本发明述及由HLA-B27的α1，α2功能域或人类角蛋白VI衍生而 来的肽，以及这种特定的由HLA-B27α1，α2功能域或人类角蛋白VI 衍生而来的肽在HLA-依赖性自身免疫疾病的诊断及治疗中的应用。

自身免疫性疾病，如风湿，银屑病，多发性硬化，溃疡性结肠癌 及自身免疫性眼色素层炎，是当机体防御系统(免疫系统)不再耐受 作为机体自身一部分的结构，而是将其作为外侵病原体来攻击时产生 的一种疾病。将导致机体自身组织损伤甚至损毁，引起疼痛及生理功 能失常的症状：例如风湿病中出现关节僵化；银屑病中出现炎症，皮 肤剥落甚至有时出现大面积皮肤损伤；多发性硬化中出现遗传性低角 质化，意志丧失及语言障碍；溃疡性结肠癌中出现的严重腹泻及营养 失调，甚至致命的肠穿孔；眼色素层炎中出现的视力减退甚至导致失 明。

多数自身免疫病症为慢性进程，有时能够维持在某一病程期，有 时则持续恶性发展。免疫系统损毁的组织很少能够再生。风湿病中， 自身攻击免疫反应导致疼痛的关节炎症及关节退化，最终导致功能丧 失。银屑病中出现的皮肤损伤，有时是大面积的，有强烈的搔痒感并 且十分明显，常引起病人心理问题，给人际交往带来问题。

这些自身免疫性疾病发生的原因大多还未知。一些病例中，伴有 细菌或病毒感染，因而误导免疫系统，这也许是引起自身免疫性疾病 的主要原因。在风湿病和银屑病的病理形成过程中，细胞免疫反应起 着重要作用，与此同时，也能检测到抗体反应。

传统用于自身免疫性疾病治疗的手段不但影响免疫系统自身反应 (自身攻击)部分，同时抑制了抵抗外侵病原体或肿瘤细胞的免疫反 应细胞。传统的免疫抑制剂如皮质类固醇，环孢霉素A及细胞生长抑 制剂不但引起全身免疫抵抗力下降，肿瘤发病率增加，而且有许多非 免疫的，有时危及生命的副作用。

自身免疫性疾病的遗传素因可能与特定的主要组织相容性抗原 (MHC)或称HLA(人类白细胞抗原，最初是以移植抗原而发现 的)间存在统计学关系。其机制应建立在免疫系统将病原抗原(细菌 和病毒)与自身HLA抗原混淆的基础上。

HLA-B27抗原是一个特例，它经常与特定的某些自身免疫性疾病 如虹膜炎，银屑病及风湿病如Bechterew′s病(关节强硬性脊椎炎)， 银屑病性关节炎以及男孩常发的青少年类风湿关节炎伴随出现。

在自身免疫性眼色素层炎疾病中已发现(G.Wildner，& R.Thurau， Eur.J.Immunol.24，2579-2585(1994))HLA-I类抗原在病理形成过程中 并不作为抗原呈递因子，而是本身作为抗原，以肽的形式，由HLA-II 类或其它分子呈递。自身攻击免疫反应中的组织特异性也可以用与特 异自身抗原交叉反应来解释。(例如，眼色素层炎疾病中的视黄醛S 抗原)

与本发明相联系，HLA抗原在病理形成中起主要作用的自身免疫 性疾病称之为“HLA-依赖”自身免疫性疾病。

在风湿病综合征(关节强硬性脊椎炎，反应性关节炎及银屑病关 节炎)中的HLA-依赖疾病中，迄今为止，最可能的抗原是由HLA- I、II类分子呈递的细菌蛋白，有时倾向于HLA-B27，或其它(关节 特异性)II型胶原，而它与HLA-B27间的联系尚未建立起来。链球菌 蛋白及角化细胞蛋白可能是银屑病中的抗原。

风湿病及银屑病病人对HLA-B27和/或皮肤角质素序列肽的细胞 免疫反应表明这些肽是潜在的自身抗原肽，即不再被识别为自体肽或 自身肽。对HLA-B27前两个功能域的免疫反应在1986年即有报道 (G.Wildner et al.，Abstract 2.33.13，Sixth Intenational Congress of Immunology，Toronto，Canada，6 to 11 July 1986；G.Wildner，disswetation， LMU munich，1987；G.wildner et al.，Mol.Immunol.26，33-40，1989)。

近年来，为恢复存在于自身耐受与病原体抵抗间的正常平衡，进 行了许多免疫系统控制的尝试。着眼点不再是非特异的抑制所有的免 疫反应，而是只影响作用于自身攻击的免疫反应。因此，其副作用如 增加感染几率或肿瘤形成率很有希望能够避免。

在此联系中，比较已知的能引起自身免疫性疾病或急性慢性移植 排斥的生理机制十分重要。这些机制曾为寻求治疗这些病症的方法而 深入研究过。现在认为细胞毒作用，特别是CD8阳性细胞毒性T淋巴 细胞，在急性移植排斥中起主要作用，而在慢性移植排斥中细胞毒作 用作为次等重要因素。CD4阳性T淋巴细胞，尤其是辅助性T淋巴细 胞和抑制性T淋巴细胞，细胞因子在细胞免疫反应水平上更为重要。 以目前的知识，自身免疫性疾病与慢性移植排斥的情况类似。

与抑制急性移植排斥方法不同，治疗自身免疫性疾病的方法不需 要由调节细胞毒性T淋巴细胞活性主导，而是可以在细胞和体液免疫 反应两种水平进行更广泛的尝试。

作为解决上文所述与HLA-依赖自身免疫性疾病相关的方法，特 别是HLA-I类相关、HLA-II类相关的自身免疫性疾病，尤其是些特异 与HLA-B27相关者，对于本发明而言，包括应用特定的由HLA-B27 α1，α2功能域或人类角蛋白VI衍生而来的肽来诊断及治疗HLA-依 赖性自身免疫疾病的方法。

1986，1987及1989年，G.Wildner等人(loc.cit)描述了包含由 HLA-B27α1，α2功能域衍生蛋白的融合蛋白。由HLA-I类分子α1， α2功能域衍生而来的肽被Krensky等人在WO88/05784中，C.A. Clayberger和A.M.Krensky在WO93/17699中，C.A.Clayberger等人 的WO95/26979中描述，并为C.A.Claybergeh和A.M.Krensky在 Current Opinion in Immunology 7，644-648(1995)，E.Nossner等人在J. Exp.Med.183，339-348，(1996)上发表。

文件WO88/05784，WO93/17699，WO95/26979，Current Opinion in Immunology(1995，loc.cit)和J.Exp.Med.(1996，loc.cit) 发表的特定类肽是为：

-调节病人的细胞毒性T细胞的细胞毒性/细胞溶解活性，特别是细 胞毒性T淋巴细胞(CTL)，对于病人来说，称为

--抑制CTL活性，    ·通过将肽结合到CTL上，特别是通过T细胞受体，抑制由CTL 引起的靶细胞溶解(可能是通过与CTL正常结合的配体的竞争 (Current Opinion Immunol.(1995)，a.a.O.)和/或

·通过与HSP70热休克蛋白家族成员，以与其它免疫调节复合物 如FK506和环孢霉素A行为类似的方式结合，这是因为探测 与相关T细胞表面有关的热休克蛋白并不容易(J.Exp.Med.(1996)， a.a.O.)

