促红细胞生成素在制备治帕金森病运动并发症药物中的应用
阅读：217发布：2023-01-25
专利汇可以提供促红细胞生成素在制备治帕金森病运动并发症药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了促红细胞生成素在制备治 帕金森病 运动并发症药物中的应用，所述的促红细胞生成素是：自然提取的促红细胞生成素、基因重组表达促红细胞生成素、聚乙二醇修饰的促红细胞生成素、糖基化修饰的促红细胞生成素或人血清融合的促红细胞生成素中的一种。本发明的优点在于：发掘了促红细胞生成素的新医疗用途，开拓了一个新的应用领域，促红细胞生成素作为蛋白药物 治疗 和 预防 帕金森病运动并发症具有无毒 副作用 、价格低等优点，易于被患者接受，促红细胞生成素制备工艺简单，对环境友好，在治疗和预防帕金森病运动并发症中有良好的应用前景。，下面是促红细胞生成素在制备治帕金森病运动并发症药物中的应用专利的具体信息内容。
促红细胞生成素在制备治帕金森病运动并发症药物中的应
用
技术领域
[0001] 本发明涉及促红细胞生成素的新用途，具体地说，是促红细胞生成素在制备治帕金森病运动并发症药物中的用途。
背景技术
[0002] 帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是中老年人常见的神经系统退行性疾患，主要与黑质致密区多巴胺能神经元变性缺失及由此造成的黑质纹状体通路多巴胺递质减少有关。经过多年的临床实践，一般认为，左旋多巴仍是最有效的治疗帕金森病药物。但左旋多巴长期应用后，大部分患者会出现症状波动、异动症（1evodopa-induced dyskinesia，LID）和精神症状，即PD运动并发症，加之实验室发现高浓度多巴胺（dopamine，DA）和左旋多巴会由于自身氧化产生自由基，可导致神经细胞变性坏死，因此，联合其他药物共同预防和治疗PD和PD运动并发症十分迫切。
[0003] 近年研究表明，PD运动并发症的发生与表达D1受体的直接通路及其下游cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）、ERK等信号转导通路被激活关系密切，其下游信号转导蛋白多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白-32（dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr32000，DARPP-32）的蛋白Thr75位点磷酸化表达的改变可能参与了异动症的发病。
[0004] 目前在PD运动并发症的预防方面，主要采用COMT抑制剂、金刚烷胺、DR激动剂、L-dopa甲酯或乙酯等。如中国专利文献CN 200880108979.7，公布日2010年8月18日，公开了一种“用于改善帕金森病的运动并发症或精神症状的药剂”，所述的药剂具有5-羟色胺1A受体部分激动剂作用，同时对多巴胺D3受体具有激动剂作用，对于在反复给药左旋多巴时伴随产生的运动并发症具有改善和延迟发病的效果。但是西药预防和治疗产生的副作用较大，容易形成耐药性，不宜长期服用。
[0005] 促红细胞生成素（Erythropoictin，EPO）是一种参与调节红细胞前体细胞分化、增殖、抑制凋亡的糖蛋白激素，可以增加红血球的数目。近年来越来越多的研究表明，EPO在神经发育、神经保护和成年神经元修复、生存、再生过程中均发挥着非常广泛和复杂的作用，而且认为它的神经保护作用是一种不依赖于其促进红细胞生成功能的直接作用。另外，EPO及其受体（Erythropoictin receptor，EPO-R）在啮齿类、哺乳类及人类的神经元和胶质细胞均有表达。关于促红细胞生成素对PD模型的保护作用及其机制的实验研究已有报道，但是关于促红细胞生成素在制备治疗和预防PD运动并发症药物中的应用还未见报道。
发明内容
[0007] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0008] 促红细胞生成素在制备治帕金森病运动并发症药物中的应用，所述的促红细胞生成素是：自然提取的促红细胞生成素、基因重组表达促红细胞生成素、聚乙二醇修饰的促红细胞生成素、糖基化修饰的促红细胞生成素或人血清融合的促红细胞生成素中的一种。
