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新的抗原结合蛋白

阅读：412发布：2021-08-13

专利汇可以提供新的抗原结合蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及与MAGE-A3结合的抗原结合蛋白如抗体、编码这种抗原结合蛋白的多核苷酸、所述抗原结合蛋白的诊断应用和制备方法。，下面是新的抗原结合蛋白专利的具体信息内容。

权利要求

1.抗原结合蛋白，其与MAGE-A3 和 MAGE-A6特异性结合，但其不与MAGE-A2或MAGE-A12特异性结合。
2.抗原结合蛋白，其与MAGE-A3 和 MAGE-A6特异性结合，但其不与MAGE-A 亚家族的任何其他成员特异性结合。
3.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其包含具有选自SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDRH3。
4.根据权利要求3所述的抗原结合蛋白，其进一步包含选自如下的一个或多个或所有CDR：CDRH1 (SEQ ID NO:50)、CDRH1 (SEQ ID NO:56)、CDRH1 (SEQ ID NO:62)、CDRH2 (SEQ ID NO:51)、CDRH2 (SEQ ID NO:57)、CDRH1 (SEQ ID NO:63)、CDRL1 (SEQ ID NO:53)、CDRL1 (SEQ ID NO:59)、CDRL1 (SEQ ID NO:65)、CDRL2 (SEQ ID NO:54)、CDRL2 (SEQ ID NO:60 )、CDRL2 (SEQ ID NO:66)、CDRL3 (SEQ ID NO:55)、CDRL3 (SEQ ID NO:61)、CDRL3 (SEQ ID NO:67)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中CDRH1是SEQ ID NO:50，CDRH2是SEQ ID NO:51，并且CDRH3是SEQ ID NO:52。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中CDRH1是SEQ ID NO:56，CDRH2是SEQ ID NO:57，并且CDRH3是SEQ ID NO:58。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中CDRH1是SEQ ID NO:62，CDRH2是SEQ ID NO:63，并且CDRH3是SEQ ID NO:64。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中CDRL1是SEQ ID NO:53，CDRL2是SEQ ID NO:54，并且CDRL3是SEQ ID NO:55。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中CDRL1是SEQ ID NO:59，CDRL2是SEQ ID NO:60，并且CDRL3是SEQ ID NO:61。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中CDRL1是SEQ ID NO:65，CDRL2是SEQ ID NO:66，并且CDRL3是SEQ ID NO:67。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其进一步包含下列中的至少一个：
(a) 与SEQ ID NO:39的构架区具有75％或更高的序列同一性的重链可变区受体抗体构架；
(b) 与SEQ ID NO:43的构架区具有75％或更高的序列同一性的重链可变区受体抗体构架；
(c) 与SEQ ID NO:47的构架区具有75％或更高的序列同一性的重链可变区受体抗体构架；
(d) 与如SEQ ID NO:41中所示的构架区具有75％或更高的序列同一性的轻链可变结构域受体抗体构架；
(e) 与如SEQ ID NO:45中所示的构架区具有75％或更高的序列同一性的轻链可变结构域受体抗体构架；或
(e) 与如SEQ ID NO:49中所示的构架区具有75％或更高的序列同一性的轻链可变结构域受体抗体构架。
12.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其包含：
(i) SEQ ID NO: 47的重链可变区或与SEQ ID NO:47具有75%或更高的序列同一性的变体重链可变区，和SEQ ID NO: 49的轻链可变区或与SEQ ID NO:49具有75%或更高的序列同一性的轻链可变区；
(ii) SEQ ID NO: 39的重链可变区或与SEQ ID NO:39具有75%或更高的序列同一性的变体重链可变区，和SEQ ID NO: 41的轻链可变区或与SEQ ID NO:41具有75%或更高的序列同一性的轻链可变区；或
(iii) SEQ ID NO: 43的重链可变区或与SEQ ID NO:43具有75%或更高的序列同一性的变体重链可变区；和SEQ ID NO: 45的轻链可变区或与SEQ ID NO:45具有75%或更高的序列同一性的轻链可变区。
13.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，包含：
(a) SEQ ID NO:52 (GGNNGFAY)的CDRH3或具有在SEQ ID NO:52的氨基酸残基2处的Trp取代Gly的变体；
(b) SEQ ID NO:50 (SDYVWN)的CDRH1或具有在SEQ ID NO:50的氨基酸残基4处的Ala取代Val的变体；
(c) SEQ ID NO:51 (YIGHSGRTSY NPSLKS)的CDRH2，或包含在SEQ ID NO:51的第2个氨基酸残基处的Met或Val取代Ile、在SEQ ID NO:51的第4个氨基酸残基处的Tyr取代His或在SEQ ID NO:51的第10个氨基酸残基处的Leu取代Tyr的变体；
(d) SEQ ID NO:53 (KSSQSLLNSG NQKNYLT)的CDRL1，或包含在SEQ ID NO:53的第5个氨基酸残基处的Asn、Asp、Thr或Glu取代Ser、在SEQ ID NO:53的第7个氨基酸残基处的Asp、Tyr、Val、Ile、Ser、Asn Phe、His、Gly或Thr取代Leu、在SEQ ID NO:53的第14个氨基酸残基处的Ser、Thr、Lys或Gly取代Asn；在SEQ ID NO:53的第15个氨基酸残基处的Phe、Asn、Ala、His、Ser或Arg取代Tyr；或在SEQ ID NO:53的第16个氨基酸残基处的Met、Val、Ile或Phe取代Leu的变体；
(e) SEQ ID NO:54 (WTSTRDS)的CDRL2；和
(f) SEQ ID NO:55 (QNDYSYPPT)的CDRL3，或包含在SEQ ID NO:55的氨基酸残基1处的Ser、Gly、Phe或Leu取代Gln、在SEQ ID NO:55的氨基酸残基2处的Gln或His取代Asn；在SEQ ID NO:55的氨基酸残基3处的Asn、Phe、Gly、Ser、Arg、His、Thr、Tyr或Val取代Asp、在SEQ ID NO:55的氨基酸残基4处的Asn、Trp Thr、Ser、Arg、Gln、His、Ala或Asp取代Tyr；或在SEQ ID NO:55的氨基酸残基5处的Glu、Asn、Gly、His、Thr、Arg、Ala取代Ser、在SEQ ID NO:55的氨基酸残基6处的Asp、Thr、Val、Leu、His、Asn、Ile、Trp、Pro或Ser取代Tyr；或在SEQ ID NO:55的氨基酸残基8处的Leu、Tyr、Arg、Ile、Trp或Phe取代Pro的变体；
所述抗原结合蛋白结合MAGE A3。
14.权利要求13的抗原结合蛋白，其包含：
(a) SEQ ID NO:52的CDRH3；
(b) SEQ ID NO:50的CDRH1；
(c) SEQ ID NO:51的CDRH2；
(d) SEQ ID NO:53的CDRL1；
(e) SEQ ID NO:54的CDRL2；
(f) SEQ ID NO:55的CDRL3；
(g) 重链构架，如SEQ ID NO:39中所述，包含第2个氨基酸残基处的Val；第20个氨基酸残基处的Leu；第22个氨基酸残基处的Cys；第24个氨基酸残基处的Val；第26个氨基酸残基处的Gly；第29个氨基酸残基处的Ile；第36个氨基酸残基处的Trp；第47个氨基酸残基处的Trp或Tyr；第48个氨基酸残基处的Met；第69个氨基酸残基处的Ile或Met；
第71个氨基酸残基处的Arg、Lys或Val；第76个氨基酸残基处的Asn；第78个氨基酸残基处的Phe；第80个氨基酸残基处的Leu；或第92个氨基酸残基处的Cys，其中氨基酸残基使用Kabat方案编号；和
(h) 轻链构架，如SEQ ID NO:41中所述，包含第2个氨基酸残基处的Ile、Leu或Val；
第3个氨基酸残基处的Val、Gln、Leu或Glu；第4个氨基酸残基处的Met或Leu；第23个氨基酸残基处的Cys；第35个氨基酸残基处的Trp；第71个氨基酸残基处的Tyr或Phe；第
88个氨基酸残基处的Cys，或第98个氨基酸残基处的Phe，其中氨基酸残基使用Kabat方案编号；
并且其中所述抗原结合蛋白结合MAGE A3。
15.权利要求14的抗原结合蛋白，其中
(a) 所述重链构架包含第2个氨基酸残基处的Val；第20个氨基酸残基处的Leu；第
22个氨基酸残基处的Cys；第24个氨基酸残基处的Val；第26个氨基酸残基处的Gly；第
29个氨基酸残基处的Ile；第36个氨基酸残基处的Trp；第47个氨基酸残基处的Trp；第
48个氨基酸残基处的Met；第69个氨基酸残基处的Ile；第71个氨基酸残基处的Arg；第
76个氨基酸残基处的Asn；第78个氨基酸残基处的Phe；第80个氨基酸残基处的Leu；和第92个氨基酸残基处的Cys；其中氨基酸残基使用Kabat方案编号；和
(b) 所述轻链构架包含第2个氨基酸残基处的Ile；第3个氨基酸残基处的Val；第4个氨基酸残基处的Met；第23个氨基酸残基处的Cys；第35个氨基酸残基处的Trp；第71个氨基酸残基处的Phe；第88个氨基酸残基处的Cys，和第98个氨基酸残基处的Phe，其中氨基酸残基使用Kabat方案编号。
16.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，包含：
(a) SEQ ID NO:58 (QDYFDY)的CDRH3或具有在SEQ ID NO:58的氨基酸残基6处的His、Val、Ile、Ser、Asp或Gly取代Tyr的变体；
(b) SEQ ID NO:56 (TNAMS)的CDRH1，或具有在SEQ ID NO:56的氨基酸残基2处的Ile、His、Tyr、Phe、Thr、Cys、Glue或Asp取代Asn；在SEQ ID NO:56的氨基酸残基3处的Tyr、Trp、Gly、Thr、Leu或Val取代Ala；在SEQ ID NO:56的氨基酸残基4处的Ile、Val或Trp取代Met；或在SEQ ID NO:56的氨基酸残基5处的His、Glu、Asn、Gln、Tyr或Thr取代Ser的变体；
(c) SEQ ID NO:57 (TITSGGGSTY YPVSVKG)的CDRH2，或包含在SEQ ID NO:57的第1个氨基酸残基处的Gly、Tyr、Phe、Ile、Glu或Val取代Thr；在SEQ ID NO:57的第2个氨基酸残基处的Leu、Val、Thr、Ser或Asn取代Ile；在SEQ ID NO:57的第3个氨基酸残基处的Ser、Phe、Trp或His取代Thr；在SEQ ID NO:57的第4个氨基酸残基处的Asp、Ser或Asn取代Gly；在SEQ ID NO:57的第5个氨基酸残基处的Ser取代Gly；在SEQ ID NO:57的第
8个氨基酸残基处的Tyr、Thr、Asn、Asp或Arg取代Ser；或在SEQ ID NO:57的第10个氨基酸残基处的Gly、His、Phe、Asp或Asn取代Tyr的变体；
(d) SEQ ID NO:59 (RSSTGAVTST NYAN)的CDRL1，或包含在SEQ ID NO:59的第6个氨基酸残基处Thr取代Ala；或在SEQ ID NO:59的第12个氨基酸残基处His取代Tyr的变体；
(e) SEQ ID NO:60 (GTNNRAP)的CDRL2；和
(f) SEQ ID NO:61 (ALWYSNHWV)的CDRL3，或包含在SEQ ID NO:61的氨基酸残基5处Asn取代Ser；或在SEQ ID NO:61的氨基酸残基7处Leu取代His的变体；
所述抗原结合蛋白结合MAGE A3。
17.权利要求16的抗原结合蛋白，其包含：
(a) SEQ ID NO:58的CDRH3；
(b) SEQ ID NO:56的CDRH1；
(c) SEQ ID NO:57的CDRH2；
(d) SEQ ID NO:59的CDRL1；
(e) SEQ ID NO:60的CDRL2；
(f) SEQ ID NO:61的CDRL3；
(g) 重链构架，如SEQ ID NO:43中所述，包含第2个氨基酸残基处的Val、Ile或Gly；
第4个氨基酸残基处的Leu或Val；第20个氨基酸残基处的Leu、Ile、Met或Val；第22个氨基酸残基处的Cys；第24个氨基酸残基处的Thr、Ala、Val、Gly或Ser；第26个氨基酸残基处的Gly；第29个氨基酸残基处的Ile、Phe、Leu或Ser；第36个氨基酸残基处的Trp；
第47个氨基酸残基处的Trp；第48个氨基酸残基处的Ile、Met、Val或Leu；第69个氨基酸残基处的Ile、Leu、Phe、Met或Val；第71个氨基酸残基处的Arg；第78个氨基酸残基处的Ala、Leu Val、Tyr或Phe；第80个氨基酸残基处的Leu或Met；第90个氨基酸残基处的Tyr或Phe；第92个氨基酸残基处的Cys；和第94个氨基酸残基处的Arg、Lys、Gly、Ser、His或Asn，其中氨基酸残基使用Kabat方案编号；和
(h) 轻链构架，如SEQ ID NO:45中所述，包含第2个氨基酸残基处的Ala或Gln；第3个氨基酸残基处的Val；第4个氨基酸残基处的Val；第23个氨基酸残基处的Cys；第35个氨基酸残基处的Trp；第48个氨基酸残基处的Ile；第66个氨基酸残基处的Leu；第71个氨基酸残基处的Ala；第88个氨基酸残基处的Cys，和第98个氨基酸残基处的Phe，其中氨基酸残基使用Kabat方案编号；
并且其中所述抗原结合蛋白结合MAGE A3。
18.权利要求17的抗原结合蛋白，其中
(a) 所述重链构架包含第2个氨基酸残基处的Val；第4个氨基酸残基处的Val；第20个氨基酸残基处的Leu；第22个氨基酸残基处的Cys；第24个氨基酸残基处的Ala；第26个氨基酸残基处的Gly；第29个氨基酸残基处的Phe；第36个氨基酸残基处的Trp；第47个氨基酸残基处的Trp；第48个氨基酸残基处的Val；第69个氨基酸残基处的Ile；第71个氨基酸残基处的Arg；第78个氨基酸残基处的Leu；第80个氨基酸残基处的Leu；第90个氨基酸残基处的Tyr；第92个氨基酸残基处的Cys；和第94个氨基酸残基处的Arg；其中氨基酸残基使用Kabat方案编号；和
(b) 所述轻链构架包含第2个氨基酸残基处的Ala；第3个氨基酸残基处的Val；第4个氨基酸残基处的Val；第23个氨基酸残基处的Cys；第35个氨基酸残基处的Trp；第48个氨基酸残基处的Ile；第66个氨基酸残基处的Leu；第71个氨基酸残基处的Ala；第88个氨基酸残基处的Cys；和第98个氨基酸残基处的Phe，其中氨基酸残基使用Kabat方案编号。
19.根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，包含：
(a) SEQ ID NO:64 (GGGVLLRLPL FAY)的CDRH3或具有在SEQ ID NO:64的氨基酸残基
13处的His、Val、Ile、Ser、Asp或Gly取代Tyr的变体；
(b) SEQ ID NO:62 (SYTMS)的CDRH1，或具有在SEQ ID NO:62的氨基酸残基2处的Ile、His、Phe、Thr、Asn、Cys、Glu或Asp取代Tyr；在SEQ ID NO:62的氨基酸残基3处的Tyr、Ala、Trp、Gly、Leu或Val取代Thr；在SEQ ID NO:62的氨基酸残基4处的Ile、Val或Trp取代Met；或在SEQ ID NO:62的氨基酸残基5处的His、Glu、Asn、Gln、Tyr或Thr取代Ser的变体；
(c) SEQ ID NO:63 (TITSGGGSSY YPDSVKG)的CDRH2，或包含在SEQ ID NO:63的第1个氨基酸残基处的Gly、Tyr、Phe、Ile、Glu或Val取代Thr；在SEQ ID NO:63的第2个氨基酸残基处的Leu、Val、Thr、Ser或Asn取代Ile；在SEQ ID NO:63的第3个氨基酸残基处的Ser、Phe、Trp或His取代Thr；在SEQ ID NO:63的第5个氨基酸残基处的Asp、Ser或Asn取代Gly；在SEQ ID NO:63的第6个氨基酸残基处的Ser取代Gly；在SEQ ID NO:63的第
8个氨基酸残基处的Tyr、Thr、Asn、Asp或Arg取代Ser；或在SEQ ID NO:63的第10个氨基酸残基处的Gly、His、Phe、Asp或Asn取代Tyr的变体；
(d) SEQ ID NO:65 (RSSTGAVTAS NYAN)的CDRL1，或包含在SEQ ID NO:65的第6个氨基酸残基处Thr取代Ala；或在SEQ ID NO:65的第12个氨基酸残基处His取代Tyr的变体；
(e) SEQ ID NO:66 (GINNRAP)的CDRL2或在SEQ ID NO:66的第2个氨基酸残基处具有Thr取代Ile的变体；
(f) SEQ ID NO:67 (ALWYNNHWV)的CDRL3，或包含在SEQ ID NO:67的氨基酸残基5处Ser取代Asn；或在SEQ ID NO:67的氨基酸残基7处Leu取代His的变体；
所述抗原结合蛋白结合MAGE A3。
20.权利要求19的抗原结合蛋白，其包含：
(a) SEQ ID NO:64的CDRH3；
(b) SEQ ID NO:62的CDRH1；
(c) SEQ ID NO:63的CDRH2；
(d) SEQ ID NO:65的CDRL1；
(e) SEQ ID NO:66的CDRL2；
(f) SEQ ID NO:67的CDRL3；
(g) 重链构架，如SEQ ID NO:47中所述，包含第2个氨基酸残基处的Val、Ile或Gly；
第4个氨基酸残基处的Leu或Val；第20个氨基酸残基处的Leu、Ile、Met或Val；第22个氨基酸残基处的Cys；第24个氨基酸残基处的Thr、Ala、Val、Gly或Ser；第26个氨基酸残基处的Gly；第29个氨基酸残基处的Ile、Phe、Leu或Ser；第36个氨基酸残基处的Trp；
第47个氨基酸残基处的Trp；第48个氨基酸残基处的Ile、Met、Val或Leu；第69个氨基酸残基处的Ile、Leu、Phe、Met或Val；第71个氨基酸残基处的Arg；第78个氨基酸残基处的Ala、Leu Val、Tyr或Phe；第80个氨基酸残基处的Leu或Met；第90个氨基酸残基处的Tyr或Phe；第92个氨基酸残基处的Cys；或第94个氨基酸残基处的Arg、Lys、Gly、Ser、His或Asn，其中氨基酸残基使用Kabat方案编号；和
(h) 轻链构架，如SEQ ID NO:49中所述，包含第2个氨基酸残基处的Ala或Gln；第3个氨基酸残基处的Val；第4个氨基酸残基处的Val；第23个氨基酸残基处的Cys；第35个氨基酸残基处的Trp；第48个氨基酸残基处的Ile；第66个氨基酸残基处的Leu；第71个氨基酸残基处的Ala；第88个氨基酸残基处的Cys，或第98个氨基酸残基处的Phe，其中氨基酸残基使用Kabat方案编号；
并且其中所述抗原结合蛋白结合MAGE A3。
21.权利要求20的抗原结合蛋白，其中
(a) 所述重链构架包含第2个氨基酸残基处的Val；第4个氨基酸残基处的Leu；第20个氨基酸残基处的Val；第22个氨基酸残基处的Cys；第24个氨基酸残基处的Ala；第26个氨基酸残基处的Gly；第29个氨基酸残基处的Phe；第36个氨基酸残基处的Trp；第47个氨基酸残基处的Trp；第48个氨基酸残基处的Val；第69个氨基酸残基处的Ile；第71个氨基酸残基处的Arg；第78个氨基酸残基处的Leu；第80个氨基酸残基处的Leu；第90个氨基酸残基处的Tyr；第92个氨基酸残基处的Cys；和第94个氨基酸残基处的Ser；其中氨基酸残基使用Kabat方案编号；和
(b) 所述轻链构架包含第2个氨基酸残基处的Ala；第3个氨基酸残基处的Val；第4个氨基酸残基处的Val；第23个氨基酸残基处的Cys；第35个氨基酸残基处的Trp；第48个氨基酸残基处的Ile；第66个氨基酸残基处的Leu；第71个氨基酸残基处的Ala；第88个氨基酸残基处的Cys，和第98个氨基酸残基处的Phe，其中氨基酸残基使用Kabat方案编号。
22.核酸分子，其编码权利要求1-21中任一项定义的抗原结合蛋白。
23.根据权利要求22所述的核酸分子，其包含：
(i) SEQ ID NO:38的重链DNA序列或具有75%或更高同一性的变体重链；
(ii) SEQ ID NO:42的重链DNA序列或具有75%或更高同一性的变体重链；
(iii) SEQ ID NO:46的重链DNA序列或具有75%或更高同一性的变体重链；
(iv) SEQ ID NO:40的轻链DNA序列或具有75%或更高同一性的变体轻链；
(iv) SEQ ID NO:44的轻链DNA序列或具有75%或更高同一性的变体轻链；或(iv) SEQ ID NO:48的轻链DNA序列或具有75%或更高同一性的变体轻链。
24.表达载体，包含如权利要求22-23中任一项定义的核酸分子。
25.重组宿主细胞，包含如权利要求24定义的表达载体。
26.用于生产抗原结合蛋白的方法，包括培养如权利要求25定义的宿主细胞和回收所述抗原结合蛋白的步骤。
27.在人福尔马林固定石蜡包埋组织中检测MAGE-A3和/或MAGE-A6的方法，包括使用如权利要求1-21中任一项定义的单克隆抗体在所述组织上进行酶联免疫吸附测定。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述组织是肿瘤组织。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述肿瘤组织是黑素瘤或非小细胞肺癌。

