一种肺动脉高压标志物及其作为治疗靶点的应用
阅读：822发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种肺动脉高压标志物及其作为治疗靶点的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 肺 动脉高压标志物及其作为 治疗 靶点的应用，特别是NOC4L基因作为肺动脉高压标志物及治疗靶点的应用。本发明首次揭示了NOC4L基因与肺动脉高压的相关性，分别采用NOC4L超表达和NOC4L敲除小鼠以及野生型小鼠进行持续缺 氧 的环境处理，建立起小鼠肺动脉高压模型，结果发现NOC4L基因的超表达可以显著地降低右心室收缩压、右心室肥大指数以及肺血管重塑率，NOC4L敲除小鼠的右心室收缩压、右心室肥大指数以及肺血管重塑率显著升高。本发明为研究治疗肺动脉高压的新型药物开发提供了一个新的靶点。，下面是一种肺动脉高压标志物及其作为治疗靶点的应用专利的具体信息内容。
一种肺动脉高压标志物及其作为治疗靶点的应用
技术领域
背景技术
[0002] 肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是由已知或未知原因引起肺动脉内压力异常升高的疾病或病理生理综合征，存在肺循环障碍与右心高负荷，可导致右心衰竭甚至死亡。肺动脉高压在临床常见，是严重危害人民健康的医疗保健问题。动脉高压是一种极度严重的疾病。75％的患者集中于20～40岁年龄段，15％的患者年龄在20岁以下。肺动脉高压的症状包括：呼吸短促、易于疲劳、晕厥、胸痛以及腿部和踝部水肿。此外，心脏听诊可闻P2亢进。如果不及时治疗，患者的肺动脉高压会逐步加重，甚至使寿命缩短。多数肺动脉高压相关的症状源自右心衰竭。上世纪90年代以前，医学界对这种疾病缺少有效的治疗手段。
[0003] 目前医学界对于肺动脉高压的治疗没有特效药，一般通过康复运动和社会心理支持等方法。一些抗凝药物、利尿剂、洋地黄以及通过吸氧等方式的支持治疗效果并不明显。一些靶向药物近年来逐渐被开发出来，例如波生坦、安立生坦、伊洛前列素等，大多数针对于第1、4类肺动脉高压患者，不良反应较多，风险较大。而介入治疗和手术治疗都只针对一小部分肺动脉高压患者，且风险大，术后后遗症多。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种肺动脉高压标志物及其作为治疗靶点的应用，特别是NOC4L基因作为肺动脉高压标志物及治疗靶点的应用。
[0005] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供NOC4L基因的以下任一应用：
[0006] 1)作为肺动脉高压标志物及治疗靶点的应用；
[0007] 2)制备治疗肺动脉高压药物或组合物方面的应用，其中所述药物或组合物靶向NOC4L基因并提高NOC4L基因表达量；
[0008] 3)作为标志物在制备肺动脉高压检测和/或疗效评价试剂中的应用。
[0009] 第二方面，本发明提供肺动脉高压标志物，所述标志物至少包含NOC4L基因。
[0010] 第三方面，本发明提供治疗肺动脉高压的药物或组合物，其有效成分为NOC4L基因表达促进剂。
[0011] 第四方面，本发明提供检测NOC4L基因表达量的试剂在制备肺动脉高压检测试剂或试剂盒中的应用。
[0012] 第五方面，本发明提供一种治疗肺动脉高压的方法，通过提高NOC4L基因表达量来实现该疾病的治疗。NOC4L基因的超表达可以显著地降低右心室收缩压、右心室肥大指数以及肺血管重塑率。
[0013] 基因NOC4L编码的蛋白能够抑制炎症因子IL6、TNFα等的产生，NOC4L表达量的提高，可以抑制相关炎症因子的产生，可以抑制相关炎症因子的产生，缓解肺动脉高压病人的局部炎症，起到治疗作用。
[0014] 第六方面，本发明提供一种构建肺动脉高压动物模型的方法，将NOC4L基因敲除动物在持续缺氧环境下处理，即得肺动脉高压动物模型。
[0016] 所述肺动脉高压小鼠模型的构建方法具体为：将基因NOC4L敲除小鼠置于常压低氧动物饲养舱内饲养21天，维持舱内氧浓度在9％～11％，保持舱内温度为22～26℃。
[0017] 第七方面，本发明提供按照前述方法构建得到的肺动脉高压动物模型在筛选肺动脉高压治疗药物中的应用。