[0009] 所述促红细胞生成素的剂量为2500-100000 U/kg。
[0010] 所述促红细胞生成素的剂量为7000-50000 U/kg。
[0011] 所述促红细胞生成素的剂量为10000-20000 U/kg。
[0012] 本发明优点在于：
[0013] 1、本发明发掘了促红细胞生成素的新医疗用途，开拓了一个新的应用领域；
[0014] 2、该促红细胞生成素作为蛋白药物治疗和预防PD运动并发症具有无毒副作用、价格低等优点，易于被患者接受；
[0016] 附图1是免疫组化检测大鼠脑内EPO及EPO-R结果。
[0017] 附图2是免疫组化检测大鼠黑质TH细胞结果。
[0018] 附图3是大鼠脑内黑质多巴胺能神经元计数结果。
[0019] 附图4是大鼠黑质TH及纹状体TH的检测结果。
具体实施方式
[0020] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0021] 实施例1 自然提取的促红细胞生成素治疗PD运动并发症的临床前试验[0022] 一、实验方法
[0023] 1. 异动症（levodopa-induced dyskinesia，LID）模型制备
[0024] 大鼠腹腔注射3％的戊巴比妥麻醉后，严格平颅位固定于大鼠脑立体定向仪上，剪毛后碘伏消毒头部皮肤，沿正中线切开头皮，15%双氧水烧灼骨膜，暴露颅骨缝及前囟，确定前囟坐标，根据包新民等所著《大鼠脑立体定位图谱》，确定右侧前脑内侧束（medial forebrain bundle，MFB）注射位点：①前囟后3.7mm，矢状缝右侧1.7mm，颅骨下8.0mm，门齿线2.4mm；②前囟后4.4mm，矢状缝右侧1.2mm，颅骨下8.0mm，门齿线2.4mm。按上述确定的注射位点钻孔，用10μl规格的微量注射器抽取6-OHDA 6μl（溶于0.2%维生素C生理盐水，浓度4μg/μl），每点注射3μl，注射速度约1μl/min，留针5min后缓慢退针，退4mm再留针5min，直至完全退出，缝合皮肤切口，置笼喂养。3周后，大鼠腹腔注射阿朴吗啡（0.5mg/kg）诱导旋转，平均旋转频率＞7次/min为成功PD大鼠模型。利用6-OHDA制备PD模型大鼠后，腹腔注射左旋多巴甲酯/苄丝肼（50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/kg苄丝肼溶于含0.2%维生素C的消毒生理盐水中）4周，制备LID大鼠模型。
[0025] 模型分组和行为学测定
[0026] 随机将LID大鼠模型分为：①LID组（LID大鼠不再做进一步处理）、②EPO 2500 U/kg组（LID大鼠皮下注射剂量为2500活性单位/kg大鼠的自然提取的EPO）、③EPO 5000 U/kg组（LID大鼠皮下注射剂量为5000活性单位/kg大鼠的自然提取的EPO）、④EPO 10000 U/kg组（LID大鼠皮下注射剂量为10000活性单位/kg大鼠的自然提取的EPO）、⑤EPO15000 U/kg组（LID大鼠皮下注射剂量为15000活性单位/kg大鼠的自然提取的EPO）、⑥EPO 100000 U/kg组（LID大鼠皮下注射剂量为100000活性单位/kg大鼠的自然提取的EPO）。另设有假手术组：正常SD大鼠，不作任何处理。各组大鼠经腹腔注射阿朴吗啡诱导旋转，记录其30分钟内旋转圈数，计算各组大鼠每分钟的平均旋转圈数。
[0027] 免疫组化染色
[0028] 大鼠在结束注射后的第12h，每组随机抽取4只大鼠用乙醚麻醉，依次经心脏灌注预冷的生理盐水100ml和4%多聚甲醛300ml，断头取脑，相同固定液中后固定8h，经修块、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡后用石蜡包埋。行石蜡切片，切片厚度为5μm。取纹状体冠状层面采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法行免疫组化染色，步骤如下：石蜡切片脱蜡至水；3%双氧水室温避光孵育5min，以消除内源性过氧化氢酶活性；pH7.7的
1nmol/l EDTA-Tris-HCl微波加热修复；1%BSA-PTS（0.5%Triton-X100）室温封闭20min；