说明书全文

新的抗原结合蛋白

发明领域

[0001] 本发明涉及与人MAGE-A3结合的抗原结合蛋白如抗体、编码这种抗原结合蛋白的多核苷酸、所述抗原结合蛋白的诊断应用和制备方法。

[0002] 背景“癌症 - 睾丸”抗原在几种类型的肿瘤中表达，但它们在正常组织中的表达限于睾丸，睾丸不可以将抗原递呈给T细胞，因为它们缺乏MHC(主要组织相容性复合体)I类分子的表达。因此，癌症-睾丸抗原被认为是肿瘤特异性抗原，并且是肿瘤免疫治疗的潜在目标。
已知人MAGE-A3经常在各种人肿瘤中表达，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、膀胱癌、头颈癌、鳞状食道癌和肝癌。

[0003] MAGE-A3属于MAGE-A亚家族，其包括11个已知成员(MAGEA 1-6和8-12)。尽管已经报道了其他“MAGE A”(黑色素瘤抗原家族A)基因(如MAGE A7、A13-15)，这些基因的表达模式提示它们是假基因(参见，例如，Chomez等, Cancer Research, 61:5544 (2001))。11个MAGE-A基因具有位于最后的外显子中的它们的整个编码序列。

[0004] 与MAGE-A3基因具有最高的序列相似性的MAGE-A基因是MAGE-A6，是99％相同的，并且这两个基因之间的差异位于最后的外显子内。与MAGE-A3接下来最密切相关的两个基因是MAGE-A2和MAGE-A12。在蛋白水平上，MAGE-A6与MAGE-A3具有95％的序列同一性，MAGE-A2与MAGE-A3具有84％的序列同一性，MAGE-A12与MAGE-A3具有85％的序列同一性。(图1)。

[0005] MAGE-N是MAGE家族的新成员，是从由人肝细胞癌细胞系分离的mRNA鉴定的(Wu等, Chin. J. Cell Mol. Immunol. 18:270-4 (2002))。已经报道MAGE-N与肝细胞癌密切相关(Dong等, Cancer Biol. Ther. 3(9):891-8 (2004)。在预测蛋白水平，MAGE-N与MAGE-A3和MAGE-A6具有<85％的序列相似性。MAGE-N可能是MAGE-A3、A12和A1的组合 - 其中MAGE-N的N-末端区域(氨基酸1-129)与MAGE-A3的N-末端区域具有99％同一性，MAGE-N的中央区域与MAGE-A12的中央区域相比差异一个氨基酸，MAGE-N的C-末端区域与MAGE-A1的C-末端区域是相同的。

[0006] 发明简述本发明提供与MAGE-A3 和 MAGE-A6特异性结合的抗原结合蛋白。

[0007] 本发明提供与MAGE-A3 和 MAGE-A6特异性结合但不与MAGE-A2或MAGE-A12结合或特异性结合的抗原结合蛋白。

[0008] 本发明提供与MAGE-A3特异性结合并包含选自SEQ ID NO:52、58和64的CDRH3或其变体的抗原结合蛋白。

[0009] 本发明提供与MAGE-A3特异性结合并包含选自SEQ ID NO:55、61和67的CDRL3或其变体的抗原结合蛋白。

[0010] 本发明还提供与MAGE-A3特异性结合的抗原结合蛋白，其包含：(i) SEQ ID NO:47的重链可变区和/或SEQ ID NO:49的轻链可变区；或与SEQ ID
NO:47具有75%或更高序列同一性的变体重链可变区；或与SEQ ID NO:49具有75%或更高序列同一性的轻链可变区；
(ii) SEQ ID NO:39的重链可变区和/或SEQ ID NO:41的轻链可变区；或与SEQ ID NO:39具有75%或更高序列同一性的变体重链可变区；或与SEQ ID NO:41具有75%或更高序列同一性的轻链可变区；或
(iii) SEQ ID NO:43的重链可变区；和/或SEQ ID NO:45的轻链可变区；或与SEQ ID NO:43具有75%或更高序列同一性的变体重链可变区；或与SEQ ID NO:45具有75%或更高序列同一性的轻链可变区。

[0011] 本发明还提供编码本文所定义的抗原结合蛋白的核酸分子。本发明还提供包含本文所定义的核酸分子的表达载体。本发明还提供包含本文所定义的表达载体的重组宿主细胞。本发明还提供用于生产本文所定义的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括培养如上所定义的宿主细胞和回收抗原结合蛋白的步骤。

[0012] 本发明还提供通过使用MAGE-A3的分歧肽(divergent peptides)免疫而产生如本文所述的抗原结合蛋白的方法。

[0013] 本发明还提供使用如本文所述的抗原结合蛋白在人福尔马林固定的石蜡包埋组织中检测MAGE-A3和/或MAGE-A6的方法。

[0014] 本发明还提供使用如本文所述的抗原结合蛋白在人福尔马林固定的石蜡包埋组织中检测MAGE-N的方法。

[0015] 附图简述图1：人MAGE-A1、A2、A3、A4、A5、A6、A8、A9、A10、A11和A12的序列比较。

[0016] 图2：对应于MAGE-A3 (SEQ ID NO:3)的氨基酸66-91的MAGE-A3片段的比较。肽MA3#3 (SEQ ID NO:37)中含有的氨基酸标有下划线。

[0017] 图3：对应于MAGE-A3 (SEQ ID NO:3)的氨基酸137-180的MAGE-A3片段的比较。肽MA3#1 (SEQ ID NO:35)和MA3#2 (SEQ ID NO:36)中含有的氨基酸标有下划线。

[0018] 图4A：图示在用三种与KLH缀合的MAGE-A3肽的混合物免疫的小鼠的血清中相对抗-MAGE-A3抗体滴度(方案IMM-134)。在ELISA中对全长重组MAGE-A3蛋白(血清稀释度为1:1000、1:5000、1:10,000、1:50,000、1:100,000、1:200,000和1:500,000)检测方案中包括的四只小鼠中每一只的免疫前血清(Pre)和血清稀释度。以如免疫前(Pre)血清上的顺序对于小鼠1、2、3和4给出每个稀释度的结果。

[0019] 图4B：图示在用全长重组MAGE-A3蛋白免疫的小鼠的血清中相对抗-MAGE-A3抗体滴度(方案IMM-135)。在ELISA中对全长重组MAGE-A3蛋白(血清稀释度为1:1000、1:5000、1:10,000、1:50,000、1:100,000、1:200,000和1:500,000)检测方案中包括的四只小鼠中每一只的免疫前血清(Pre)和血清稀释度。以如免疫前(Pre)血清上的顺序对于小鼠1、2、3和4给出每个稀释度的结果。

[0020] 图5：表示免疫小鼠的血清的反应性和特异性。在ELISA中对全长重组MAGE-A3、A2和A12以及对三种与KLH缀合的MAGE-A3肽测试IMM-134的小鼠#4和IMM-135小鼠#1的血清(1:1000稀释)。对于每份测试样品，从左到右给出下述结果：MAGE-A3、MAGE-A2、MAGE-A12、肽MA3#1、肽MA3#2和肽MA3#3。

[0021] 图6：显示与重组MAGE-A3反应的克隆上清液的特异性分析。MAb 1B1显示在6A中，16G7和23D2显示在图6B中。对重组MAGE-A3, MAGE-A2和MAGE-A12蛋白和对三种与KLH缀合的MAGE-A3肽中每一种测试克隆。对于测试的每份上清液样品，从左到右给出下述结果：MAGE-A3、MAGE-A2、MAGE-A12、肽MA3#1、肽MA3#2和肽MA3#3。“Neg”表示孔中没有抗原的阴性对照。垂直轴是通过ELISA测量的光密度，代表克隆的分泌能力。

[0022] 图7：图示在亚克隆和使杂交瘤适应在标准培养基上生长后获得的4种杂交瘤上清液的反应性的ELISA分析的结果。对重组MAGE-A3, MAGE-A2和MAGE-A12蛋白和对三种与KLH缀合的MAGE-A3肽中每种测试每种杂交瘤上清液。使用上清液57B作为阳性对照，单独的山羊抗小鼠HRP(二级抗体)作为阴性对照。对于测试的每份上清液样品，从左到右给出下述结果：肽MA3#1、肽MA3#2、肽MA3#3、MAGE-A3、MAGE-A2和MAGE-A12。

[0023] 图8：ELISA分析结果的图表，显示了生物素化的mAb 23D2与0.1 µg/孔的重组MAGE-A3蛋白的反应性。生物素化mAb的稀释曲线表明，0.032μg/50µl的抗体稀释物提供了在未饱和情况下的强信号。

[0024] 图9：显示生物素化的mAb 23D2和渐增量的未标记的mAbs 1B1、16G7、mAb23D2(阳性对照)和M75(阴性对照)之间进行的竞争测定的结果。对于每个浓度的未标记的mAb(水平轴)，从左到右给出下述结果：23D2、16G7、1B1和M75。

[0025] 图10：显示使用检测MAGE-A3/A6 的mAb 23D2、检测MAGE-A4的mAb 57b和检测MAGE-A9的mAb 14A11的肿瘤样品的IHC分析的表格。RT-PCR分析的结果显示为-、+、++、+++。IHC染色的结果显示为-、+、++、+++、++++，分别表明0％、1-24％、25-49％、50-74％和75-100％的细胞被染色。IHC强度的结果显示为+(弱)、++(中度)和+++(强)；在一些组织样品中观察到两种染色强度的组合。N.D.表明无法测定。RT-PCR和IHC结果之间的差异加框表示。

[0026] 图11显示抗-MAGE-A3单克隆抗体1B1、16G7和23D2的可变轻和重链的核苷酸序列。

[0027] 图12显示从抗-MAGE-A3单克隆抗体1B1、16G7和23D2的可变轻和重链的核苷酸序列获得的氨基酸序列。CDR标有下划线；构架区没有标下划线。

[0028] 发明详述GlaxoSmithKline Biologicals S.A.正在开发用于治疗转移性黑色素瘤和NSCLC的MAGE-A3抗原特异性癌症免疫治疗剂(ASCI)。该免疫治疗剂组合(a)融合蛋白，其包含MAGE-A3的片段，与(b)佐剂系统，其是选择用于增加抗肿瘤免疫反应的免疫刺激化合物的特定组合。(Brichard等., Vaccine 25(增刊2):B61 (2007))。在登记进目前的临床试验中之前，筛选患者以确定他们是否具有表达MAGE-A3的肿瘤。目前，通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)进行肿瘤中MAGE-A3表达的分析。使用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织(存档组织块)通过免疫组织化学(IHC)检测需要对MAGE-A3特异性并且能够检测FFPE组织中抗原的可靠的单克隆抗体(mAb)。由于MAGE-A蛋白的高序列相似性，针对MAGE-A3的抗体可能与其他MAGE-A蛋白交叉反应。例如，Kocher等通过用重组MAGE-A3蛋白免疫小鼠产生了抗-MAGE-A3单克隆抗体 (Kocher等Cancer Res, 55:2236, 1995.)。后来显示产生的mAb(称为57B)与MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6和–A12交叉反应(Rimoldi等.Int J Cancer, 86:749, 2000)。57B mAb与福尔马林固定和石蜡包埋组织的反应性的进一步分析报道，它主要检测MAGE-A4，因为它与表达其他MAGE-A抗原的组织无反应性，不论他们的表达水平(Landry等Int J Cancer, 86:835, 2000)。

[0029] 抗-MAGE-A3 mAb 6D10(Abnova, GeneTex和Novus Biologicals)的特异性分析显示，该mAb与MAGE-A2和MAGE-A6交叉反应(本申请人的未发表数据)。此外，在福尔马林固定和石蜡包埋组织上的IHC(免疫组织化学)分析中使用该mAb是不成功的(本申请人的未发表数据)。已知另一种针对MAGE-A3/A6的mAb为mAb M3H67 (LICR New York, USA;参见例如Sharma等, Clinical Cancer Research 12:5442 (2006); Chitale等, Modern Pathology 18:119 (2005))。已经将该抗体用于表征在福尔马林固定和石蜡包埋组织中MAGE-A3/A6的表达，但其特异性的分析还没有公布(参见，例如， Chitale等.Mod Pathol, 18: 119, 2005; Perez 等.Int J Cancer, 123: 1551, 2008; Oba-Shinjo等.Cancer Immun, 8: 7, 2008; Nelson等.Cancer Immun, 7: 1, 2007 ; Luftl等.Br J Dermatol, 151: 1213, 2004; Lohmann, 等 .Melanoma Res, 13: 595, 2003; 和Dhodapkar,等.Cancer Immun, 3: 9, 2003)。

[0030] 仍然需要mAb，其在特异性识别高度相似的MAGE-A3和MAGE-A6蛋白的同时，不与密切相关的MAGE-A2或A12蛋白或任何其他已知的MAGE-A蛋白交叉反应。此外，还需要能够在FFPE组织上可靠地检测MAGE-A3和/或A6的这种抗体。

[0031] 本发明提供与MAGE-A3 和 MAGE-A6特异性结合的抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可为抗体，例如单克隆抗体(mAb)。

[0032] 除非另有解释，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属的领域中普通技术人员通常理解的含义。分子生物学中常用术语的定义可见Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew等.(编辑 ), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd. 出版 ,1994 (ISBN 0-632-02182-9);和Robert A. Meyers (编辑), Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN
1-56081-569-8)。

[0033] 单数术语“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文清楚地另有指明。类似地，词语“或”意在包括“和”，除非上下文清楚地另有指明。术语“多个”是指两个或更多个。应当进一步理解的是，对于核酸或多肽给出的所有分子量或分子质量值是近似的，提供用于说明。

[0034] 氨基酸在本文中缩写如下：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酸(Glu或E )；谷氨酰胺(Gln或Q)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(Ile或I)；亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。

[0035] 本文所用术语"抗原结合蛋白"指能够与MAGE-A3特异性结合的抗体、抗体片段和其他蛋白构建体，例如结构域或区域。

[0036] 本文所用术语"抗体"以其最广泛的意义指具有免疫球蛋白样结构域的分子，并包括：单克隆抗体、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异源缀合物抗体；单可变结构域或区域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫学有效片段、单链Fv、双TM抗体、TANDABS 等(对于可替换的"抗体"形式的综述，参见Holliger和Hudson, Nature Biotechnology, 2005, 第23卷，第9期，1126-1136)。

