组为干旱处理组，25℃、光周期16h光照/8h黑暗(光强2000-3000Lx)条件下培养，停止浇灌，处理10天，处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端1/3的叶片，用液氮迅速冷冻后，于-70℃冰箱中保存。
[0025] (3)总RNA提取：
[0026] 分别取对照组和干旱处理组的棉花叶片0.5g，用植物RNA提取试剂盒(购自invitrogen)提取棉花叶片的总RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度计U-2001测定总RNA在
260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度较高，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒(purification of polyA+RNA from total RNA)分离mRNA。
260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值为1.8-2.0，表明总RNA纯度较高，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒(purification of polyA+RNA from total RNA)分离mRNA。
[0027] (4)抑制差减杂交：
[0028] 按Clontech公司的PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制差减杂交。先将Driver mRNA和Tester mRNA分别反转录，得到双链cDNA，再以2μg Tester cDNA和2μg Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。在37℃水浴下分别将Tester cDNA和Driver cDNA用Rsa I酶切1.5h，然后将酶切后的Tester cDNA分成两等份，连接上不同的接头，而Driver cDNA不连接头。两种连有不同接头的Tester cDNA分别与过量的Driver混合，进行第一次正向差减杂交。将两种第一次正向差减杂交的产物混合，再与新变性的Driver cDNA进行第二次正向差减杂交，通过两次抑制性PCR扩增差异表达的片段，使其得到富集。
[0029] (5)cDNA差减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定
[0030] 依照pGEM-T Easy试剂盒的程序，将所述第二次正向差减杂交cDNA片段的第二次抑制性PCR产物(使用QIAquick PCR Purification Kit纯化，购自Qiagen)与pGEM-T Easy(购自Promega试剂盒)载体连接，其具体步骤如下：用200μl PCR管依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交cDNA片段的第二次PCR产物3μl，2×T4连接酶缓冲液5μl，pGEM-T Easy载体1μl，T4DNA连接酶1μl，于4℃连接过夜。取10μl连接反应产物，加入到100μl感受态大肠杆菌JM109(购自TAKARA)中，冰浴30min、热休克60秒、冰浴2min，另加250μl LB培养液(含有1％Tryptone(购自OXOID)，0.5％Yeast Extract(购自OXOID)，1％NaCl(购自国药))置37℃水浴中，以225rpm振荡培养30min，取200μl菌液接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB(同上)/X-gal/IPTG(X-gal/IPTG购自TAKARA)培养板上，37℃培育18h。计数培养板中直径＞1mm的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取540个白色菌落(编号：Gh-D2-001至Gh-D2-540)。将所有白色克隆接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基的96孔细胞培养板(CORNING)中，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，于-80℃保存备用。以巢式PCR引物Primer 1和Primer
2R(Clontech公司的PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒自带)进行菌液PCR扩增，得到452个阳性克隆，然后将所有阳性克隆送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。
2R(Clontech公司的PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒自带)进行菌液PCR扩增，得到452个阳性克隆，然后将所有阳性克隆送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。
[0031] (6)差异克隆的cDNA测序分析：
[0032] 将DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的cDNA后，共得到405个有效EST(unigene)。
[0033] 实施例2 棉花异戊烯基转移酶编码基因GhIPT3的克隆
[0034] 克隆子Gh-D2-233去掉冗余DNA后，序列为SEQ ID NO：3，序列分析表明该序列的编码的蛋白质属于异戊烯基转移酶，本文将SEQ ID NO：3序列对应的全长编码基因命名为GhIPT3，其对应的蛋白命名为IPT3。