·通过抑制/阻断CTL分化(WO93/17699)，或

--将MHC限制性靶细胞敏化，使其具有CTL/刺激CTL活性，可 能通过在MHC介入条件下将肽呈递给CTL，

-利用将CTL与相应肽结合来鉴定CTL，或诊断特异CTL的出现，

-利用将特异CTL群体与相应肽结合使其从混合T细胞中分离出 来。

所有文件将所描绘肽的申请领域定位于移植药物，特别是与急性 移植排斥相结合(见Clayberger等人的WO95/26979，C.A.Claybergeh 和A.M.Krensky的Current Opinion in Immunology 7，644-648(1995)， E.Nossner等人的J.Exp.Med.183，339-348，(1996))以及在病毒，细菌 和寄生虫感染的治疗和瘤形成的治疗上。

文件WO88/05784和WO93/17699仅概括提到利用肽诊断和/或治 疗自身免疫性疾病，而没有具体化，例如并未考虑到特殊的自身免疫 性疾病。但是，正如上文解释过的，在自身免疫性疾病中，特异辅助 性T淋巴细胞和抑制性T淋巴细胞中CD4阳性T淋巴细胞的活性，细 胞因子和其它机制在细胞免疫反应水平上比细胞毒性T淋巴细胞活性 更为重要，就治疗自身免疫性疾病而言，一种其它的，被设想可能具 有更广谱活性的肽是必要的。

用肽代替完整抗原蛋白或由蛋白的衍生长链片段具有一些说服性 的原因，特别是在计划给予人或动物时采用完整抗原蛋白或衍生长链 片段带来了以下的困难：

1)所谓“加工”，即免疫活性片段(表位)的精确删除并不总在 受体机制中起作用。

2)无论怎样，抗原“重组”合成需要很大的花费和努力。

3)抗原一般从自然组织中分离。在此联系中，细菌，病毒和/或病 毒体感染很易出现，可能由(逆)病毒或细菌DNA引起继发转染。

4)抗原蛋白即使在干燥形式和特殊、精细的保存条件下也可能仅 有很短的保存时间。

5)敏化的危险，当将抗原用于人类或动物时引起典型的食物或接 触过敏，这是由于浆细胞及嗜酸性细胞表面的IgE很易发生交叉反 应。

正如前文所述及，本发明所基于的物质是在由HLA-B27α1，α2功 能域或人类角蛋白VI衍生而来的肽在HLA-依赖性自身免疫疾病的诊 断及治疗中的应用中获得的。

这里所考虑的自身免疫性疾病包括HLA-I类相关和HLA-II类相关 自身免疫性疾病，特别是，但并不排除，风湿病综合征的疾病，例如 关节炎，类风湿和反应性关节炎，银屑病关节炎和青少年类风湿关节 炎，以及虹膜炎，银屑病及眼色素层炎。本发明上文定义的肽能够应 用于HLA-B27相关自身免疫性疾病的诊断与治疗，这种病也将述及。 病症中存在与HLA-B27抗原的联系，例如，关节强硬性脊椎炎 (Bechterew′s病)和上文述及的风湿病综合征特殊病症，特别是青少 年类风湿关节炎和银屑病关节炎，以及虹膜炎，眼色素层炎和银屑病 的特殊病症。需要强调的是上文定义的肽，其适用性并不局限于诊断 和治疗和/或抑制HLA-B27相关自身免疫性疾病。相反，它可以扩展 到那些与I类HLA抗原相关的自身免疫性疾病，例如非HLA-B27相关 的青少年类风湿关节炎和银屑病关节炎。其适用性也可以扩展到HLA- II类相关自身免疫性疾病，例如特异的HLA-II类相关的关节炎。

本发明所用的肽包括由HLA-B27α1，α2功能域或人类角蛋白VI 衍生而来的肽，更精确的说，是核心序列B27PA，B27PA*，B27PB， B27PC和Ker333或其衍生物：

肽B27PA：

Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Thr-Asp-

Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Thr，

肽B27PA*：

Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln，

肽B27PB：

Leu-Leu-Arg-Gly-Tyr-His-Gln-Asp-Ala-Tyr

肽B27PC：

Arg-Val-Ala-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val

肽Ker333：

Leu-Asp-Leu-Asp-Ser-Ile-Ile-Ala-Glu-Val-Lys-Ala-Gln-Tyr-Glu-

Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-Ser

依照由H.Szots，G.Riethmuller，E.Weiss和T.Meo在Proc.Natl. Acad.Sci.USA83，1428-1432(1986)提供的HLA-B27氨基酸序列，

-肽B27PA与HLA-B27的α1功能域内60-80氨基酸相对应，

-肽B27PA*与HLA-B27的α1功能域内60-72氨基酸相对应，

-肽B27PB与HLA-B27的α2功能域内109-118氨基酸相对应，和

-肽B27PC与HLA-B27的α2功能域内151-165氨基酸相对应。

本发明发现仅有所述核心序列中不连续分布的有限数量的氨基酸 是抑制或治疗HLA-依赖性自身免疫性疾病的肽活性所必需的。因 此，在这方面不重要的氨基酸位点可以被进一步删除，插入，转换及 替代，而不损坏肽所述及的生物学活性。基本的氨基酸的衍生及修饰 (甲基化，酰胺化，糖基化，结合脂肪酸残基(饱和及不饱和脂肪酸 残基)，等)也包括在本文中。

肽相对于核心序列的改变的关键是使形成的肽表现出一种空间或 称三维结构，基于本发明之目的。此结构并不比上文定义序列形成的 带电和/或表面结构逊色。更优越的是这种改变肽的空间结构在其表面 结构和电荷分布上与上文述及核心肽或至少其中为生物活性所必需的 核心肽之片段是一致的。

因此，本发明可用的肽及由B27PA，B27PA*和Ker333而来的衍生 物可用下文的公式表示：BL1-X-BL2-Y-BL3-Z-BL4-W-BL5和BL1-X- BL2-Y-BL3-Z

简写BL代表与下文表中所给信息相关的氨基酸嵌段，可以包括1 -8个氨基酸。单独的氨基酸或氨基酸集团(X，Y，Z和W)定 位在这些氨基酸之间，它们很有特点并且很可能在上文述及生物活性 中起重要作用。肽B27PAh和Ker333是以X，Y，Z和W的氨基酸 位置为基础分别从其全序列中选出来的。

但是，还需考虑到在核心序列中的其它氨基酸在肽的生物学活性 中也很重要。正如上文所述及的，在本文中很重要的是所得肽的空间 或三维结构与上文述及核心肽或至少一部分一致。

在上文所提及B27PA和/或B27PA*的核心序列中：

-X(在肽的2位；相当于Szots等人报道的61位(a.a.O.))相当于 天冬氨酸(Asp)，

-Y(在肽的7位；相当于Szots等人报道的66位(a.a.O.))相当于 异亮氨酸(Ile)，

-Z(在肽的11-13位；相当于Szots等人报道的70-72位(a.a. O.))相当于三肽序列Lys-Ala-Gln，或Lys-Ala-Glu，

-W(在肽的20位；相当于Szots等人报道的79位(a.a.O.))相当 于精氨酸(Arg)，

所有这些在替代中优先考虑同系(例如，结构和化学性质相近的)的 氨基酸或氨基酸集团。

在上文提及的Ker333核心序列中，残基X，Y，Z和W对应于 由B27PA和B27PA*衍生而来的肽中相同的氨基酸，例如，

-X(在肽的2位；)相当于天冬氨酸(Asp)，

-Y(在肽的7位；)相当于异亮氨酸(Ile)，

-Z(在肽的11-13位；)相当于三肽序列Lys-Ala-Gln，或Lys- Ala-Glu，

-W(在肽的20位；)相当于精氨酸(Arg)，

所有这些在替代中优先考虑同系的(例如，结构和化学性质相近 的)的氨基酸或氨基酸集团。

在下文表中给出的嵌段序列BL的氨基酸和肽与肽B27PA， B27PA*和Ker333中相同位置的氨基酸一致；其中BL1是1到2个氨 基酸的嵌段，如Trp或Leu，正如在肽B27PA，B27PA*和Ker333的 同样位置上所出现的。设计的BL2包括一个含有4到5个氨基酸的嵌 段。还可以想象这两个嵌段的进一步转换，修饰和替代结果。同样情 况，BL3到BL5肽嵌段分别含有3到4个，6到8个和1到2个氨基 酸。尽管在BL的位置上，可以在维持所需生物学活性的同时进行更 广泛的替代，但在这种情况下，替代中仍优先考虑B27PA，B27PA* 和Ker333核心序列的同系氨基酸，