[0037] 本文所用修饰语“单克隆的”是指从抗体的基本上同质群体获得的抗体，不表明该抗体是通过任何具体方法产生的。例如，可以通过杂交瘤方法(Kohler和Milstein，Nature256:495 (1975))，或通过重组DNA方法制备，或者从噬菌体文库分离本发明的单克隆抗体(mAbs)。

[0038] 根据由其分离它们的杂交瘤命名本发明的单克隆抗体，例如，mAb 1B1是从杂交瘤细胞1B1获得的。

[0039] 短语"单可变区"指抗原结合蛋白可变区(例如VH、VHH、VL)，其可特异性结合抗原或结合独立于不同的可变区的表位。

[0040] 可认为"结构域抗体"或"dAb"与"单可变结构域"相同，其能够结合抗原。单可变结构域可为人抗体可变结构域，但还包括来自其他物种的单抗体可变结构域，例如啮齿动物(例如如WO 00/29004中所公开的)、绞口鲨(nurse shark)和骆驼科(Camelid) VHH dAb。骆驼科VHH为源自包括骆驼、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)、单峰骆驼(dromedary)和原驼(guanaco)在内的物种的免疫球蛋白单可变结构域多肽，所述物种产生天然缺乏轻链的重链抗体。这种VHH结构域可根据本领域可获得的标准技术人源化，认为这种结构域为"结构域抗体"。本文所用VH 包括骆驼科VHH结构域。

[0041] 本文所用术语"结构域"指具有独立于蛋白的其余部分的四级结构的折叠蛋白结构。结构域通常负责蛋白的不相关的功能性质，在很多情况下可将其加入、移走或转移到其他蛋白，而不丢失蛋白和/或结构域的剩余部分的功能。"单可变结构域"(或“单可变区”)为包含抗体可变结构域特征序列的折叠多肽结构域。因此，其包括完全抗体可变结构域和经修饰的可变结构域，例如，其中一个或多个环被以下序列取代：所述序列不是抗体可变结构域的特征，或已经被截短或包含N-或C-末端延伸的抗体可变结构域，以及保留至少全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。结构域可结合抗原或结合独立于不同的可变区或结构域的表位。

[0042] 本文所用“MAGE-A”是指从人MAGE-A获得的或与人MAGE-A具有相同的序列的MAGE-A，除非另有说明。因此，本文所用MAGE-A3是指具有人MAGE-A3序列的多肽，除非另有说明。

[0043] 本发明人使用下列方案来产生单克隆抗体(在表1中显示)。用分歧MAGE-A3肽的组合或用全长重组MAGE-A3免疫小鼠。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测试来自免疫小鼠的血清针对全长重组MAGE-A3的反应性，以选择用于在杂交瘤产生的动物。针对MAGE-A3筛选由获得的杂交瘤产生的单克隆抗体，然后测试选择的mAb针对MAGE-A3、MAGE-A12和MAGE-A2；和针对表达MAGE-A3的组织的反应性。可以使用该方案以产生与MAGE-A3和MAGE-A6特异性结合但不与MAGE-A2和/或MAGE-A12交叉反应的额外的mAb。可以任选地测试产生的mAb针对免疫中使用的肽的反应性。

[0044] 表1

[0045] 可借助在非抗体蛋白支架例如结构域上安排一个或多个CDR来提供抗原结合片段。非抗体蛋白支架或结构域是经过蛋白工程改造以获得与不同于其天然配体的配体结合的蛋白支架或结构域，例如作为选自以下的支架的衍生物的结构域：CTLA-4 (EVIBODY™)；脂笼蛋白(lipocalin)；源自蛋白A的分子例如蛋白A的Z-结构域(AFFIBODY™, SpA)、A-结构域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白例如GroEl和GroES；转铁蛋白(穿膜抗体(transbody))；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适配体；C-型凝集素结构域(四连接素(Tetranectin))；人γ-晶状体蛋白和人泛素(affilins)；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型结构域；和纤连蛋白(adnectin)；它们已经经过蛋白工程改造以获得与不同于其天然配体的配体结合。

[0046] 抗原结合片段或免疫学有效片段可包含部分重链或轻链可变序列。片段为至少5、6、8或10个氨基酸长。可替换地，片段为至少15、至少20、至少50、至少75或至少100个氨基酸长。

[0047] 本说明书通篇所用与抗原结合蛋白有关的术语"特异性结合"、“特异性结合”或“特异性结合”是指蛋白或多肽和抗原结合蛋白之间的相互作用。相互作用取决于抗原结合蛋白识别的蛋白或多肽的特定结构(即，抗原决定簇或表位)的存在。抗原结合蛋白可以与具有相同抗原决定簇或表位的不同蛋白/多肽交叉反应；这是不认为是非特异性结合。此外，这些术语是指与非特异性结合相比以高亲和力的结合。参见例如Lodish, Cell Biology 538-9 (第5版, 2004)。本文所述抗原结合蛋白以它们与亲缘关系相近的分子例如MAGE-A2 或 MAGE-A12结合相比至少2、5、10、50、100或1000倍更高的亲和力来结合MAGE-A3 和/或 MAGE-A6。

[0048] 抗原结合蛋白- MAGE-A3相互作用的结合亲和力或平衡解离常数(KD)可为100 nM或更小、10 nM或更小、2 nM或更小或1 nM或更小。可替换地，KD可为5-10 nM之间；或1-2 nM之间。KD可为1 pM-500 pM之间；或500 pM-1 nM之间。通过结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd) (KD = kd/ka)来测定抗原结合蛋白的结合亲和力。可通过本领域已知的任何合适方法如BIAcoreTM，例如通过用由伯胺偶联偶联在CM5芯片上的MAGE-A3来进行抗原捕获并将抗体捕获到该表面，来测量结合亲和力。可替换地，可通过FORTEBIO™ 技术，例如通过用由伯胺偶联偶联在CM5针上的MAGE-A3来进行抗原捕获并将抗体捕获到该表面上，来测量结合亲和力。

[0049] 抗原结合蛋白的解离速率常数(kd) 可为1x 10-3s-1或更小、1x 10-4s-1或更小或-5 -1 -5 -1 -4 -1 -4 -1 -3 -11x 10 s 或更小。kd可在1x 10 s -1x 10 s 之间；或在1x 10 s -1x 10 s 之间。缓慢的kd可导致抗原结合蛋白-配体复合物的缓慢解离。

[0050] 本文所用术语“源自”不仅在参考来源是材料的物理来源的意义上定义了材料来源(参考来源)，而且定义了在结构上与该材料相同但物理上不是从该参考来源获得的材料。因此，“源自供体抗体的氨基酸序列”不仅是指从供体抗体物理获得(例如，纯化)的序列，而且是指与供体抗体相同但不是从其获得的序列。

[0051] “分离”意指分子例如抗原结合蛋白被从其可实际存在的环境中移出。例如，所述分子可从其实际上正常存在的物质中纯化。例如，抗原结合蛋白可被纯化为相对于含有抗原结合蛋白的培养基至少95%、96%、97%、98%或99%或更高。

[0052] 本文所用术语"VH"和"VL"分别指抗原结合蛋白的重链可变区和轻链可变区。

[0053] 本文所用“CDR”是指抗原结合蛋白的互补性决定区氨基酸序列。CDR是免疫球蛋白重链和轻链的高可变区。在免疫球蛋白的可变部分有3个重链和3个轻链CDR (或CDR区)。因此，本文所用"CDR"指所有3个重链CDR、所有3个轻链CDR、所有重链和轻链CDR或至少两个CDR。

[0054] 除非另外规定，否则在本说明书中通篇根据Kabat编号规则来对可变结构域序列和全长抗体序列的氨基酸残基进行编号。同样地，实施例中所用术语"CDR"、"CDRL1"、"CDRL2"、"CDRL3"、"CDRH1"、"CDRH2"、"CDRH3"遵循Kabat编号规则。对于进一步的信息，参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版，U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)。

[0055] 本领域技术人员显然明白，对于可变结构域序列和全长抗体序列的氨基酸残基，有可替换的编号规则。对于CDR序列还有可替换的编号规则，例如在Chothia等(1989) Nature 342: 877-883中提出的那些编号规则。抗体的结构及蛋白折叠可意味着认为其他残基是CDR序列的部分，技术人员应该如此理解。因此，本文所用术语"相应CDR"指用任何编号规则(例如表2中提出的那些)的CDR序列。

[0056] 技术人员可获得的用于CDR序列的其他编号规则包括"AbM" (University of Bath)和"接触(contact)" (University College London)方法。用Kabat、Chothia、AbM和接触方法中的至少两种可测定最小重叠区，以提供 "最小结合单位"。最小结合单位可为CDR的亚部分。

[0057] 下表2代表用每一种编号规则对每一个CDR或结合单位的一种定义。表2中用Kabat编号方案来给可变结构域氨基酸序列编号。应该注意，某些CDR定义可以根据所用的个别出版物而变化。

[0058] 表2

[0059] 本文所用术语"抗原结合位点"指在抗原结合蛋白上能够特异性与抗原结合的位点。其可为单结构域(例如表位结合结构域)或单-链Fv (ScFv)结构域，或其可为如在标准抗体中存在的配对的VH/VL结构域。

[0060] 本文所用术语"表位"指使得抗原结合蛋白与特定结合结构域接触的抗原部分。表位可为线性，包含来自抗原的基本线性的氨基酸序列。可替换地，表位可以是构象的或不连续的。例如，构象表位包含需要结构约束元件的氨基酸残基。不连续表位包含由其他序列分开的氨基酸残基，即不在抗原的一级序列中连续的序列中。在抗原的三级及四级结构背景下，不连续表位的残基靠近到足以使彼此被抗原结合蛋白结合。

[0061] 对于核苷酸和氨基酸序列，术语"同一性"、"序列同一性"或"序列相似性"，是指若需要时当与合适的插入或缺失最佳比对及比较时，在两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的同一性程度。

[0062] 两个序列之间的同一性百分比是由所述序列共有的相同位置数量的函数(即%同一性=相同的位置数量/总位置数量乘以100)，这要考虑到缺口数量和每一缺口的长度，对于两个序列的最佳比需要引入它们。可用如下所述的数学算法完成两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定。

[0063] 可用以下算法来测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比：GCG 软件包中的GAP程序、NWSgapdna.CMP矩阵，并使用40、50、60、70或80的缺口权重及1、2、3、4、5或6的长度权重。用纳入ALIGN程序(2.0版)中的E. Meyers和W. Miller (Comput. Appl. Biosci.,4:11-17 (1988))算法还可测定两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的同一性百分比，并使用PAM 120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。另外，可用以下算法测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比：纳入GCG 软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))算法、Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、
14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

[0064] 在一种方法中，多核苷酸序列可与本文所述的参考多核苷酸序列(参见例如SEQ ID NO:38, 40, 42, 44, 46 或 48)相同，即100%相同，或与参考序列比较，其可包括达某些整数数值的核苷酸改变，例如至少50、60、70、75、80、85、90、95、98或99%相同。这种改变选自至少一个核苷酸缺失、取代(包括转换及颠换)或插入，其中所述改变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或这些末端位置之间的任何位置，可各自散布在参考序列核苷酸之间或散布在参考序列内的一个或多个邻接基团中。核苷酸改变的数量通过以下方法确定：将本文所述参考多核苷酸序列(参见例如SEQ ID NO:38, 40, 42, 44, 46 或 48)中的核苷酸总数乘以各自同一性百分比的百分比数值(除以100)，并从本文所述的参考多核苷酸序列的所述核苷酸总数中减去该乘积，或者：nn ≤ xn - (xn · y)，
其中nn为核苷酸改变的数量，xn为本文所述参考多核苷酸序列中的核苷酸总数，y对于50%为0.50、对于60%为0.60、对于70%为0.70、对于75%为0.75、对于80%为0.80、对于85%为0.85、对于90%为0.90、对于95%为0.95、对于98%为0.98、对于99%为0.99或对于100%为1.00，•为乘法运算符号，其中在从xn减去xn和y 的乘积之前，将xn和y 的任何非整数乘积四舍五入为最接近的整数。

[0065] 同样地，多肽序列可与本文所述多肽参考序列(参见例如SEQ ID NO:39, 41, 43,45, 47, 49, 或 50-67)相同，即100%相同，或与参考序列比较，其可包括至多某些整数数值的氨基酸改变，使得%同一性小于100%，例如至少50、60、70、75、80、85、90、95、98或99%相同。这种改变选自至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)或插入，其中所述改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何位置，可各自散布在参考序列氨基酸之间或散布在参考序列内的一个或多个邻接基团中。通过以下方法确定关于给定同一性%的氨基酸改变的数量：将本文所述多肽参考序列编码的多肽序列中的氨基酸总数乘以各自同一性百分比的百分比数值(除以100)，然后从本文所述的多肽参考序列的所述氨基酸总数中减去该乘积，或：
na ≤ xa - (xa · y),
其中na为氨基酸改变的数量，xa为本文所述参考多肽序列中的氨基酸总数，y对于50%为0.50、对于60%为0.60、对于70%为0.70、对于75%为0.75、对于80%为0.80、对于85%为
0.85、对于90%为0.90、对于95%为0.95、对于98%为0.98、对于99%为0.99或对于100%为1.00，•为乘法运算符号，其中在从xa减去xa和y的乘积之前，将xa和y的任何非整数乘积四舍五入为最接近的整数。

[0066] 可在全长序列或其任何片段中测定同一性%；且含或不含任何插入或缺失。

[0067] 术语"肽"、"多肽"和"蛋白"每一种都指包含两个或更多个氨基酸残基的分子。肽可为单体或多聚体。

[0068] 本领域充分了解的是，将某些氨基酸取代认作"保守的"，即氨基酸具有相似的化学和物理特性。保守氨基酸取代的表格是本领域已知的。基于共有的侧链特性将氨基酸典型地分组，认为保留全部或基本上全部抗原结合蛋白的结合亲和力的组别中的取代为保守取代。通过示例而非限制的方式，可以用另一种脂族氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸)取代具有脂族侧链的氨基酸；可以用另一种具有羟基侧链的氨基酸(例如，丝氨酸和苏氨酸)取代具有羟基侧链的氨基酸；可以用另一种具有芳族侧链的氨基酸(例如，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸)取代具有芳族侧链的氨基酸；可以用另一种具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)取代具有碱性侧链的氨基酸；可以用另一种具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)取代具有酸性侧链的氨基酸；以及可以用另一种疏水性或亲水性氨基酸分别取代疏水性或亲水性氨基酸。

[0069] 本文所述的本抗原结合蛋白仅与来自MAGE-A家族的MAGE-A3和MAGE-A6特异性结合。本发明提供与MAGE-A3特异性结合的抗原结合蛋白，其包含如下或由如下组成：(i) SEQ ID NO:47的重链可变区(或与SEQ ID NO:47具有75%或更高序列同一性的
变体重链可变区)和SEQ ID NO:49的轻链可变区(或与SEQ ID NO:49具有75%或更高序列同一性的轻链可变区)；
(ii) SEQ ID NO:39的重链可变区(或与SEQ ID NO:39具有75%或更高序列同一性的变体重链可变区)和SEQ ID NO:41的轻链可变区(或与SEQ ID NO:41具有75%或更高序列同一性的轻链可变区)；或
(iii) SEQ ID NO:43的重链可变区(或与SEQ ID NO:43具有75%或更高序列同一性
的变体重链可变区)；和SEQ ID NO:45的轻链可变区(或与SEQ ID NO:45具有75%或更高序列同一性的轻链可变区)。

[0070] 本发明提供与MAGE-A3结合并包含具有选自SEQ ID NO:52、58和64的序列的CDRH3或其变体CDRH3序列的抗原结合蛋白。除了上面所述的CDRH3序列以外，这种抗原结合蛋白可进一步包含以任何组合的CDRH1、CDRH2、CDRL1、CDRL2或CDRL3中的一个或多个，其中一个或多个CDR具有选自如下的序列：SEQ ID NO:50、56或62 (CDRH1)，SEQ ID NO:51、57或63 (CDRH2)，SEQ ID NO:53、59或65 (CDRL1)，SEQ ID NO:54、60或66 (CDRL2)，和SEQ ID NO:55、61或67 (CDRL3)；或其变体CDR序列。

[0071] 本发明还提供与MAGE-A3结合并包含选自SEQ ID NO:39、43或47的重链可变区的抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可包含选自SEQ ID NO:41、45或49的轻链可变区。重链可变区中的任一种可以与轻链可变区的任一种组合。

[0072] 本发明还提供与MAGE-A3结合并包含下列的重链可变区和轻重链可变区组合中的任一种：(SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41)或(SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:45)，或(SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49)。

[0073] 本发明还提供与SEQ ID NO:39、43或47中的任一种具有75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高、99%或更高或100%同一性的抗体重链可变区。本发明还提供与SEQ ID NO:41、45或49中的任一种具有75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高、99%或更高或100%同一性的抗体轻链可变区。
可在全长序列中测定SEQ ID NO:39、43、47、41、45或49的变体的百分比同一性。如上所述的规范CDR或构架残基取代可以存在于具有上述序列同一性的这种重或轻链可变区中。具有上述序列同一性的抗原结合蛋白的由EC50显示的与MAGE-A3结合的效力为参考序列显示的效力的10倍以内或5倍以内。可通过ELISA测定来进行由EC50显示的与MAGE-A3结合的效力的测定。

[0074] 抗体重链可变区可以是SEQ ID NO: 39、43和47中任一种的变体，其含有30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、插入或缺失。抗体轻链可变区可以是SEQ ID NO: 41、45和49中任一种的变体，其含有30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、插入或缺失。

[0075] 例如，抗原结合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO:52)和CDRH1 (SEQ ID NO:50)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO:52)和CDRH2 (SEQ ID NO:51)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRH1 (SEQ ID NO:50)和CDRH2 (SEQ ID NO:51)和CDRH3 (SEQ ID NO:52)或其变体。

[0076] 抗原结合蛋白可包含CDRL1 (SEQ ID NO:53)和CDRL2 (SEQ ID NO:54)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRL2 (SEQ ID NO:54)和CDRL3 (SEQ ID NO:55)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRL1 (SEQ ID NO:53)、CDRL2 (SEQ ID NO:54)和CDRL3 (SEQ ID NO:55)或其变体。