[0035] SEQ ID NO：3
[0036] 1 ACGAGGAAGC CCTGCGGGAG ATCAAAGATA ACACGTGTCG ACTGGCAAAG AGACAGATAG[0037] 61 GAAAGATCCT ACGGCTGAGA GAGGGCGGAT GGGACTTCAC TAGATTCGAC GCAACGGTGA[0038] 121 CGTTTCAAGC ATTGATGAAG AAAAAGCAGT CGTCGGCGGT GGCGGCGCCG GAACTAGAAT[0039] 181 GGAGGGAGAT TTGGGAAAGG GAAGTGGTGG AACCAAGCGT GAAGATTGTG AAGCGATTTT[0040] 241 TGGAGGAGTA GGTTTTCCAG CTAATTTATT CTTTGTTGGA AAAATTGCTC TAAAAAAAGG[0041] 301 GGTGGAAAAA TTCAGATTAG CCAGAGTTAG GGGTGAGTAA AACTCGATTC GACTCGAAAA[0042] 361 AATTGAATTT CGAGTTAAAC GAATCGAGTT ATTCGAGTTA ATCGAGTTAT TCGAGTCAAC[0043] 421 TTAAATTTTT TTTTCGAATT TCGAGTTCGA ATAGAGTTGA GTTTTCGAAT TCGAAAAAAA[0044] 481 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A
[0045] GhIPT3全长编码基因的克隆
[0046] 根据已经获得的SEQ ID NO：3序列，设计如下三条特异性引物，作为5’RACE的3’端特异性引物。
[0047] GhIPT3GSP1：SEQ ID NO：4：
[0048] TTCTTCATCA ATGCTTGAAA CG
[0049] GhIPT3GSP2：SEQ ID NO：5：
[0050] TCTCTCAGCC GTAGGATCTT TC
[0051] GhIPT3GSP3：SEQ ID NO：6：
[0052] CTCTTTGCCA GTCGACACGT GT
[0054] 用SEQ ID NO：5与通用引物AAP(试剂盒自带)，以mRNA逆转录的cDNA(反转录引物SEQ ID NO：4)为模板进行第一轮PCR扩增，具体步骤如下：
[0055] 50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl mRNA反转录的cDNA，1.0μl Ex Taq(购自TAKARA)、10μM的引物SEQ ID NO：5和AAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min。
[0056] 所得的PCR产物用双蒸水稀释50倍后取2.0μl作为模板，用SEQ ID NO：6与引物AUAP进行第二轮PCR扩增，具体步骤如下：50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl稀释的第一轮PCR产物，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：6和AUAP各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min。回收第二次PCR产物中片段约为900bp条带(Gel Extraction Kit购自OMEGA)，并将其连接于pGEM-T Easy Vector，然后转化到JM109(具体方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQ ID NO：6与引物AUAP进行菌液PCR扩增(反应体系及反应条件同上)，得到3个阳性克隆，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序测序，获得该基因的cDNA的5’端。
[0057] 所得的5’RACE产物克隆测序后，与SEQ ID NO：3结果拼接。获得GhIPT3的cDNA序列SEQ ID NO：7。
[0058] SEQ ID NO：7：
[0059] 1 CATAACCAGC TTTGTTTTTT GTTTTTTTTT TATTCCTCTT CCCCATGGAA CATATTCTTT[0060] 61 CTTCTTTTCA TTCTCTCGAT TCCCCGGTTT TTTACCGTCC TCTTCCCCTC CACCGGCGTC[0061] 121 CGAGGTGGCC CCGTATGGGC TCCTCCACCC CCCACCACCG TAACAACCAA AACAAGACCA[0062] 181 AACTCATCGT CATCATGGGT GCTACCGGTA CCGGAAAATC CCGCCTCTCC ATCGACTTGT[0063] 241 CAACCCATTT CCCTCACTCT CAAATCATAA ACTCAGACAA AATGCAACTT TACAACGGCT[0064] 301 TAGATATAAC CACGAACAAG ATCCCTCTCC CTGAAAGGAA AGGGGTCCAG CACTATCTTC[0065] 361 TCGGCGAGTT CGACTCAATC GACGCCGACG TGGAGCCGTC GCAGTTCCGT TCCGCCGCGG[0066] 421 GATCAACCAT CGCCGACATT GCCTCGCGTG GGAACTTGCC GCTTCTTGTT GGTGGGTCCA[0067] 481 ACACTTTCAT TCATGCTCTC CTGGTGGAAA