正如前文多次述及的，最重要的是产生空间结构，此结构的并不 比上文定义序列形成带电和/或表面结构逊色，更优越的是这种修饰肽 的空间结构在整体上，或至少在长度上多于6，最好是8个氨基酸， 其表面结构和电荷分布上与上文述及核心肽或相关片段的是一致的。   BL1  X   BL2   Y     BL3     Z    BL4   W   BL5   名称   1-2as  (2)   4-5as   (7)     3-4as (11，12，13)   6-8as   (20)   1-2as  Asp   Ile  Lys-Ala-Gln     或  Lys-Ala-Glu   Arg   Trp  ″  Arg-Glu  -Thr-Gln    ″  Cys-Lys-Ala     ″  Thr-Asp-  Arg-Glu-  Asn-Leu    ″   Thr   或   Ile  B27PA   Trp  ″  Arg-Glu  -Thr-Gln    ″  Cys-Lys-Ala     ″    -    -    -  B27PA*   Leu  ″  Leu-Asp  -Ser-Ile    ″  Ala-Glu-Val     ″  Thr-Glu-  Glu-Ile-  Ala-Asn    ″   Ser  Ker333

由上文述及核心序列B27PA衍生而来的肽中，BL4也可以特异表 达以下其中一个氨基酸集团：

Thr-Asp-Arg-Glu-Asp-Leu

或

Thr-Asp-Arg-Glu-Ser-Leu

或

Thr-Tyr-Arg-Glu-Asn-Leu

或

Thr-Tyr-Arg-Glu-Asp-Leu

或

Thr-Tyr-Arg-Glu-Ser-Leu

这也同样适用于由上文述及的核心序列B27PB和B27PC衍生的 及含有以下序列的肽。

                 BL6-O-BL7-M-BL8

肽B27PB和B27PC在设计的O和M肽位点是一致的。

优选的，在上文述及的核心序列B27PB中

-O(在肽的2-3位；相当于Szots等人报道的110-111位(a. a.O.))相当于二肽序列Leu-Arg，和

-M(在肽的5位；相当于Szots等人报道的113位(a.a.O.))相当 于酪氨酸(Tyr)。

在上文述及的核心序列B27PC中

-O(在肽的6-7位；相当于Szots等人报道的156-157位(a a.O.))同样相当于二肽序列Leu-Arg，和

-M(在肽的9位；相当于Szots等人报道的159位(a.a O.))相当 于酪氨酸(Tyr)。

这种情况下，O和M位点，及BL位点在替代中优先考虑同系 (例如，结构和化学性质相近的)的氨基酸或氨基酸集团。氨基酸的 替换，修饰，转换，删除和插入可能处于这样的程度之内：基于本发 明的目的，这些改变不会不利地影响以上定义序列造成的电荷和/或 表面结构。优选地，基于表面结构的空间结构和电荷分布与核心片段 的至少一部分，在长度上多于6，最好是多于8个氨基酸的，对肽的 生物学活性至关重要的片段一致。

下表主要通过举例说明在基本核心序列B27PB和B27PC中找到 的相应氨基酸或肽序列位点。

 名称     BL6     O     BL7      M       BL8      B27PB  B27PC     1-5as       Leu     Arg-Val-Ala-Glu-Glu     2as     Leu-Arg     ″     ″     1as       Gly     Ala     1as     Tyr     ″     ″     0-6as       His-Gln-Asp-Ala-Tyr     Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val

但是，必须强调的是由上文述及一般公式中得来的肽并不需要有同 样的所研究的活性谱，例如，HLA-依赖自身免疫性疾病治疗活性。 单个或仅仅一些氨基酸变异足以使之能够作为成功治疗HLA-依赖自 身免疫性疾病的肽，如虹膜炎，银屑病及风湿病如Bechterew′s病(关 节强硬性脊椎炎)，银屑病性关节炎以及男孩常发的青少年类风湿关 节炎，它与开始用的肽不同。

上文所示序列中由8-20个，较好的是10-18个，更好的是 12-16个氨基酸氨基酸组成的肽也是本发明述及的与上文描述的应 用于诊断和治疗的肽。

在本发明方法中，肽的N-末端和/或C-末端进行替换；例如：

脂肪酸和磷酸脂，

糖基和

C1-C12-烷基或C1-C12-链烯残基

所需偶联制剂和偶联方法为技术熟练人员所知。用甲基二硫苯甲 酸(MDTB)通过肽的NH2基团，与激活的烯烃结合，运用双功能 连接试剂，如MBSE，戊二醛和甲基二硫苯甲酸(MDTB)与磷酸脂 如磷酸酰胆碱或磷酸酰乙醇胺偶联可作为例子。

本发明方法中肽直接或通过取代基或偶联系统(如生物素/结合 素)与有机或无机支持物，或如下文将详细介绍的通过直接或间接可 探测的标记物结合或吸附。

上文定义的肽可以进行很多改变而不丢失其基本功能，例如：

1)肽可在N-末端或C-末端扩展。

2)肽可在N-末端或C-末端截短，然而仅限于至少含有6个氨基 酸的肽，最好是至少8个氨基酸。

尤其是在由B27PA和Ker333衍生的肽中，几个特征性氨基酸之 外N-末端或C-末端的截除可以不引起上文定义的生物学活性的丢 失。举一个C-末端截除的例子，B27PA衍生肽B27PA*，如同上文 述及，含有由Szots等人(a.a.O.)编号的HLA-B27序列中60-72的 氨基酸。

本发明还包括以下用在本发明中的肽：

肽B27PA：

Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln-Thr-Asp-

Arg-Glu-Asn-Leu-Arg-Thr，

肽B27PA*：

Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln，

肽B27PB：

Leu-Leu-Arg-Gly-Tyr-His-Gln-Asp-Ala-Tyr，

肽B27PC：

Arg-Val-Ala-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Glu-Gly-Glu-Cys-Val，

肽Ker333：

Leu-Asp-Leu-Asp-Ser-Ile-Ile-Ala-Glu-Val-Lys-Ala-Gln-Tyr-Glu-

Glu-Ile-Ala-Asn-Arg-Ser.

本发明还与由上文述及肽序列衍生、和本中请所具有的HLA-依 赖自身免疫性疾病治疗活性具有可比性的肽相关，可比活性是指高达 200％，某些情况下高达300％，或低于25％的活性。本发明所述由 上文述及序列衍生的肽主要是由单一氨基酸或较小的氨基酸集团替代 序列衍生而来的。这些肽优选用以下方法衍生：

-少量，不超过4或5个氨基酸，单一或小集团被一个或几个，最好 是同系氨基酸替代，和/或

-少量，不超过3个氨基酸的特定氨基酸加至N-末端和/或C-末 端，和/或

-肽在N-末端和/或C-末端截除一小部分氨基酸；一般只在含多 于6，最好是8个氨基酸的肽中截除。

正如前文所述，肽B27PA和Ker333是根据与某些特定位点氨基 酸序列同源性，由各自全序列中选择出来的。现认为至少一些特异氨 基酸位点在肽的生物学活性中很重要。在以下核心序列B27PA和 Ker333，和通过C-末端截除衍生于B27PA的核心序列B27PA*中， 具有相同的单个氨基酸，下文用下划线表示：

肽B27PA：

Trp- Asp-Arg-Glu-Thr-Gln- Ile-Cys-Lys-Ala- Lys- Ala- Gln-Thr-Asp-

Arg-Glu-Asn-Leu- Arg-Thr，

肽Ker333：

Leu- Asp-Leu-Asp-Ser-Ile- Ile-Ala-Glu-Val- Lys- Ala- Gln-Tyr-Glu-

Glu-Ile-Ala-Asn- Arg-Ser，

肽B27PA*：

Trp- Asp-Arg-Glu-Thr-Gln- Ile-Cys-Lys-Ala- Lys- Ala- Gln.