[0077] 抗原结合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO:52)和CDRL3 (SEQ ID NO:55)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO:52)、CDRH2 (SEQ ID NO:51)和CDRL3 (SEQ ID NO:55)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO:52)、CDRH2 (SEQ ID NO:51)、CDRL2 (SEQ ID NO:54)和CDRL3 (SEQ ID NO:55)或其变体。

[0078] 抗原结合蛋白可包含CDRH1 (SEQ ID NO:50)、CDRH2 (SEQ ID NO:51)、CDRH3 (SEQ ID NO:52)、CDRL1 (SEQ ID NO:53)、CDRL2 (SEQ ID NO:54)和CDRL3 (SEQ ID NO:55)。可替换地，可以存在变体CDR。

[0079] 本发明还提供与MAGE-A3结合并包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:47的可变结构域序列的相应CDRH3或其变体CDRH3取代上述CDRH3的如上所述的抗原结合蛋白。因此，抗原结合蛋白可以如上所述但具有SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:64的CDRH3。

[0080] 本发明还提供与MAGE-A3结合并包含SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49的可变结构域序列的相应CDR或其变体CDR取代上述CDRH1、CDRH2、CDRL1、CDRL2或CDRL3的如上所述的抗原结合蛋白。

[0081] 例如，抗原结合蛋白可包含相应CDRH3和相应CDRH1或其变体。抗原结合蛋白可包含相应CDRH3和相应CDRH2或其变体。抗原结合蛋白可包含相应CDRH1、相应CDRH2和相应CDRH3；或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRL1和相应CDRL2或其变体。抗原结合蛋白可包含相应CDRL2和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRL1、相应CDRL2和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRH3和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRH3、相应CDRH2和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRH3、相应CDRH2、相应CDRL2和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRH1、相应CDRH2、相应CDRH3、相应CDRL1、相应CDRL2和相应CDRL3或其变体。

[0082] 本发明的抗原结合蛋白可以包含CDRH3 (SEQ ID NO:58)和CDRH1 (SEQ ID NO:56)或其变体。抗原结合蛋白可以包含CDRH3 (SEQ ID NO:58)和CDRH2 (SEQ ID NO:57)或其变体。抗原结合蛋白可以包含CDRH1 (SEQ ID NO:56)和CDRH2 (SEQ ID NO:57)和CDRH3 (SEQ ID NO:58)或其变体。

[0083] 抗原结合蛋白可包含CDRL1 (SEQ ID NO:59)和CDRL2 (SEQ ID NO:60)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRL2 (SEQ ID NO:60)和CDRL3 (SEQ ID NO:61)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRL1 (SEQ ID NO:59)、CDRL2 (SEQ ID NO:60)和CDRL3 (SEQ ID NO:61)或其变体。

[0084] 抗原结合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO:58)和CDRL3 (SEQ ID NO:61)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO:58)、CDRH2 (SEQ ID NO:57)和CDRL3 (SEQ ID NO:61)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO:58)、CDRH2 (SEQ ID NO:57)、CDRL2 (SEQ ID NO:60)和CDRL3 (SEQ ID NO:61)或其变体。

[0085] 抗原结合蛋白可包含CDRH1 (SEQ ID NO:56)、CDRH2 (SEQ ID NO:57)、CDRH3 (SEQ ID NO:58)、CDRL1 (SEQ ID NO:59)、CDRL2 (SEQ ID NO:60)和CDRL3 (SEQ ID NO:61)。可替换地，可以存在变体CDR。

[0086] 本发明还提供与MAGE-A3结合并包含SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:47的可变结构域序列的相应CDRH3或其变体CDRH3取代上述CDRH3的如上所述的抗原结合蛋白。因此，抗原结合蛋白可以如上所述但具有SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:64的CDRH3。

[0087] 本发明还提供与MAGE-A3结合并包含SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:49的可变结构域序列的相应CDR或其变体CDR取代上述CDRH1、CDRH2、CDRL1、CDRL2或CDRL3的如上所述的抗原结合蛋白。

[0088] 例如，抗原结合蛋白可以包含相应CDRH3和相应CDRH1或其变体。抗原结合蛋白可包含相应CDRH3和相应CDRH2或其变体。抗原结合蛋白可包含相应CDRH1、相应CDRH2和相应CDRH3；或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRL1和相应CDRL2或其变体。抗原结合蛋白可包含相应CDRL2和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRL1、相应CDRL2和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRH3和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRH3、相应CDRH2和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRH3、相应CDRH2、相应CDRL2和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRH1、相应CDRH2、相应CDRH3、相应CDRL1、相应CDRL2和相应CDRL3或其变体。

[0089] 本发明的抗原结合蛋白可以包含CDRH3 (SEQ ID NO:64)和CDRH1 (SEQ ID NO:62)或其变体。抗原结合蛋白可以包含CDRH3 (SEQ ID NO:64)和CDRH2 (SEQ ID NO:63)或其变体。抗原结合蛋白可以包含CDRH1 (SEQ ID NO:62)和CDRH2 (SEQ ID NO:63)和CDRH3 (SEQ ID NO:64)或其变体。

[0090] 抗原结合蛋白可包含CDRL1 (SEQ ID NO:65)和CDRL2 (SEQ ID NO:66)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRL2 (SEQ ID NO:66)和CDRL3 (SEQ ID NO:67)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRL1 (SEQ ID NO:65)、CDRL2 (SEQ ID NO:66)和CDRL3 (SEQ ID NO:67)或其变体。

[0091] 抗原结合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO:64)和CDRL3 (SEQ ID NO:67)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO:64)、CDRH2 (SEQ ID NO:63)和CDRL3 (SEQ ID NO:67)或其变体。抗原结合蛋白可包含CDRH3 (SEQ ID NO:64)、CDRH2 (SEQ ID NO:63)、CDRL2 (SEQ ID NO:66)和CDRL3 (SEQ ID NO:67)或其变体。

[0092] 抗原结合蛋白可包含CDRH1 (SEQ ID NO:62)、CDRH2 (SEQ ID NO:63)、CDRH3 (SEQ ID NO:64)、CDRL1 (SEQ ID NO:65)、CDRL2 (SEQ ID NO:66)和CDRL3 (SEQ ID NO:67)。可替换地，可以存在变体CDR。

[0093] 本发明还提供与MAGE-A3结合并包含SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:43的可变结构域序列的相应CDRH3或其变体CDRH3取代上述CDRH3的如上所述的抗原结合蛋白。因此，抗原结合蛋白可以如上所述但具有SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:58的CDRH3。

[0094] 本发明还提供与MAGE-A3结合并包含SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:45的可变结构域序列的相应CDR或其变体CDR取代上述CDRH1、CDRH2、CDRL1、CDRL2或CDRL3的如上所述的抗原结合蛋白。

[0095] 例如，抗原结合蛋白可以包含相应CDRH3和相应CDRH1或其变体。抗原结合蛋白可包含相应CDRH3和相应CDRH2或其变体。抗原结合蛋白可包含相应CDRH1、相应CDRH2和相应CDRH3；或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRL1和相应CDRL2或其变体。抗原结合蛋白可包含相应CDRL2和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRL1、相应CDRL2和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRH3和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRH3、相应CDRH2和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRH3、相应CDRH2、相应CDRL2和相应CDRL3或其变体。抗原结合蛋白可以包含相应CDRH1、相应CDRH2、相应CDRH3、相应CDRL1、相应CDRL2和相应CDRL3或其变体。

[0096] 可通过参考Kabat (1987)、Chothia (1989)、AbM或接触方法来定义相应CDR。可在表2中找出每一方法的一个定义，并可施用于参考重链可变区SEQ ID NO:39、43、或 47和参考轻链可变区SEQ ID NO:41、45、或 49，以确定相应CDR。

[0097] CDR变体或变体结合单位包括由以下修饰的氨基酸序列：至少一个氨基酸(例如通过一个，两个，或不超过6个氨基酸)，所述修饰使得变体保留未经修饰的序列的生物学特性。例如，变体是与MAGE-A3结合的功能变体。可通过缺失或取代一个，两个或若干个氨基酸，或通过添加或插入一个，两个或若干个氨基酸，或通过其组合(例如通过一个，两个或不超过6个氨基酸)，来部分改变CDR氨基酸序列。CDR变体或结合单位变体可在氨基酸序列中以任何组合含有1、2、3、4、5或6个氨基酸取代、添加或缺失。氨基酸残基取代可为保守取代，例如，将一个疏水氨基酸取代可替换的疏水氨基酸。例如亮氨酸可被缬氨酸或异亮氨酸取代。

[0098] CDR L1、L2、L3、H1和H倾向于在结构上表现出有限数量的主链构象之一。通过CDR长度并通过环包裹(loop packing)二者来确定CDR的特定规范结构类型，其通过位于CDR和构架区二者内的关键位置的残基来决定(结构决定残基或SDR)。Martin和Thornton (1996；J Mol Biol 263:800-815)已经生成了确定"关键残基"规范模板(canonical template)的自动方法。用簇分析(cluster analysis)来确定CDR组的规范类别(canonical class)，然后通过分析埋入的疏水氢-键合的残基和保守的甘氨酸和脯氨酸来鉴别规范模板。可通过将序列与关键残基模板比较，并用同一性或相似性矩阵为每一个模板评分，将抗体序列的CDR 指定为规范类别。

[0099] 包含对应于参考CDR的CDR的本发明的抗原结合蛋白的由EC50显示的与MAGE-A3结合的效力为包含参考CDR的抗原结合蛋白显示的效力的10倍以内或5倍以内。包含参考CDR的变体的本发明的抗原结合蛋白的由EC50显示的与MAGE-A3结合的效力为包含参考CDR的抗原结合蛋白显示的效力的10倍以内或5倍以内。参考CDR包括具有选自SEQ ID NO:50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64 65、66和67的序列的那些CDR。

[0100] 本文所述的一个或多个CDR、相应CDR、变体CDR或结合单位可例如作为人源化的或嵌合的可变结构域存在于人构架的背景中。

[0101] 重链可变区中任一种可与合适的人恒定区组合。轻链可变区中任一种可与合适的恒定区组合。

[0102] 与抗原结合蛋白结合的MAGE-A3多肽可为重组多肽。MAGE-A3可在溶液中，或可被连接到固态表面。例如，MAGE-A3可被连接到珠粒，例如磁性珠粒。MAGE-A3可被生物素化。可通过在固体表面偶联生物素-链霉亲和素，将与MAGE-A3缀合的生物素分子用于将MAGE-A3固定到固体表面上。

[0103] 本发明还提供与MAGE-A3结合并包含与选自SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:43, SEQID NO:47, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:45和 SEQ ID NO:49的构架区具有75%或更高序列同一性的重链可变区受体抗体构架的如上所述的抗原结合蛋白。

[0104] 抗原结合蛋白可源自大鼠、小鼠、灵长类(例如食蟹猴、旧大陆猴(Old World monkey)或类人猿)或人。抗原结合蛋白可为人源化抗体或嵌合抗体。

[0105] 抗原结合蛋白可包含恒定区，其可为任何同种型或亚类。恒定区可为IgG同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。抗原结合蛋白恒定区可为IgGl 。

[0106] 可将对抗体的Fc效应子部分的突变性变化用于改变FcRn和抗体之间相互作用亲和力，以调节抗体转换(turnover)。可延长体内抗体的半衰期。本发明抗原结合蛋白可为Fc无效化的。可替换地，抗原结合蛋白可以是Fc无效化的。

[0107] 本发明还提供编码本文所述抗原结合蛋白的核酸分子。所述核酸分子可包含编码以下的序列：(i)一个或多个CDRH、或重链可变序列；和(ii)一个或多个CDRL、或轻链可变序列，且(i)和(ii)在相同核酸分子上。可替换地，编码本文所述抗原结合蛋白的核酸分子可包含编码以下的序列：(a)一个或多个CDRH、或重链可变序列；或(b)一个或多个CDRL、或轻链可变序列，且(a)和(b)在分开的核酸分子上。

[0108] 编码重链可变序列的核酸分子可以包含SEQ ID NO:38、42或46中的任一种或由其组成。编码轻链可变序列的核酸分子可以包含SEQ ID NO:40、44或48中的任一种或由其组成。

[0109] 本发明还提供包含本文所述核酸分子的表达载体。还提供包含本文所述表达载体的重组宿主细胞。

[0110] 可在合适的宿主细胞中生产本文所述抗原结合蛋白。用于生产本文所述抗原结合蛋白的方法包括培养本文所述宿主细胞和回收抗原结合蛋白的步骤。重组转化、转染或转导的宿主细胞可包含表达盒，其包含编码本文所述抗原结合蛋白重链可变结构域的多核苷酸，并进一步包含编码本文所述抗原结合蛋白轻链可变区的多核苷酸。可替换地，重组转化、转染或转导的宿主细胞可包含至少一种表达盒，由此第一表达盒包含编码本文所述抗原结合蛋白重链可变区的多核苷酸，并进一步包含含有编码本文所述抗原结合蛋白轻链可变区的多核苷酸的第二表达盒。稳定转化的宿主细胞可包含含有一个或多个编码本文所述抗原结合蛋白的重链和/或轻链可变区的表达盒的载体。例如这种宿主细胞可包含编码轻链可变区的第一载体和编码重链可变区的第二载体。

[0111] 宿主细胞可为真核的例如哺乳动物。这种细胞系的实例包括CHO(中国仓鼠卵巢)或NS0 (骨髓瘤细胞系)。宿主细胞可为非人宿主细胞。宿主细胞可为非胚胎宿主细胞。宿主细胞可在培养基例如无血清培养基中培养。可由宿主细胞将抗原结合蛋白分泌到培养基中。可将抗原结合蛋白纯化到相对于所述含有抗原结合蛋白的培养基的至少95%或更高(例如98%或更高)。

[0112] 本发明的抗原结合蛋白被提供为包含抗体结合蛋白和生理上可接受的载体的组合物，或作为包含抗原结合蛋白和生理上可接受的载体的药物组合物。可提供包含这种组合物连同使用说明书的分份试剂盒(kit-of-part)。为了方便，试剂盒可包含预定量的试剂及使用说明。

[0113] 抗体结构可基于恒定区氨基酸序列将来自大部分脊椎动物物种的抗体轻链指定为称为κ和λ的两种类型中的一种。根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将人抗体指定为5种不同的种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。可将IgG和IgA进一步细分为亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；
和IgA1和IgA2。具有至少IgG2a、IgG2b物种变体存在于小鼠和大鼠。

[0114] 可变区的更保守的部分称为构架区(FR)。完整重链和轻链的可变结构域各包含由3个CDR连接的4个FR。各链中的CDR由FR区接近地结合在一起，并与来自其他链的CDR结合在一起，这样有助于形成抗体的抗原结合位点。

[0115] 制备方法可在以下转基因生物体中制备抗原结合蛋白：例如山羊(参见，例如，Pollock等
(1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157)、鸡(参见，例如，Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55)、小鼠(参见，例如，Pollock等，1999)或植物(参见，例如，Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11: 199-204；Ma (1998) Nat. Med. 4: 601-606；
Baez等(2000) BioPharm 13: 50-54；Stoger等(2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590)。

[0116] 还可通过化学合成来制备抗原结合蛋白。然而，通常用本领域技术人员众所周知的重组细胞培养技术来制备抗原结合蛋白。分离编码抗原结合蛋白的多核苷酸，将其插入到可复制的载体例如质粒中用于进一步克隆(扩增)或表达。一种表达系统为谷氨酸合成酶系统(例如由Lonza Biologics, Basel, Switzerland所销售)，尤其是当宿主细胞为CHO或NS0时。易于分离编码抗原结合蛋白的多核苷酸，并用常规程序(例如寡核苷酸探针)测序。可使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、通常所用质粒的微染色体。通常这种载体进一步包括与抗原结合蛋白多核苷酸可操作地连接的信号序列、复制起始点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，以便促进表达。可将编码轻链和重链的多核苷酸插入到分开的载体，并同时或序贯引入(例如通过转化、转染、电穿孔或转导)同一个宿主细胞中，或在需要时可在所述引入之前将重链和轻链二者插入到相同载体中。

[0117] 可以使用本发明的多核苷酸序列的密码子优化以增加由宿主细胞产生的蛋白的水平。已公开了若干方法(Nakamura等(1996)Nucleic Acids Research 24: 214-215；W098/34640；W097/11086)。由于遗传编码的冗余性，本文公开的可替换的多核苷酸(尤其是那些密码子优化用于在给定宿主细胞中表达的多核苷酸)还可编码本文所述抗原结合蛋白。可修改编码本发明抗原结合蛋白的多核苷酸的密码子使用以满足宿主细胞的密码子偏好来增加转录物和/或产物产量(例如Hoekema等，Mol Cell Biol 1987
7(8):2914-24)。密码子选择可基于用于表达的宿主细胞的合适的相容性。

[0118] 抗原结合蛋白可作为含在成熟蛋白的N-末端具有特异性切割位点的异源信号序列的融合蛋白产生。信号序列应该由宿主细胞识别并处理。对于原核宿主细胞，信号序列可为例如碱性磷酸酶、青霉素酶或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，信号序列可为例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列，参见例如WO90/13646。在哺乳动物细胞系统中，病毒分泌性前导序列例如单纯疱疹gD信号和天然免疫球蛋白信号序列可能是合适的。通常信号序列符合读框地与编码抗原结合蛋白的DNA连接。

[0119] 对于适于大部分革兰氏阴性细菌的pBR322，适于大部分酵母的2 μ质粒和适于大部分哺乳动物细胞的各种病毒来源(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)，复制起始点是本领域中众所周知的。通常对于哺乳动物表达载体不需要复制起始点组分，但可使用SV40，因为其含有早期启动子。

[0120] 典型的选择基因编码以下蛋白：(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)或四环素(tetracycline)的抗性，或(b)补充营养缺陷或提供在复杂培养基中不能获得的营养物，或(c)二者组合。选择方案可涉及阻止宿主细胞生长。已经用编码抗原结合蛋白的基因成功转化的细胞，由于例如由共同递送的选择标记赋予的药物抗性而存活。一个实例是二氢叶酸还原酶(DHFR)选择标记，其中在甲氨蝶呤存在下培养转化物。细胞可在渐增量的甲氨蝶呤存在下培养，以扩增外来目的基因的拷贝数。CHO细胞是用于DHFR选择的特别有用的细胞系。另一实例是谷氨酸合成酶表达系统(Lonza Biologics, Basel, Switzerland)。用于酵母中的选择基因的实例是trpl基因，参见Stinchcomb等(1979) Nature 282: 38。