CCTTTGACCC TCAAGTGGAC GTGTTTGCCG[0068] 541 AGTCAAGCTC AGTGAGTCGA GCGTTGAGGT ATGACTGTTG TTTCCTTTGG GTCGACGTGG[0069] 601 CTTGGTCGGT ACTCAGTGAG TACCTATGCA TACGAGTTGA TGAAATGCTT GACTCAGGGA[0070] 661 TGTTAGAAGA GTTGGCTCAG TTCTATGACC CGACCAAAGC GGGTGTCATG GTGGGGCTAC[0071] 721 GGAAGGCAAT CGGAGTACCC GAATTCGATG CCTATTTCAG GAAATACCAG CCGTGGGAAA[0072] 781 GCCCAGAAAA CGGCGTCGTC CCCAACAAGG ACCGTGATCA GAGCCGGAGG GAAGCGTACG[0073] 841 AGGAAGCCCT GCGGGAGATC AAAGATAACA CGTGTCGACT GGCAAAGAGA CAGATAGGAA[0074] 901 AGATCCTACG GCTGAGAGAG GGCGGATGGG ACTTCACTAG ATTCGACGCA ACGGTGACGT[0075] 961 TTCAAGCATT GATGAAGAAA AAGCAGTCGT CGGCGGTGGC GGCGCCGGAA CTAGAATGGA[0076] 1021 GGGAGATTTG GGAAAGGGAA GTGGTGGAAC CAAGCGTGAA GATTGTGAAG CGATTTTTGG[0077] 1081 AGGAGTAGGT TTTCCAGCTA ATTTATTCTT TGTTGGAAAA ATTGCTCTAA AAAAAAGGGT[0078] 1141 GGAAAAATTC AGATTAGCCA GAGTTAGGGG TGAGTAAAAC TCGATTCGAC TCGAAAAAAT[0079] 1201 TGAATTTCGA GTTAAACGAA TCGAGTTATT CGAGTTAATC GAGTTATTCG AGTCAACTTA[0080] 1261 AATTTTTTTT TCGAATTTCG AGTTCGAATA GAGTTGAGTT TTCGAATTCG AAAAAAAAAA[0081] 1321 AAAAAAAAAA AAAAAAAA
[0082] 根据SEQ ID NO：7序列设计一对引物如下：
[0083] Gh IPT3F：SEQ ID NO：8：
[0084] ATGGAACATA TTCTTTCTTC TTTTC
[0085] Gh IPT3R：SEQ ID NO：9：
[0086] TGAAGCGATT TTTGGAGGAG TAG
[0087] 通过SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9来克隆GhIPT3全长编码序列。
[0088] 采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以棉花的cDNA为模板进行PCR反应。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min。
[0089] PCR扩增产物加A尾：PCR产物加2.5倍的无水乙醇，-20℃放置10分钟，离心，去上清，晾干，用21μl双蒸水溶解。加入2.5μl 10×Ex Buffer，0.5μl 5mM的dATP，1.0μl Ex Taq。反应条件：70℃反应30分钟。将得到约1000bp的DNA片段回收(Omega回收试剂盒)，连接至pGEM T-easy载体上(得到GhIPT3-pGEM质粒)，转化JM109(方法同上)，随机挑取10个白色菌落于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，37℃培养过夜后加甘油至终浓度20％，-80℃保存备用。SEQ ID NO：8与SEQ ID NO：9进行菌液PCR扩增(反应体系及反应条件同上)，得到3个阳性克隆，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，序列为SEQ ID NO：2，其编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
[0090] IPT3蛋白的氨基酸序列：SEQ ID NO：1
[0091] 1 MEHILSSFHS LDSPVFYRPL
[0092] 21 PLHRRPRWPR MGSSTPHHRN
[0093] 41 NQNKTKLIVI MGATGTGKSR
[0094] 61 LSIDLSTHFP HSQIINSDKM
[0095] 81 QLYNGLDITT NKIPLPERKG
[0096] 101 VQHYLLGEFD SIDADVEPSQ
[0097] 121 FRSAAGSTIA DIASRGNLPL
[0098] 141 LVGGSNTFIH ALLVETFDPQ
[0099] 161 VDVFAESSSV SRALRYDCCF
[0100] 181 LWVDVAWSVL SEYLCIRVDE
[0101] 201 MLDSGMLEEL AQFYDPTKAG
[0102] 221 VMVGLRKAIG VPEFDAYFRK
[0103] 241 YQPWESPENG VVPNKDRDQS
[0104] 261 RREAYEEALR EIKDNTCRLA
[0105] 281 KRQIGKILRL REGGWDFTRF
[0106] 301 DATVTFQALM KKKQSSAVAA
[0107] 321 PELEWREIWE REVVEPSVKI
[0108] 341 VKRFLEE＊