同系氨基酸的替代优先在下划线的氨基酸位点上进行，反之非同 系氨基酸的替代以一定的程度可能发生在其余位点上。但是，必须考 虑到肽序列中其它氨基酸位点对肽的生物学活性也很重要。正如前文 述及多次，肽形成的三维结构对肽的生物学功能至关重要结构的变 化，只要是对于上文定义序列的带电和/或表面结构，最好是修饰肽的 三维结构与核心序列的或生物学功能必需的核心序列之段的结构保持 基本不变，即为可行。

上文所述在HLA-依赖自身免疫性疾病诊断中具有可比应用性， 和/或治疗中具有可比活性的方案，基于上述声明中肽的空间结构，除 替代之外，同样也包括本发明中通过对上文述及序列的个别氨基酸或 相对较小的氨基酸集团修饰(例如，甲基，脂肪酸或糖基基团的修 饰)转换，删除和/或插入的肽结构。

另外，本发明还涉及按照正确顺序和已知方法通过连接氨基酸及 其衍生物产生上文定义肽的方法。

按照上文所述核心序列产生肽的策略包括依照核心序列或这些核 心序列片段的空间结构设计的特异方法。以上文所述同系氨基酸的替 代为例来说明计算机辅助分子模型，以建立影响所得肽空间结构最大 可能的氨基酸替代，修饰，删除或插入为目的。肽构建学的概念，以 产生非肽类似物为目的，是建立与所给原始肽十分类似的三维结构， 对上文述及核心序列或其片段而言，提供一个与“正常”氨基酸形成 嵌段所不同的替代方案。

与上文定义相似的肽还包括上文述及的与之结合的标记物质，此 标记物并不显著影响肽诊断HLA-依赖性自身免疫性疾病的适用性。

本发明中可用的肽，或发明中的肽，可由多种制备方法。例如， 化学合成可以用自动或手动操作市售肽合成仪，例如，Beckman或实 用性Biosystems公司。这种情况下，肽合成的操作按照仪器制造商所 提供的包括在方法容许条件下所用试剂的明确介绍。

其它的可能性包括在手工操作化学合成中。以下是一些关于技术 熟练人员所知方法的参考文献，R.B.Merrifield所用的固相方法 (“固相合成”，Science232，341-347(1986))，此方法是通过用二环 己碳二亚胺(DCCI)激活原始氨基酸复合物的羰基或所需结构的原 始肽部分序列的羰基，和通过一定复合物或最终肽中定位于相同位点 的片段中的氨基官能团激活具有活化羰基末端的复合物。后一种方法 中，需要封闭在同等条件下具有活性的反应物的基团；例如，用三- 丁氧羰基基团(t-BOC基团)处理氨基。

肽可以由自然来源分离，特别是某些由DNA编码肽转染的细菌或 真核细胞，在这些细胞中可以表达DNA。所用方法为技术熟练人员所 掌握，例如DNA扩增，转染和肽纯化分离，例如用层析方法，(离子 交换层析和免疫亲合层析，胶滤过等)和电泳。这种由自然来源分离 的肽十分适用于HLA-依赖自身免疫性疾病的治疗。

正如前文所述，本发明特别包括所述肽在HLA-依赖自身免疫性 疾病的诊断和治疗中的应用。

a)HLA-依赖自身免疫性疾病的诊断

由HLA-B27和角蛋白VI衍生而来的肽用于诊断中，来检测细胞 和体液免疫反应。这使临床综合征的免疫分类更为精确，使特异治疗 成为可能。在所描绘的基础上，这些肽呈递了更为特异的抗原而非相 对完整抗原。另外，对角蛋白来说，与蛋白不同，肽的可溶性在应用 上更为优越。

这里所述的自身免疫性疾病包括HLA-I类相关和HLA-II类相关的 自身免疫性疾病，特别是，并不限于，风湿病复合征，如关节炎，类风 湿和反应性关节炎，银屑病关节炎和青少年类风湿关节炎，还有虹膜 炎，银屑病和眼色素层炎。还提及可用于HLA-B27相关自身免疫性疾 病诊断和治疗的本发明上文定义的肽。在关节强硬性脊椎炎 (Bechterew′s疾病)以及上文提及风湿病综合征的某些情况下，存在 与HLA-B27抗原的联系，特别是某些青少年类风湿关节炎和银屑病关 节炎，及某些虹膜炎，眼色素层炎和银屑病。必须强调的是，上文定 义的肽并不限于适用于HLA-B27相关自身免疫性疾病的诊断和治疗 和/或抑制HLA-B27-相关自身免疫性疾病。相反，还可以用在与 其它HLA-I类抗原相关的自身免疫性疾病，如非-HLA-B27-相关 青少年类风湿关节炎和银屑病关节炎。另外，其实用性还可扩展到 HLA-II类相关自身免疫性疾病，如特异HLA-II类相关关节炎。

这些肽特别适用于作为检测抗体的体外测试系统的抗原，如在酶 联免疫吸收测试(ELISA)或免疫荧光测试，和适用于细胞免疫反 应，如T细胞刺激测试。

在这些测试中，肽可以直接在溶解状态或吸附或共价结合于支持 物上使用。所用肽与可探测的标记底物直接或间接结合。如技术熟练 人员所知，这些标记底物包括荧光底物，酶，含放射活性元素(3H， 13C，32P，35S，125I，等)的基团或分子，和磁性粒子，通过直接 结合或结合系统(如生物素/抗生物素蛋白)来结合。另外，肽的游离 或相应修饰形式可以以试剂盒的形式获得，其中包括检测方法中所需 的其它试剂。

肽也可以直接用于人类诊断。在这种情况下，可通过皮内或皮下 注射以溶液或吸收或结合于支持物形式存在的肽产生免疫反应，然后 测定。肽尤其适用于作为在健康受试者身上引起的延迟性免疫反应的 诊断研究方法，或用于特殊诊断的病人。肽通过传统途径给予，如口 服。静脉注射，皮下注射，肌内注射，等，以包括添加或辅助成分的 形式给予，这是由技术熟练人员所熟悉的应用。

b)HLA-依赖自身免疫性疾病的抑制/治疗

上文定义的由HLA-B27和角蛋白VI衍生而来的肽，可以以a) 中例子中的方法作为以上所列HLA-依赖自身免疫性疾病的治疗剂。

本发明还与抑制或治疗HLA-依赖自身免疫性疾病的肽的应用， 特别是为抑制和/或治疗HLA-依赖自身免疫性疾病制备制剂的应用 有关。

本发明还与治疗人类HLA-依赖自身免疫性疾病的方法有关，包 括给予上文定义的肽。

本发明中，给予所述肽的目的是为使受试对象耐受作为免疫活性 引起的免疫反应靶体的不同自身抗原。在这种情况下，肽产生特异免 疫反应，包括特异-T细胞的耐受，灭活或消除。但是，耐受也可以 由封阻消化性(professionell)或非特定抗原呈递细胞上的抗原呈递 限制因子而引起。

如上文所述，与自身免疫性疾病相关的免疫系统的反应并不局限 在血淋巴细胞中。体液免疫反应，通过抗体，巨噬细胞和其它免疫系 统细胞，也应包括本发明中肽的可能靶体。

病人和正常志愿者的实验发现可以用于确定肽的治疗强度。一方 面，例如，体外检测Bechterew′s疾病(关节强硬性脊椎炎)病人和正 常志愿者的外周血(PBL)中分离的淋巴细胞。这些淋巴细胞用不同 的蛋白和肽及反应进行孵育，细胞扩增增加，用3H-胸腺嘧啶掺入检 测。在此联系中发现，Bechterew′s疾病病人的淋巴细胞与正常志愿者 不同，对肽B27PA*的反应强于肽B27PD(与上文定义不同)。可以 通过肽的一级结构(氨基酸序列)推论淋巴细胞表现的交叉反应活性 正是自身免疫反应的原因。