[0018] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0019] 本发明首次揭示了NOC4L基因与肺动脉高压的相关性，分别采用NOC4L超表达和NOC4L敲除小鼠以及野生型小鼠进行持续缺氧的环境处理，建立起小鼠肺动脉高压模型，结果发现NOC4L基因的超表达可以显著地降低右心室收缩压、右心室肥大指数以及肺血管重塑率，NOC4L敲除小鼠的右心室收缩压、右心室肥大指数以及肺血管重塑率显著升高。本发明为研究治疗肺动脉高压的新型药物开发提供了一个新的靶点，对于肺动脉高压疾病的治疗和靶点研究有极大的指导意义。附图说明
[0020] 图1为本发明实施例1中PH小鼠右心室收缩压的比较结果。
[0021] 图2为本发明实施例1中PH小鼠右心室肥厚指数的比较结果。
[0022] 图3为本发明实施例1中PH小鼠肺小动脉病理学切片比较结果。
[0023] 图4为本发明实施例1中PH小鼠肺小动脉重塑率比较结果。
[0024] 图中，以常氧WT组作为参照，***P＜0.001；以缺氧野生组作为参照，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。
具体实施方式
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0026] 以下实施例中，小鼠NOC4L基因参见GenBank NO.NM_153570。
[0027] 为了进一步研究NOC4L基因在小鼠体内的作用，由南京模式动物中心制备NOC4L敲除和超表达小鼠。将小鼠exon3两端加上loxp位点，与巨噬细胞特异敲除的lyz-cre工具鼠交配，得到巨噬细胞特异敲除的小鼠(KO)。将小鼠的NOC4L基因前插入lyz promoter(用于特异的增强髓系基因的表达的元件)，并在两侧插入insulator(调控NOC4L的特异表达起关键作用的元件)，通过原核注射的方式得到巨噬细胞特异的NOC4L超表达小鼠(OE)。
[0028] 实施例1肺动脉高压动物模型的建立
[0029] 为了探究遗传因素对肺动脉高压有治疗作用，本实施例中分别采用NOC4L超表达(OE)和NOC4L敲除小鼠(KO)以及野生型小鼠(WT)进行持续缺氧的环境处理小鼠21天，建立起小鼠肺动脉高压模型(PH小鼠)。将缺氧组小鼠置于常压低氧动物饲养舱内，维持舱内氧浓度在9％～11％，保持舱内温度为22～26℃。常氧组小鼠吸入常压空气，其它条件同常氧组。在常氧放置的老鼠为常氧处理组，在缺氧箱内放置的小鼠为缺氧处理组。一共6个实验组，分别为常氧WT、常氧NOC4L OE、常氧NOC4L KO、缺氧WT、缺氧NOC4L OE、缺氧NOC4L KO。
[0030] 实验方法：
[0031] 1、右心室肥大指数(RVH)测定
[0032] 将小鼠麻醉后，开胸腔，摘取心脏，剥离所有血管和心室，剪下右心室，分别称量右心室重量和左心室加膈的重量，用右心室重除以左心室和膈重。
[0033] 2、右心室收缩压(RVSP)测定
[0034] 小鼠饲养到各相应时间点后，用戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔注射麻醉，参照Yanli等报道的右心导管插入术，用生理仪配套导管测右心室收缩压。导管末端连接多道生理记录仪信号采集处理系统，根据监视器所显示的血压值与压力曲线波型的移行变化判断导管尖端的位置。待导管进人右心室后，测定并记录RVSP。
[0035] 3、HE染色
[0036] 将切好的石蜡切片放入55℃烘箱中10min。
[0037] ①石蜡切片经脱蜡下行至70％乙醇；
[0038] 二甲苯I(分析纯)：15min
[0039] 二甲苯II(分析纯)：7min
[0040] 二甲苯：无水乙醇(体积比1:1)：5min
[0041] 各级乙醇：100％、95％、90％、80％、70％，各5min
[0042] ②苏木精溶液染色10-15min；
[0043] ③自来水冲洗2min；
[0044] ④0.5％盐酸酒精溶液分化8s；
[0045] ⑤自来水返蓝10min；
[0046] ⑥70％酒精-80％酒精各2min；
[0047] ⑦0.5％伊红酒精染液50-70s；
[0048] ⑧90％乙醇，95％乙醇分色各3min；
[0049] ⑨无水乙醇I、II脱水各3min；
[0050] ⑩无水乙醇：二甲苯(体积比1:1)3min；
[0051] 二甲苯I 3min；
[0052] 二甲苯II 3min；
[0053] 中性树胶封片；
[0054] 染色结果：胞核呈蓝紫色，胞质呈粉红色。