TH受体单克隆抗体（1:400，1%BSA稀释）4℃湿盒内孵育过夜；滴加稀释的生物素标记二抗，
37℃孵育20min；滴加稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37℃孵育20min；联苯二胺（DAB）显色剂显色，自来水冲洗，之后脱水、透明、封片。各步骤之间均用0.01mol/l PBS充分漂洗，PBS代替一抗作为阴性对照。免疫组化切片各观察区随机取5个不重叠视野，于高倍镜（10×40）下观察，采用OLYMPUS-IX50成相系统拍摄，Image-Pro Plus 5.1图象处理软件进行半定量分析，计算TH受体阳性细胞指数（IOD）=阳性细胞面积×校正光密度值（测量区光密度－背景光密度）。
1nmol/l EDTA-Tris-HCl微波加热修复；1%BSA-PTS（0.5%Triton-X100）室温封闭20min；
TH受体单克隆抗体（1:400，1%BSA稀释）4℃湿盒内孵育过夜；滴加稀释的生物素标记二抗，
37℃孵育20min；滴加稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37℃孵育20min；联苯二胺（DAB）显色剂显色，自来水冲洗，之后脱水、透明、封片。各步骤之间均用0.01mol/l PBS充分漂洗，PBS代替一抗作为阴性对照。免疫组化切片各观察区随机取5个不重叠视野，于高倍镜（10×40）下观察，采用OLYMPUS-IX50成相系统拍摄，Image-Pro Plus 5.1图象处理软件进行半定量分析，计算TH受体阳性细胞指数（IOD）=阳性细胞面积×校正光密度值（测量区光密度－背景光密度）。
[0029] 蛋白免疫印迹
[0030] 大鼠在最后一次注射12h后，乙醚麻醉，每组随机抽取4只大鼠断头处死。迅速开颅取脑，快速冰上分离双侧纹状体，每10mg组织加入100μl蛋白裂解液RIPA（含有50mM pH7.4 Tris，150mM NaCl，1%Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等）和1μl蛋白酶抑制剂PMSF，超声充分匀浆，冰上裂解30 min，然后置于4℃离心机于14000rpm离心30min，吸取上清液至另一EP管，提取总蛋白，测定蛋白浓度后于-80℃保存。
[0031] 蛋白电泳溶液配制。1×电泳缓冲液(Running Buffer)：14.4g/L 甘氨酸，3g/L Tris base，1g/L十二烷基磺酸钠。转膜缓冲液(Transter Buffer)：19.375 g Tris base，0.75 g甘氨酸，200ml甲醇加水至1000ml。1×上样缓冲液(Sample Buffer)：62.5mM Tris-HCl (pH6.8，25℃)，2% w/v十二烷基磺酸钠，10%甘油，50mM二硫苏糖醇，0.01%w/v溴酚蓝或酚红。10×TBS (Tris-buffered saline)：封闭缓冲液(Blocking Buffer)：1×TBS，
0.1%吐温-20和5% w/v脱脂奶粉。第一抗体稀释液：1×TBS，0.1%吐温-20和5%封闭剂。
Wash Buffer TBS/T：1×TBS，0.1% Tween-20。
0.1%吐温-20和5% w/v脱脂奶粉。第一抗体稀释液：1×TBS，0.1%吐温-20和5%封闭剂。
Wash Buffer TBS/T：1×TBS，0.1% Tween-20。
[0032] 配胶用Bio-Rad公司的专用配胶槽，用15μl微量注射器或20μl EPPENDORF移液枪加已变性的样品于加样孔中，每加一个，水冲洗针管。先在100V下电泳30min，再稳压150V电泳60min。蛋白转膜，250mA的电流下转移90min，转膜后取膜。转膜后用25ml TBS室温下洗膜5min；用25ml的封闭缓冲液室温下封闭1h；用15ml的Wash Buffer洗3次，每次5min；按相应浓度稀释第一抗体TH抗体（滴度为1:400）或抗β-actin的兔抗溶液（滴度为1:1000），在10ml的一抗稀释缓冲液中，4℃轻摇孵育膜过夜；用15ml的Wash Buffer洗3次，每次5min；加第二抗体（抗兔的HRP相连的IgG；1:1000）于10ml的封闭缓冲液中室温下轻摇孵育膜1h；用15ml的Wash Buffer洗3次，每次5min。配置10ml的ECL显色混合液，加于PVDF膜上，置室温中反应，去除多余液体，用Imagelab图像分析软件计算各样本目的蛋白条带OD值与面积值的乘积，从而进行蛋白条带密度定量。每个样品的免疫印迹蛋白条带与β-actin相比较后，得出一个密度比，再进行统计学分析。