[0121] 将适于表达抗原结合蛋白的启动子可操作地与编码抗原结合蛋白的DNA/多核苷酸连接。用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸和杂交启动子例如Tac。适于在酵母细胞中表达的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶，例如烯醇酶、甘油醛3磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶和葡萄糖激酶。诱导型酵母启动子包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或麦芽糖/半乳糖利用的酶。

[0122] 用于在哺乳动物细胞系统中表达的启动子包括病毒启动子，例如多瘤病毒、禽痘病毒和腺病毒(例如腺病毒 2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(尤其是立即早期基因启动子)、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、肌动蛋白、罗氏肉瘤病毒(RSV)启动子和早期或晚期猴病毒40。当然，启动子的挑选基于与用于表达的宿主细胞的合适的相容性。第一质粒可包含RSV和/或SV40和/或CMV启动子、编码轻链可变区(VL)、κC区、连同新霉素和氨苄青霉素抗性选择标记的DNA，第二质粒包含RSV或SV40启动子、编码重链可变区(VH)的DNA、编码γ1恒定区的DNA、DHFR和氨苄青霉素抗性标记。

[0123] 若合适时，例如用于在高等真核细胞中表达时，可使用在载体中可操作地与启动子元件连接的增强子元件。哺乳动物增强子序列包括来自球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白和胰岛素的增强子元件。可替换地，人们可使用来自真核细胞病毒的增强子元件，例如SV40增强子(在bp100-270处)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子(polyma enhancer)、杆状病毒增强子或鼠IgG2a基因座(参见WO04/009823)。增强子可位于载体的启动子上游位点。可替换地，增强子可位于其他地方，例如在非翻译区或聚腺苷酸化信号下游。增强子的选择和定位可基于与用于表达的宿主细胞的合适的相容性。

[0124] 在真核生物系统中，将聚腺苷酸化信号可操作地与编码抗原结合蛋白的DNA/多核苷酸连接。通常将这种信号序列置于开放读框的3'端。在哺乳动物系统中，非限制性实例包括源自生长激素、延伸因子-1α和病毒(例如SV40)基因或逆转录病毒长末端重复的信号。在酵母系统中，聚腺苷酸化/终止信号的非限制性实例包括源自磷酸甘油酸激酶(PGK)和醇脱氢酶1 (ADH)基因的信号。在原核系统中，通常不需要聚腺苷酸化信号，通常代之以采用更短更明确的终止子序列。聚腺苷酸化/终止序列的选择可基于与用于表达的宿主细胞的合适的相容性。

[0125] 除以上外，可用于提高产量的其他特征包括染色质重构元件、内含子和宿主-细胞特异性密码子修饰。

[0126] 用于克隆或表达编码抗原结合蛋白的载体的合适的宿主细胞为原核细胞、酵母细胞或高等真核生物细胞。合适的原核细胞包括真细菌类，例如肠杆菌科，例如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(例如ATCC 31,446；31,537；27,325))；肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形菌属(Proteus)，沙门氏菌属(Salmonella)，例如沙门伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷菌(Serratia marcescans)，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. licheniformis) (参见DD 266 710)，假单胞菌属(Pseudomonas)，例如铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。在酵母宿主细胞中，还涵盖酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces) (例如ATCC 16,045；12,424；24178；56,500)、耶氏酵母属(yarrowia) (EP402, 226)、毕赤酵母(Pichia pastoris) (EP 183 070，还参见Peng等(2004) J. Biotechnol. 108: 185-192)、念珠菌属(Candida)、里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244 234)、青霉属(Penicillin)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主，例如构巢曲菌(A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)。

[0127] 高等真核生物宿主细胞包括哺乳动物细胞，例如COS-1 (ATCC No.CRL 1650)、COS-7 (ATCC CRL 1651)、人胚肾细胞系293、幼仓鼠肾细胞(BHK) (ATCC CRL.1632)、BHK570 (ATCC NO:CRL 10314)、293 (ATCC NO.CRL 1573)；中国仓鼠卵巢细胞CHO (例如CHO-Kl, ATCC NO:CCL 61)、DHFR-CHO细胞系例如DG44 (参见Urlaub等(1986) Somatic Cell Mol. Genet.12: 555-556)，尤其是适应于悬浮培养的CHO细胞系、小鼠sertoli细胞、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞(ATCC CRL-1587)、HELA细胞、犬肾细胞(ATCC CCL 34)、人肺细胞(ATCC CCL 75)、Hep G2和骨髓瘤或淋巴瘤细胞，例如NS0 (参见US 5,807,715)、Sp2/0、Y0。

[0128] 还可进一步对这种宿主细胞进行工程改造或改变，以改进抗原结合蛋白的质量、功能和/或产量。非限制性实例包括特异性修饰(例如糖基化)酶和蛋白折叠伴侣的表达。

[0129] 可通过本领域技术人员已知的任何方法来培养用编码抗原结合蛋白的载体转化的宿主细胞。可将宿主细胞培养在旋转培养瓶、滚动瓶或中空纤维系统中，但对于大规模生产，尤其对于悬浮培养使用搅拌罐反应器。可将搅拌罐改为用例如喷头、阻墩(baffle)或低剪切力叶轮通气。对于鼓泡塔和气升式反应器，可使用空气或氧气泡直接通气。当宿主细胞在无血清培养基中培养时，向培养基中补充细胞保护剂(例如pluronic F-68)来帮助预防因通气过程而造成的细胞损伤。根据宿主细胞特性，可将微载体用作贴壁依赖性细胞系的生长底面，或可将细胞变得适应于悬浮培养(其具有代表性)。宿主细胞尤其是无脊椎动物宿主细胞的培养可利用多种操作方式，例如分批补料式、重复批量处理(参见Drapeau等(1994) Cytotechnology 15: 103-109)、持续批处理或灌注培养。尽管可将重组转化的哺乳动物宿主细胞培养在含血清培养基中，例如胎牛血清(FCS)，例如这种宿主细胞可培养在合成的无血清培养基中，例如公开在Keen等(1995) Cytotechnology 17: 153-163中的TM
培养基，或商购培养基，例如ProCHO-CDM或ULTRACHO (Cambrex NJ, USA)，需要时补充能源，例如葡萄糖和合成生长因子，例如重组胰岛素。宿主细胞的无血清培养可能需要使那些细胞适应于在无血清条件下生长。一种适应方法是在含血清培养基中培养这种宿主细胞，反复将80%的培养基更换为无血清培养基，以使宿主细胞学会适应在无血清条件下(参见例如Scharfenberg等(1995)在Animal Cell Technology: Developments towards the
21st century (Beuvery等编辑，619-623, Kluwer Academic publishers)。

[0130] 可回收分泌到培养基中的抗原结合蛋白，并用多种技术纯化以提供适合用于预期用途的纯化程度。例如抗原结合蛋白用于治疗人患者的用途通常需要至少95%纯度，更通常98%或99%或更高纯度(与粗培养基比较)。通常用离心，接着用例如微孔过滤、超滤和/或深层过滤来澄清上清液的步骤，从培养基中除去细胞碎片。可利用多种其他技术，例如透析和凝胶电泳和色谱技术，例如羟磷灰石(HA)、亲和色谱法(任选涉及亲和标签系统，例如多组氨酸)和/或疏水作用色谱法(HIC，参见美国专利号5, 429,746)。在进行各种澄清步骤后，可用蛋白A或G 亲和色谱法来捕获抗体。可接着进行另外的色谱步骤，例如离子交换和/或HA色谱法、阴离子或阳离子交换、大小排阻色谱法和硫酸铵沉淀。还可采用各种病毒除去步骤(例如用例如DV-20 过滤器纳米过滤)。在这些各种步骤后，提供包含至少75mg/ml或更高、或100mg/ml或更高的抗原结合蛋白的纯化的(例如单克隆)制剂。这种制剂基本上没有抗原结合蛋白的聚集形式。

[0131] 可将细菌系统用于表达抗原结合片段。这种片段可位于细胞内、外周胞质内或分泌到细胞外。可根据本领域技术人员已知的方法，提取不溶性蛋白，再折叠形成活性蛋白，参见Sanchez等(1999) J. Biotechnol. 72: 13-20；和Cupit等(1999) Lett Appl Microbiol 29: 273-277。

[0132] 脱酰胺作用是其中除去酰胺官能团的化学反应。在生物化学中，该反应在蛋白降解中很重要，因为其损伤含有酰胺侧链的氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺。脱酰胺反应是用于医疗用途的蛋白的制备过程中发生的常见的翻译后修饰。例如，已经报道在体外或体内降低或丢失重组人DNA酶和重组可溶性CD4的生物学活性，而其他重组蛋白似乎不受影响。

[0133] 产生与MAGE-A3和MAGE-A6特异性结合的mAb的方法本发明进一步提供制备、鉴定和产生与MAGE-A3 和 MAGE-A6特异性结合但不与
MAGE-A2或MAGE-A12结合(或特异性结合)的单克隆抗体的方法。该方法包括用至少一种免疫肽免疫动物(如小鼠)，所述免疫肽包含分歧表位，即，与MAGE-A3和MAGE-A6中发现的序列100％相似、但显示与MAGE-A2或MAGE-A12的任何部分的更低序列相似性的氨基酸序列。氨基酸序列可以显示与MAGE-A2或MAGE-A12的任何部分的低于90％、80％、77％、75％或70％的相似性。合成包含氨基酸序列的免疫肽并且任选地连接至载体蛋白(如匙孔傶血蓝蛋白)；可以将一个或两个氨基酸添加到氨基酸序列以促进其连接至载体蛋白并与之保持距离。这种肽的实例包括SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。本发明进一步提供制备、鉴定和产生与MAGE-A3 和 MAGE-A6特异性结合但不与任何其他MAGE-A亚家族成员结合(或特异性结合)的单克隆抗体的方法。

[0134] 免疫后，免疫动物的细胞用于通过任何合适的方法产生单克隆抗体，如Kohler和Milstein, Nature, 256:495 (1975)首先描述的杂交瘤的方法。进行筛选以鉴定与MAGE-A3和MAGE-A6、但不与MAGE-A2或MAGE-A12特异性结合的那些单克隆抗体。可以使用杂交瘤培养上清液或纯化的单克隆抗体进行这种筛选。可以使用本领域中已知的方法从杂交瘤分离编码单克隆抗体的DNA并测序，以获得单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列。然后将编码期望的单克隆抗体(或单克隆抗体的部分)的DNA放置于表达载体中，然后将该表达载体转染进合适的宿主细胞中，用于表达编码的多肽。也可以，例如，通过用编码人重和/或轻链构架区的序列取代相应的序列而修饰DNA。

[0135] 使用方法可将本文所述抗原结合蛋白用于体外或体内检测生物样品中的MAGE-A3和/或
MAGE-A6。检测可以是为了研究、治疗或诊断目的。例如，可以将抗-MAGE-A3抗原结合蛋白用于在培养的细胞、在组织、在体液中或在血清中检测MAGE-A3。组织可能出于任何原因首先从人或动物体取出(例如，活检样品，或在手术期间切出的组织)，并且可能是从人患者获得的肿瘤组织(包括但不限于黑色素瘤和非小细胞肺癌)。可采用常规免疫测定，包括ELISA、蛋白印迹、免疫组织化学或免疫沉淀。

[0136] 通过关联MAGE-A3的存在或水平与疾病，本领域技术人员可以诊断与MAGE-A3表达相关的疾病。来自受试者如人受试者的肿瘤组织中的MAGE-A3的检测可以用于确定受试者是否适于，或可能响应于，设计用于治疗表达MAGE-A3的肿瘤的治疗。本发明的抗原结合蛋白可用于检测MAGE-A3和/或MAGE-A6蛋白，并且可用于筛选福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织中的MAGE-A3和/或MAGE-A6。

[0137] MAGE-N的预测的氨基酸序列(SEQ ID NO:68) (Genebank, Locus No. AF443295; Zhang等.Oncology Report, 20:245, 2008)具有与MAGE-3A的N-末端区域具有97％的序列相似性即具有一个氨基酸差异的N-末端区域(氨基酸1-129)。对应于MAGE-N的N-末端区域中的氨基酸73-90的序列与肽MA3#3 (SEQ ID NO 37)(对应于MAGE-A3中的氨基酸73-90)中MAGE-A3片段的氨基酸序列相同。本文所述抗原结合蛋白与MA3#3肽特异性结合(图7)。因此，可以将本文所述抗原结合蛋白用于体外或体内检测生物样品中的MAGE-N。
检测可以是为了研究、治疗或诊断目的。例如，可以将抗-MAGE-A3抗原结合蛋白用于在培养的细胞、在组织、在体液中或在血清中检测MAGE-N。组织可能出于任何原因首先从人或动物体取出(例如，活检样品，或在手术期间切出的组织)，并且可能是从人患者获得的肿瘤组织(包括但不限于肝细胞癌)。可采用常规免疫测定。包括ELISA、蛋白印迹、免疫组织化学或免疫沉淀。

[0138] 通过关联MAGE-N的存在或水平与疾病如肝细胞癌，本领域技术人员可以诊断与MAGE-N表达相关的疾病。来自受试者如人受试者的肿瘤组织中的MAGE-N的检测可以用于确定受试者是否适于，或可能响应于，设计用于治疗表达MAGE-N的肿瘤的治疗。本发明的抗原结合蛋白可用于检测MAGE-N蛋白，并且可用于筛选福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织中的MAGE-N。

[0139] 可将本发明的抗原结合蛋白提供在诊断试剂盒中，所述试剂盒包括一种或多种抗原结合蛋白、可检测标记和试剂盒的使用说明。为了方便，试剂盒可包括预定量的试剂和使用说明。

[0140] 序列SEQ ID NO:1 - 11: 分别为人MAGE A1、A2、A3、A4、A5、A6、A8、A9、A10、A11和A12。

[0141] SEQ ID NO:12 - 22: 对应于MAGE-A3 aa66-91的MAGE A1、A12、A2、A3、A6、A4、A5、A8、A10、A11和A9的片段。

[0142] SEQ ID NO:23: 对应于MAGE-A3 aa 66-91的片段的共有序列。

[0143] SEQ ID NO:24 - 33: 对应于MAGE-A3 aa137-180的MAGE A1、A12、A2、A3、A6、A4、A8、A10、A11和A9的片段。

[0144] SEQ ID NO:34: 对应于MAGE-A3 aa 137-180的片段的共有序列。

[0145] SEQ ID NO:35: 用于免疫的肽MA3#1。

[0146] SEQ ID NO:36: 用于免疫的肽MA3#2。

[0147] SEQ ID NO:37: 用于免疫的肽MA3#3。

[0148] SEQ ID NO:38 – 49: 用于mAb 1B1、mAb 16G7和mAb 23D2的重链和轻链核苷酸和氨基酸序列。

[0149] SEQ ID NO:50 – 52: mAb 1B1的CDRH1 – CDRH3。

[0150] SEQ ID NO:53 – 55: mAb 1B1的CDRL1 – CDRL3。

[0151] SEQ ID NO:56 – 58: mAb 16G7的CDRH1 – CDRH3。

[0152] SEQ ID NO:59 – 61: mAb 16G7的CDRL1 – CDRL3。

[0153] SEQ ID NO:62 – 64: mAb 23D2的CDRH1 – CDRH3。

[0154] SEQ ID NO:65 – 67: mAb 23D2的CDRL1 – CDRL3。

[0155] SEQ ID NO:68: MAGE-N。实施例

[0156] 实施例1-全长MAGE-A3和MAGE-A6肽的合成为了降低获得与其他MAGE-A蛋白交叉反应的抗体的机会，鉴定来自MAGE-A3蛋白的分歧表位并使用含有该表位的肽免疫小鼠。还使用由用全长MAGE-A3蛋白(SEQ ID NO:3)免疫小鼠组成的第二种策略。

[0157] 鉴定分歧表位。这些表位源自MAGE-A3序列(SEQ ID NO:3)的两个区域，所述区域显示与其他MAGE-A蛋白序列(除了它们与之高度相似的MAGE-A6序列)更少的序列相似性。第一区域跨越MAGE A3的氨基酸(AA)66至91(SEQ ID NO:15)，并显示与MAGE-A2和MAGE-A12分别73％和76％的同一性(图2)。第二区域包含MAGE-A3的AA 137至180(SEQ ID NO:27)，并显示与MAGE-A2和MAGE-A1272％的同一性(图3)。

[0158] 合成总共三个含有分歧表位的肽(表3)：表3
肽名称在MAGE-A3(SEQIDNO:3)中的相应氨基酸肽序列 SEQIDNO
MA3#1 AA137-147 CGSVVGNWQYFF SEQIDNO:35
MA3#2 AA163-180* CGIELMEVDPIGHLYFAT SEQIDNO:36
MA3#3 AA73-90 CGTTMNYPLWSQSYEDSSNQ SEQIDNO:37
* MAGE-A3中氨基酸163至180的序列为GIELMEVDPIGHLYIFAT (参见图1)。通过粗
心的错误，MA3#2肽被合成为CGIELMEVDPIGHLYFAT，并且不含有对应于MAGE-A3序列的残基#177的异亮氨酸残基。

[0159] 将一个或两个氨基酸(上述表3中带下划线的)加至MA3肽的NH2末端以促进其连接至载体蛋白并与之保持距离。由于使用的三个MAGE-A3片段与MAGE-A6具有高序列相似性，预测获得的抗体可以与该蛋白交叉反应。

[0160] 合成MA3#1、MA3#2和MA3#3肽(New England Peptide, Inc.)并直接与匙孔傶血蓝蛋白(KLH)缀合。肽-KLH缀合物为1 mg/ml的浓度。还合成未缀合的冻干的MA3#1、MA3#2和MA3#3肽(NEP Inc)。