[0056] 染液配制：
[0057] 将维多利亚蓝B 1g、新品红1g、结晶紫1g在200ml热水中溶解，按顺序加入间二苯酚4g，糊精4g，30％氯化铁50ml(现用现配)，煮5min过滤，沉淀和滤纸用200ml 95％乙醇溶解，煮沸15-20min过滤(水浴)，95％乙醇补至200ml，最后加2ml浓盐酸。密封，避光保存。
[0058] 染色方法：
[0059] 二甲苯I：10min；二甲苯II：10min；100％乙醇：5min；90％乙醇：5min；自来水：5min；0.5％高锰酸钾5min；自来水冲洗2-3min；1％草酸溶液2-3min(漂白即可)；自来水冲洗2-3min；95％乙醇2-3min；Elastic染液染色2h；95％乙醇洗去染液；自来水冲洗2-3min；
Van Gieson染液染1min；快速脱水：80％乙醇1min，90％乙醇1min，无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，二甲苯I 5min，二甲苯II 5min。
Van Gieson染液染1min；快速脱水：80％乙醇1min，90％乙醇1min，无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，二甲苯I 5min，二甲苯II 5min。
[0060] 5、血管重塑率
[0061] 采用Keegan等的方法(Keegan et al.，2001)，用染弹性纤维的肺石蜡切片进行计数，选取50-100μm，远离大气道的肺小动脉血管进行计数，重塑部分超过血管周长1/2及以上的记为重塑血管。
[0062] 6、原代肺泡巨噬细胞的分离和处理
[0063] 按照Yang等的方法分离原代肺泡巨噬细胞(Yang et al.，1997)：取2月龄小鼠，腹腔注射戊巴比妥麻醉动物。仰卧固定，消毒颈部，剪开颈部皮肤，剥离腺体肌肉，暴露气管。在气管上部剪开一个小口，不要剪断，用1ml枪头插一个小白枪头，吸取4℃1ml PBS(无Ca2+、Mg2+，0.6mM EDTA)从开口吹入肺中，吹打进后吸出。再用新的PBS吹入，吸出，反复3-4次。将收集的肺泡灌洗液200g离心5分钟，去上清液。用无血清RPMI-1640培养液洗涤细胞一次，
200g离心5分钟。加入有血清的RPMI-1640重悬，接种。贴壁2h，用PBS洗三次。加入有血清的RPMI-1640培养。
200g离心5分钟。加入有血清的RPMI-1640重悬，接种。贴壁2h，用PBS洗三次。加入有血清的RPMI-1640培养。
[0064] 7、统计学处理
[0065] 计量资料以均数±标准误表示，采用SPSS 22.0进行统计处理，统计检验均基于双尾T检验。
[0066] 选取同日龄的WT小鼠，NOC4L OE和NOC4L KO小鼠，每种基因型的小鼠随机分成常氧组和缺氧组，将缺氧组小鼠置于常压低氧动物饲养舱内，维持舱内氧浓度在9％～11％，保持舱内温度为22～26℃。常氧组小鼠吸入常压空气，其它条件同实验组。
[0067] PH小鼠右心室收缩压：持续缺氧21天后，缺氧组平均右心室收缩压较常氧组显著升高，差异有统计学意义(P＜0.001)。NOC4L OE小鼠的实验组平均右心室收缩压较缺氧组显著降低，差异有统计学意义(P＜0.005)。NOC4L KO小鼠的实验组平均右心室收缩压较缺氧组显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果见图1。
[0068] NOC4L基因显著抑制PH小鼠右心室肥厚指数：缺氧组小鼠右心室肥厚指数明显高于常氧对照组小鼠。NOC4L OE小鼠的实验组平均右心室肥厚指数较缺氧组显著降低，差异有统计学意义(P＜0.005)。NOC4L KO小鼠的实验组平均右心室肥厚指数较缺氧组显著升高，差异有统计学意义(P＜0.005)。结果见图2。
[0069] 肺小动脉病理学改变：缺氧模型组小鼠管壁显著增厚，重构明显(图3)。NOC4L OE小鼠表现为显著降低的肺小动脉重塑率，NOC4L KO小鼠表现为显著升高的肺小动脉重塑率(图4)。
[0070] 综上，NOC4L基因对于肺动脉高压有很好的治疗靶点意义，NOC4L基因的超表达可以显著地降低右心室收缩压、右心室肥大指数以及肺血管重塑率，对于肺动脉高压疾病的治疗和靶点研究有极大的指导意义。
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