体液和细胞介导的免疫的产生是活化的辅助T细胞与抗原呈递细胞 (“APCs”)和效应T细胞的相互作用的结果。辅助T细胞的活化不仅有赖于 抗原特异性T细胞受体(“TCR”)与其相应肽-MHC配体的相互作用，也需要 多种细胞粘附分子和共刺激分子的协同结合与活化[Salazar-Fontana，2001]。
重要的共刺激分子是CD154(也称为CD40配体，CD40L，gp39，T-BAM， T-细胞活化分子，TRAP)，其为以活化依赖性、瞬时受限的方式于CD4+T细 胞表面表达的II型跨膜蛋白。CD154在活化以后也在CD8+亚组T细胞，嗜 碱性细胞，肥大细胞，嗜酸性细胞，天然杀伤细胞，B细胞，巨噬细胞，树 突细胞和血小板上表达。
CD154对应受体(counter-receptor)CD40是I型膜蛋白，其构成性并广泛 性地在许多细胞类型表面表达，包括APCs[Foy，1996]。
由CD154通过CD40产生的信号启动一系列事件，导致携带CD40受 体的细胞活化以及最佳CD4+T细胞激发。更具体地，CD154和CD40之间 的相互作用促进B细胞分化成分泌抗体的细胞和记忆B细胞[Burkly，2001]。 此外，CD154-CD40相互作用通过巨噬细胞和树突细胞的活化以及自然杀伤 细胞和细胞毒T淋巴细胞的生成促进细胞介导的免疫[Burkly，2001]。
CD154在调节体液和细胞介导的免疫反应中的重要性激发了人们对利 用该途径的抑制剂的治疗性免疫调节作用的兴趣[美国专利5,474,771]。因此， 抗-CD154抗体在多种对其它治疗蛋白或基因治疗，过敏原，自身免疫以及 移植的免疫反应模型中有益[美国专利5,474,771；Burkly，2001]。
CD40-CD154相互作用在多种试验诱导的自身免疫病中重要，诸如胶 原诱导的关节炎，试验性过敏性脑脊膜炎(“EAE”)，卵巢炎，结肠炎，药物诱 导的狼疮肾炎。具体地，所有这些模型中疾病的诱导可通过CD154拮抗剂 在抗原给药时阻断[Burkly，2001]。
利用抗-CD154拮抗剂阻断疾病也在自发自身免疫病动物模型中见到， 包括胰岛素依赖性糖尿病以及狼疮肾炎，以及移植物抗宿主疾病，移植， 肺纤维化以及动脉粥样硬化疾病模型[Burkly，2001]。
尽管糖基化抗-CD154抗体可用于预防和治疗多种免疫反应相关疾病， 一些受试者中，利用它们的治疗有时并发血栓栓塞活性[Biogen Press Release， 2001；IDEC Press Release，2001]。尽管该副作用的机制未知，其可能包括抗 -CD154抗体或其聚集体对血小板上的FcgRIIa和CD154的聚集(colligation)， 导致不适当的血小板活化。与其它Fcγ受体和补体的结合也可强化该效果。 因此，不结合效应器受体的抗-CD154抗体的形式对于治疗用途可能更为安 全和/或更有效。
抗-CD154抗体抑制免疫功能的机制比起简单地与CD154结合以阻断 与CD40的相互作用来更为复杂，实际上包括效应途径的贡献。例如，抗体 -抗原结合可通过Fc结构域与Fcγ受体或补体组分的结合诱导活化的T细胞 的消除。可选，抗体与CD154的结合可通过在携带Fcγ受体的细胞表面形 成抗体支架而增强。此外，抗体与其作用位点的接近可通过Fcγ受体结合相 互作用促进。
在糖基化抗体，包括抗-CD154抗体中，附着于Fc二聚体CH2结构域中 保守N-连接的位点的聚糖包含在CH2结构域之间，使得糖残基与相对的CH2 结构域上的特异性氨基酸残基接触[Jeffries，1998]。体外利用多种糖基化抗 体的体内研究证实去除CH2聚糖改变Fc结构使得与Fc受体以及补体蛋白 C1Q结合的抗体大大减少[Nose，1983；Leatherbarrow，1985；Tao，1989；Lund， 1990；Dorai，1991；Hand，1992；Leader，1991；Pound，1993；Boyd，1995]。体内 研究证实无糖基抗体的效应器功能减少。例如，无糖基抗-CD8抗体不能消 耗小鼠中携带CD8-的细胞[Isaacs，1992]，无糖基抗-CD3抗体不能诱导小鼠 或人中的细胞因子释放[Boyd，1995；Friend，1999]。
尽管去除CH2结构域中的聚糖似乎对效应器功能有明显效果，抗体其 它功能和物理特性不变。具体地，显示聚糖的去除对血清半寿期和抗原结 合几乎没有到没有影响[Nose，1983；Tao，1989；Dorai，1991；Hand，1992； Hobbs，1992]。
发明简述
该发明中，抗-CD154抗体作用的机制中的Fc效应器功能通过利用抗 CD-154抗体来消除，所述抗体中Fc效应器功能通过修饰Fc二聚体CH2结 构域中保守的N-连接的位点来降低，导致“无糖基”抗-CD154抗体。所述 修饰的实例包括Fc二聚体CH2结构域中保守N-连接的位点的突变，去除与 CH2结构域中N-连接位点所连接的聚糖，以及防止糖基化。
为说明抗-CD154抗体的抑制作用的机制是否依赖其Fc效应器相互 作用，比较抗-CD154抗体及其无糖基对应部分通过阻断CD154-CD40相互 作用抑制数种疾病的能力。本文报道的结果证实了抗-CD154抗体的无糖基 形式与抗-CD154抗体的糖基化形式保护作用相当。
由于本发明无糖基抗-CD154抗体特征在于效应器功能降低，这些抗体 尤其可用于存在不需要的血栓栓塞活性可能性的受试者中。此外，无糖基 抗-CD154抗体的降低的Fc效应器功能可降低或消除抗-CD154抗体疗法的 其它可能的副作用，诸如消除活化的T细胞和经诱导表达CD154的其它细 胞群或单核细胞/巨噬细胞的Fc依赖性活化。
具体地，本发明提供识别CD154的无糖基抗-CD154抗体。更具体地， 本发明提供人源化无糖基抗-CD154抗体—即“无糖基hu5c8”，和鼠无糖基 抗-CD154抗体—即“无糖基muMR1”。
本发明的一个实施方案中，无糖基hu5c8抗体自NS0无糖基hu5c8细 胞系制备，该细胞系于2003年1月14日保藏在美国典型培养物保藏中心 (“ATCC”)，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia(保藏号PTA-4931)，无 糖基MR1抗体自NSO无糖基鼠MR1细胞系制备，该细胞系于2003年1 月14日保藏在ATCC(保藏号PTA-4934)。
本发明一个实施方案中，无糖基抗-CD154抗体能够抑制CD154和 CD40之间的相互作用。
本发明另一实施方案中，无糖基抗-CD154抗体能以直接或间接阻断携 带CD40的细胞的活化的方式与CD154结合。
本发明还提供了抑制受试者中免疫反应的方法，包括给药受试者无糖 基抗-CD154抗体或其抗体衍生物，其中所述抗体或抗体衍生物以有效抑制 受试者中的免疫细胞的活化的量给药。
本发明还提供治疗或预防受试者中的免疫反应依赖性疾病或病症的方 法，包括给予所述受试者无糖基抗-CD154抗体或其抗体衍生物，所述抗体 或抗体衍生物以有效抑制受试者中免疫细胞的活化的量给药，由此治疗或 预防所述免疫反应依赖性疾病或病症。
附图简述
图1显示无糖基hu5c8单克隆抗体(“mAb”)和糖基化hu5c8mAb以相同 的相对亲和力结合人CD154。生物素化的hu5c8mAb与细胞表面CD154的 结合与未标记的糖基化hu5c8mAb或无糖基hu5c8mAb的被滴度物 (titrations)竞争。利用链霉抗生物素-PE检测的生物素化抗体的平均荧光强 度相对于未标记抗体浓度作图。四参数曲线拟合绘制在一起。
图2显示无糖基hu5c8mAb具有受损的FcR结合能力。评估抗-CD154 抗体，即无糖基hu5c8mAb，在huCD154和FcγRI+细胞(a)或huCD154+ CHO细胞与FcγRIII+细胞(b)之间形成桥的能力。荧光标记的FcγR+细胞加 入微量滴定板，其中含有糖基化hu5c8mAb或无糖基hu5c8mAb，它们与 CD154预结合。结合的FcγR+细胞通过利用激发/发射光谱485/530nm测定 每个孔中的相对荧光单位(“RFU”)来检测。
图3显示糖基化hu5c8mAb和无糖基hu5c8mAb在猕猴中的血清半寿 期相同。糖基化hu5c8mAb和无糖基hu5c8mAb在猕猴血清中的浓度在给 予单个20mg/kg静脉内剂量后测定。每个治疗组的平均血清浓度描述为±标 准偏差(“SD”)。
图4显示糖基化hu5c8mAb和无糖基hu5c8mAb抑制对破伤风类毒素 (“TT”)的初始免疫反应。描绘了在糖基化hu5c8mAb研究(实心标记)和无 糖基hu5c8mAb研究(空心标记)中，猕猴的mAb处理组和盐水对照组的结 果。
图5显示无糖基hu5c8mAb抑制对TT的后继免疫反应。描绘了个体 猕猴对TT的初始(实心标记)和后继(空心标记)总体抗体反应(EAUC)。 1A组动物在初始和后继TT攻击之前接受盐水。1B组动物在初始TT攻击 之前接受盐水，在后继TT攻击之前接受无糖基hu5c8mAb攻击。
图6显示BALB/c小鼠中糖基化鼠嵌合MR1(“muMR1”)和无糖基 muMR1抗体的药物动力学。描绘了糖基化muMR1抗体(菱形符号)和无糖 基muMR1抗体(正方形符号)的结果。
图7(A&B)显示SNF1小鼠中，无糖基抗-CD154抗体降低对单链(A) 和双链(B)DNA的自身抗体反应。描绘了muMR1抗体(菱形符号)和无糖基 muMR1抗体(正方形符号)的结果。对照muIgG2a抗体显示为三角形符号。
图8显示无糖基抗-CD154抗体降低SNF1小鼠中肾小球肾炎的发展。 描绘muIgG2a(对照)，muMR1和无糖基muMR1处理的小鼠的混合组织学 得分。
图9显示无糖基抗-CD154抗体延缓SNF1小鼠中肾小球肾炎的出现。 显示muMR1抗体(菱形符号)和无糖基muMR1抗体(正方形符号)的结果。 对照muIgG2a抗体显示为三角形符号。
图10显示无糖基抗-CD154抗体防止SNF1小鼠中血清肌酸酐的增加。 显示muMR1抗体(菱形符号)和无糖基muMR1抗体(正方形符号)的结果。 对照muIgG2a抗体显示为三角形符号。
图11显示无糖基抗-CD154抗体延缓SNF1小鼠中增加的血尿素氮 (“BUN”)水平的出现。显示muMR1抗体(菱形符号)和无糖基muMR1抗体 (正方形符号)的结果。对照muIgG2a抗体显示为三角形符号。
图12显示于用同种型对照P1.17抗体处理的小鼠相比，用muMR1抗 体处理的抗体不出现试验性自身免疫脑脊膜炎(“EAE”)症状。描绘了muMR1 抗体(空心圆)和P1.17对照抗体(实心圆)的结果。
图13显示用无糖基muMR1抗体处理的小鼠中，无糖基muMR1抗体 对于抑制EAE临床表现的有效性与muMR1抗体相同。结果表示为相对于 疾病诱导后天数的残疾得分(平均值+平均值标准误-“SEM”)和％初始重 量(平均值+SEM)。P1.17是对照Ig。
图14描绘了同种异体的胰岛移植后恒河猴中的空腹血葡萄糖(“FBG”) 水平。急性排异定义为FBG＞100mg/dl。显示了无糖基hu5c8mAb(虚线)和 糖基化hu5c8mAb(实线)处理的动物。
发明详述
为了本发明的描述能够被更充分理解，给出以下详述。除非另有定义， 所用所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员理解的含义一样。以 下描述示例性方法和材料，但是类似本文所述方法和材料的那些也可用于 本发明实践并且对于本领域技术人员而言是明显的。
本申请中的各种公开出版物和参考都包含在方括号中。这些公开出版 物和参考的公开内容的全部内容都包含在本申请中作为参考，以更充分描 述本发明所述领域的状态。这些参考文件的书目提要条文可见于正文中或 在试验详述部分后以带编号的内容列出。如有冲突，以说明书为准。所述 材料，方法和实施例仅仅为了举例而不是限制。