[0161] 获得总共3 mg浓度为0.426 mg/ml的杆状病毒中产生的MAGE-A3重组蛋白和3mg浓度为1.487 mg/ml的大肠杆菌中产生的MAGE-A3重组蛋白(GSK Biologicals, Rixensart, Belgium)。还获得浓度为0.486 mg/ml的MAGE-A2重组蛋白(LVL313)和浓度为0.458 mg/ml的MAGE-A12重组蛋白(LVL314) (GSK Biologicals, Laval, Canada)。所有这种材料以小等份保存在-20℃。

[0162] 实施例2-免疫策略：同时进行具有不同免疫策略的两个方案。这些实验由机构动物伦理委员会批准。

[0163] 每个方案由免疫一组四只购自Charles River Inc的6-8周龄雌性Balb/c小鼠组成。免疫前，对于每组小鼠，采集血液样品以获得免疫前血清。

[0164] 第一种方案(IMM-134)包括在佐剂Quil-A(Cedarlane Laboratories Ltd., Hornby, ON, Canada; Superfos Biosector, Vedbaek, Denmark)存在的情况下用三种肽-KLH缀合物(如实施例1中所述)的混合物免疫小鼠。在第0、14和35天用在100 µl 体积中的10 µg每种肽-KLH缀合物和10 µg Quil-A皮下(s.c.)注射每只小鼠。在第45天采集血液样品用于分析。实施例11描述了随后的详细方案。

[0165] 第二种方案包括用MAGE-A3重组蛋白免疫小鼠。在第0、14和35天用在100 µl 体积中的20 µg杆状病毒中产生的MAGE-A3重组蛋白和10 µg Quil-A皮下(s.c.)注射每只小鼠。在第45天采集血液样品用于分析。实施例11描述了在进行本实施例随后的详细方案。

[0166] 实施例3-滴度测定、小鼠选择和最终加强-结果通过ELISA对在杆状病毒中产生的重组MAGE-A3蛋白测试免疫前(第0天)血清和不
同浓度的在第45天从来自实施例2的每只免疫小鼠获得的血清(图4A和4B)。然后进行第二次ELISA分析，其中用重组MAGE-A3、MAGE-A2和MAGE-A12蛋白以及用与KLH缀合的三种MAGE-A3肽(MA3#1, MA3#2和MA3#3)中的每一种测试来自每个方案的每只小鼠的血清。将这些血清的反应性与免疫前血清(小鼠，IMM-135＃1)、mAb 57B(作为阳性对照)、无关的mAb M344(阴性对照)和单独的二级抗体(山羊抗小鼠(GAM)IgG-HRP，Jackson ImmunoResearch)(阴性对照)的反应性比较(图5)。

[0167] 用抗原包被Nunc MAXISORP™96孔的孔。如下在Tris-缓冲盐水(TBS)中稀释抗原：对于纯化的重组MAGE蛋白为0.1 µg/50µl，或对于与KLH缀合的肽为0.5 µg/50µl，所述抗原以50 µl/孔分布并在37℃干燥过夜。所述孔在TBS中洗涤数次，将50 µl TBS-1%酪蛋白加入每孔。所述孔在37℃孵育1小时，在TBS中再次洗涤数次。

[0168] 加入50μl小鼠血清，在TBS-0.02％酪蛋白中稀释，然后在湿度箱中在37℃孵育1小时，并用TBS洗涤6次。

[0169] 然后加入二级抗体：将50μl辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二级抗体(GAM IgG-HRP, Jackson ImmunoResearch)加入每孔，在TBS-0.02％酪蛋白中1:5000稀释，并且在湿度箱中在37℃孵育1小时。然后用TBS洗涤孔6次。

[0170] 显色：加入每孔50μl的2,2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS, Chemicon International,目录号ES004-500 ml)并在湿度箱中在37℃孵育30分钟。通过加入50μl/孔的ABTS封闭溶液终止反应。在Molecular Devices板酶标仪上读出在405nm处的光密度。

[0171] 针对稀释范围为1:1000至1:500,000的MAGE-A3蛋白检测来自所有8只小鼠的血清。图4A显示了，用三种与KLH缀合的肽的混合物免疫的小鼠(方案IMM-134)中，小鼠#3具有最高的滴度。具有第二最高滴度的小鼠是小鼠#4。如图4B中显示，在用重组MAGE-A3蛋白免疫的小鼠组(方案IMM-135)中，小鼠#1具有最高的滴度。

[0172] 为了确定抗血清的特异性并确定来自方案IMM-134的小鼠的抗血清与何种肽是反应的，进行第二次ELISA分析，其中用重组MAGE-A3、MAGE-A2和MAGE-A12蛋白以及用三种与KLH缀合的MAGE-A3肽中的每一种检测来自每个方案(1:1000稀释)的小鼠的血清。

[0173] 图5显示了IMM-134小鼠#4的血清与重组MAGE-A3，但非MAGE-A2或MAGE-A12肽反应。这表明用分歧肽的免疫策略(IMM-134)在产生对MAGE-A3/A6特异性的抗体中是有效的。该小鼠的血清也与MAGE-A3肽＃2和＃3反应，但不与肽＃1反应，表明肽＃1免疫原性更弱，肽＃2和＃3含有对MAGE-A3特异性的表位。

[0174] 另一方面，IMM-135小鼠#1的血清对MAGE-A3不是特异性的，因为它也与MAGE-A2和MAGE-A12交叉反应。该血清与MAGE-A3肽#3的强反应性提示，该肽含有免疫显性表位(图5)。

[0175] 实施例4-细胞融合-结果因为来自用与KLH缀合的肽的混合物免疫的小鼠的血清中的抗体滴度，以及因为这导致对MAGE-A3/A6特异性的抗体的产生(见上面的实施例3)，使用来自小鼠＃3的脾细胞( IMM-134；实施例2)进行细胞融合。

[0176] 通过注射相同量(10μg的每种肽-KLH缀合物)的用于前面小鼠#3 (IMM-134)中的免疫的抗原进行最终加强。然而，最终加强意在静脉内(i.v.)给予，并且没有佐剂。在小鼠# 3(IMM-134)的最终加强中犯了技术错误，因为在Quil-A存在的情况下注射了抗原，这在注射后几分钟杀死了小鼠。因此，使用小鼠＃4(IMM-134)重复最终加强(没有Quil-A)。最终加强后三天通过心脏穿刺处死小鼠#4。使用采集的血液来制备血清。在无菌条件下取出小鼠＃4的脾脏，分离并制备脾细胞用于融合。

[0177] 实施例12描述了在进行本实施例随后的方案。简而言之，在培养基(含有β-巯基乙醇、100 U青霉素和100 U 链霉素的Iscove氏培养基)中洗涤脾细胞数次并计数。获得总数为187,500,000个活细胞和80,000,000个死细胞(70％活力)。

[0178] 培养脾细胞，稀释，洗涤并计数(参见实施例12)。获得总共为66,300,000个活细胞和15,000,000个死细胞(70％活力)。然后用66,300,000个SP2细胞融合187,500,000个脾细胞(近似3:1的脾细胞/SP2比)。在23块96-孔板中用200μl细胞悬浮液/孔接种杂交瘤。

[0179] 实施例5-抗体筛选-结果在实施例4中描述的融合之后13天，克隆准备进行测试。23块板的观察结果显示，在每个孔中发现1-5个克隆。通过ELISA进行抗-MAGE-A3反应性克隆的鉴定。

[0180] 用重组MAGE-A3蛋白包被Nunc MAXISORP™ 96-孔板的孔。以0.1 µg/50µl在Tris-缓冲盐水(TBS)中稀释MAGE-A3，以50 µl/孔分布并在37℃干燥过夜。所述孔在TBS中洗涤数次，将50 µl TBS-1%酪蛋白加入每孔。所述孔在37℃孵育1小时，在TBS中再次洗涤数次。

[0181] 从实施例4中获得的23块96-孔板的每个孔，获得在TBS-0.02％酪蛋白中稀释的50μl培养基上清，并转移进用MAGE-A3蛋白包被的孔中，然后在湿度箱中在37℃孵育1小时，并用TBS洗涤6次。

[0182] 用50μl 57B杂交瘤上清液替代来自每个板的孔H12的上清液作为阳性对照。

[0183] 如实施例3中所述的对于MAGE-A3的ELISA方案中所指示揭示反应性抗体。

[0184] 阳性克隆是与大部分其他克隆相比在405nm处具有更高吸收的那些克隆。鉴定至少135个MAGE-A3反应性克隆。(结果未显示)。将每个这些潜在克隆转移进含有1ml完全培养基的24孔板以扩增细胞。

[0185] 实施例6-杂交瘤选择和亚克隆-结果总共，两天后在ELISA中检测来自实施例5的75个克隆与下列抗原的反应性，所述75个克隆在转移至24孔板后容易生长：重组MAGE-A3、重组MAGE-A2；重组MAGE-A12；与KLH缀合的肽MA3#1；与KLH缀合的肽MA3#2；和与KLH缀合的肽MA3#3。

[0186] 对于每个克隆，50µl培养基上清液转移进含有0.1 µg/孔的重组MAGE蛋白中的一种或0.5 µg/孔的与KLH缀合的肽中的一种的96孔板的孔中。作为阳性对照，对每种抗原检测50 µl 57B杂交瘤上清液。使用如实施例3中描述的方案揭示反应性抗体。

[0187] 在75个克隆中，58个保留与MAGE-A3的反应性，但只有50个对MAGE-A3是特异性的(8个克隆显示与MAGE-A12的交叉反应性，并且1个还与MAGE-A2交叉反应(克隆3H2、4B5、5D3、9H8、12F3、13A6、18H11、19H3))。几个克隆是非特异性的，因为它们与所有抗原反应。关于与肽-KLH缀合物的反应性，对MAGE-A3特异性的克隆的大多数仅与肽MA3#3有反应性，然而，几个也显示与肽MA3＃2的更低的反应性。仅仅两个克隆显示出比与肽MA3＃3更强的与肽MA3＃2的反应性(克隆9A5和21A8)。图6A和6B显示这些75个克隆中
的一些(包括1B1、16G7和23D2)的反应性。对于所有克隆的结果未显示。

[0188] 为了评价mAb在福尔马林固定和石蜡包埋组织中检测MAGE-A3的能力，通过免疫组织化学(IHC)对(a)TC1细胞的小鼠异种移植物(TC1)；(b) 表达MAGE-A3的TC1细胞的小鼠异种移植物(TC1-MAGE-A3细胞)和 (c) 人睾丸样品检测一系列22份MAGE-A3特异性克隆上清液(1:10稀释)的反应性。作为对照，用1:200稀释的mAb 57B上清液检测相同组织。TC1细胞的小鼠异种移植物由GSK提供；对于IHC方案参见随后的实施例13。从具有最佳分泌潜力和特异性的克隆中随机挑取22个克隆以提供对克隆在FFPE组织中检测MAGE-A3的能力的初始评价。

[0189] TC-1肿瘤细胞由T. C. Wu (Johns Hopkins University, Baltimore, MD)友情提供。如以前所述(Lin K等, Cancer Res.56:21-6 (1996))，它们通过HPV16 E6和E7基因以及活化的ras癌基因的相继转移从C57BL/6小鼠的原代肺细胞产生。然后，用MAGE-A3编码质粒稳定转染TC1-细胞。

[0190] 表4显示了IHC分析的结果。22个克隆中没有一个显示与TC1异种移植物的反应性。然而，7个克隆显示与TC1-MAGE-A3细胞的反应性(克隆1B1、1B12、3A5、5A2、16C1、16G7和23D2)。在这七个中，只有23D2上清液显示与人睾丸样品的弱反应性(与精原细胞、偶尔与初级精母细胞相关的反应性)。MAb 57B 在TC1细胞的异种移植物上是阴性的，但与TC1-MAGE-A3细胞的异种移植物以及与人睾丸(其中观察到精母细胞和精原细胞的强染色)是强烈反应的。

[0191] 表4

[0192] 然后亚克隆在IHC 中有反应性的7个克隆(1B1、1B12、3A5、5A2、16C1、16G7和23D2)，如同克隆13A6(其显示与MAGE-A2和-A12的交叉反应性(对于该方案参见随后的实施例14)。第一次亚克隆后，克隆1B1、3A5、16G7和23D2仍然与重组MAGE-A3反应。

[0193] 克隆1B1、16G7和23D2的第二次亚克隆后，测试的克隆中的100％(20/20)与重组MAGE-A3反应，并且这些杂交瘤被视为分泌单克隆抗体的纯克隆。对于克隆13A6也进行第二次亚克隆。克隆3A5在第二次亚克隆后不能被视为是纯的，因为20个亚克隆中的1个亚克隆没有与MAGE-A3反应。因此，对克隆3A5进行第三次亚克隆，测试的24个克隆中的15个亚克隆有反应性，表明该克隆是不稳定的。因此，停止克隆3A5的亚克隆。

[0194] 第二次亚克隆1B1、16G7、23D2和13A6后，这些克隆逐渐适应在标准培养基(含有100 U青霉素和100 U链霉素、50μM ß-巯基乙醇和10％胎牛血清的Iscove氏培养基)中生长。细胞首先在完全培养基而非HAT和P288D1条件培养基中生长。然后细胞在仅含有
10％而非20％的胎牛血清的培养基中生长。当细胞完全适应在标准完全培养基中生长时，进行ELISA以验证该克隆仍然分泌抗MAGE-A3抗体(参见图7)。克隆1B1、16G7和23D2和与KLH缀合的MAGE-A3肽＃3以及与重组MAGE-A3蛋白强烈反应，但不与其他抗原反应，表明在亚克隆后所述克隆保留其最初的反应性。作为安全措施，在亚克隆过程的各个步骤冷冻来自所有克隆的细胞。

[0195] 实施例7-冷冻细胞的母储存物(master stock)的制备扩增适应在标准培养基中生长的来自实施例6的杂交瘤以制备冷冻细胞的大量储存
6
物。对于每个杂交瘤，至少20个含有10 x 10 活细胞(在1 ml中)的冷冻管冷冻在90% FCS-10% DMSO(二甲亚砜)中。冷冻管在Mr. Frosty (Nalgene目录号：5100-001)盒中在-80℃冷冻过夜，然后储存在-80℃。

[0196] 其中保存母储存物的-80℃生物冷冻柜发生机械问题，温度上升至-40℃。细胞立即解冻，并在标准培养基中培养。高百分比的死亡率(>90%)导致进行如实施例6中所述的两次额外的亚克隆以确保杂交瘤是分泌性杂交瘤的纯克隆。在第二次亚克隆后，制备包6
含至少20个冻存管的新的母储存物，所述冻存管含有在90% FCS-10% DMSO中的10 x 10活细胞(在1 ml中)并具有超过90％的活力。冷冻管在Mr. Frosty (Nalgene 目录号：
5100-001)盒中在-80℃冷冻过夜，然后转移至液氮中。

[0197] 实施例8-抗体表征为了表征杂交瘤1B1、16G7和23D2产生的mAb的性质、活性和特异性，从实施例7获得的杂交瘤以大量生长以产生500-ml多批次的杂交瘤上清液。

[0198] 抗体浓度：通过夹心ELISA使用小鼠IgG标准曲线测定在这些批次的杂交瘤上清液中的每一批的抗体浓度。使用用0.5 µg/50 µl/孔的针对小鼠IgG和IgM的山羊多克隆抗体(Jackson Immunoresearch目录号：115-005-044)包被的96孔板。包被后，将板在37℃干燥过夜，然后所述孔在TBS中洗涤3次，将50 µl TBS-1%酪蛋白加入每孔。所述板在37℃孵育1小时，在TBS中再次洗涤3次。

[0199] 制备0.5至3ng/50μl范围内的IgG(Sigma目录号：I5381)的标准曲线，并一式三份加入孔(50μl/孔)。在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中制备来自杂交瘤1B1、16G7和23D2的上清液的1:1000至1:8000的稀释物，并以一式三份分布。所述板在湿度箱中在37℃孵育1小时，然后用TBS洗涤6次。

[0200] 向每孔中加入50μl在TBS -0.02％酪蛋白中1:5000稀释的HRP-缀合的二级抗体(山羊抗小鼠IgG-HRP，Jackson ImmunoResearch目录号：115-035-062)，所述板在湿度箱中在37℃孵育1小时，然后用TBS洗涤6次。加入ABTS(Chemicon International目录号：ES004-500 ml)，每孔100μl，并在湿度箱中在37℃孵育30分钟。通过加入100μl/孔的ABTS封闭溶液终止反应。在Molecular Devices板酶标仪上读出在405nm处的光密度。

[0201] 在mAb 23D2、16G7和1B1杂交瘤上清液中的抗体浓度分别为103、29和60 µg/ml。

[0202] 抗体同种型分型：使用来自Sigma的小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(目录号：ISO-2)通过ELISA测定mAb 23D2、16G7和1B1中每种的同种型。在抗小鼠重链特异性抗体上捕获来自杂交瘤上清液的抗体，使用HRP标记的二级抗体并随后在ABTS存在的情况下孵育而揭示结合的抗体。使用表5中列举的试剂。

[0203] 抗体在PBS中1:1000稀释，100μl/孔一式两份分布在96孔板中，在湿度箱中在37℃孵育1小时，并在TBS-0.05% Tween 20中洗涤三次。然后加入100μl样品上清液，在室温孵育1小时，在TBS-0.05% Tween 20中洗涤三次。二级抗体在TBS-0.05% Tween 20中1:600稀释，100 µl/孔分布，在37℃孵育1小时，并在TBS-0.05% Tween 20中洗涤三次。加入ABTS(Chemicon International目录号：ES004-500 ml)，每孔100μl，并在湿度箱中在37℃孵育30分钟。通过加入100μl/孔的ABTS封闭溶液终止反应，并在Molecular Devices板酶标仪上读出在405nm处的光密度。

[0204] mAb 23D2被确定为IgG2a抗体，而mAbs 16G7和1B1均为IgG1抗体(结果未显示)。

[0205] 抗体的纯化初步IHC分析(实施例6)提示mAb 23D2在IHC中工作良好。用50-ml杂交瘤上清液
23D2(批号090309)的样品使用MABTRAP™试剂盒(GE Healthcare Inc, United Kingdom)来纯化mAb 23D2。对于该方案参见随后的实施例15。对于IgG的Bradford测定法显示，可以从50 ml上清液纯化总共4.32 mg mAb 23D2。