另外，用肽B27PA*和Ker333在大鼠上作免疫实验，引起类似银 屑病关节炎的指关节肿胀例数分别为四个中有一个，两个中有一个。 这些发现同时表明在反应动物中，肽能够表现出与正常存在于指关节 区的表位的交叉反应活性。此交叉反应活性为自身免疫性疾病的原 因。如果能够获得这方面的结果，那么正如前文举例描述，将相同肽 包括在诊断和进一步判定自身免疫性疾病的类型就很有价值。

在自身免疫眼色素层炎中，前文已经提到交叉反应活性直接提供 了治疗方法(见，如，WO95/29194；S.R.Thurau，等人，Immunology Letters 57，193-201(1997))。肽免疫反应活性的知识在治疗病人中有诊 断重要性，因为此反应活性直接提供这些肽用于治疗的可能性，如， 通过它们调节自身攻击免疫反应。

可以通过静脉注射，皮下或肌内给予，特别是，向予粘膜表面如 鼻腔气管区，肺或胃肠道(特别是口服给予)上文定义的肽，或含有 这些肽的制备物，产生耐受。

在此联系中，要考虑到单个给予或两个或多个上文定义的肽结合 给予。当两个或多个肽给予时，可以同时或次序给予。

制备包括所述肽可以干粉，溶液，悬浊液或气溶胶，如鼻喷雾或 吸入喷雾形式给予。制备包括活性底物和传统的辅助和携带底物。肽 可以每日10微克到1000微克每公斤体重的剂量给予。

本发明中的优选给予模式是通过粘膜，特别是鼻腔，肺和胃肠道 粘膜，用鼻腔或吸入喷雾或口服给予肽。口服，鼻或吸入产生耐受机 制还属未知，目前的知识认为细胞效应并不重要，至少不通过CTL的 途径。由给予粘膜抗原产生的调节细胞还未完全分辨或功能定性。

口服给予时，可以用释放系统，如，胶囊，肽可以通过它在特定 的胃肠道部位释放，如小肠的某段区域，通过这种释放，在其特定位 置，持续一个相对较长的时间。这样可以，例如，使制备物免于与胃 中的攻击性，酸性物质接触。植入的缓释设计也可用于皮下给予。技 术熟练人员对上文所述类型的缓释设计很熟悉。

虽然本文并不排除以治疗为目的通过皮肤给予肽，以目前的知识 它并不作为优选方案。例如，在银屑病中，皮肤溃疡处的自身攻击T 淋巴细胞能够将皮肤给予的肽识别为已制备的在相应MHC条件下的 抗原，如，蛋白水解裂解，这样会加强自身攻击反应。

与目前一些中心所尝试的用完整蛋白诱导耐受的方法相比，用上 文所述肽诱导耐受在HLA-依赖自身免疫性疾病中有很多优越性， 如：

1)肽可以用蛋白化学相对简单的合成。

2)肽并不由天然组织中分离得到。减少了组织可能感染的病毒， 病原体或细菌感染的可能性，和由相应(逆)病毒或细菌DNA引起的 二次感染的可能性。

3)作为由动物物质分离蛋白的替代方法的重组产生方法并不需 要，因为很费力且产量相对低。

4)肽在干粉状态有很长的保存寿命，且并不需要如何特殊的储存 条件。

5)与蛋白相比较，以食物或接触过敏为形式的敏化危险，在肽中 并不出现，因为它不能与浆细胞或嗜酸性细胞表面的IgE发生交联效 应。

6)如上文描述，肽在免疫系统中有调节效应。

实施例

本发明中，上文定义的肽，用作测定细胞免疫反应的体外探测系 统抗原的适用性，由肽B27PA*一系列检测来例证。

肽：

所测试肽是上文提及的肽B27PA*，它是由B27PA的核心序列的 C-末端截除8个氨基酸所得，其包括Szots等人(Loc.cit.)所述 HLA-B27序列中的60-72氨基酸：

B27PA*：

Trp-Asp-Arg-Glu-Thr-Gln-Ile-Cys-Lys-Ala-Lys-Ala-Gln

及对照肽B27PD，它与本发明可用的肽情况不同，包含Szots等 人(Loc.cit)所述HLA-B27序列中的125-138氨基酸：

B27PD：

Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-Ala-Asp-Thr.

肽B27PD在实验性自身免疫眼色素层炎(EAU)大鼠模型中引 起眼色素层炎(WO95/29194；G.Wildner & S.R.Thurau，Eur.J. Immunol.24，2579-2585(1994))。

肽B27PA*是在半自动肽合成仪上按照制造商说明书制备的。肽 B27PD由Neosystems，Strasbourg，France制备。肽由未添加RPMI- 1640溶解。

病人：

所探测的外周血T淋巴细胞(PBL)来源于有关节强硬性脊椎炎 (AS)的HLA-B27+病人，其它脊椎关节病HLA-B27+病 人，有类风湿关节炎(RA)的HLA-B27-病人，健康HLA- B27+对照主体和健康HLA-B27-对照主体。

有关节强硬性脊椎炎(AS)的HLA-B27+病人：

本研究中有关节强硬性脊椎炎(AS)的55个病人完全符合New york修正的关于准确AS的定义(S.Vander Linden，H.A.Valkenburg， A.Cats，Arthritis Rheum.27，361-368，(1984))：(36男性和19女性； 平均年龄：409年，年龄范围：18-71岁)。所有病人符合临床 “急性”病的前提条件。

其它脊椎关节病HLA-B27+病人：

本研究中的28个患有其它脊椎关节病HLA-B27+病人包括5个 有反应性关节炎，10个有银屑病关节炎和13个有肠病关节炎并发 Crohn′s疾病或溃疡性大肠炎(15男性和13女性；平均年龄：42.4 年，年龄范围：22-76岁)的病人。

健康HLA-B27+对照主体：

本研究中包括30个主体(18男性和12女性；平均年龄：46.2 年，年龄范围：20-78岁)。

健康HLA-B27-对照主体：

本研究中包括22个主体(10男性和12女性；平均年龄：30.8 年，年龄范围：22-53岁)。

有类风湿关节炎(RA)的HLA-B27-病人：

本研究中包括7个急性类风湿关节炎(RA)的HLA-B27-病 人(1个男性和4个女性；平均年龄：56.8年，年龄范围：30-72 岁)。

对照血捐献者中没有人有脊椎关节炎个人或家族发病史，也没有 近期发生过胃肠道或泌尿生殖道感染。

外周血淋巴细胞(PBL)的分离：

由肝素化外周血获得的PBLs是用Ficoll-Hypaque梯度标准离心， 三次清洗并重悬于RH10培养基中(含2mM L-谷氨酰胺，HEPES， 100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素和10％热灭活人类AB血清的 RPMI-1640基质)。

淋巴细胞扩增检测：

用或不用刺激物，用RH10培养基在96孔圆底微孔板 (Nunc，Roskilde，Denmark)上制备5×10E4 PBLs，终体积为10ul。所 用肽终浓度为10ug/ml。所有实验重复三次。培养物在潮湿环境(5％ CO2，95％空气)下37摄氏度孵育6天。第5天，向每孔加入0.25uCi 3H-胸腺嘧啶(3H-TdR；Amersham，Braunschweig，Germany)。第6 天，细胞用标准收集法通过玻璃滤纸收集。3H-TdR掺入用液闪计 数定量。结果以刺激结果([有刺激物的cpm-无刺激物的cpm]：[无 刺激物的cpm])表示。