说明本领域熟练技术人员已知重组DNA技术的标准参考文献包括 Ausubel et al.， Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley & Sons， New York(1998 and Supplements to 2001)；Sambrook et al.， Molecular Cloning： A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview， New York(1989)；Kaufman et al.，Eds.， Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine，CRC Press，Boca Raton(1995)；McPherson， Ed.， Directed Mutagenesis：A Practical Approach，IRL Press，Oxford(1991)。
说明本领域熟练技术人员已知的免疫学常规原则的标准参考文献包括： Harlow and Lane，Antibodies ：A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1999)；and Roitt et al.， Immunology，3d Ed.，Mosby-Year Book Europe Limited，London(1993). Standard reference works setting forth the general principles of medical physiology and pharmacology known to those of skill in the art include：Fauci et al.，Eds.， Harrison’s Principles Of Internal Medicine，14th EdMcGraw-Hill Compames，Inc.(1998)。
本发明试剂和方法涉及利用无糖基抗体或其抗体衍生物来抑制免疫反 应和治疗免疫反应诱导的疾病和病症-例如：自身免疫病，过敏，移植排斥， 炎症，移植物抗宿主疾病，纤维化，和动脉粥样硬化。
更具体地，用于治疗具体是人类治疗的无糖基抗-CD154抗体，包括人 抗体，人源化抗体，嵌合抗体，多克隆抗体和多聚体抗体。
抗体
抗体是大约MW 150kD的糖蛋白，其通过脊椎动物免疫系统的体液分 支应答于体内外来分子的存在而产生。功能抗体或抗体衍生物能够在体外 和体内识别并结合其特异性抗原，并启动任何与抗体结合相关的后继作用， 包括例如，直接细胞毒，补体依赖的细胞毒(“CDC”)，抗体依赖的细胞毒 (“ADCC”)，和抗体生成。
一旦与抗原结合，抗体活化免疫系统的许多效应器系统中的一或多种， 导致感染生物体和其它含有抗原的实体(例如癌细胞)的中和、破坏和消 除。
尽管天然存在抗体来自单个物种，经改造的抗体和抗体片段可来自一 种以上物种的动物，-例如，嵌合抗体。目前，小鼠(鼠)/人嵌合和鼠/非-人 灵长类抗体已经产生，但其它物种的组合也是可能的。
一个实施方案中，本发明无糖基抗-CD154抗体是嵌合抗体。通常嵌合 抗体包括重链和/或轻链可变区，包括与另一物种(通常为人)的恒定区融合 的一个物种(通常为小鼠)的互补决定区(“CDR”)和框架残基。这些嵌合小鼠/ 人抗体含有分别大约75％的人氨基酸序列和25％的小鼠氨基酸序列。人序 列代表抗体恒定区，小鼠序列代表抗体可变区(并由此含有抗原结合位点)。
利用这种嵌合体的基本原理是保持小鼠抗体的抗原特异性但降低小鼠 抗体的免疫原性(小鼠抗体将在除小鼠以外的物种中导致针对它的免疫反 应)，并由此能够在人治疗中利用所述嵌合体。
另一具体实施方案中，本发明无糖基抗-CD154抗体包括嵌合抗体，其 含有来自一种抗体的框架区和来自另一种抗体的CDR区。
另一更为具体实施方案中，本发明的无糖基抗-CD154抗体包括嵌合抗 体，其含有来自不同人抗体的CDR区。
另一具体实施方案中，本发明的无糖基抗-CD154抗体包括嵌合抗体， 其含有来自至少两种不同人抗体的CDR区。
制备上述所有嵌合抗体的方法是本领域技术人员已知的[美国专利 5,807,715；Morrison，1984；Sharon，1984；Takeda，1985]。
本发明另一实施方案中，无糖基抗-CD154抗体还包括灵长源化的，人 源化的和完全的人抗体。灵长源化的和人源化的抗体通常包括来自移植到 非人灵长类或人抗体V区框架中的鼠抗体重和/或轻链CDR，通常还包括人 恒定区[Riechmann，1988；Co，1991；United States patents 6,054,297；5,821,337； 5,770,196；5,766,886；5,821,123；5,869,619；6,180,377；6,013,256；5,693,761； 和6,180,370]。
1.人源化的抗体
人源化的抗体是通过重组DNA技术制备的抗体，其中结合抗原不需 要的人免疫球蛋白轻链或重链(例如可变区的恒定区和框架区)的一些或全 部氨基酸用于取代来自同源非人抗体的轻链或重链的相应氨基酸。例如， 给定抗原的鼠抗体的人源化版本的重链和轻链上都具有(1)人抗体恒定区； (2)人抗体可变区的框架区；和(3)鼠抗体CDR。必要时，人框架区中的一 或多个残基可被改变成鼠抗体中相应位置的残基，以保持人源化抗体与抗 原的结合亲和力。该改变有时称为“回复突变”。人源化抗体与嵌合人抗体相 比，通常较不可能激发人中的免疫反应，因为前者含有少得多的非人组分。 制备人源化抗体的方法是抗体领域技术人员已知的[欧洲专利239400；Jones， 1986；Riechmann，1988；Verhoeyen，1988；Queen，1989；Orlandi，1989；美国专 利6,180,370]。
本发明一个实施方案中，人源化的抗体通过将鼠(和其它非-人)CDR移 植到人抗体上产生。更具体地，可如下进行：(1)编码重链和轻链可变区的 cDNA分离自杂交瘤；(2)可变区DNA序列包括CDR通过测序确定；(3)编 码CDR的DNA通过定点诱变转移到人抗体重链和轻链可变区相应区域； 和(4)加入所需同种型(例如，CH同种型1，CL同种型k)的人恒定区基因片 段。最后，人源化重链和轻链基因在哺乳动物宿主细胞(例如，CHO或NSO 细胞)中共表达以产生可溶性人源化抗体。
有时，将CDR直接转移到人框架导致所得抗体丧失抗原结合亲和力。 这是由于在一些同源抗体中，特定的框架区内氨基酸残基与CDR反应由此 影响抗体的总体抗原结合亲和力。在所述情况中，将“回复突变”引入受体抗 体框架区中是重要的，以便保持同源抗体的抗原结合活性。制备回复突变 的常用方法是本领域技术人员已知的[Queen，1989；Co，1991；PCT patent application WO 90/07861；Tempest，1991]。
2.人抗体
本发明一个实施方案中，抗体和抗体衍生物是完全的人无糖基抗 -CD154抗体。
本发明更为具体的实施方案中，完全人抗体利用体外激发的人脾细胞 [Boerner，1991]和噬菌体展示的抗体文库[美国专利6,300,064]制备。
本发明更为具体的实施方案中，完全人抗体通过库克隆(repertoire cloning)[Persson，1991；Huang and Stollar，1991]制备。此外，美国专利 5,798,230描述了从人B细胞制备人单克隆抗体，其中产生人抗体的B细胞 通过用表达EB病毒核抗原2(“EBNA2”)的EB病毒或其衍生物感染来永生 化，所述EBNA2是永生化所需的蛋白。EBNA2的功能随后被关闭，导致 抗体生成增加。
制备完全人抗体的其它方法包括利用非人动物，其内源Ig位点已经失 活，并且对于未经重排的人抗体重链和轻链基因而言是转基因的。所述转 基因动物可用活化的T细胞或D1.1蛋白[美国专利5,474,771；美国专利 6,331,433；美国专利6455,044]免疫，杂交瘤可从来自所述转基因动物的B 细胞生成。这些方法的细节在本领域中描述。见，例如各种与含有人Ig微 基因座(miniloci)的转基因小鼠的GenPharm/Medarex(Palo Alto，CA)公开出 版物/专利，包括美国专利5,789,650；与XENOMOUSE小鼠有关的各种 Abgenix(Fremont，CA)公开出版物/专利，包括美国专利6,075,181，6,150,584 和6,162,963；Green，1997；Mendez，1997；以及各种关于“transomic”小鼠的 Kirin(Japan)公开出版物/专利，包括欧洲专利843961和Tomizuka，1997。
去糖基化抗体的生成
目前存在两种途径降低mAb的效应器功能同时保持其Fc部分的其它 有价值的性质。一种修饰抗体的方法是突变mAb表面参与效应结合相互作 用的氨基酸[欧洲专利239400；Jefferies，1998]。而很可能突变的一些组合将 导致效应器功能的适当降低，经过检测的表面突变体抗体目前显示保持残 基活性。该方法的其它问题是mAb表面的氨基酸改变可激发免疫原性。
本发明涉及效应器功能降低的无糖基抗-CD154抗体或抗体衍生物，其 特征在于位于所述抗体Fc部分的CH2结构域中保守N-连接的位点的修饰。
本发明一个实施方案中，所述修饰包括位于重链糖基化位点的突变以 防止该位点的糖基化。因此，本发明一个优选实施方案中，无糖基抗-CD154 抗体或抗体衍生物通过突变重链糖基化位点，-即，突变N298Q(N297利用 Kabat EU编号)并在适当宿主细胞中表达制备。例如，该突变可根据生产商 推荐用于Amersham-Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ，USA)的定点诱变试 剂盒的方案实现。所述突变的抗体可在宿主细胞(例如NSO或CHO细胞) 中稳定表达然后纯化。作为一个实例，纯化可利用蛋白A和凝胶过滤层析 进行。本领域技术人员清楚其它表达和纯化方法也可使用。
本发明另一实施方案中，无糖基抗-CD154抗体或抗体衍生物具有降低 的效应器功能，其中位于所述抗体或抗体衍生物的Fc部分的CH2结构域中 的保守N-连接的位点的修饰包括去除CH2区聚糖，-即，去糖基化。这些无 糖基抗-CD154抗体可通过常规方法产生然后酶促去糖基化。抗体的酶促去 糖基化的方法是本领域技术人员已知的[Williams，1973；Winkelhake & Nicolson，1976]。
本发明另一实施方案中，去糖基化可通过利用糖基化抑制物衣霉素 (tunicamycin)[Nose & Wigzell，1983]实现。即所述修饰是防止在所述抗体Fc 部分CH2结构域中的保守N-连接的位点的糖基化。
本发明的其它实施方案中，重组CD154多肽(或含有所述多肽的细胞 或细胞膜)可用作抗原以产生抗-CD154抗体或抗体衍生物，其随后被去糖基 化。所述抗原可与佐剂混合或连接于半抗原以增加抗体生成。
无论本发明的无糖基抗体或抗体衍生物的修饰是否通过上述的定点诱 变和酶促去糖基化法制备，抗体生成的基础是本领域技术人员已知的。例 如，免疫非人哺乳动物的方案在本领域已经确定[Harlow，1998；Coligan， 2001；Zola，2000]。