[0109] GhIPT3编码基因的核苷酸序列：SEQ ID NO：2
[0110] 1 ATGGAACATA TTCTTTCTTC TTTTCATTCT CTCGATTCCC CGGTTTTTTA CCGTCCTCTT[0111] 61 CCCCTCCACC GGCGTCCGAG GTGGCCCCGT ATGGGCTCCT CCACCCCCCA CCACCGTAAC[0112] 121 AACCAAAACA AGACCAAACT CATCGTCATC ATGGGTGCTA CCGGTACCGG AAAATCCCGC[0113] 181 CTCTCCATCG ACTTGTCAAC CCATTTCCCT CACTCTCAAA TCATAAACTC AGACAAAATG[0114] 241 CAACTTTACA ACGGCTTAGA TATAACCACG AACAAGATCC CTCTCCCTGA AAGGAAAGGG[0115] 301 GTCCAGCACT ATCTTCTCGG CGAGTTCGAC TCAATCGACG CCGACGTGGA GCCGTCGCAG[0116] 361 TTCCGTTCCG CCGCGGGATC AACCATCGCC GACATTGCCT CGCGTGGGAA CTTGCCGCTT[0117] 421 CTTGTTGGTG GGTCCAACAC TTTCATTCAT GCTCTCCTGG TGGAAACCTT TGACCCTCAA[0118] 481 GTGGACGTGT TTGCCGAGTC AAGCTCAGTG AGTCGAGCGT TGAGGTATGA CTGTTGTTTC[0119] 541 CTTTGGGTCG ACGTGGCTTG GTCGGTACTC AGTGAGTACC TATGCATACG AGTTGATGAA[0120] 601 ATGCTTGACT CAGGGATGTT AGAAGAGTTG GCTCAGTTCT ATGACCCGAC CAAAGCGGGT[0121] 661 GTCATGGTGG GGCTACGGAA GGCAATCGGA GTACCCGAAT TCGATGCCTA TTTCAGGAAA[0122] 721 TACCAGCCGT GGGAAAGCCC AGAAAACGGC GTCGTCCCCA ACAAGGACCG TGATCAGAGC[0123] 781 CGGAGGGAAG CGTACGAGGA AGCCCTGCGG GAGATCAAAG ATAACACGTG TCGACTGGCA[0124] 841 AAGAGACAGA TAGGAAAGAT CCTACGGCTG AGAGAGGGCG GATGGGACTT CACTAGATTC[0125] 901 GACGCAACGG TGACGTTTCA AGCATTGATG AAGAAAAAGC AGTCGTCGGC GGTGGCGGCG[0126] 961 CCGGAACTAG AATGGAGGGA GATTTGGGAA AGGGAAGTGG TGGAACCAAG CGTGAAGATT[0127] 1021 GTGAAGCGAT TTTTGGAGGA GTAG
[0128] 实施例3GhIPT3基因植物表达载体构建
[0129] 选择植物双元表达载体pCAMBIA2300(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)作为植物表达载体，用Pnos启动子替换NPTII基因含双增强子的35S启动子，以降低NPTII蛋白在植物中的表达。选择诱导型启动子rd29A及终止子Tnos分别作为GhIPT3基因的启动子和终止子。
[0130] 用引物SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11以植物表达载体pBI121(购自北京华夏远洋科技有限公司)为模板扩增Pnos，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl pBI121，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通过EcoRI、BglII酶切后将所得的PCR产物连接到pCAMBIA2300(promega，T4连接酶盒)获得
pCAMBIA2300-1。
pCAMBIA2300-1。
[0131] SEQ ID NO：10：
[0132] GCACGAATTC GGCGGGAAAC GACAATCTGA
[0133] SEQ ID NO：11：
[0134] ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG
[0135] SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13以pBI121为模板扩增Tnos，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl pBI121，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通过SacI、EcoRI酶切后将所得的PCR产物连接到pCAMBIA2300-1(promega T4连接酶盒)获得pCAMBIA2300-2
[0136] SEQ ID NO：12：
[0137] AAGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA
[0138] SEQ ID NO：13：
[0139] TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA
[0140] SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15以拟南芥(哥伦比亚型，购自TARI，www.arabidopsis.org)DNA为模板扩增拟南芥rd29A启动子(参考Zeng J.，et L.2002，Preparation of total DNA from“recalcit rant plant taxa”，Acta Bot.Sin.，44(6)：
694-697中的方法提取拟南芥DNA)。采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl拟南芥DNA，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性
5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通过HindIII、PstI酶切后将所得的PCR产物连接到(连接方法同上)pCAMBIA2300-2获得pCAMBIA2300-3[0141] SEQ ID NO：14：
694-697中的方法提取拟南芥DNA)。采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl拟南芥DNA，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性
5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s)，72℃延伸10min。通过HindIII、PstI酶切后将所得的PCR产物连接到(连接方法同上)pCAMBIA2300-2获得pCAMBIA2300-3[0141] SEQ ID NO：14：
[0142] ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTA
[0143] SEQ ID NO：15：
[0144] TGACTGCAGTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAG
[0145] SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17扩增GhIPT3(模板是实施例2所获得的阳性GhIPT3-pGEM质粒)，采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，1.0μl GhIPT3-pGEM质粒，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17各2.0μl，以及31μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min。通过PstI、SacI酶切后将所得的PCR产物连接到(连接方法同上)pCAMBIA2300-3，获得植物表达载体rd29A-GhIPT3-2300。
[0146] SEQ ID NO：16：
[0147] TGACTGCAGATGGAGAAGAAAGGGACAGTAT
[0148] SEQ ID NO：17：
[0149] AAGGAGCTCTCAAACCAGGCTCTGGGTATAA
[0150] 实施例4rd29A-GhIPT3-2300表达载体转化农杆菌
[0151] 农杆菌LBA4404(购自Biovector Science Lab，Inc)感受态制备：提前1-2天将农杆菌LBA4404在含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB固体培养基上划单斑接种，28℃培养1至2天。挑取单菌落接种于5ml含50μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB液体培养基中，28℃下摇动培养过夜(约12-16h)至OD600值为0.4，形成种子菌液。取5ml活化后的菌液(1∶20的比例)接种于100ml同样浓度抗生素的LB液体培养基中，28℃摇动培养2-2.5h至OD600＝0.8。冰浴菌液10min，每隔3min摇匀一次，令细菌均匀进入休眠状态。于4℃下4000g离心10min，弃上清液；加入一定量冰预冷的10％甘油重悬浮菌体，4℃下4000g离心10min，收集沉淀；用冰预冷的10％甘油重复洗3-4次；加入适量冰浴预冷的10％甘油重新悬浮细菌沉淀，以40μl/管将其分装，于-70℃保存备用。
[0152] 转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，往40μl的感受态细胞中加入1μl的质粒，混匀后冰浴约10min。将感受态细胞和rd29A-GhIPT3-2300质粒DNA的混合物用移液枪转移到冰预冷的电击杯中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将电击杯(购自bio-rad)放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用0.1cm规格的电击杯的时候，MicroPulser(购自bio-rad)的程序设置为“Agr”，电击一次。立即取出电击杯，加入28℃预热的LB培养基。快速而轻柔的用枪将细胞打匀。将悬浮液转入1.5ml的离心管，28℃，225rpm培养1h。取100-200μl的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上(LB固体培养基，含50μg/ml利福平、50μg/ml链霉素、50μg/ml卡那霉素)，28℃培养。筛选阳性转化克隆，并将其菌液于-70℃保存备用。
[0153] 实施例5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草