[0206] 然后通过SDS-PAGE分析获得的mAb 23D2的纯度(对于该方案参见随后的实施例15)。结果表明，mAb 23D2样品是高纯度的，因为在污染蛋白不存在的情况下在还原条件下只有显示两个条带(重链和轻链；55kDa和23kDa)。

[0207] 抗体生物素化为了用于竞争测定中，将mAb 23D2生物素化。首先将纯化的mAb 23D2(在4.32 µg/µl为100µl)在4℃针对0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.8)透析过夜。透析后，获得的抗体浓度被确定为1.74 µg/µl(使用如实施例15中所述的Bradford测定法)。

[0208] 将2.5 µl 0.5 µg/µl的生物素(总共1.25 µg)加入29 µl 1.74 µg/µl的纯化的mAb 23D2中(总共50 µg)。然后加入2.5µl DMSO(Fisher目录号：D4540)，并在室温孵育4小时。通过加入1µl 0.1M NH4Cl并随后在室温孵育10分钟而停止反应。该抗体在4℃针对PBS透析过夜，透析后的生物素化mAb的浓度被确定为1.33 µg/µl(使用如实施例15中所述的Bradford测定法)。

[0209] 然后使用生物素化mAb 23D2的稀释物(0、0.5、0.1、0.15、0.2、0.25 和0.3μg/50μl)进行针对MAGE-A3的ELISA，以确定生物素化的mAb 23D2使用的有用的条件。生物素化mAb的稀释曲线表明，0.032μg/50µl的抗体稀释物提供了在未饱和情况下的强信号(图8)。

[0210] 抗体竞争为了确定mAb 23D2、1B1和16G7中的所有三种是否针对相同表位或针对不同表位，在生物素化mAb 23D2和渐增量的mAb1B1和16G7之间进行竞争测定。使用未标记的mAb 23D2作为竞争的阳性对照，使用mAb M75(无关的IgG1抗体)作为竞争的阴性对照。

[0211] 图9显示了竞争的结果。需要至少40倍更多的未标记的mAb 23D2竞争95％的生物素化的mAb 23D2。然而，仅需要10倍更多的mAb 16G7竞争95％的生物素化的mAb 23D2。此外，5倍更多的mAb 16G7能够竞争85％的生物素化的mAb 23D2。相反地，5倍更多的mAb
1B1提供对生物素化的mAb 23D2的很少竞争，甚至40倍更多的mAb 1B1仅可以竞争55%。
用无关的mAb M75，甚至在40X，没有观察到任何竞争。

[0212] 这些结果表明，mAb 23D2和16G7针对相同的表位，但mAb 16G7比mAb 23D2具有更高的亲和力/抗体亲抗原性。mAb 1B1或针对不同的但接近的表位，因为它与mAb 23D2部分地竞争；或针对与mAb 23D2相同的表位，但具有更低的亲和力/抗体亲抗原性，因为对于更完全地竞争mAb 23D2需要更大量(超过40X)的1B1抗体。

[0213] 抗体特异性在Western印迹分析中检测mAb 1B1、16G7和23D2对用编码MAGE-A1、A2、A3、A4、A6、A8、A9、A10、A11和A12的质粒瞬时转染的HEK 293细胞的特异性。使用未转染的细胞作为对照。将25至85μg的转染的或未转染的细胞的裂解物在SDS-PAGE上电泳，并转移至硝酸纤维素上。通过印记与mAbs 1B1、16G7和23D2中每一种孵育而进行免疫检测。额外地使用一起识别转染物表达的所有MAGE-A抗原的mAb的混合物进行免疫检测(对于该混合物中的mAb参见表6)。

[0214] 方法：以运行凝胶中10%丙烯酰胺和层叠凝胶中4.5%丙烯酰胺制备微型凝胶。在40 µl上样缓冲液(还原条件下)中制备样品，装入凝胶并在层叠凝胶中100V 和运行凝胶中200 V进行迁移。在4℃在1小时期间以100mA将蛋白转移至硝酸纤维素上，将膜在TBS-5％脱脂奶中孵育，并在室温与TBS-1%脱脂奶中稀释的抗体孵育1小时。膜在TBS中洗涤三次，并在室温和与HRP缀合的山羊抗小鼠HRP(Jackson Immunoresearch 目录号：
115-035-062)孵育一小时，然后在TBS中洗涤三次。通过化学发光(Perkin Elmer Western lightning目录号：NEL102)揭示结合的抗体；在1分钟至30分钟使膜曝光(Amersham目录号：28906836)。

[0215] 表6mAb 识别
57B MAGE-A1,A2,A3,A4,A6,A12(Dr.G.Spagnoli提供)
14A11MAGE-A9 (GSKBioSA)
6C1 MAGE-A1A2,A3,A4,A6,A10,A12(Novocastra)
MA454MAGE-A1(SantaCruzBiotechnolgy)
3F7 MAGE-A8(Abnova)
YN-2 MAGE-A11(Abnova)

[0216] 所有三种mAb(1B1、16G7和23D2)与MAGE-A3和A6特异性反应，因为它们没有显示与其他MAGE-A抗原的反应性。然而，mAb 16G7在长曝光后揭示出在未转染和转染的HEK293细胞中发现的更高分子量的非特异性条带。mAb 23D2揭示了限于MAGE-A3和A6的模式，具有可能是降解产物的一些低分子量条带。mAb 1B1如mAb 23D2对MAGE-A3和A6是高特异性的，显示了与降解产物没有反应性的干净模式。(Western印记未显示)
使用mAb 23D2对纯化的全长MAGE-A2、-A3、-A9和-A12重组蛋白进行另一种Western印迹分析。对于每种重组蛋白，通过SDS PAGE电泳1微克纯化的蛋白，并转移至硝酸纤维素上。然后用mAb 23D2和用一起能够识别4种MAGE-A蛋白的mAb(mAb 14A11和57B)的混合物检测印迹。MAb 23D2与MAGE-A3特异性反应，并且不与纯化的MAGE-A2、-A9或-A12蛋白交叉反应。(结果未显示)。

[0217] 也通过Western印迹检测mAb 1B1、16G7和23D2对以低于转染物(其可以以高水平表达转基因)的水平表达MAGE-A抗原的癌细胞的裂解物的反应性和特异性。检测四种类型的癌细胞(GERL、K562、STAQ和CRL-1555)。使用MAGE-A3瞬时转染的HEK293细胞的裂解物作为阳性对照。蛋白在SDS-PAGE上电泳，转移至硝酸纤维素并用所述三种mAb检测。

[0218] 所有三种mAb与HEK293-MAGE-A3转染物强烈反应。mAb 23D2和16G7与K562和GERL细胞的裂解液阳性反应，在约45 kDa处显示对应于MAGE-A3和/或MAGE-A6的条带。没有发现与STAQ和CRL-1555细胞的裂解物的反应。mAb 16G7还显示在所有细胞裂解物中都出现的在约60kDa处的一些非特异性条带。

[0219] 对于mAb 1B1，没有观察到与四种细胞裂解物中任一种的反应性，但在非常长曝光后，可以观察到在约45 kDa处的一些微弱条带。mAb 1B1与K562和GERL细胞裂解物的反应性的缺乏可能是由于该mAb更低的亲和力/抗体亲抗原性，这防止它检测与其中发现更高量的MAGE-A3的转染的HEK293细胞相比更少量的抗原。

[0220] 在HEK293细胞中表达的MAGE-A3和K562和GERL细胞表达的MAGE-A3之间可见迁移模式中的差异；用于转染HEK293细胞的MAGE-A3质粒编码His-标签的MAGE-A3蛋白，这导致该差异。

[0221] MAGE-A mRNA表达的RT-PCR分析显示，K562细胞表达MAGE-A6，GERL细胞表达MAGE-A3和A6(表7)。STAQ或CRL1555都没有表达MAGE-A3或MAGE-A6。因此，用mAb 23D2和16G7获得的结果与RT-PCR结果一致。

[0222] 表7MAGE-A3 MAGE-A1,A4 MAGE-A2,A3,A5,A6,A11,A12 MAGE-A8,A9,A10
GERL +++ +++ +++ +++
STAQ 阴性 +++ 阴性 +
CRL1555 阴性 +++ 阴性阴性
K562 阴性 ++ +++ +

[0223] 实施例9-组织样品中MAGE-A3表达的分析使用来自杂交瘤1B1、16G7和23D2的上清液，测定对于福尔马林固定和石蜡包埋组织中MAGE-A3/A6表达的IHC分析的合适的mAb稀释物。在人睾丸的切片上和TC1细胞或TC1-MAGE-A3转染的细胞的小鼠异种移植物上(所有都是福尔马林固定和石蜡包埋的)检测1:100至1:1000的上清液的稀释度。使用mAb 57B作为与精原细胞和精母细胞的反应性的阳性对照。在已经经过热诱导抗原恢复(使用实施例13中使用的方案)的组织切片上进行IHC。对于mAb 23D2(杂交瘤上清液；批号090309)，提供最好结果的稀释度是1:750，而对于mAb 16G7 (杂交瘤上清液；批号090309)，提供最好结果的稀释度是1:200。相反，mAb 1B1甚至在低稀释度没有使组织正确染色，因此该mAb被视为不适合用于在福尔马林固定和石蜡包埋组织中的IHC分析。(IHC结果未显示)。

[0224] 人睾丸、小鼠TC1和TC1-MAGE-A3细胞：在人睾丸组织样品上，mAb 23D2和16G7(分别为1:750和1:200的稀释度)强烈染色精原细胞和一些，但不是所有，初级精母细胞，提示MAGE-A3和/或A6在精子发生的早期步骤表达。当检测TC1和TC1-MAGE-A3细胞的小鼠异种移植物时，23D2和16G7在TC1-MAGE-A3异种移植物上都给出了强信号(类似用mAb 57B获得的)，但在TC1异种移植物上没有给出任何信号。然而，mAb 16G7在TC1异种移植物上给出比mAb 23D2更强烈的背景；mAb 23D2特异性更高，几乎没有给出任何背景。这些结果表明，16G7和23D2类似地染色这些对照组织，但是由于mAb 23D2在IHC和Western印迹分析中给出更特异性的信号，所以选择mAb 23D2用于分析膀胱肿瘤中的MAGE-A3/A6表达。

[0225] 人膀胱肿瘤：使用mAb 23D2分析一组福尔马林固定和石蜡(FFPE)包埋的膀胱肿瘤样品中MAGE-A3/A6的表达。使用mAb 23D2以染色从如Picard等 Int. J. Cancer ,120:2170-2177 (2007)报道的以前已经分析(通过RT-PCR分析测定MAGE-A3、-A4、-A8和-A9 mRNA的表达，用mAb-14A11 (MAGE-A4)和mAb57b (MAGE-A9)进行的IHC)的46份肿瘤样品剩下的33份肿瘤样品。图10显示了使用mAb 23D2(MAGE-A3/A6)在这组肿瘤上的IHC的结果，并与Picard等以前获得的结果相比较。

[0226] Picard等报道了在用mAb 57b 检测的肿瘤的36% (13/36)中的MAGE-A4表达，和用mAb 14A11检测的肿瘤的42% (15/36)中的MAGE-A9表达。Picard等, Int. J. Cancer , 120:2170-2177 (2007)。33份肿瘤中只有八份肿瘤(24％)显示当用mAb 23D2测试时的反应性。在大多数情况下，反应性是病灶性的，限于小于2％的肿瘤细胞。在一份肿瘤(TUM-660)中，40％的细胞被染色。这种肿瘤适度地表达MAGE-A3 mRNA，但总体上在MAGE-A3 mRNA表达和用mAb 23D2染色之间没有很好的相关性，因为大多数表达MAGE-A3 mRNA的肿瘤没有被mAb 23D2染色。然而，在这些肿瘤的大多数中MAGE-A3 mRNA的表达是低的，提示表达限于有限量的细胞，当在IHC中用mAb 23D2仅分析一个肿瘤切片时，这可能会错过。相反，在IHC中用mAb 23D2发现阳性的两个肿瘤对于MAGE-A3 mRNA 是阴性的。在这些情况下，mAb 23D2的反应性可能是由于MAGE-A6 mRNA在这些细胞中的表达导致的(关于MAGE-A6在测试的肿瘤中表达的数据没有获得)。此外，因为MAGE抗原表达的异质性且因为用于IHC分析和用于RNA分离的肿瘤部分不一定是并列的，目前IHC和以前的RT-PCR结果之间缺乏相关性不被解释为表明缺乏mAb 23D2的特异性。此外，一些肿瘤样品是旧的，一些固定在Bouin氏液中。已经显示许多mAb 对年龄和固定类型是高度敏感的。

[0227] 非肌肉侵袭性肿瘤：使用mAb 23D2进行一组46份更近的肿瘤中(所有都固定在福尔马林中并石蜡包埋(FFPE))MAGE-A3/A6表达的IHC分析；此外，分别使用mAb 57B和14A11评价MAGE-A4和MAGE-A9的表达。这些非肌肉侵袭性肿瘤(Ta期、T1期和Tis期)在2005年12月至2007年4月之间切出。表8显示在这些肿瘤中MAGE-A3/A6与MAGE-A4和MAGE-A9的表达比较的结果。23D2的染色通常是细胞质的，尽管在一些情况下(<10％的情况)，可以观察到稀有的阳性核。在大多数情况下(24/46)，染色是弱的，通常以低强度在10％或更少的细胞中观察到，尽管有时观察到中间强度。46份肿瘤中只有9份是完全阴性的。切片的仔细筛选最经常检测到一些微弱阳性细胞的小岛。一些肿瘤显示具有
20-50％阳性细胞的中间水平的染色。在这些中，染色的强度是非常多变的，一些区域弱染色，而其他区域以中间或甚至高强度染色。在乳头状肿瘤中，通常在乳头表面观察到强染色。平肿瘤(Flat tumours)通常倾向于是阳性的。一些肿瘤(3/46)显示大多数的阳性细胞(≥90％)，染色通常在中间强度，尽管在有些部分(in patches)是可变的且达到高强度。

[0228] 表8

[0229] 当与两种其他MAGE-A抗原的表达相比时，观察到mAb 23D2使被发现对MAGE-A4或MAGE-A9是阴性的7份肿瘤染色，提示MAGE-A3/A6可以与MAGE- A9是互补的。事实上，表达MAGE-A3/A6和/或MAGE-A9的肿瘤占所述肿瘤的93%，因为46份肿瘤中只有三份肿瘤不表达所述抗原中任一种。与MAGE-A3/A6相反，MAGE-A4与MAGE-A9不是互补的，因为所有表达MAGE-A4的肿瘤也表达MAGE-A9。所有这些抗原中，MAGE-A9是最均匀表达的，因为它在46份肿瘤中的15份中的超过50％的肿瘤细胞中被发现，而分别只有9份和6份肿瘤在相似比例的肿瘤细胞中表达MAGE-A4和MAGE-A3/A6。在超过50％的细胞中表达MAGE-A3/A6或MAGE-A4的肿瘤中的所有但除了1份(P1063)在超过50％的细胞中也表达MAGE-A9。

[0230] 人睾丸FFPE：在IHC染色中用两种不同的缓冲液在5µm FFPE人睾丸组织上测试mAb 1B1、16G7和23D2用于抗原修复步骤。作为阴性对照，使用通用阴性对照抗体(DakoCytomation Inc., Denmark (编号N1698))。

[0231] 在免疫染色前使用LabVision PT模块(Thermo Fisher Scientific, Fremont, California)制备样品载玻片。

[0232] 1. 载玻片脱石蜡和再水化：二甲苯3x (3分钟)
乙醇95% 2x (2分钟)
乙醇70% 1x (3分钟)
去离子水1x (3分钟)。

[0233] 2. 抗原修复步骤：再水化后，载玻片在室温置于含有作为缓冲液的pH 8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)或pH
6.0的柠檬酸盐的PT模块中，并开始热诱导表位修复。
25℃至97℃：约45分钟
在97℃：20分钟
97℃至65℃：约30分钟
在65℃，从浴中取出载玻片，并在去离子水中冲洗两分钟，随后在PBS缓冲液中冲洗两分钟。然后进行免疫组织化学染色，在湿度箱中进行所有孵育。

[0234] 3. 免疫组织化学染色第1天：通过在PBS中H202 1.5%中孵育15分钟(coplin jar)封闭内源过氧化物
酶。载玻片在PBS中冲洗2次(3分钟)，用PBS/BR 0.5%中正常山羊血清5％(封闭试剂, Roche, 11096176001)饱和30分钟。载玻片排水并用棉纸擦拭切片周围。施加在PBS/BR
0.5%中稀释的一级抗体，在4℃过夜(稀释度1:50；1:100；1:200；1:400)。

[0235] 第2天：载玻片在PBS中冲洗2次(5分钟)，将酶缀合的二级抗体施加至载玻片(Envision, DakoCytomation Ready-to-Use for Mouse (K4004))45分钟。然后载玻片在PBS中冲洗2次(3分钟)，并用色原(DAB试剂盒，Invitrogen)显色五分钟。然后载玻片在去离子水中冲洗3次(3分钟)，并用Mayer’s hemalun (Klinipath)复染1-3分钟，在自来水中冲洗5分钟，然后在去离子水中冲洗2分钟。然后载玻片脱水并用DePex介质(BDH Chemicals, 361254D)封固。

[0236] 结果如表A中所示。

[0237] 表A

[0238] 讨论：因此，在本文报道的免疫策略IMM-134中，用含有假定分歧表位的MAGE-A3肽免疫小鼠。MAGE-A3肽MA3＃3是高免疫原性的，因为大多数获得的阳性杂交瘤分泌与该序列中发现的表位反应的抗体。MAGE-A3肽MA3＃2也是免疫原性的，但也诱导更少抗体，而MAGE-A3肽MA3＃1明显免疫原性更低。产生三种与MAGE-A3/A6特异性反应的抗体。IgG1抗体mAb 1B1没有在福尔马林固定和石蜡包埋组织中很好地检测MAGE-A3/A6，但在Western印迹中作用良好。mAb 16G7在福尔马林固定和石蜡包埋组织上在Western印迹和IHC中都工作，但可能不是特异性的，因为它给出了更高的背景。IgG2a抗体mAb 23D2在IHC和Western印迹中表现良好。mAb 23D2和16G7与相同的表位反应，但16G7似乎比mAb 23D2具有更高的亲和力/抗体亲抗原性。mAb 1B1显然与由mAb 23D2识别的表位接近的表位反应，或识别相同的表位，但其亲和力/抗体亲抗原性比其他两种mAb低得多。这些结果提示，与肽MA3＃3反应的产生的抗体可能已针对单一显性表位，并且获得的抗体的差异可能是由于亲和力/抗体亲抗原性导致的。