免疫后，本发明的抗体或抗体衍生物可利用任何常规技术制备。见，例 如，Howard，2000；Harlow，1998；Davis，1995；Delves，1997；Kenney，1997。
本发明一些实施方案中，宿主细胞可以是，例如，(1)细菌细胞，诸如大 肠杆菌，新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)，链霉菌种(Streptomyces species)， 和鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)；(2)酵母细胞，诸如酿酒酵母， 粟酒裂殖酵母，巴氏毕赤酵母，甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)；(3)昆虫 细胞系，诸如来自秋粘虫(Spodoptera frugiperda)的那些—例如，Sf9和Sf21 细胞系，和expresSFTM细胞(Protein Sciences Corp.，Meriden，CT，USA)—果 蝇S2细胞，和Hihg FiveCells(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中的拟尺蠖 (Trichoplusia)；或(4)哺乳动物细胞。常见哺乳动物细胞包括COS1和COS7 细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NSO骨髓瘤细胞，NIH 3T3细胞，293细胞， HEPG2细胞，HeLa细胞，L细胞，HeLa，MDCK，HEK293，WI38，鼠ES细胞系 (例如，来自菌株129/SV，C57/BL6，DBA-1，129/SVJ)，K562，Jurkat细胞，和 BW5147。其它有用的哺乳动物细胞系是已知的并可轻易购自美国典型培养 物保藏中心(“ATCC”)(Manassas，VA，USA)和Coriell Cell Repositories(Camden，NJ，USA)的国立普通医学研究院(National Institute of General Medical Sciences)(NIGMS)人遗传细胞库。这些细胞类型仅仅为代 表性的不是穷尽性地列出。
本发明另一实施方案中，无糖基抗-CD154抗体或抗体衍生物通过无细 胞翻译制备。
本发明另一实施方案中，无糖基抗-CD154抗体或抗体衍生物在含有表 达抗体的细胞的生物反应器中产生，以促进大规模生产。
本发明另一实施方案中，无糖基抗-CD154抗体或抗体衍生物于在乳汁 中表达抗体的转基因哺乳动物(例如，山羊，母牛，和绵羊)中产生，以促进无 糖基抗-CD154抗体的大规模产生[美国专利5,827,690；Pollock，1999]。
如上所述，本发明的无糖基抗-CD154抗体或抗体衍生物可在原核和真 核细胞中制备。本发明由此也提供表达本发明抗体的细胞，包括杂交瘤细 胞，B细胞，浆细胞，以及重组修饰以表达本发明抗体的宿主细胞。
除了其它考虑(其中一些在上文描述)，可根据宿主细胞株以所需方式加 工表达的CD154蛋白的能力来选择宿主细胞。除了无糖基化，所述多肽的 翻译后修饰包括但不限于，乙酰化，羧化，磷酸化，脂化(lipidation)，和 酰化，本发明一方面提供具有一或多种这些翻译后修饰的无糖基抗-CD154 抗体或抗体衍生物。
抗体修饰
给药时，抗体通常从循环中快速清除，并由此表现出相对较短的药物活 性。因此，需要频繁注入相对大量的抗体以维持抗体治疗的有效性。
本发明一个实施方案中，无糖基抗-CD154抗体或抗体衍生物可被修饰 (即，与其它部分连接)以增加抗体的完整性并延长其体内寿命。例如，本发 明无糖基抗-CD154抗体或抗体衍生物可被修饰以包括可增加稳定性的部 分，从而延长抗体血清半寿期。
本发明一些实施方案中，无糖基抗-CD154抗体通过与水溶性聚合物诸 如聚乙二醇，聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚 乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮基或聚脯氨酸共价连接而被修饰—所有这些经修 饰的蛋白与相应未经修饰的蛋白相比，在静脉内注射以后，在血液中显示 实质上更长的半寿期[Abuchowski，1981；Anderson，1992；Newmark，1982； Katre，1987]。
抗体修饰也可增加蛋白在水溶液中的溶解性，消除聚集，增加蛋白的 物理和化学稳定性，大大降低蛋白的免疫原性和抗原性。结果，所需体内 生物活性可通过与未经修饰的蛋白相比，以较低频率或以较低剂量给药所 述聚合物-蛋白质加成物来实现。
本发明一些实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体通过用检测标记物 来标记得到修饰，该标记物例如，放射活性同位素，酶，染料或生物素。
本发明一些实施方案中，无糖基抗-CD154抗体或抗体衍生物通过偶联 于治疗剂得到修饰，该治疗剂例如，放射同位素或放射性核素(例如，111In 或90Y)，毒素部分(例如，破伤风类毒素或蓖麻蛋白)，类毒素或化疗剂[美国 专利6,307,026]。
本发明一些实施方案中，无糖基抗-CD154抗体或抗体衍生物通过与显 像剂偶联得到修饰。显像剂可包括例如标记性部分(例如，生物素，荧光部分， 放射活性部分，组氨酸标记或其它肽标记)用于易化分离或检测。
抗体衍生物
本发明还涉及无糖基抗-CD154抗体衍生物。所有这些上述关于无糖基 抗-CD154抗体的方法和药剂都用于可制备本发明的无糖基抗-CD154抗体 衍生物。
本发明一些实施方案中，无糖基抗-CD154抗体衍生物包括异聚体抗体 复合体和抗体融合物，诸如双特异性抗体，半二聚体(hemidimeric)抗体，多 价抗体(即，四价抗体)和单链抗体。半二聚体抗体由Fc部分和一个Fab部分 组成。单链抗体由单个蛋白链中的蛋白间隔物连接的可变区组成。
本发明一些实施方案中，本发明的无糖基抗-CD154抗体衍生物还包括 含有一或多个免疫球蛋白轻链和/或重链的蛋白质，诸如这些链的单体和同 源或异源多聚体(例如二聚体和三聚体)，其中这些链可选由二硫键键合 或者是交联的。这些抗体衍生物能够与一或多种抗原结合。
根据另一实施方案，本发明包括完整抗体的无糖基化抗原结合片段， 诸如Fab，Fab’，F(ab’)2和F(v)抗体片段。另一实施方案中，本发明包括完 整抗体的抗原结合片段，诸如Fab，Fab’，F(ab’)2和F(v)抗体片段。
细胞系
本发明还提供了产生本文公开的无糖基抗-CD154抗体的细胞系。一种 这样的细胞系，其产生无糖基hu5c8抗体，于2003年1月14日根据国际 认可的用于专利程序的布达佩斯条约的规定保藏于ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia，20110-2209，U.S.A.，ATCC保藏号PTA-4931。第二 种这样的细胞系，其产生嵌合型鼠无糖基mu5c8抗体，于2003年1月14 日根据国际认可的用于专利程序的布达佩斯条约的规定保藏于ATCC， 10801 University Blvd.，Manassas，Virginia，20110-2209，U.S.A.，ATCC保藏号 PTA-4934。
治疗方法
本发明一个实施方案中，无糖基抗-CD154抗体或其抗体衍生物或包含 所述抗体或抗体衍生物的药物组合物，能够抑制受试者中的免疫反应。所 述抗体，抗体衍生物或药物组合物以有效抑制量给予受试者。
抗体，抗体衍生物或药物组合物的“有效抑制量”是有效抑制其给予的受 试者中的CD154-CD40相互作用的任何量。测定“抑制量”的方法是本领域技 术人员已知的并有赖于以下因素，包括但不限于：所涉及的受试者类型， 受试者大小，所递送的治疗剂。
本发明具体实施方案中，无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含有所 述抗体或抗体衍生物的药物组合物能与CD154蛋白分子结合。
本发明具体实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含有 所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能与CD154蛋白结合，后者与ATCC 细胞系PTA-4931产生的无糖基hu5c8特异性结合。
本发明具体实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能与CD154表位结合，所述表位与 ATCC细胞系PTA-4931产生的无糖基hu5c8特异性结合，其中所述无糖基 抗-CD154抗体或抗体衍生物的特征在于N298Q的突变(利用EU Kabat编号 为N297)。
本发明具体实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物不与效应器受体结合。本发明另一 更为具体实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含有所述 抗体或抗体衍生物的药物组合物能与CD154蛋白结合，后者与ATCC细胞 系PTA-4931产生的无糖基hu5c8特异性结合，且其中所述无糖基抗-CD154 抗体或抗体衍生物或药物组合物不与效应器受体结合。
本发明具体实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物不导致血栓形成。本发明另一更为 具体实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含有所述抗体 或抗体衍生物的药物组合物能与CD154蛋白结合，后者与ATCC细胞系 PTA-4931产生的无糖基hu5c8特异性结合，且其中所述无糖基抗-CD154 抗体或抗体衍生物或药物组合物不导致血栓形成。
本发明另一具体实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物 或含有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能通过抑制CD154-CD40相互 作用抑制免疫反应。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能抑制炎症。为本发明的目的，炎 性反应的特征在于红、肿、热和痛，作为毛细血管扩张以及水肿和吞噬性 白细胞迁移的后果。炎性反应的一些实例包括：关节炎，接触性皮炎，超-IgE 综合征，炎性肠病，过敏性哮喘，和特发性炎性反应[Gallin，1989]。关节炎的 一些实例包括：类风湿性关节炎，非类风湿性炎性关节炎，与莱姆病相关 的关节炎和炎性骨关节炎。特发性炎性疾病的一些实例包括：银屑病和系 统性红斑狼疮。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能抑制器官移植受体的排斥作用。