肽B27PA* 剂量/反应曲线的测定：

与B27PA*反应的来源于病人(AS1)的1×10E5 PBLs在不含 或含0.1到50.0ug/ml不同浓度的合成肽B27PA*的100ulRH10培养基 中孵育6天，在第5天用0.25uCi的3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)刺 激，第6天用玻璃滤纸收集。结果用每分平均计数(cpm)+-三次重复结 果的标准误差。

B27PA* 特异T细胞系的产生：

3×10E6PBLs在含10ug肽B27PA*/ml的总体积为2ml的RH10 培养基的12孔板上孵育。PBLs由有关节强硬性脊椎炎的AS1和AS2 病人和健康HLA-B27+(H1)血液捐献者分离得到，所有测试者 在开始淋巴细胞扩增鉴定(见“结果”)中表现出对B27PA*明显的淋 巴细胞增殖反应；有关节强硬性脊椎炎，AS2，而不表现出增殖反应 的病人的PBLs作为对照。经过3天的培养，培养基由新鲜添加20U 重组IL-2(rIL-2，Boehringer Ingelheim，Germany)/ml的RH10 替代。在第10天，培养物用自体，照射(4000rads)过的PBLs作为饲细 胞，添加了10ug的B27PA*肽/ml和rIL-2的RH10清洗和再刺激。再 刺激过程中，每1×10E6反应者细胞用2×10E6饲养细胞，所得T 细胞系用淋巴细胞增殖检测进行功能定性，其中用1×10E4T细胞为 反应细胞和1×10E4自身E-(例如，通过绵羊红细胞玫瑰花形成 实验由自身PBLs中分离单核细胞/B细胞侵蚀部分)作为饲养细胞， 总体积为150ulRH10，以上方法在E.Hermann，B.Fleischer，W.-J. Mayet，T.Poralla，K.-H Meyer zum Buschenfelde，Clin Exp.Immunol. 75，365-370(1989)中描述过。肽B27PA*(10或1ug/ml)和B27PD (10ug/ml)作为刺激剂，植物血凝素(PHA；1ug/ml)作为阳性 肽。为了检测单克隆抗体(Mabs)阻断肽-特异T细胞增殖的能 力，Mabs w6/32(抗-HLA-I类，1∶400)，DA6.231(抗-HLA-II； 1∶400)和1ug ml TCR-δ1(γδ-TCR的δ-链上片段决定蔟特异 性；T Cell Sciences，Cmbridge，MA，USA)加入含B27PA*的培养物。 培养的第3天，细胞用0.25uCi的3H-TdR刺激并按上文描述收获和 计数。

肽刺激T细胞系的表现型分析(FACS)：

在培养第8和20天的培养物中T细胞系，及未刺激的PBLs用细 胞分类器分析.每次实验开始3×10E5细胞用未结合Mabs抗-CD3 (OKT3)，抗-CD4(OKT4)，抗-CD8(OKT8)(混合上 清液)BMA.031(TCR-αβ上片段决定蔟特异性)和TCR-δ1标 记，然后用RPMI-1640/10％胎牛血清中荧光素异硫氰酸盐结合的多 克隆羊抗小鼠-IgG抗体(Medac，Hamburg，Germany)标记。用荧光 活化细胞分类器(FACStar，Becton Dickinson)进行细胞荧光测定分 析，每个样品中6000个细胞计数。结果用单克隆抗体(Mabs)-描 述阳性染色细胞的百分比比上所有CD3-阳性T细胞百分比来表示。

结果

PBLs对HLA-B27-衍生肽的增殖反应：

如表1所示，B27PA*在17/55有AS(SI在2.5和17之间)的 测试病人和3/30正常HLA-B27+血液捐赠者(SI在2.5和9.8) 中引起明显PBL扩增(SI＞＝2.5)。有AS的测试病人和3/30正常 HLA-B27+血液捐赠者组间有明显差异(p＝0.0135；Mann-Whitney rank sum test；Stat Exact Programme)。在2/28其它HLA-B27-相 关脊椎关节炎和2/22正常HLA-B27-对照主体中只有轻微PBL增殖 (SI＝2.5)。

由于已知一些T细胞对抗原反应时可以被刺激后分泌细胞因子而 不增殖，对肽反应(AS1)或不反应(AS2)的病人的PBLs中分泌 IFN-γ的T细胞比例用酶联免疫点印迹(ELISPOT)测定(按D.M. Klinman，T.B.Nutman修正的，“ELISPOT assay to detect cytokine- secreting murine and human cells″，in：Current Protocols in Immunology， 7th edition，Eds.：J.E.coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M. Shevach.W.Strober，Brooklyn，New York，Greene Publishing Associates，1994)灵敏的ELISPOT技术表明10E5的AS1病人PBLs中 的8个和10E5的AS2病人PBLs中的1个表现出B27PA*-刺激T细 胞产生IFN-γ的特异性。

RA病人PBLs并不被这两种所用肽刺激。

有趣的是，健康的HLA-B27+血液捐赠者(称为H1)，健康 的HLA-B27+实验主体组中一个30岁男性血液捐赠者对B27PA* 肽(SI＝9.8)表现出最强的PBL扩增反应，在我们取血样8个月 后，表现出炎症类型的后期疼痛，僵直持续1h。不幸的是，此人， H1，并未为风湿病学者进行病理检查。

如下表所示，一个AS病人的PBLs的B27PA*特异反应(为PBLs 对肽的反应)，是剂量依赖并在培养基终浓度为10ug/ml时达到最 大。     肽终浓度     B27PA*：     (ug/ml)     0     0.1     1.0     5.0     7.5     10.0     20.0     50.0     cpm±标准误     165±20     218±25     565±47     1576±70     2492±72     2718±76     2695±88     2733±84

这些结果表明有HLA-B27序列合成的肽，如B27PA*，被有关 节硬化脊椎炎HLA-B27+病人的PBLs作为自身抗原特异识别，至 少还能为HLA-B27+对照主体以较低程度识别。

尽管HLA-B27衍生肽B27PA*和B27PD对PBL捐赠者为外 源，在HLA-B27-对照主体中不诱导增殖或仅有轻微增殖。缺乏与 这些HLA-B27决定蔟反应的对照PBLs的增殖可以解释为这种反应 活性表现出的“间接共识别”，其特点是宿主MHC-限制性T细胞 共反应固定地指向外源MHC抗原上单一或一些主要决定簇。(G. Benichou，R.C.Tam，L.R.B.Loares，E.V.Fedoseyeva，Immnol.Today 18：67-71(1997))另外，在本研究中所检测的肽并不表现出与可能在 HLA-B27-志愿者中引起共反应T细胞反应的HLA-B27分子相同 的决定簇。

B27PA*-特异T细胞系的功能鉴定：

如上文所描述，3个不同的B27PA*-特异T细胞系通过培养和再 刺激含B27PA*肽的来源于病人AS1和AS3及健康HLA-B27+血液 捐赠者(H1)的PBLs而产生。AS1和AS3是其PBLs在与肽 B27PA*反应时强烈增殖的病人(AS1：SI＝17.5；AS3：SI＝15.4)。血 液捐献者H1的PBLs用B27PA*(SI＝9.8)刺激。对照T细胞系 B27PA*-AS2由与B27PA*(SI＝1)反应不增殖的PBLs衍生而来。T细 胞系在培养第20天分析。如下表所示，细胞系B27PA*-AS1， B27PA*-AS3，B27PA*-H1与B27PA*肽反应特异性增殖，而对照 细胞系B27PA*-AS2并不如此。不可能用抗-MHC-I类 Mabs(w6/32)或抗MHC-II类Mabs(DA6.231)抑制这种特异的T细胞 增殖。而单克隆抗体TCR-δ1抗-γδ-TCR)可以阻断大于50％ 的用1ug/mlB27PA*刺激的培养物中B27PA*特异性增殖反应，而对 PHA诱导的增殖没有效应。