[0239] 实施例10 单克隆抗体V-基因测序测定mAb 1B1、16G7和23D2中每一种的V-基因(编码可变区)的核苷酸序列。将每
种杂交瘤的冷冻细胞恢复并生长，对上清液中存在的抗体进行同种型分型。一旦回收细胞，将其裂解。用Promega SV总RNA系统从细胞裂解物分离RNA。进行RNA的逆转录以合成第一链cDNA。对于每个反应，使用总cDNA作为模板以及正向引物和相关同种型特异性反向引物(1B12 = IgG1κ; 16G7 = IgG1 λ;和23D2 = IgG2aλ)的合并物通过PCR进行V-基因扩增。根据制造商说明书使用Promega Access Quick试剂盒进行逆转录和PCR。纯化PCR产物并进行DNA测序。

[0240] mAb 1B1、16G7和23D2的可变轻和可变重链的核苷酸序列显示在图11中。图12提供了这些核苷酸序列编码的氨基酸序列，互补性决定区(CDR)用下划线表示(构架区不加下划线)。参见表9。

[0241] 表9

[0242] 实施例11在进行实施例2中遵循以下两个方案。该两种免疫程序(IMM-134和IMM-135)也概述于表10和表11中。

[0243] IMM-134方案：用3种与KLH缀合的MAGE-A3肽的混合物免疫Balb/c小鼠免疫原：制备三种MAGE-A3肽(MA3#1、MA3#2和MA3#3，参见本文实施例1)的混合物，每种肽与匙孔傶血蓝蛋白(KLH; NEP Inc, 收到的冻干的并以1 mg/ml 重构于PBS中)，每种肽的终浓度为0.1 µg/µl。

[0244] 佐剂：Quil-A 10 mg/ml (Cedarlane – Superfros Biosector; 目录号：7401)免疫：在4只Balb/c小鼠(Charles River Inc.)中，从每只小鼠采集100µl血液样品(免疫前血清)。将5μl 10 mg/ml的Quil-A加入500 µl 0.1 µg/µl的三种MAGE-A3肽(与KLH缀合)的混合物，并混合均匀。皮下注射100 µl/小鼠。因此，每只小鼠接受10 µg的每种MAGE-A3肽-KLH缀合物和10 µg Quil-A。

[0245] 加强：将5μl Quil-A(10 mg/ml)加入500 µl 0.1 µg/µl的三种MAGE-A3肽(与KLH缀合)的混合物，并混合均匀。皮下注射100 µl/小鼠。(因此，每只小鼠接受10 µg的每种MAGE-A3肽-KLH缀合物和10 µg Quil-A)。

[0246] 最后加强：静脉内注射100 µl/小鼠的0.1 µg/µl的三种MAGE-A3肽(与KLH缀合)的混合物。(因此，选择的小鼠接受10 µg的每种肽-KLH缀合物但没有佐剂)。

[0247] 表10：IMM-134程序：小鼠#3具有最高滴度，但因为实验失误没有活过最终加强。用小鼠#4进行融合。

[0248] IMM-135方案：用重组MAGE-A3免疫Balb/c小鼠免疫原：制备重组全长MAGE-A3(在杆状病毒中生产并由GlaxoSmithKline提供)的溶液。储存溶液为0.426 mg/ml MAGE-A3，并以终浓度0.2 µg/µl MAGE-A3制备PBS中的稀释液。

[0249] 佐剂：Quil-A 10 mg/ml (N.F. 31.05.2002) (Cedarlane – Superfros Biosector; 目录号：7401)。

[0250] 免疫：在4只Balb/c小鼠(Charles River Inc.)中，从每只小鼠采集100µl血液样品(免疫前血清)。将5μl 10 mg/ml的Quil-A加入500 µl 0.2 µg/µl的重组MAGE-A3蛋白，并混合均匀。皮下注射100 µl/小鼠。(因此，每只小鼠接受20 µg的重组MAGE-A3和10 µg Quil-A)。

[0251] 加强：将5μl Quil-A(10 mg/ml)加入500 µl 0.2 µg/µl的重组MAGE-A3蛋白，并混合均匀。皮下注射100 µl/小鼠。(因此，每只小鼠接受20 µg的重组MAGE-A3和10 µg Quil-A)。

[0252] 最后加强：静脉内注射100 µl/小鼠的MAGE-A3抗原。(因此，选择的小鼠接受20 µg的重组MAGE-A3但没有佐剂)。

[0253] 表11–IMM-135程序

[0254] 实施例12：融合方案制备Iscove’s-Pen/Strep-ßME溶液：含有Iscove氏改良Dulbecco培养基(GIBCO目录号：12200-028)，其中含有100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素(Gibco目录号：15140-122)和50μM ß-巯基乙醇。

[0255] 制备Iscove’s-Pen/Strep-ßME-5% FCS溶液：含有Iscove氏改良Dulbecco培养基(GIBCO目录号：12200-028)，其中含有100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素(Gibco目录号：15140-122)，50μM ß-巯基乙醇和5％胎牛血清(Gibco目录号：12483-020)制备Iscove’s-Pen/Strep-ßME-20% FCS Hyclone-HAT-1% CM溶液：含有Iscove氏改良Dulbecco培养基(GIBCO目录号：12200-028)，其中含有100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素( Gibco目录号：15140-122)，50μMβ-巯基乙醇和20％胎牛血清(Hyclone目录号：SH30071-03)，1X HAT(Gibco目录号：21060-017)和P388D1细胞的1％条件培养基(VP
21042005)。

[0256] 所有溶液和培养基在37℃预先温热。

[0257] 制备脾细胞：通过心脏穿刺进行小鼠处死。在无菌条件下取出脾脏。清空脾脏的细胞内容物，并在Iscove’s-Pen/Strep-ßME中洗涤细胞3次(Sorvall RT-6000D, 1500 rpm, 10分钟)。通过台盼蓝排斥计数细胞。

[0258] 结果：187.5 x 106活细胞和80 x 106死细胞= 70%活细胞制备SP2细胞：融合前一周开始培养SP2细胞。在Iscove’s-Pen/Strep-ßME-10% FCS
5
中培养细胞。融合的前一天，以3 x 10 细胞/ml稀释细胞。在融合当天，在Iscove’s-Pen/Strep-ßME中洗涤细胞一次(Sorvall RT-6000D, 1500 rpm, 10分钟)并通过台盼蓝排斥计数细胞。

[0259] 结果：66.3 x 106活细胞和15 x 106死细胞= 77%活细胞6 6
融合：在50 ml管中，以3:1的比例(187.5 x 10 脾细胞和66.3 x 10 SP2细胞)
组合脾细胞和SP2细胞，用Iscove’s-Pen/Strep-ßME完成体积至50ml，并离心(Sorvall RT-6000D, 1500 rpm, 10分钟)。在1分钟期间将1 ml 50% PEG4000(Sigma目录号：
P7306)慢慢加入倾析后松散的细胞沉淀。在37℃下在90秒期间慢慢摇动管。通过慢慢加入20 ml Iscove’s-Pen/Strep-ßME (前1ml在30秒内，接下来2 ml在30秒内，最后
17 ml在60秒内)终止反应。完成体积至50 ml，并孵育5分钟，然后离心细胞(Sorvall RT-6000D, 1500 rpm, 10分钟)。用50 ml Iscove’s-Pen/Strep-ßME-5% FCS洗涤细胞一次(Sorvall RT-6000D, 1500 rpm, 10分钟)。在完全培养基Iscove’s-Pen/Strep-ßME-20% FCS Hyclone-HAT-1% CM中悬浮细胞并200 µl/孔分配在23块96孔板中。在37℃, 5% CO2孵育10-15天。

[0260] 实施例13：免疫组织化学(IHC)组织切片：切出所需数量的待分析组织的5-µm切片。必须尽可能新鲜地制备切片。较旧的切片可能降低信号强度。

[0261] 石蜡去除和组织水化：在通风橱下遵循表12中的步骤：表12
物质时间
浴1 甲苯 5分钟
浴2 甲苯 10分钟
浴3 乙醇100% 2分钟
浴4 乙醇100% 5分钟
浴5 乙醇95% 5分钟
浴6 乙醇95% 5分钟
低速流自来水在低速流下5分钟

[0262] 缓冲液的预加热：用1200 ml 0.01M柠檬酸盐缓冲液pH 6.0填充压力锅(Dako Diagnostique Canada Inc.)。紧紧关闭压力锅的盖子，并将它置于微波炉(SAMSUNG 900W)中。以最大强度加热，直到压力指示器升高(约12分钟)。

[0263] 加热用于抗原修复：当指示器下降时，打开压力锅，把载玻片放入里面，用缓冲液覆盖载玻片。盖上盖子，然后重新放入微波炉中。以最大强度加热约12分钟或直到蒸汽喷射最大，然后加热额外6分钟。打开微波炉，将压力指示器下降，然后打开压力锅的盖子。

[0264] 免疫组织化学：用IDETECT超级染色系统(HRP) (ID Labs Inc 目录号IDST1007)进行免疫检测。将载玻片放入PBS 1X至少五分钟。通过在H2O2 3% (Laboratoire Mat # HR-0133)浴中孵育5分钟而封闭内源过氧化物酶。在PBS 1X浴中冲洗。使用吸水纸去除过量缓冲液并将载玻片置于湿度箱中。一次进行一张载玻片以避免干燥组织。加入2-3滴封闭血清缓冲液，并在室温下孵育20分钟。去除过量缓冲液，并在所需稀释度(根据组织的大小150至200μl)添加一级抗体。在室温下孵育过夜。在两次PBS浴中洗涤。如上所述去除过量缓冲液。添加200-250 �l生物素化抗免疫球蛋白(Linking Reagent)并在室温下孵育20分钟。在PBS中洗涤2次。使用吸水纸去除过量缓冲液并将载玻片置于湿度箱中。一次进行一张载玻片以避免组织干燥。添加200-250 �l超链霉亲和素/过氧化物酶复合物(Linking Reagent)并在室温下孵育20分钟。在PBS中洗涤2次。使用吸水纸去除过量缓冲液并将载玻片置于湿度箱中。一次进行一张载玻片以避免组织干燥。每张载玻片加入250μl DAB溶液(Zymed目录号：00-2014)并孵育(对于每种mAb必须优化孵育时间以避免信号饱和)。在蒸馏水浴中冲洗三次。

[0265] 复染：在Harris氏苏木精溶液(Fischer目录号：SH26-500D)中孵育载玻片30秒至1分钟。在显微镜下检查复染。在自来水下去除过量染料。

[0266] 载玻片封固：在通风橱下遵循表13中的步骤：表13
物质时间
浴7 乙醇50% 1分钟
浴8 乙醇70%+10滴氨树胶30% 2分钟
浴9 95%乙醇 1分钟
浴10100%乙醇 2分钟
浴11100%乙醇 2分钟
浴12异丙醇 1分钟
浴13二甲苯 2分钟
浴14二甲苯保持在二甲苯中直到封固

[0267] 一次进行1张载玻片。将一滴Entellan (BDH, 目录号:UN 1866)滴在组织上。将盖玻片盖在Entellan上。放干，在显微镜下仔细鉴定载玻片并阅读。

[0268] 实施例14：杂交瘤亚克隆和培养将每个候选克隆转移进含有2.5 ml完全培养基(Iscove’s-Pen/Strep-ßME-20% FCS Hyclone-HAT-1% CM)的6孔板的孔中。在37℃下在5％CO2孵育板，直到细胞已经达到所需密度。

[0269] 通过台盼蓝排斥计数细胞。将3,750个细胞转移进13-ml管中。用完全培养基使体积完成至7.5 ml (100 细胞/200 µl)。从该管制备系列1:10稀释以获得含有10个细胞/200μl和1个细胞/200µl的悬浮液。将这种细胞悬浮液(100、10和1个细胞/每200µl)中的每一种分布至96孔板的32个孔(200μl/孔)中并在37℃、5％CO2孵育该板
10-15天。

[0270] 在ELISA中测试在含有1个细胞/200µl悬浮液的孔中生长的克隆与重组MAGE-A3蛋白的反应性(反应的克隆被认为是阳性的)。目视控制测试的克隆以确保只有一个集落存在于孔中。如果从含有1个细胞/200µl悬浮液的孔中没有获得克隆，在ELISA中测试在含有10个细胞/200µl悬浮液或100个细胞/200µl悬浮液的孔中生长的克隆与重组MAGE-A3蛋白的反应性，目视控制克隆以确保只有一个集落存在于孔中。

[0271] 将阳性克隆转移进6孔板的孔中并如上所述再次将细胞亚克隆以确保克隆性。当通过ELISA测试的所有亚克隆都是阳性时，获得克隆性。

[0272] 最后的亚克隆逐渐适应于在标准培养基(Iscove’s-Pen/Strep-ßME-10% FCS)中生长。

[0273] 将在标准培养基中适应的杂交瘤在-80℃在Mr Frosty冷冻容器(Nalgene目录6
号:5100-0001)中在90% FCS-10% DMSO (10 x 10 个细胞/冷冻管)中冷冻过夜，然后在至少24小时后转移进在-80℃的液氮箱中。

[0274] 实施例15：抗体的纯化使用MABTRAP™试剂盒( GE Healthcare 目录号:17-1128-01)进行从杂交瘤上清液纯化抗体。

[0275] 制备：允许柱和缓冲液在室温温热。如说明书中所示制备缓冲液。通过添加60-200 µl中和缓冲液/每ml待收集的部分而制备收集管。离心并过滤杂交瘤上清液以除去任何颗粒。

[0276] 纯化：用水填充注射器，将它连接至柱，并用5 ml水洗出乙醇防腐剂。用15ml结合缓冲液平衡柱。通过使用注射器缓慢通过上清液而将50 ml杂交瘤23D2上清液(批号：090309)施加于柱中。用25ml结合缓冲液洗涤并用5 ml洗脱缓冲液洗脱进5部分，每部分1ml。测定每部分的O.D. 280(1:100稀释的样品)。结果：对于23D2杂交瘤上清液，在部分# 2中发现峰值(O.D. 280 nm=0.055)。

[0277] 通过Bradford测定确定抗体浓度：用0、2.5、5、10、15、20、25和30 µg IgG (Sigma 目录号:I5381)制备标准曲线。用PBS完成至100µl并添加1 ml Bradford试剂(VP270908)。混合均匀。测定2、5和10 µl Mab 23D2部分#2的浓度。用PBS完成至100µl并添加1 ml Bradford试剂(VP270908)。混合均匀。阅读在595nm处的光密度(OD)。使用曲线方程确定浓度。结果：23D2部分#2的浓度为4.32 µg/µl。

[0278] mAb 23D2的纯度的分析：以运行凝胶中10%丙烯酰胺和层叠凝胶中4.5%丙烯酰胺制备微型凝胶。用40 µl还原性上样缓冲液(在β-巯基乙醇存在的情况下)的纯化的23D2 (4.32 µg/µl)的两份样品(2和10μg)上样至凝胶。在150V在10％聚丙烯酰胺凝胶上电泳90分钟(也包括分子量标记)后，用考马斯亮蓝溶液使凝胶染色30分钟。在脱色溶液中清洗凝胶过夜，第二天在白光灯下将凝胶拍照。

[0279] 实施例16：规范在哺乳动物物种中，抗体多肽含有恒定(即，高度保守的)和可变区。在可变区是CDR和所谓的“构架区”(在重链或轻链的可变区内但在CDR外的氨基酸)。CDR是可变区内非连续段的氨基酸，但是，无论物种，可变重链和轻链区内的这些关键氨基酸序列的位置分布是相似的。所有规范抗体的可变重链和轻链中每一个对于各自的轻(L)和重链(H)具有3个CDR区(称为L1、L2、L3、H1、H2、H3)。Kabat等, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)已经描述了公认的CDR区。

[0280] 基于Martin & Thornton 规范定义(Martin & Thornton, J. Mol. Biol.263:800-815 (1996))预测对于mAb 1B1、16G7和23D2的规范亚型。

[0281] 在单克隆抗体1B1、16G7和23D2的CDR或构架区中发现的规范残基显示在下列表14-28中，用下划线和粗体表示。如果mAb序列中存在的残基不存在于规范组中，其显示在括号中。可替换的残基(来自规范组)显示在常规类型中。表15-29中氨基酸的编号遵循Kabat方案：
1B1 H1 – 规范2
环H1 2/11A 11
来源[1baf]
表14
1B1 H2 -规范1
环H2 1/9A 9
来源[1gig]
表15
1B1 L1 -规范3
环L1 3/17A 17
来源[1hil]
表16
1B1 L2 -规范1
环L2 1/7A 7
来源[1lmk]
表17
1B1 L3 -规范1
环L3 1/9A 9
来源[1tet]
表18
16G7 H1 -规范1
环H1 1/10A 10
来源[2fbj]
表19
16G7 H2 -规范3
环H2 3/10B 10
来源[1igc]
表20
16G7 L1 -规范7
环L1 7/14B 14
来源[1gig]
表21
16G7 L2 -规范1
环L2 1/7A 7
来源[1lmk]
表22
16G7 L3 -规范8
环L3 8/?/9D 9
来源[1gig]
表23
23D2 H1 -规范1
环H1 1/10A 10
来源[2fbj]
表24
23D2 H2 -规范3
环H2 3/10B 10
来源[1igc]
表25
23D2 L1 -规范7
环L1 7/14B 14
来源[1gig]
表26
23D2 L2 -规范1
环L2 1/7A 7
来源[1lmk]
表27
23D2 L3 -规范8
环L3 8?/9D 9
来源[1gig]
表28

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