本发明另一更为具体实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍 生物或含有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能够抑制心脏、肾、肝、 皮肤、胰岛细胞和骨髓的受体的排斥作用。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能抑制受体中的移植物抗宿主疾 病。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能抑制受试者中的过敏反应-例如， 干草热或对青霉素或其它药物的过敏。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能抑制患有自身免疫病的受试者中 的自身免疫反应。自身免疫病的实例包括，但不限于，类风湿性关节炎， 重症肌无力，系统性红斑狼疮，Graves病，特发性血小板减少性紫癜，溶血 性贫血，糖尿病，炎性肠病，克隆氏病，多发性硬化，银屑病和药物诱导 的自身免疫病，-例如，药物诱导的狼疮。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能抑制患有来自感染性疾病的自身 免疫反应的受试者中的自身免疫反应。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能抑制患有来自Reiter综合征，脊柱 关节炎，莱姆病，HIV感染，梅毒或结核病的自身免疫反应的受试者中的 自身免疫反应。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能抑制受试者中的纤维化。
纤维化的一些实例包括：肺纤维化或纤维变性疾病。肺纤维化的一些 实例包括：继发于成人呼吸窘迫综合征的肺纤维化，药物诱导的肺纤维化， 特发性肺纤维化，或过敏性肺炎(hypersensitivity pneumonitis)。纤维变性疾 病的一些实例包括：丙型肝炎；乙型肝炎；肝硬化；继发于毒素伤害的肝 硬化；继发于药物的肝硬化；继发于病毒感染的肝硬化；以及继发于自身 免疫病的肝硬化。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能抑制胃肠疾病。胃肠疾病的一些 实例包括：食管运动障碍，炎性肠病和硬皮病。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能抑制血管疾病。血管疾病的一些 实例包括：动脉粥样硬化或再灌注损伤。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能抑制T细胞癌症(例如T细胞白 血病或淋巴瘤)患者中的T细胞肿瘤细胞的增殖。所述无糖基抗-CD154抗 体或抗体衍生物或药物组合物可以以有效抑制受试者中T细胞肿瘤细胞增 殖的量给药受试者。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能抑制HTLVI病毒对受试者T细胞 的病毒感染。所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或药物组合物可以以 有效抑制病毒感染的量给予受试者。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能显像受试者中的肿瘤细胞或赘生 细胞，其表达ATCC细胞系PTA-4931产生的无糖基hu5c8特异性识别的蛋 白。显像受试者中的肿瘤细胞或赘生细胞的方法包括以下步骤：在允许抗 体或抗体衍生物与肿瘤细胞或赘生细胞表面的蛋白形成复合体的条件下， 给予受试者有效量的无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物，或药物组合物； 显像任何形成的抗体/蛋白复合体或抗体衍生物/复合体，由此显像受试者中 的任何肿瘤细胞或赘生细胞。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物或含 有所述抗体或抗体衍生物的药物组合物能检测受试者中的肿瘤细胞或赘生 物细胞的存在，其表达ATCC细胞系PTA-4931产生的无糖基hu5c8特异性 识别的蛋白。检测受试者中的肿瘤细胞或赘生物细胞存在的方法包括以下 步骤：在允许抗体或抗体衍生物与蛋白形成复合体的条件下，给予受试者 有效量的无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物，或药物组合物；从受试者清 除任何未结合的显像剂；和检测形成的抗体/蛋白复合体或抗体衍生物/复合 体，所述复合物的存在表明受试者中肿瘤细胞和赘生物细胞的存在。
药物组合物
本发明提供药物组合物，其包括本文所述无糖基抗-CD154抗体或抗体 衍生物。
本发明一个实施方案中，所述药物组合物包括一或多种无糖基抗 -CD154抗体或抗体衍生物。
本发明另一实施方案中，所述药物组合物还包括可药用载体，佐剂，递 送载体，缓冲液或稳定剂。
本发明更为具体的实施方案中，所述可药用载体是磷酸盐缓冲的盐水， 生理盐水，水，柠檬酸盐/蔗糖/Tween配制剂和乳剂-例如，油/水乳剂。
本发明一个实施方案中，所述药物组合物可在微被囊装置中递送从而 降低和防止对蛋白的宿主免疫反应。所述抗体或抗体衍生物也可以在膜诸 如脂质体中微被囊化的形式来递送。
本发明一个实施方案中，所述药物组合物可以为无菌注射制备物的形 式，例如无菌可注射水性或油性悬液。该悬液可根据本领域已知技术利用 适宜的分散剂，湿润剂和悬浮剂来配制。
本发明一个实施方案中，所述药物组合物可口服，局部或静脉内递送。
本发明另一更为具体实施方案中，对于口服给药，所述药物组合物配制 在适宜的胶囊，片剂，含水悬液或溶液中。所述组合物的口服给药用固体 制剂可含有适宜载体或赋形剂，诸如玉米淀粉，凝胶，乳糖，阿拉伯树胶， 蔗糖，微晶纤维素，高岭土，甘露醇，磷酸二钙，氯化钠，或褐藻酸。可 使用的崩解剂包括，但不限于，微晶纤维素，玉米淀粉，羟基乙酸淀粉钠， 和褐藻酸。可使用的片剂粘合剂包括阿拉伯树胶，甲基纤维素，羧甲基纤 维素钠，聚乙烯吡咯烷酮(PovidoneTM)，羟丙基甲基纤维素，蔗糖，淀粉和乙 基纤维素。可使用的润滑剂包括硬脂酸镁，硬脂酸，硅酮流体，滑石，石 蜡，油，和硅胶。
本发明另一更为具体实施方案中，对于局部应用，所述药物组合物可配 制在适宜的软膏中。局部应用的组合物制剂的一些实例包括：滴剂，酊剂， 洗剂，乳膏，溶液和软膏，其中含有活性组分以及各种支持剂和载体。
本发明一个实施方案中，局部半固体软膏制剂通常包括在载体中的浓 度约1-20％，-例如，5-10％的活性成份，所述载体诸如药物乳膏基质。
本发明一个实施方案中，吸入药物组合物和透皮药物组合物也可轻易 制备。
本发明一个实施方案中，在水或其它含水载体中制备的口服给药的药 物组合物的液体制剂可含有多种悬浮剂，诸如甲基纤维素，藻酸盐，黄芪 胶，果胶，kelgin，角叉菜胶(carrageenan)，阿拉伯树胶，聚乙烯吡咯烷酮， 和聚乙二醇。本发明药物组合物的液体制剂也可包括溶液，乳剂，糖浆或 酏剂，其含有与活性化合物一起的湿润剂，甜味剂，和着色剂以及调味剂。 所述药物组合物的各种液体和粉末制剂可通过吸入待治疗哺乳动物的肺中 的常规方法来制备。
本发明一个实施方案中，注射用药物组合物的液体制剂可包含各种载 体，诸如植物油，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，乳酸乙酯，碳酸乙酯， 豆蔻酸异丙酯，乙醇，多元醇-即甘油，丙二醇，液体聚乙二醇，等。一 些实施方案中，所述组合物包括柠檬酸盐/蔗糖/tween载体。对于静脉内注 射，组合物的水溶性版本可通过滴注方法给药，由此含有抗真菌剂和生理 可接受的制剂的药物制剂被输注。生理可接受的赋形剂可包括，例如5％葡 萄糖，0.9％盐水，林格溶液和其它适宜赋形剂。所述组合物的适宜不溶性形 式可作为含水基质或可药用油基质中的悬液配制并给药，所述基质诸如长 链脂肪酸的酯-例如油酸乙酯。
本发明一个实施方案中，所述药物组合物包括在可药用载体中的约0.1 -90％重量(诸如1-20％或1-10％)的无糖基抗-CD154抗体或其抗体衍生 物。
本发明一个实施方案中，每种药物组合物中抗体或抗体衍生物的最佳 百分比根据制剂本身以及具体病变和相关治疗方案中的所需治疗效果而不 同。药物制剂在本领域已经完全确定[Gennaro，2000；Ansel，1999；Kibbe， 2000]。医学领域熟练技术人员已知的常规方法可用于将所述药物组合物给 予受试者。
本发明一些实施方案中，所述药物组合物还包括免疫抑制性或免疫调 节性化合物。例如，所述免疫抑制性或免疫调节性化合物可为以下物质之 一：通过CD28中断T细胞共刺激信号的药剂；中断钙调磷酸酶信号的药 剂，皮质类固醇，抗增生药剂，与在免疫细胞表面上表达的蛋白质特异性 结合的抗体，所述免疫细胞包括但不限于CD45，CD2，IL2R，CD4，CD8和 RANK FcR，B7，CTLA4，TNF，LTγ，以及VLA-4。
本发明一些实施方案中，所述免疫抑制性和免疫调节性化合物是他克 莫司(tacrolimus)，西罗莫司(sirolimus)，霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)， mizorubine，脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)，布喹那钠(brequinar sodium)， 来氟米特(leflunomide)，雷怕霉素(rapamycin)或azaspirane。
本发明的其它实施方案中，抗体，抗体衍生物或包含它们的药物组合物 可单独包含在容器，包装或分配器中或作为试剂盒的一部分，所述试剂盒 具有标签和给药说明。
给药和递送途径
无糖基抗-CD154抗体或其抗体衍生物以及本发明的药物组合物可以 以任何医学接受的方式给予受试者。为本发明的目的，“给药”指本领域技术 人员已知的给药抗体，抗体衍生物和药物组合物的任何标准方法，并且不 应限于本发明提供的实施例。
本发明一些实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物和药 物组合物可通过使用标准方法经静脉内、皮下、腹膜内、肌内、髓内、脑 室内、经硬膜外内、动脉内、血管内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、 肝内、脊髓内、肿瘤内、脑内、肠内、肺内、粘膜内、子宫内、舌下、或 在炎症位点或肿瘤生长位点进行局部注射来给药。
本发明一些实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物和药 物组合物可通过包括口服，经鼻，经眼，经直肠或局部的途径来给予受试 者。
另一更为具体实施方案中，本发明所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍 生物和药物组合物可以以胶囊、片剂、含水悬液或溶液的形式经口服给药 受试者。
另一更为具体实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物和 药物组合物可通过应用乳膏、软膏等经局部给药受试者。
本发明的其它实施方案中，本发明所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍 生物和药物组合物可通过利用雾化器，干粉吸入器或定量吸入器来吸入而 给药。
本发明其它实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物和药 物组合物可通过以下方式来给予受试者：持续释放给药，诸如在手术过程 中直接应用的可降解植入物的储器式注射，或将输注泵或生物相容性持续 释放植入物植入受试者中。