[0033] 统计学分析
[0034] 采用SPSS13.0软件进行统计学处理。数据以均数±标准误差表示，应用团体t检验和单因素方差分析进行统计，以P＜0.05为显著性水平。
[0035] 二、结果
[0036] 1. 不同剂量EPO对大鼠模型旋转次数的影响
[0037] 各组大鼠注射阿朴吗啡后，其平均旋转圈数结果见表1，假手术组大鼠30分钟内平均旋转数为0±2圈/分钟，LID组大鼠30分钟内平均旋转数为19±2圈/分钟，与假手术组相比 P<0.001（*）；2500 U/kg、5000 U/kg EPO组旋转数与LID组比较无明显差异，P>0.05；高剂量EPO组（≥10000 U/kg）旋转数较低，与LID组比较P<0.001（#）。结果表明自然提取的EPO可以降低异动症大鼠的不自主旋转次数，其中，高剂量EPO有十分明显的治疗效果。
[0038] 表1 不同剂量EPO对大鼠模型旋转次数的影响
[0039]
[0040] 2. 免疫组化检测结果
[0041] （1）EPO及EPO-R检测结果
[0042] 假手术组大鼠脑内EPO检测为阴性，注射5000 U/kg EPO的大鼠脑内EPO检测仍为阴性，而注射10000 U/kg EPO后大鼠脑内可检测到较多的EPO阳性神经元。相似的，注射EPO后大鼠脑内神经元上的EPO-R表达出现增多现象，特别是注射了10000 U/kg EPO后，大鼠脑内神经元上的EPO-R大量表达。请参见图1，A：假手术组大鼠脑EPO染色，无阳性；B：5000 U/kg组EPO染色，无阳性；C：10000 U/kg组EPO染色，明显阳性；D：假手术组大鼠黑质EPO-R染色，少数阳性；E：5000 U/kg组EPO-R染色，少数阳性；F：10000 U/kg组黑质EPO-R染色，明显阳性。
[0043] （2）黑质多巴胺能神经元的检测结果
[0044] 与正常SD大鼠相比，LID模型组的毁损侧黑质TH阳性细胞明显减少，而给予EPO保护的LID大鼠可见毁损侧的TH阳性细胞较LID模型组明显增加，可见EPO对黑质多巴胺能神经元具有保护作用，其中EPO剂量为10000 U/kg大鼠。请参见图2，A：假手术组大鼠黑质，毁损侧；B：假手术组大鼠黑质，右侧；C：LID模型大鼠黑质，毁损侧；D：LID模型大鼠黑质，健侧；E：EPO组大鼠黑质，毁损侧；F：EPO组大鼠黑质，健侧。
[0045] （3）黑质多巴胺能神经元计数结果
[0046] 对黑质TH阳性细胞计数，与自身未损伤侧相比得出TH阳性神经元百分比。统计结果请参见图3，图中显示LID组大鼠阳性细胞为19±3％，与假手术组比P<0.01（*），EPO组为86±6％，与LID组比P<0.01（#），其中EPO剂量为10000 U/kg大鼠。
[0047] 检测结果
[0048] 与假手术组相比，LID组及EPO组的黑质损伤侧的TH均明显减少，但在纹状体中，EPO组损伤侧的TH明显增加，提示EPO对纹状体的多巴胺神经元具有保护作用，其中EPO剂量为10000 U/kg大鼠。检测结果请参见图4，L：损伤侧，U：未损伤侧。
[0049] 实施例2 基因重组表达促红细胞生成素治疗PD运动并发症的临床前试验[0050] 实验方法同实施例1，以基因重组表达EPO代替自然提取的EPO皮下注射到LID大鼠，然后检测相应指标。基因重组表达EPO对大鼠模型旋转次数的影响见表2。
[0051] 表2 不同剂量基因重组表达EPO对大鼠模型旋转次数的影响
[0052]
[0053] 从表中可看出，基因重组表达EPO可以降低异动症大鼠的不自主旋转次数，其中，高剂量EPO有十分明显的治疗效果。
[0054] 对各组大鼠进行免疫组化检测和Western blot检测，检测结果与实施例1中的图1至图4结果基本一致，在注射基因重组表达EPO后，大鼠脑内神经元上的EPO-R表达出现增多现象，特别是注射了高剂量基因重组表达EPO后，大鼠脑内神经元上的EPO-R大量表达，可见基因重组表达EPO对黑质和纹状体的多巴胺能神经元具有保护作用。充分说明基因重组表达EPO具有治疗帕金森病运动并发症的功效。