[0154] 用75％酒精浸泡烟草种子(国家烟草中期库，获取单位：中国农科院烟草所，库编号I5A00660)30s，然后用灭菌双蒸水洗两次。再用0.1％升汞浸泡8min，然后用灭菌双蒸水洗两次，完成表面灭菌。将表面灭菌的烟草种子置于MS(18.78mM KNO3，1.25mM KH2PO4，20.6mM NH4NO3，1.5mM MgSO4，3.0mM CaCl2，50μM KI，100μM H3BO3，100μM MnSO4，30μM ZnSO4，1μM Na2MoO4，0.1μM CoCl2，100μM Na2EDTA，100μM FeSO4，7.4g/L琼脂，蔗糖30g/L)上于无菌条件下发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成5mm×5mm大小的叶盘，用处于对数生长期的含表达载体rd29A-GhIPT3-2300的农杆菌浸染叶盘10min，吸干菌液，在黑暗条件下共培养2天(MS培养基)。将叶片转到分化培养基(MS+1mg/L细胞分裂素(BA)+0.1mg/L萘乙酸(NAA)+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)上，光照条件下培养45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基(MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L头孢霉素)中培养30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行编号保存。
[0155] 取获得的转基因烟草叶片，提取DNA(同实施例3中拟南芥DNA提取方法)，用SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9(50μl PCR反应体系：5μl 10×Ex Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl DNA，1.0μl Ex Taq、10μM的引物SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9各2.0μl，以及35μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，33个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min)，72℃延伸10min)，PCR鉴定，保存阳性植株进行编号TOZ1-TOZ20。
[0156] 实施例6 过表达GhIPT3转基因烟草T1代植株的抗旱模拟实验及功能鉴定
[0157] 灭过菌的蛭石用1/2MS培养基浸透。TOZ1-TOZ20及对照烟草种子分别播种在蛭石上，每盆播种15颗种子，25℃、14小时光培养/10小时暗培养循环，每周浇一次1/2MS，培养25天之后，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9做PCR检测，去除阴性植株。选取大小一致的转基因烟草及对照烟草做耐旱实验，每盆保留大小较一致的4-5棵苗。转基因烟草、对照烟草干旱14天(不浇水)，25℃、14小时光培养/10小时暗培养循环。T1代转基因植株(TO代转基因植株的种子长成的植株)的抗旱性鉴定表明，对照植株都萎蔫严重，而T1Z6、T1Z9、T1Z17、T1Z19四个株系烟草表现出明显的抗旱性(参见图3a和3b，以T1Z6为例，T1Z9、T1Z17、T1Z19的结果与T1Z6类似，在此未示出)。
[0158] 实施例7 在转录水平上验证IPT3蛋白表达
[0159] 实施6中抗旱性好的转基因植株随机选取8棵(分别属于上述4个抗旱株系)，实施6中对照植株选取4棵，干旱14天叶片0.05g，用植物RNA提取试剂盒(invitrogen)提取的总RNA。紫外分光光度测定总RNA在260nm和280nm的吸光度值，计算各个RNA浓度。依照invitrogen反转录试剂盒SuperScript III Reverse Transcriptase所示方法进行反转录(1μg总RNA作为模板，反转录引物SEQ ID NO：9)。通过SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：18检测GhIPT3，检测IPT3蛋白相对表达情况。采用TaKaRa的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的cDNA为模板进行PCR反应。50μl PCR反应体系：10μl 5×PS Buffer，3μl 2.5mM的dNTP，2.0μl cDNA，1.0μl PrimeSTAR、10μM的引物SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：18各2.0μl，以及30μl的双蒸水。PCR反应条件：94℃预变性5min，28个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min。产物电泳结果如图4所示：M为DNA Ladder Marker(DL2000，购自深圳瑞真生物技术有限公司)，1-8为耐干旱T1代转基因烟草植株，9为质粒PCR阳性对照(rd29A-GhIPT3-2300质粒)，10-13为不耐干旱对照烟草植株。图中所示条带大小与正对照的大小一致(约为1000bp)。结果表明，耐干旱T1代转基因烟草植株中GhIPT3转录较强，不耐干旱对照烟草植株没有GhIPT3转录。
[0160] SEQ ID NO：18：AATCTTCACG CTTGGTTCCA C
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