另一更为具体实施方案中，本发明所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍 生物和药物组合物可通过可注射储器的给药途径(injectable depot route)给 药，诸如利用1，3，或6个月的储器式可注射或可生物降解物质和方法。
另一更为具体实施方案中，本发明所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍 生物和药物组合物可通过将含有抗体，抗体衍生物和药物组合物的透皮贴剂 给予受试者皮肤来给药受试者，并使得所述贴剂与受试者皮肤接触，通常 每贴1-5小时。
本发明的其它实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物和 药物组合物可以以任何剂量每kg体重以及医学可接受的任何剂量频率给药 受试者。可接受的剂量包括约0.01和200mg/kg受试者体重的范围。
其它实施方案中，本发明所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物和药 物组合物可以以每天到每隔一个月的间隔重复给药。
本发明一个实施方案中，所述无糖基抗-CD154抗体，抗体衍生物和药 物组合物如需要可每天给药多个剂量以获得总的所需日剂量。治疗方法的 有效性可通过监测受试者的已知体征或疾病症状来评估。
对于本发明的所有实施方案，有效产生所需效果的本发明所述无糖基 抗-CD154抗体，其抗体衍生物以及药物组合物的剂量和给药频率将有赖于 多种因素，诸如待治疗疾病的性质，受试者大小，治疗目的，所用具体药 物组合物，以及治疗医师的判断。
本发明所述无糖基抗-CD154抗体，其抗体衍生物以及药物组合物可作 为单个剂量针对特定指征给药，诸如防止受试者对暴露了较短时间的抗原 的免疫反应，所述抗原诸如在一天的治疗中给药的外源抗原。所述治疗的 实例包括联合给药本发明的抗体或抗体衍生物以及治疗剂，例如，抗原性 药物(antigenic pharmaceutical)，过敏原或血液产品，或基因治疗载体。 在抗原长期存在的指征中，诸如在控制对移植的组织或长期给药的抗原性 药物的免疫反应中，本发明的抗体或抗体衍生物或药物组合物间隔给药， 持续医学上指示的较长时间，从数天或数周到受试者的一生。
本发明一个实施方案中，可通过上述方法治疗的受试者是动物。优选所 述动物是哺乳动物。可被治疗的哺乳动物的实例包括，但不限于，人，非 人灵长类，啮齿类(包括大鼠，小鼠，仓鼠和豚鼠)，母牛，马，绵羊， 山羊，猪，狗，和猫。优选，所述哺乳动物是人。
本发明可基于以下实施例更好理解。然而，本领域技术人员将轻易理 解所讨论的具体方法和结果仅仅是本发明的举例，如在本发明随后的实施 方案中具体描述的。
试验详述
实施例
以下实施例举例说明了本发明的方法和产品。对所述条件和参数的适 宜的变动和改造在分子生物学领域是常见的，并且是本领域技术人员显而 易见的，它们在本发明的精神和范围内。
实施例1：无糖基hu5c8抗体的产生和评估
无糖基hu5c8 mAb的产生和表达
为降低hu5c8 mAb的效应器功能，无糖基形式通过改变重链CH2结构 域中经典的N连接的Asn位点为Gln残基来产生。
竞争结合试验证实了与糖基化hu5c8 mAb相比，无糖基hu5c8 mAb结 合细胞表面CD154的能力没有改变(图1)。
利用桥接试验形式(bridging assay format)，在体外测定效应器功能。与 糖基化hu5c8 mAb相比，无糖基hu5c8 mAb与FcγRI的相对结合减弱25倍 (图2A)。在达到5mg/ml的浓度时，不能证实无糖基hu5c8 mAb与FcγRIII 的残余结合，而正常糖基化hu5c8 mAb在相同的试验形式中显示EC50为 50ng/ml(图2B)。
猕猴中无糖基hu5c8 mAb的药物动力学
给予单剂量20mg/kg hu5c8 mAb和无糖基hu5c8 mAb后，对来自两个 独立试验的血清浓度-时间图进行药物动力学分析，所述分析利用两个隔室 模型(compartment model)，其具有一级清除率常数(first order elimination rate constant)(WinNolin Professional Software v3.1，Pharsight Corp.，Cary，NC)。图 3含有药物动力学图，图1含有hu5c8 mAb和无糖基hu5c8 mAb的平均药 物动力学参数。hu5c8 mAb的清除和体积分布比无糖基hu5c8 mAb稍大。
                          表1
          将20mg/kg的hu5c8或无糖基hu5c8单剂量静脉内
             给药猕猴A以后的平均药物动力学参数   抗体     CmaxB   (μg/mL)   CIC   (mLhr/kg)   VssD   (mL/kg)   t1/2 E   (d)   hu5c8   无糖基   hu5c8   515(±16)   869(±360)     4.61(±0.70)   3.10(±1.10)     71(±10)   47(±11)     11.5(±2.5)   11.8(±3.0)  
A数据显示为数学平均值±标准偏差，对于hu5c8处理组而言n＝3，对 于无糖基hu5c8而言n＝4。B最大血清浓度，C系统清除率，D稳态分布体 积，E终期血清半寿期。
方法-实施例1
1.抗体生成  hu5c8 mAb的选择，克隆和人源化在以前已经描述。分 别见Lederman，1992和Karpusas，2001。hu5c8  mAb杂交瘤可获自ATCC (HB10916)。利用Amersham-Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ，USA)的试剂 盒，根据生产商推荐的方案，通过独特位点消除诱变，在糖基化hu5c8 mAb 中进行重链糖基化位点突变N298Q(N297，利用EU编号)。产生的无糖基 hu5c8在NSO骨髓瘤细胞中稳定表达并通过蛋白A和凝胶过滤层析纯化。 产生无糖基hu5c8抗体的细胞系得自ATCC(PTA-4931)。SDS-PAGE和分析 性凝胶过滤层析显示所述蛋白形成预期的二硫键连接的四聚体。
2.CD154结合试验  对huCD154+ D1.1细胞(Dr.Leonard Chess， Columbia University馈赠，也可得自ATCC(CRL-10915)进行基于FACS的竞 争结合试验。0.1mg/ml生物素化的hu5c8mAb与细胞表面CD154的结合与 hu5c8mAb和无糖基hu5c8mAb的被滴定液(titration)竞争。细胞结合的生物 素化hu5c8 mAb用链霉抗生物素-藻胆红素(PE)(BD-PharMingen San Diego， CA，USA)检测。相对结合亲和力可从四参数曲线拟合的IC50值推定。
3.CD154-FcγR桥接测定  FcγR结合亲和力利用基于抗体形成抗原 与携带FcγR的细胞之间的“桥接”的能力的试验测定(见下文)。FcγRI(CD64) 桥接试验通过用1mg/ml重组可溶人CD154(Biogen，Karpusas，1995)的PBS 溶液在4℃包被96孔Maxisorb ELISA板(Nalge-Nunc Rochester，NY，USA) 过夜，随后用1％BSA的PBS溶液封闭来进行。hu5c8mAb(糖基化和无糖 基)的被滴定液随后与CD154在37℃结合30分钟，洗涤该板，测定荧光标 记的U937(CD64+)细胞的结合。U937细胞在含有10％FBS，10mM HEPES， L-谷氨酰胺，和青霉素/链霉素的RPMI培养基中生长，以1∶2分裂，并在用 1000单位/ml IFNγ测定前活化一天以增加FcγRI表达。
FcγRIII(CD16)桥接试验利用生长于96孔组织培养板(Corning Life Sciences Acton，MA，USA)中的表达CD154的单层中国仓鼠卵巢(CHO)细胞 (Biogen)进行，并测定用CD16(Dana Farber Institute，Boston，MA，USA馈赠) 转染的荧光标记的Jurkat细胞的mAb依赖性结合。CHO-CD154+细胞以 1×105细胞/ml接种于96孔板中，在含有10％透析的FBS，100nM氨甲喋 呤，L-谷氨酰胺，和青霉素/链霉素(所有试剂均来自Gibco-BRL Rockville， MD，USA)的α-MEM中生长到满底。生长在含有10％FBS，400mg/ml遗传 霉素(Geneticin)，10mM HEPES，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，和青霉素/链霉素 (所有试剂得自Gibco-BRL)的RPMI中的CD16+Jurkat细胞在进行所述测定 以前1∶2分裂。
在对于FcγRI和FcγRIII受体的实验中，携带Fc受体的细胞用2′，7′-双 -(2-羧基乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酰氧基甲基酯(BCECF-AM)(Molecular Probes Eugene，OR，USA)在37℃标记20分钟。洗涤去除过量BCECF-AM， 1×105标记的细胞在测定中在37℃保温30分钟。未结合的FcγR+细胞通过 洗涤数次去除，并在Cytofluor 2350 Fluorescent Microplate Reader(Millipore Corporation Bedford，MA，USA)上读板，激发波长485nm，发射波长530nm。
实施例2：无糖基hu5c8抗体抑制初始和后继体液反应
抑制猕猴中对破伤风类毒素(TT)抗原的初始体液免疫反应
各自为单剂量的20mg/kg的无糖基hu5c8 mAb和糖基化hu5c8 mAb (根据实施例1制备)抑制对TT的初始抗体反应的能力在分别的实验中评 估。与盐水处理的对照组相比，给药无糖基hu5c8 mAb或糖基化hu5c8 mAb 导致总体初始免疫反应(EAUC)分别降低70％和77％。图4图示TT抗体在 整个42天中的效价，表明无糖基hu5c8 mAb对初始体液反应的抑制程度与 糖基化hu5c8 mAb相似，但是其FcγR结合能力降低。
人源化的mAbs的免疫原性是它们在该非人灵长类模型中的有效性的 另一测量指标。四只用单剂量20mg/kg无糖基hu5c8 mAb处理的动物中有 三只在药物从血清清除之后不久，于第82天左右出现了低滴度的抗-hu5c8 抗体，与存在无糖基mAb时的体液反应的抑制一致(数据未显示)。
作为初始反应抑制的另一测量指标，腹股沟淋巴结活检显示无糖基 hu5c8 mAb治疗的动物中生发中心(“GC”)的存在与对照相比显著减少。在治 疗的动物中，GC很少见并且很小，占据皮质的20％以下。对照动物具有多 个GC，以及中度到明显的反应性二级滤泡。观察到的淋巴结的中度到重度 再生不良与以前对糖基化hu5c8 mAb观察到的(数据未显示)一致。
将单剂量20mg/kg糖基化或无糖基hu5c8 mAb给药猕猴以后血液学参 数没有总体改变，淋巴细胞总数没有明显改变。此外，CD4/CD8 T细胞比 例不变，表明广泛的CD4+T细胞消耗没有出现(数据未显示)。
抑制猕猴中对破伤风类毒素(TT)抗原的后继体液反应
单剂量20mg/kg无糖基hu5c8 mAb抑制后继体液反应的能力通过将第 二次TT攻击给予8只盐水对照动物来评估，所述动物在以前所述的无糖基 hu5c8 mAb研究阶段中具有正常初始反应。第二次TT攻击以前，这些动物 中有4只接受20mg/kg无糖基hu5c8 mAb(组1B)，四只接受盐水(组1A)。