                                                       T-细胞系     B27PA*-AS1     B27PA*-AS3     B27PA*-H1     B27PA*-AS2     T+培养基     T+E-+培养基     T+E-+B27PA*(10μg/ml)     +w6/32     +DA6.231     +TCR-δ1     T+E-+B27PA*(1μg/ml)     +w6/32     +DA6.231     +TCR-δ1     T+E-+B27PD(10μg/ml)     T+E-+PHA(1μg/ml)     +TCR-δ1     72±5     89±9     1548±34     1576±55     1513±102     855±85     912±90     925±82     896±77     411±42     101±16     3689±177     3650±158     75±8     96±11     1120±48     1105±41     1077±83     635±64     725±48     730±50     695±55     304±29     95±10     4248±124     4268±135     68±8     85±10     1368±58     1379±67     1322±117     893±82     816±55     827±69     803±53     410±40     94±21     3480±145     3538±170     86±9     114±16     134±18     n.best.     n.best.     n.best.     126±22     n.best.     n.best.     n.best.     125±12     4068±170     4103±182

n.b.＝未确定

B27PA* 特异性T细胞系的流式细胞分析：

从上表可以看出，与未刺激的PBLs(0天)或仅用rIL-2刺激的 PBLs系相比较，B27PA*特异性T细胞系B27PA*-AS1，B27PA*- AS3，B27PA*-H1(培养第8和20天的产物)表现型源于B27PA*- 刺激细胞系中γδ-TCR+淋巴细胞的扩展。在第20天，γδ-TCR+ 淋巴细胞在所有CD3阳性细胞中分别含有25.5％(志愿者AS1)， 30.4％(志愿者AS3)，32.7％(志愿者H1)。相反，B27PA*-刺激对照 细胞系B27PA*-AS2仅含7.4％γδ-TCR+细胞。下表数据以占总 CD3-阳性T细胞的百分比形式给出。

TCR-αβ(％)    CD4(％)   CD8(％) TCR-γδ(％) 供体AS1 新鲜分离的PBLs B27PA*刺激，第8天 B27PA*刺激，第20天 rIL-2刺激，第20天       93.5     84.9     73.6     93.0       69.8     52.9     45.1     67.7       24.6     28.2     30.5     26.7       5.3     13.7     25.5     6.3 供体AS3 新鲜分离的PBLs B27PA*刺激，第8天 B27PA*刺激，第20天 rIL-2刺激，第20天       93.3     83.6     59.2     92.2       71.0     63.5     34.4     75.8       22.4     21.3     25.6     16.6       5.8     15.5     30.4     7.2 供体H1 新鲜分离的PBLs B27PA*刺激，第8天 B27PA*刺激，第20天 rIL-2刺激，第20天       95.7     85.2     67.1     93.7       73.1     58.4     34.9     75.0       22.3     26.5     31.5     18 4       4.1     14.0     32.7     6.0 供体AS2 新鲜分离的PBLs B27PA*刺激，第8天 B27PA*刺激，第20天 rIL-2刺激，第20天       94.1     92.3     91.9     92.1       66.3     68.6     70.2     74.3       27.4     24.0     21.4     18.5       5.3     7.2     7.8     7.4

用Mabs阻断B27PA*-特异性T细胞系的FACScan分析和实验数 据表明γδ-TCR+T细胞，比起CD4-阳性αβ-TCR+T细 胞，在与HLA-B27-衍生肽体外孵育后刺激和膨胀细胞中占多数。 在此联系中，值得一提的是自身反应γδ-TCR+细胞可能与一些人 类自身免疫性疾病有关(J.Soderstrom，E.Halapi，e.Nisson，A. Gronberg，j.van Embden，L.Klareskog，R.Kiessling，Scand.J.Immunol. 32，503-515(1990))，包括类风湿关节炎，尽管在RA病人的外周血或 滑液和膜中γδ-TCR+细胞的相对数量并不增加。(M.Smith，B. Broker，L.Moretta，E.Ciccone，C.E.Grossi，J.C.W.Edwards，F.yuksel，B. Colaco，C.Worman，L.Mackenzie，R.Kinne，G.Weseloh，K.GLuckert， P.M.Lydyard，Scand.J.Immunol.32，585-593(1990))在脊椎关节炎中， Klebsiella肺炎中增殖的γδ-TCR+细胞(E.Hermann，B.Sucke， U.Droste，K.-H.Meyer zum Buschenfelde，Arthtisis Rheum.38，1277-1282， (1995))或对自身靶体，Daudi细胞系或感染了肠细菌的B细胞系表现 出细胞毒性的γδ-TCR+细胞(E.Hermann，B.Ackermann，R. Duchmann，K.-H.Meyer zum Buschenfelde，Clin.Exp.Rheumatol.13， 187-191，(1995))由滑液中分离得到。按照脊椎关节炎的病理机制推 论，γδ-TCR+细胞可能在抗感染致关节炎的细菌的细胞或自身相 同的炎症“应激”组织的早期防御机制中起作用(E.Hermann，B Ackermann，R.Duchmann，K.-H.Meyer zum Buschenfelde，Clin.Exp. Rheumatol.13，187-191，(1995)。另一个着眼于HLA-B27肽特异性γ δ-TCR+细胞作用的观察是在实验自身免疫眼色素层炎(EAU)的 动物模型中进行。从由口服产生眼色素层炎自身抗性S-Ag肽或交 叉反应肽B27PD诱导耐受的大鼠转移出来的γδ-TCR+细胞能够 以抗原特异的形式抑制眼色素层炎(G.Wildner，T.Hunig，S.Thurau， Eur.J.Immunol.26，2140-48，(1996))。在结果中能够获得具有对源于 HLA-B抗原B27肽的特异性的γδ-TCR+细胞，其中与疾病有 关的HLA-B抗原B27可能与免疫调节，甚至下调人类关节强硬性 脊椎炎中的炎症有关。这项在以上文描述检测方法进行的观察中，健 康者，HLA-B27阳性血捐献者的周边T细胞与B27PA*肽反应这一 现象与后期可能性并不矛盾。

                        序列表

(1)一般信息：

  (i)申请人：

    (A)名称：Wildner，Gerhild

    (B)街道：Rupprechtstrasse 8a

    (C)城市：Munich

    (E)国家：Germany

    (F)邮编：(ZIP)：80636

  (ii)发明题目：用作自身免疫疾病的诊断和治疗剂的肽

  (iii)序列数：11个

  (iv)计算机可读形式：

    (A)媒体类型：Floppy disk

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)

  (V)目前申请数据：

    申请号：PCT/EP97/05124

  (VI)先有申请数据：

    (A)申请号：DE19638108.08

    (B)申请日：18-SEP-1996

(2)SEQ ID NO：1信息：

  (i)序列描述：

    (A)长度：21个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑学：线型

  (ii)分子类型：肽

  (iii)假说的：非

  (v)片段类型：内部的

  (vi)原始来源：

    (A)生物：人类

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：肽

    (B)位置：1…21

    (D)其它信息：/标记＝来自HLA-B27的α-l-结构域 的肽B27PA(氨基酸60-80)

  (xi)SEQ ID NO：1的序列描述：

Trp Asp Arg Glu Thr Gln Ile Cys Lys Ala Lys Ala Gln Thr Asp Arg

1               5                   10                  15

Glu Asn Leu Arg Thr

            20

(2)SEQ ID NO：2信息：

  (i)序列描述：

    (A)长度：13个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑学：线型

  (ii)分子类型：肽

  (iii)假说的：非

  (v)片段类型：内部的

  (vi)原始来源：

    (B)生物：人类

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：肽

    (B)位置：1…13

    (D)其它信息：/标记＝来自HLA-B27的α-1-结构域的肽 B27PA*(氨基酸60-72)