[0055] 实施例3 聚乙二醇修饰的促红细胞生成素治疗PD运动并发症的临床前试验[0056] 实验方法同实施例1，以聚乙二醇修饰的EPO代替自然提取的EPO皮下注射到LID大鼠，然后检测相应指标。聚乙二醇修饰的EPO对大鼠模型旋转次数的影响见表3。
[0057] 表3 不同剂量聚乙二醇修饰的EPO对大鼠模型旋转次数的影响
[0058]
[0059] 从表中可看出，聚乙二醇修饰的EPO可以降低异动症大鼠的不自主旋转次数，其中，高剂量EPO有十分明显的治疗效果。
[0060] 对各组大鼠进行免疫组化检测和Western blot检测，检测结果与实施例1中的图1至图4结果基本一致，在注射聚乙二醇修饰的EPO后，大鼠脑内神经元上的EPO-R表达出现增多现象，特别是注射了高剂量聚乙二醇修饰的EPO后，大鼠脑内神经元上的EPO-R大量表达，可见聚乙二醇修饰的EPO对黑质和纹状体的多巴胺能神经元具有保护作用。充分说明聚乙二醇修饰的EPO具有治疗帕金森病运动并发症的功效。
[0061] 实施例4 糖基化修饰的促红细胞生成素治疗PD运动并发症的临床前试验[0062] 实验方法同实施例1，以糖基化修饰的EPO代替自然提取的EPO皮下注射到LID大鼠，然后检测相应指标。糖基化修饰的EPO对大鼠模型旋转次数的影响见表4。
[0063] 表4 不同剂量糖基化修饰的EPO对大鼠模型旋转次数的影响
[0064]
[0065] 从表中可看出，糖基化修饰的EPO可以降低异动症大鼠的不自主旋转次数，其中，高剂量EPO有十分明显的治疗效果。
[0066] 对各组大鼠进行免疫组化检测和Western blot检测，检测结果与实施例1中的图1至图4结果基本一致，在注射糖基化修饰的EPO后，大鼠脑内神经元上的EPO-R表达出现增多现象，特别是注射了高剂量糖基化修饰的EPO后，大鼠脑内神经元上的EPO-R大量表达，可见糖基化修饰的EPO对黑质和纹状体的多巴胺能神经元具有保护作用。充分说明糖基化修饰的EPO具有治疗帕金森病运动并发症的功效。
[0067] 实施例5 人血清融合的促红细胞生成素治疗PD运动并发症的临床前试验[0068] 实验方法同实施例1，以人血清融合的EPO代替自然提取的EPO皮下注射到LID大鼠，然后检测相应指标。人血清融合的EPO对大鼠模型旋转次数的影响见表5。
[0069] 表5 不同剂量人血清融合的EPO对大鼠模型旋转次数的影响
[0070]
[0071] 从表中可看出，人血清融合的EPO可以降低异动症大鼠的不自主旋转次数，其中，高剂量EPO有十分明显的治疗效果。
[0072] 对各组大鼠进行免疫组化检测和Western blot检测，检测结果与实施例1中的图1至图4结果基本一致，在注射人血清融合的EPO后，大鼠脑内神经元上的EPO-R表达出现增多现象，特别是注射了高剂量人血清融合的EPO后，大鼠脑内神经元上的EPO-R大量表达，可见人血清融合的EPO对黑质和纹状体的多巴胺能神经元具有保护作用。充分说明人血清融合的EPO具有治疗帕金森病运动并发症的功效。
[0073] 本发明促红细胞生成素在制备治疗帕金森病运动并发症药物中的应用，EPO可以降低异动症大鼠的不自主旋转次数，在注射EPO后，大鼠脑内神经元上的EPO-R表达出现增多现象，EPO对黑质多巴胺能神经元具有保护作用，起到了治疗异动症的作用，可以作为PD运动并发症治疗的有效辅助药物。
[0074] 需要说明的是，文献“促红细胞生成素对帕金森病模型的保护作用及其机制的实验研究”（详见：吴艳，华中科技大学2008年博士学位论文）公开了促红细胞生成素对帕金森病有一定治疗作用。应当理解，帕金森病与帕金森病运动并发症不是同一概念，这两种病症的发病原因、发病机制、发病症状不同，药物治疗的作用机制也不同，根据现有技术促红细胞生成素对帕金森病模型有保护作用不能推出促红细胞生成素对帕金森病运动并发症有治疗作用，也就是本发明保护的技术方案促红细胞生成素在制备治疗帕金森病运动并发症药物中的应用是非显而易见的。
[0075] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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