后继免疫反应的特征在于开始较快并且比初始免疫反应的程度强。计 算单个动物的后继反应相对于初始反应的程度(EAUC后继/EAUC初始)(表 2)。图5显示总体初始和后继个体免疫反应。应注意到个体动物的免疫反 应程度存在明显差异。平均而言，盐水对照(组1A)中的后继TT攻击产 生的总体抗体反应比它们对该抗原的初始反应高6.5倍，而接受无糖基 hu5c8 mAb的动物(组1B)产生的总体后继抗体反应平均而言比它们的初 始反应仅高2.0倍。因此，给药无糖基hu5c8 mAb与盐水对照相比，前者导 致后继抗体反应的程度降低70％。
                                   表2
                猕猴中对破伤风类毒素的总体初始和后继免疫反应(EAUC)   治疗组                   组1A            (盐水-盐水)A                 组1B        (盐水-无糖基hu5c8)B   动物#   1A-1   1A-2   1A-3   1A-4   1B-1   1B-2   1B-3   1B-4   初始EAUC   (×105)   2.1     1.1     2.0     0.3     3.9     0.9     1.6     2.6     后继EAUC   (×105)   8.7     5.2     9.6     6.0     8.3     1.5     3.3     5.5     强度   4.2   4.8   4.8   18.8   2.1   1.6   2.1   2.2   组平均强度                   6.5                   2.0
A1A组动物在初始和后继TT攻击之前接受盐水。1B组动物在初始TT 攻击之前接受盐水，在后继TT攻击之前接受无糖基hu5c8。B后继反应的 程度通过后继EAUC与初始EAUC的比值表示。
方法-实施例2
1.对TT的体液免疫反应  利用与实施例1中同样的猕猴，在猕猴中 进行两个独立的研究。收集来自每个研究的血清样品并将用于免疫分型的 全血保持在室温，在取血日进行分析。
该无糖基hu5c8 mAb研究包括两个处理组。组1包括4只雄性和四只 雌性动物，其在第一天接受盐水并作为未处理的对照。组2包括两只雄性 和两只雌性动物，其在第一天经静脉内接受单剂量20mg/kg无糖基hu5c8 mAb(如上所述)。处理4小时以后，所有动物经肌内(IM)接受5Lf(限量 絮凝化剂量(limes flocculating dose))吸收的TT。在第一天处理前后以及直到 给药后(post-dosing)第190天的选定日子采血。在第15天取淋巴结活检样品。
糖基化hu5c8 mAb研究包括五组处理组，每组含有三个雌性样品。第 一天，第一组接受盐水(未处理的对照)，第二到五组分别接受单剂量的 0.2，1，5或20mg/kg糖基化hu5c8 mAb，其可得自ATCC(CRL-10915)。处 理4小时后，所有动物接受单次IM注射的5Lf吸收的TT。第一天处理前 后以及直到给药后第42天的选定日子，从所有组采血。为允许这两个独立 研究的可比性，选定的血清样品在抗TT ELISA实验中并列比较。
在上述无糖基研究中初次TT攻击后第230天，对照组1分成两组。组 1A作为未经处理的对照，组1B用无糖基hu5c8 mAb处理评估其抑制后继 免疫反应的能力。动物如下处理：组1B在第一天经静脉内接受单剂量20 mg/kg无糖基hu5c8 mAb。组1A在第一天经静脉内接受等体积的磷酸盐缓 冲的盐水。处理后四小时，所有动物接受IM剂量的5Lf吸收的TT。第一 天处理前后以及直到给药后第85天的选定日期采血。
2.评估免疫反应利  用非隔室分析(noncompartmental analysis)评估免 疫反应。计算的免疫参数包括最大效价值(Emax)，达到该最大值的时间 (tmax)，以及从抗原给药到最后的取样时间点对所给予的抗原的总体抗体反 应(EAUC(0-最后))。利用具有初始消除率常数的两隔室模型进行药物动力学 分析(WinNolin Professional Software v3.1，Pharsight Corp.，Cary，NC，USA)。 确定的药物动力学参数包括最大血清浓度(Cmax)，系统清除速率(Cl)，稳态 分布体积(Vss)和抗体的终期半寿期(t1/2)。统计学分析，包括数学平均值， 标准偏差和几何平均值利用Microsoft Excel version 5.0软件(Microsoft Corp.， Redmond，WA，USA)计算。
3.猕猴的免疫分型  利用双色全血染色方案然后用FACS分析进行淋 巴细胞免疫分型。简而言之，在室温将100μl EDTA-处理的全血与标记的 mAb的以下组合之一室温保温20min：CD20-FITC克隆2H7 (BD-Pharmingen San Diego CA，USA)和CD2-PE克隆RPA-2.10 (BD-Pharmingen)，CD3-FITC克隆SP-34(BD-Pharmingen)和CD4-PE克隆 OKT4(Ortho Diagnostic Systems Raritan，NJ，USA)，或CD3-FITC和CD8-PE 克隆DK-25(Dako Corporation Carpinteria，CA，USA)。红细胞用2ml 1X FACS裂解溶液(Becton-Dickinson Franklin Lakes，NJ，USA)裂解。淋巴细胞 用1％的多聚甲醛固定，并用配备Cellquest软件的FACScan (Becton-Dickinson)分析。总淋巴细胞数目通过所有CD2和CD20阳性细胞 的数目之和确定。B细胞鉴定为CD20阳性细胞。T细胞亚组鉴定为CD3和 CD4或CD3和CD8双阳性。总淋巴细胞、B细胞、CD4+T细胞和CD8+T 细胞表示为淋巴细胞分析门内的阳性细胞百分比。计算每组数据的 CD4/CD8比例。
4.hu5c8 mAb药物动力学的ELISA.  ELISA板(Nalge-Nunc Rochester，NY，USA)用5μg/ml重组可溶人CD154(Biogen，seealso Karpusas 1995)在PBS中、4℃包被过夜并用2％驴血清阻断。(Jackson ImmunoResearch Laboratories West Grove，PA，USA-Catalog #017-000-121)。血清连续稀释液 和8-500ng/ml的hu5c8的标准曲线在室温保温1小时的过程中制得。结合 的hu5c8mAb利用驴抗-人IgG辣根过氧化物酶(HRP)(Jackson ImmunoResearch Laboratories West Grove，PA，USA)检测，然后用3，3’，5，5’- 四甲基联苯胺(“TMB”)底物试剂盒(Pierce Biotechnology Rockland，IL，USA) 显示。在450nm利用Spectromax读板仪(Molecular Devices Sunnyvale，CA， USA)读板。用Softmax Pro软件(Molecular Devices)将稀释的血清逆拟合 (back-fit)到标准品的四参数曲线拟合的线性部分。
5.测定抗-hu5c8抗体反应的ELISA  ELISA板(CorBing-Costar)用1 μg/ml无糖基hu5c8mAb(上述)在碳酸氢盐缓冲液pH9.6中、4℃保温过夜 并用1％BSA封闭。猕猴血清的连续稀释液在室温保温1.5h。结合的抗 -hu5c8 mAb利用100ng/ml生物素化的hu5c8mAb然后用链霉抗生物素 -HRP(Pierce Biotechnology)检测，然后用TMB底物试剂盒(Pierce Biotechnology)显示。在450nm利用Spectromax读板仪(Molecular Devices) 读板。抗体效价定义为产生超过放血前的值(prebleed value)＞0.100O.D.单 位的最高稀释度的倒数。
6.抗-TT反应的ELISA  ELISA板(Corning-Costar)用5μ/ml TT (Massachusetts Public Health Biologic Laboratories Boston，MA，USA)碳酸氢 盐缓冲液pH9.6中、4℃保温过夜。连续稀释的猕猴血清加入封闭的板， 在室温放置2小时。结合的抗-TT抗体用兔抗-猴IgG-HRP(Cappel-Organon Teknika Durham，NC，USA)检测，然后用TMB底物试剂盒(Pierce Biotechnology)显示。在450nm利用Spectromax读板仪(Molecular Devices Sunnyvale，CA，USA)读板。用Softmax Pro软件(Molecular Devices)为每种连 续稀释的血清样品产生四参数曲线拟合。抗体效价定义为产生超过放血前 的值0.100O.D.单位的稀释度的倒数。
7.血液学  收集EDTA钾抗凝的血液样品并每月分析以下血液学参 数：总白细胞计数，红细胞计数，血红蛋白浓度，血细胞比容，平均细胞 容积(mean corpuscular volume)，平均细胞血红蛋白(mean corpuscular hemoglobin)，平均细胞血红蛋白浓度，血小板计数和血涂片评估(包括差别)。
8.淋巴结活检  无糖基hu5c8 mAb的初始TT反应研究的第15天，从 所有动物采集腹股沟淋巴结。清理淋巴结组织，包埋在石蜡中，切片并封 固于玻璃载片上。载玻片用苏木精和伊红染色。所述载玻片通过目测分析 生发中心的存在，并基于生发中心的频率和大小定量评估。
实施例3：无糖基muMR1抗体抑制狼疮性肾炎
系统性红斑狼疮(“SLE”)是自发出现的自身免疫病，主要见于女性，特 征在于多种病理性抗核自身抗体的产生。在狼疮肾炎中，肾损伤主要由细 胞和体液免疫机制共同介导，包括沉积在肾小球中并活化补体级联反应的 免疫复合物的形成，其导致肾小球肾炎。以前确定在人和小鼠SLE中产生 的抗核抗体都是由所选自身免疫Th细胞和B细胞的群体之间的同源反应 (cognate interaction)驱动的。[Kalled et al.，1998]。
以前的研究证实，对于确诊患有狼疮肾炎的(SWR x NZB)F1(SNF1)小 鼠，用抗-CD154 mAb长期治疗的仓鼠MR1(haMR1)，在5.5月龄开始治疗 可延长生存期并降低严重肾炎的发病率。
在该实施例中，描述了该模型中两种鼠嵌合MR1 mAbs的有效性。鼠 嵌合MR1(“muMR1”)由融合于鼠IgG2a重链和kappa轻链恒定区的原始仓 鼠重链和轻链可变区组成。无糖基形式的muMR1通过突变IgG2a Fc的CH2 结构域中N连接的糖基化位点产生。利用这两种抗体，在狼疮肾炎中评估 Fc糖基化对抗-CD154 mAbs的作用。
该实施例的结果证实，嵌合mAbs，muMR1和无糖基muMR1，都保留 了抑制自身抗体反应的能力。具体地，类似于野生型，亲本仓鼠MR1，与 用鼠IgG2a对照mAb处理的小鼠相比，两种鼠源化的抗体都保持最小化用 它们处理的小鼠中肾炎症，纤维化，硬化和血管炎的能力。
muMR1和无糖基muMR1的药物动力学  muMR1和无糖基muMR1 抗体的药物动力学分析揭示，两种抗体都显示在BALB/c小鼠血清中的相同 动力学图谱(图6)。具体，这些嵌合分子在正常小鼠中的血清半寿期估计为 ～9天，类似仓鼠MR1(数据未示)。
自身抗体反应的分析