  (xi)SEQ ID NO：2的序列描述：

Trp Asp Arg Glu Thr Gln Ile Cys Lys Ala Lys Ala Gln

1               5                   10

(2)SEQ ID NO：3信息：

  (i)序列描述：

    (A)长度：10个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑学：线型

  (ii)分子类型：肽

  (iii)假说的：非

  (v)片段类型：内部的

  (vi)原始来源：

    (C)生物：人类

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：肽

    (B)位置：1…10

    (D)其它信息：/标记＝来自HLA-B27的α-2-结构域的肽 B27PB(氨基酸109-118)

  (xi)SEQ ID NO：3的序列描述：

Leu Leu Arg Gly Tyr His Gln Asp Ala Tyr

1               5                   10

(2)SEQ ID NO：4信息：

  (i)序列描述：

    (A)长度：15个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑学：线型

  (ii)分子类型：肽

  (iii)假说的：非

  (v)片段类型：内部的

  (vi)原始来源：

    (D)生物：人类

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：肽

    (B)位置：1…15

    (D)其它信息：/标记＝来自HLA-B27的α-2-结构域的肽 B27PC(氨基酸151-165)

  (xi)SEQ ID NO：4的序列描述：

Arg Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Glu Cys Val

1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：5信息：

  (i)序列描述：

    (A)长度：21个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑学：线型

  (ii)分子类型：肽

  (iii)假说的：非

  (v)片段类型：内部的

  (vi)原始来源：

    (E)生物：人类

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：肽

    (B)位置：1…13

    (D)其它信息：/标记＝来自人类角蛋白VI的肽Ker333

  (xi)SEQ ID NO：5的序列描述：

Leu Asp Leu Asp Ser Ile Ile Ala Glu Val Lys Ala Gln Tyr Glu Glu

1               5                   10                  15

Ile Ala Asn Arg Ser

            20

(2)SEQ ID NO：6信息：

  (i)序列描述：

    (A)长度：11个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑学：线型

  (ii)分子类型：肽

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：1

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝1-2个氨基酸，例如，由B27PA衍 生的肽中的Trp或，例如由Ker33衍生的肽中的Leu。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：3

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝4-5个氨基酸，例如，由B27PA衍 生的肽中的Cys-Lys-Ala或，例如由Ker33衍生的肽中的Ala-Gly-Val。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：9

    (C)其它信息：/标记“Xaa＝6-8个氨基酸，例如，由B27PA衍 生的肽中的Thr-Asp/Tyr-arg-Glu-Asn/Asp/Ser-Leu或，例如由Ker33 衍生的肽中的Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：11

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝1-2个氨基酸，例如，由B27PA衍 生的肽中的Thr or Ile或，例如由Ker33衍生的肽中的Ser。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：肽

    (B)位置：1…11

    (D)其它信息：/标记＝衍生于肽B27PA或肽Ker333的肽，如 果合适，在其C或N端延长或截短(截短通常限于至少6个氨基酸的 肽)

  (xi)SEQ ID NO：6的序列描述：

Xaa Asp Xaa Ile Xaa Lys Ala Gln Xaa Arg Xaa

1               5                   10

(2)SEQ ID NO：7信息：

  (i)序列描述：

    (A)长度：11个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑学：线型

  (ii)分子类型：肽

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：1

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝1-2个氨基酸，例如，由B27PA衍 生的肽中的Trp或，例如由Ker33衍生的肽中的Leu。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：3

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝4-5个氨基酸，例如，由B27PA衍 生的肽中的Arg-Glu-Thr-Gln或，例如由Ker33衍生的肽中的Leu- Asp-Ser-Ile。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：5

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝3-4个氨基酸，例如，由B27PA衍 生的肽中的Cys-Lys-Ala或，例如由Ker33衍生的肽中的Ala-Glu- Val。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：9

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝6-8个氨基酸，例如，由B27PA衍 生的肽中的Thr-Asp/Tyr-Arg-Glu-Asn/Asp/Ser-Leu或，例如由Ker33 衍生的肽中的Tyr-Glu-Glu-Ile-Ala-Asn。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：11

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝1-2个氨基酸，例如，由B27PA衍 生的肽中的Thr or Ile或，例如由Ker33衍生的肽中的Ser。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：肽

    (B)位置：1…11

    (D)其它信息：/标记＝衍生于肽B27PA或肽Ker333的肽，如 果合适，在其C或N端延长或截短(截短通常限于至少6个氨基酸的 肽)

  (xi)SEQ ID NO：7的序列描述：

Xaa Asp Xaa Ile Xaa Lys Ala Glu Xaa Arg Xaa

1               5                   10

(2)SEQ ID NO：8信息：

  (i)序列描述：

    (A)长度：8个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑学：线型

  (ii)分子类型：肽

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：1

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝1-2个氨基酸，例如，Trp。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：3

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝4-5个氨基酸，例如，Arg-Glu-Thr-Gln。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：5

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝3-4个氨基酸，例如Cys-Lys-Ala。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：肽

    (B)位置：1…8

    (D)其它信息：/标记＝衍生于肽B27PA*如果合适，在其C或 N端延长或截短(截短通常限于至少6个氨基酸的肽)

  (xi)SEQ ID NO：8的序列描述：

Xaa Asp Xaa Ile Xaa Lys Ala Gln

1               5

(2)SEQ ID NO：9信息：

  (i)序列描述：

    (A)长度：8个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑学：线型

  (ii)分子类型：肽

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：1

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝1-2个氨基酸，例如，Trp。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：3

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝4-5个氨基酸，例如，Arg-Glu-Thr- Gln。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：5

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝3-4个氨基酸，例如Cys-Lys-Ala。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：肽

    (B)位置：1…8

    (D)其它信息：/标记＝衍生于肽B27PA*如果合适，在其C或 N端延长或截短(截短通常限于至少6个氨基酸的肽)

  (xi)SEQ ID NO：9的序列描述：

Xaa Asp Xaa Ile Xaa Lys Ala Glu

1               5

(2)SEQ ID NO：10信息：

  (i)序列描述：

    (A)长度：6个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑学：线型

  (ii)分子类型：肽

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：1

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝1-5个氨基酸，例如，衍生于B27PB 的肽中的Leu，或，衍生于B27PC的Arg-Val-Ala-Glu-Gln。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：4

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝1个氨基酸，例如，衍生于B27PB 的肽中的Gly，或，衍生于B27PC的Ala。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：区域

    (B)位置：1

    (D)其它信息：/标记“Xaa＝0-6个氨基酸，例如，衍生于B27PB 的肽中的His-Gln-Asp-Ala-Tyr，或，衍生于B27PC的Leu-Glu-Gly-Glu- Cys-Val。

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：肽

    (B)位置：1…6

    (D)其它信息：/标记＝衍生于肽B27PB或肽B27PC，如果合适， 在其C或N端延长或截短(截短通常限于至少6个氨基酸的肽)

  (xi)SEQ ID NO：10的序列描述：

Xaa Leu Arg Xaa Tyr Xaa

1               5

(2)SEQ ID NO：11信息：

  (i)序列描述：

    (A)长度：14个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：

    (D)拓扑学：线型

  (ii)分子类型：肽

  (iii)假说的：非

  (v)片段类型：内部的

  (vi)原始来源：

    (A)生物：人类

  (ix)特征，

    (A)名称/关键词：肽

    (B)位置：1…14

    (D)其它信息：/标记＝可比于肽B27PD

  (X)公开信息：

    (A)作者：Wildner，Gerhild

             Thurau Stephan

    (C)杂志：Eur.J，Immunol.

    (D)卷：24

    (E)页：2579-2585

    (F)日期：1994

  (xi)SEQ ID NO：11的序列描述：

Ala Leu Asn Glu Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr

1               5                   10