与对照动物相比，用muMR1或无糖基muMR1的处理大大降低了对 dsDNA和ssDNA的自身抗体反应(图7A&B)。
组织学分析
肾组织学分析证实，五只同种型对照动物中有3只患有严重的末期肾 病，特征为评分方案中所述的多种特征。处理组动物中除了极少数以外疾 病严重性明显较低。野生型(n＝11)和无糖基(n＝12)muMR1处理的动物之间 的差异很小，但是野生型的综合疾病评分稍低。图8显示了该组肾的综合 组织学评分。用无糖基muMR1处理的所有动物中，大多数患有轻微的早期 肾小球改变，小管间质改变很少或不明显。所有用muMR1(n＝11)处理的动 物有轻微早期改变，没有明显小管间质改变。从这些结果明显可见，muMR1 和无糖基muMR1都可有效防止以狼疮肾炎为特征的组织学改变。
B和T细胞区中淋巴样扩大程度通过对每只经过处理的动物的每个脾 进行组织学分析评估。鉴定次级滤泡较难，因为存在与冷冻切片制备有关 的人工行为结果。脾淋巴样区扩大程度和肾疾病得分之间没有明显相关性。 然而，与muMR1处理的动物相比，在同种型对照和无糖基muMR1-处理的 动物中，小动脉周围的淋巴细胞鞘(PALS)扩大的程度似乎明显得多(数据 未示)。
肾功能分析
为评估肾功能，测定每只动物的蛋白尿(PU)水平，以及血清肌酐和血 尿素氮(BUN)。嵌合muMR1mAbs延迟SNF1动物中严重肾炎的发作，如通 过测定尿中蛋白质含量所示的那样。当与对照动物相比时，抗-CD154处理 的小鼠在6-9个月之间的时间点的PU值较低(图9)。然而，在～10月龄， 所有组的PU值指示肾衰(图9)。这些结果提示抗-CD154治疗延迟蛋白尿的 开始。
图10显示SNF1小鼠血清中的肌酐水平，图11显示SNF1小鼠血清中 的BUN水平。对照组动物在7.25-10.5月龄，其血清肌酐和BUN水平升 高。反之，用糖基化muMR1治疗的小鼠在整个研究中保持稳定，其血清 肌酐或BUN没有实质的升高或降低。无糖基muMR1治疗的动物保持正常 血清肌酐水平到～9月龄，那时观察到轻微增加。类似地，该组中的BUN水 平在11月龄升高。
生存评估
抗-CD154mAb治疗延长SNF1小鼠生存期。在11月龄，超过90％治 疗的小鼠存活，而对照仅有56％存活。到第14个月，所有对照小鼠都死亡， 但分别有86％和75％的muMR1和无糖基muMR1小鼠仍存活。(数据未示)
总体来看，这些试验证实用muMR1或无糖基muMR1长期治疗肾炎 SNF1小鼠的存活期延长，自身抗体产生减少，肾病发展延缓。糖基化和无 糖基muMR1获得的稍有不同的结果表示Fc糖基化对狼疮中抗-CD154mAb 的有效性的影响较小。因此，无糖基抗-CD154mAb代表对狼疮肾炎的有效 治疗。
方法-实施例3
1.小鼠  BALB/c，SWR和NZB小鼠购自The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。(SWR x NZB)F1(SNF1)杂合体在Biogen的动物饲养装置中， 在常规圈养条件下喂养。雌性SNF1小鼠用于所有狼疮研究。BALB/c小鼠 用于药物动力学(“PK”)研究。
2.抗体  MR1杂交瘤(ATCC#CRL-2580)(其产生Armenian仓鼠抗-小 鼠CD154 mAb)购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。
3.治疗方案  所有注射通过经腹膜内途径给予。狼疮研究包括接受 PI.17muIgG2a的SNF1小鼠对照组和接受嵌合抗-CD154 mAbs之一的治疗 的SNF1组。前6周中每周一次给予单剂量500μg mAb，然后每月一次单次 注射500μg直到动物死亡或研究终止。研究在动物为～5.5月龄时开始，每 月一次收集血清样品。对于PK研究，BALB/c小鼠接受单剂量100μg muMR1 或无糖基muMR1，4小时后以及第1，2，4，7，9，11和14天收集血样。
4.ELISA测定法  为检测血清嵌合MR1 mAbs，NUNC Maxisorp板用5 μg/ml重组可溶鼠CD154在4℃保温过夜。第二天封闭所述板，加入稀释 的血清，然后加入辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠IgG2a(Southern Biotech)， 并用TMB底物显示。反应用2N硫酸终止，并在450nm在Spectramax读 板仪(Molecular Devices，CA)上读板。抗-单链DNA(ssDNA)和抗-双链 (“dsDNA”)ELISA利用NUNC MaxiSorp板进行。所述板在4℃用10μg/ml 甲基化BSA(Calbiochem Corp，La Jolla，CA)包被过夜然后用5μg/ml I级小 牛胸腺DNA(SIGMA，St.Louis，MO)在25℃包被2小时。小牛胸腺DNA 用超声剪切然后在使用前用SI核酸酶消化。对于抗-ssDNA测定法，DNA煮 沸10分钟，然后在冰上冷冻备用。封闭后，将血清样品的连续稀释物加入 并在室温保温2小时。自身抗体用山羊抗小鼠IgG-碱性磷酸酶(SIGMA，ST. LOUIS，MO)检测并用对硝基苯基磷酸盐(SIGMA，ST.LOUIS，MO)在1M 二乙醇胺缓冲液中显示。在405nm读板，并通过利用已知量的抗-DNA mAb 205或mAb 5c6获得标准曲线，所述抗体对ss-和dsDNA都特异。抗-DNA 效价定义为超过背景0.1 OD单位的稀释度的倒数。
5.组织学  肾和脾冷冻切片和福尔马林固定的石蜡包埋组织用苏木精 -伊红(“H&E”)染色炎性浸润。肾也用马森三色法(Masson Trichrome)染色纤 维化并用周期酸性(Periodic acid)Schiff染色(Periodic Acid Schiff stain) (“PAS”)染色基底膜增厚。染色的组织切片通过兽医病理学家评分。狼疮肾 炎的组织病理学分级总分基于肾小球，间质和小管的改变。级别0到4+基 于受检结构(即肾小球，血管等)受影响的百分比，具体如下：0，没有明显 损伤；1+，1％-30％结构受损；2+，30％-60％结构受损；3+，＞60％结构受损到一 定程度；4+，＞60％结构严重受损。
6.尿和血清的分析  每只小鼠的尿的分析用Albustix (Bayer Corp.， Tarrytown，NY)每周监测以测定蛋白尿(“PU”)。蛋白尿水平评分如下：0.5+， 15-30mg/dl；1+，30mg/dl；2+，100mg/dl；3+，300mg/dl；4+，＞2000mg/dl。整个 研究过程中，在COBAS化学分析仪(Roche)上间歇测定血清肌酐和血尿素 氮(BUN)以测定肾功能以及PU。
实施例4：无糖基muMR1抗体抑制试验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)
免疫时封闭CD40配体可抑制EAE发展[Samoilova，1997]。在该实施例 中，分析muMR1和无糖基muMR1抗体抑制EAE的能力。该实施例还评 估了通过抗-CD154 mAb抑制EAE是否与主动抑制机制相关，以及其由有 赖于抗体的Fc依赖性相互作用的机制介导的程度。
该实施例的结果证实了无糖基muMR1mAb与野生型糖基化仓鼠MR1 mAb作为EAE抑制物在阻断临床疾病的发展中同样有效。更具体地，所有 MR1 mAbs完全抑制疾病发展，如通过平均最大得分和平均疾病严重度评估 的那样，只有仓鼠MR1-处理组中的一只小鼠例外。这些结果提示抗-CD154 mAbs对抗EAE的保护作用的潜在机制似乎与T调节诱导无关。它们也显 示mAb的Fc依赖性效应器功能对临床有效性没有较大的影响，但似乎对 EAE自身免疫环境中的抑制的潜在机制有贡献。
用糖基化muMR1抑制临床EAE
图12表明，与同种型对照P1.17治疗的小鼠相比，muMR1治疗的小 鼠在初始肽免疫之后不显示疾病症状。muMR1治疗的动物在80天的随诊 期中不显示临床症状(数据未示)。当小鼠用在完全弗氏佐剂乳化的 PLP139-151再免疫时，P1.17-治疗的动物中临床症状的严重性增加。在第0， 2，和4天已经用muMR1治疗过的小鼠在再次攻击之后出现EAE，其严重 性等同于P1.17-治疗的小鼠中的EAE的第一阶段。这些结果证实抗-CD154 mAb治疗不导致主动抑制。我们还研究了20×106个脾细胞的转移是否会导 致初始受体小鼠 recipient mice)对随后的主动EAE诱导的抗性，情况 不是这样(数据未示)。所述脾细胞收集自经EAE诱导并用muMR1治疗 后1或3周的小鼠。
用无糖基muMR1抑制临床EAE
图13和表3证实，给药3个剂量200μg时，与对照Ig P1.17相比， muMR1和无糖基muMR1 mAbs有效抑制整个随诊期间的EAE临床征象。 在这方面，muMR1和无糖基muMR1抗体与仓鼠MR1同样有效(数据未 示)。给药低剂量的这些抗体没有显示出抗体之间在抑制EAE的能力方面存 在较大的差异。
抑制CNS炎性浸润
为评估抗体在抑制中枢神经系统(“CNS”)中的炎性浸润方面是否存在 差异，将4-5个小鼠分成一组，不同的组用不同量的抗体(muMR1和无糖 基muMR1，或3个剂量的200μg和P1.17对照Ig)治疗，在第16天，用同 种型对照抗体治疗的小鼠中的疾病活性达到高峰时，处死这些小鼠。
表3：糖基化不是抗-CD154的抑制效应所需的     抗体         剂量   (μg)       N         发病率         平均最   大得分   ±SD1     平均累   积得分   ±SD1   P1.17   3×200   14   13   2.4±0.8   32.1±32.5   muMR1   3×200   13   0   0±0§   0±0#   muMR1   3×75   6   0   0±0§   0.8±1.2##   muMR1   3×25   6   3   1.4±1.6§§   39.3±53.1   无糖基   MR1   3×200     14     0     0±0§     0±0#     无糖基   MR1   3×75     6     1     0.6±1.4§     19.7±47.9     无糖基   MR1   3×25     6     2     0.8±1.3§     9±17.4  
1.疾病进展显示在图1中。对于每只单独的小鼠，整个监测期过程中 最大残疾得分和累计得分在计算组平均值之前分别评估。
§与P1.17治疗的小鼠相比，p＜0.0005；§§与P1.17治疗的小鼠相 比，p＜0.05。
#与P1.17治疗的小鼠相比，p＝0.002；##与P1.17治疗的小鼠相比， p＜0.02。
*与25μg muMR1相比，p＝0.05。
如表4所示，所述抗体在抑制疾病进展早期过程中，抑制CNS中炎性 浸润进展的能力方面没有差异。由于不确定小鼠在缺乏EAE征象的情况下 是否出现亚临床活性，在该试验终点(第58天)分析来自每组6-14只小鼠 的CNS组织。
与用200μg muMR1治疗的小鼠相反，P1.17-治疗的小鼠和用200μg无 糖基MR1治疗的小鼠显示轻度炎性浸润主要位于小脑的证据(表5)。然而， 利用低剂量抗体的治疗揭示，无糖基MR1与其糖基化形式相似(有时比其 糖基化形式的保护作用更强)。这些结果证实两种抗体都可同等抑制临床 EAE的进展。
方法-实施例4
1.EAE的诱导雌性SJL小鼠(10-12周龄，Harlan)用在完全弗氏佐 剂(Difco，Detroit，MI)中乳化的50μg PLP139-151经皮下免疫。三天后，对 小鼠静脉内注入109热杀死的百日咳杆菌(B.pertussis)生物体(RIVM， Bilthoven，The Netherlands)。EAE的进展通过每天评估体重和残疾得分来监 测。得分范围自0：无症状，0.5：尾紧张(tonus)部分丧失，1：尾紧张完全丧失， 2：四肢衰弱，2.5：局部麻痹，3：后肢完全麻痹，3.5：膈和后肢完全麻痹，大 小便失禁，4：垂死，至5：由于EAE导致死亡。
表4：抗-CD154对CNS浸润的影响(第16天)   抗体   剂量   (μg)   患有浸润的动物数量     无   偶发的   中度   重度   P1.17   3×200   0   3   1   1   muMR1   3×200   3   1   0   0   muMR1   3×75   3   2   0   0   muMR1   3×25   1   1   3   0   无糖基MR1   3×200   5   0   0   0   无糖基MR1   3×75   4   1   0   0   无糖基MR1   3×25   2   1   2   0
表5：抗-CD154对CNS浸润的影响(第58天)   抗体     剂量   (μg)          患有浸润的动物数量   无     偶发的     中度     重度     P1.17同种型   200   3   8   3   0   muMR   200   12   1   0   0   muMR   75   3   3   0   0   muMR   25   0   5   1   0   无糖基MR1   200   8   5   1   0   无糖基MR1   75   4   2   0   0   无糖基MR1   25   4   2   0   0
2.抗体生成  仓鼠抗-小鼠CD154mAb MR1的重链和轻链的可变区通 过RT-PCR从杂交瘤总RNA克隆。仓鼠/小鼠嵌合mAb的表达载体通过利 用标准重组DNA技术，将鼠IgG2a或鼠kappa恒定区cDNAs(来自抗-人 CD154mAb-即，糖基化hu5c8的重链和轻链的全长cDNA克隆)分别改造 到重链和轻链的可变区上来构建。通过流式细胞术和免疫沉淀证实，瞬时 表达的嵌合MR1mAb(称为muMR1)具有(recapitulate)仓鼠mAb的CD154 结合性质。
无糖基嵌合MR1(称为aglyMR1)被构建成通过对重链进行定点诱变 来改变Fc的N-连接的糖基化位点中的天冬酰胺残基(在Kabat EU命名法中 为N297)为谷氨酰胺残基。构建含有用于免疫球蛋白轻链和重链的CMV-IE 启动子驱动型串联转录盒以及谷氨酰胺合成酶基因作为选择标记的稳定表 达载体，用于muMR1和agly muMR1 IgG2a，kappa mAbs。表达载体被转染 入NSO细胞，通过在不含谷氨酰胺的培养基中选择来分离稳定的克隆。
MuMR1和无糖基MR1在蛋白A琼脂糖上从生物反应器细胞上清液中 通过亲和力纯化然后在Sephacryl 300上进行大小排阻层析以去除聚集体。 层析树脂购自Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)。通过 SDS-PAGE显示，mAbs纯度＞95％，内毒素分析保证这些试剂对于体内应 用的安全性。体外试验发现，MuMR1和无糖基MR1对细胞表面muCD154 的相对亲和力相同，并且它们在BALB/c小鼠体内的药物动力学半寿期相同 (数据未示)。根据与Biogen的约定，鼠IgG2a同种型对照mAb，P1.17(ATCC# TIB-10)是由Protos Immunoresearch(Burlingame，CA)纯化自腹水的蛋白A。
3.抗-CD154抗体的递送  在第0，2和4天，每只小鼠接受200μl PBS i.p.，其中还含有以下物质：组1＝PBS(对照)；组2＝200μg muMR1；组3＝ 200μg仓鼠Ig(Ig对照)；组4＝200μg鼠源化的MR1；组5＝200μg P1.17 IgG2a对照；组6＝200μg无糖基muMR1。
一些试验中，小鼠在第80天用在完全弗氏佐剂中乳化的50μg PLP139-151再免疫。
4.疾病评估  每天称重小鼠，在整个56天的过程中，根据以下评分系 统监测临床活动(clinical activity)：0：无症状，0.5：尾紧张部分丧失，1：尾紧 张完全丧失，2：四肢衰弱，2.5：局部麻痹，3：后肢完全麻痹，3.5：膈和后肢 完全麻痹，大小便失禁，4：垂死，5：由于EAE导致死亡。
5.组织学  每只小鼠的脑组织和脊髓在10％福尔马林中固定并在石蜡 中包埋。从每只单独的小鼠获得间隔100μm的3-6张脊髓切片(4μm)和6 张脑切片(每张包括小脑，大脑，脑干，和蛛网膜下隙)，并在用苏木精 染色之后，分析炎性浸润的程度。
每张单独的切片根据以下评分：0＝无浸润；1＝偶发的轻度血管周围浸 润(每张切片少于两处炎性损伤)；2＝多灶，轻度血管周围浸润；4＝多灶，严 重血管周围浸润，伴有向实质中的扩散。基于所有切片的平均情况，将小 鼠分类为无、偶发、中度或严重浸润。
6.统计学分析  结果通过One-Way ANOVA分析，然后利用LSD检验 通过post-hoc分析。P-值＜0.05被认为显著。
实施例5：无糖基hu5c8抗体抑制胰岛细胞移植
以前的研究表明，用20mg/kg诱导/维持-剂量方案的糖基化hu5c8治 疗的恒河猴保持肾同种异体移植物功能，并且在6个月的给药期间不出现 排斥发作，而接受肾同种异体移植物的未经治疗的猴子在8天之内迅速排 斥它们的移植物[Kirk，1999]。Kirk的研究小组的相关试验中，证实无糖基 hu5c8对治疗移植排斥无效。
与Kirk的发现明显相反，本发明的结果证明了无糖基化形式的hu5c8 mAb实际上可有效治疗其它背景中的移植排斥。
恒河猴中的胰岛细胞同种异体移植物
以前证明，糖基化hu5c8使得胰岛植入以及保持同种异体移植物的存 活成为可能[Kenyon，1999]。
四只20mg/kg诱导/维持方案治疗的恒河猴在移植后＞213，＞255，＞269， 和＞341天获得胰岛素非依赖性。本研究的结果显示接受胰岛同种异体移植 物的未经治疗的对照猴子在第8天显示急性排斥，如到第11-14天出现的 持续高血糖和c肽(内源性胰岛素生成的产物)生成缺乏所证实的那样(数据 未示)。
与未经治疗的对照动物相反，图14显示用无糖基hu5c8的诱导/维持方 案(上文所述)可成功治疗两只恒河猴之一。尽管两只猴子在第7天都经历了 高血糖和初始排斥，当用胰岛素治疗猴子并持续无糖基hu5c8治疗时，两 只猴子之一显示同种异体移植物的部分功能，如第28天(空心菱形)通过 c肽存在测定的那样，并保持到第45天。
这些结果提示无糖基化抗-CD154 mAbs可用于移植背景中的治疗方 案。然而，由于移植过程中的免疫反应非常强，即涉及体液，细胞和炎性 免疫反应，有可能无糖基抗-CD154抗体在与免疫抑制剂和免疫调节化合物 联合递送时最为有效。例如，中断经由CD28的T细胞共刺激信号的药剂， 中断钙调磷酸酶信号的药剂，皮质类固醇，抗增生药剂，和其它特异性结 合在免疫细胞表面表达的蛋白质的抗体，包括但不限于CD45，CD2，IL2R， CD4，CD8和RANK FcR，B7，CTLA4，TNF，LTβ，和VLA-4。
方法-实施例5
1.胰岛细胞同种异体移植  这些研究如上所述进行[Kenyon，1999]。简 而言之，同种异体反应性供体-受体恒河猴对基于阳性混合淋巴细胞培养反 应性选择。受体在第0天接受完全胰岛切除以及门内(intraportal)同种异基因 胰岛移植。
2.抗体治疗  剂量方案利用在-1，0，3，10和18天的20mg/kg的诱导以 及在每个月第28天开始的一个剂量的20mg/kg的维持来进行。
3.移植物功能评估  胰岛移植物功能每天通过禁食和餐后血糖水平来 监测。胰岛衰竭(原发性无功能或急性排斥)定义为缺乏禁食与刺激的c 肽生成(内源性胰岛素产物)。原发性无功能定义为移植的组织不能在移 植后紧接的时期内发挥作用，并且特征为持续高血糖以及血糖控制不稳定。 急性排斥发作定义为禁食血糖＞100mg/dL，餐后血糖＞150-175mg/dL。总体 移植物功能通过监测维持正常血糖水平所需的外源胰岛素量来评估。
实施例6：无糖基hu5c8(抗-CD154)抗体防止抗-CD154-介导的T-细 胞同种异体反应性的用途
靶向T细胞上的CD154的单克隆抗体已经显示部分防止体外以及体内 同种异体反应性。然而，不清楚抗-CD154 mAb的抑制活性是否有赖于阻断 刺激性CD40-CD154相互作用或可选有赖于直接经由CD154递送抑制信 号。
为评估阻断刺激性CD40-CD154相互作用对人T细胞的体外同种异体 反应性的效果，所述效果与刺激CD154(即，直接通过CD154递送抑制信号) 相反，将未分级分离的PBMC或纯化的CD4+T细胞，与同种异基因HLA 错配的刺激细胞(CD40阳性细胞)在存在可溶或固定于培养孔的人源化的 抗-CD154 mAb(hu5c8，Biogen Inc.，MA，USA)的条件下共培养。大多数阻断 试验利用遗传改造的可溶性抗-CD154(无糖基化hu5c8)变体进行，所述变体 的Fc效应器功能降低并由此其与CD154交联的能力降低。用于该实施例中 的无糖基化hu5c8与本申请中全文描述的无糖基hu5c8 mAb相同。见，例 如实施例1， 和 见上文。可溶但非包被的抗-CD154抗体抑制原代 混合的淋巴细胞培养物(“MLC”)(40±23％ vs 3±18％抑制，n＝4)中同种异基因 T细胞增殖。类似地，次级MLC(n＝5试验)中同种异体抗原特异性T淋巴 细胞的增殖通过用CD154阻断来激发(利用可溶抗体)而受到抑制，然而， 其可通过CD154(包被的抗体)刺激而增加。此外，包被的抗-CD154抗体 的刺激强烈增加同种异体抗原特异性CTL效应物的产生，而CTL不受 CD154阻断的影响。
为检测抗-CD154的刺激活性是否需要B7-CD28共刺激相互作用，在 CTLA4-Ig这种可抑制B7分子与CD28结合的分子存在的条件下进行 MLC。存在CTLA4-Ig下的激发分别抑制初级和次级MLC中同种异体抗原 特异性T淋巴细胞的增殖75±14％(n＝3)和64±28％(n＝6)，并抑制CTL产生 48±23％(n＝2)。包被的抗-CD154抗体的信号明显增加初级(58±0.6％，n＝2) 和次级(61±49％，n＝6)MLC中同种异体抗原特异性T细胞的残余CD28-非依 赖性增殖，但是并不完全消除CTLA4-Ig-诱导的抑制。然而，CTLA4-Ig对 CTL生成的抑制效应被CD154刺激(通过包被的抗-CD154抗体)消除。与含 有或不含有CTLA4-Ig的对照培养物相比，CD25，HLA-DR和CD95在同种 异体反应性T细胞上的表达通过刺激CD154(n＝2)明显增加。
我们的数据显示固定在培养板上时，抗-CD154抗体可促进，而不是 阻断T细胞同种异体反应性。通过可溶性无糖基hu5c8 mAb阻断CD154不 能增强体外T细胞活化并由此在体内有利，并且基于这些发现，无论单独 使用或与其它阻断共刺激途径的分子联用，其在移植试验模型中可有效降 低体内同种异体抗原T细胞反应。
本领域技术人员将理解，可对本发明优选实施方案进行多种改变和修 饰而不偏离本发明的精神。意图将所有这种改变包含在本发明范围内。
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