用于预测心力衰竭和心肌梗塞患者中疾病进展的线粒体非编码RNA
阅读：542发布：2020-05-23
专利汇可以提供用于预测心力衰竭和心肌梗塞患者中疾病进展的线粒体非编码RNA专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及预测具有慢性心 力 衰竭的测试患者的死亡率的方法，包括基于检测选自SEQ ID NO:1-8的一种或多种长非编码RNA(lncRNA)的表达 水 平。本发明还涉及在测试患者中预测心肌梗塞后心脏重塑的方法，该方法基于检测选自SEQ ID NO:1-8的一种或多种lncRNA的表达水平。，下面是用于预测心力衰竭和心肌梗塞患者中疾病进展的线粒体非编码RNA专利的具体信息内容。
1.一种预测具有慢性心力衰竭的测试患者死亡率的方法，所述方法包括(a)检测在获自所述具有慢性心力衰竭的测试患者的样品中一种或多种长非编码RNA(lncRNA)的表达水平，所述lncRNA选自SEQ ID NO:1-8，
(b)将所述一种或多种lncRNA的表达水平与这些一种或多种lncRNA在获自具有慢性心力衰竭的对照患者的样品中的表达水平进行比较，其中
所述对照患者在诊断慢性心力衰竭后存活至少约3年，并且相较于对照患者样品，所述一种或多种lncRNA的至少一种在测试患者样品中过表达大于2倍指示所述测试患者未来心血管死亡的可能性增加；和/或
(b’)将所述一种或多种lncRNA的表达水平与这些一种或多种lncRNA在获自具有慢性心力衰竭的对照患者的样品中的表达水平进行比较，其中
所述对照患者在诊断慢性心力衰竭后约3年内死于心血管事件，并且相较于对照患者样品，所述一种或多种lncRNA的至少一种在测试患者样品中失表达大于2倍指示测试患者长期存活的可能性增加。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述慢性心力衰竭是收缩性心力衰竭。
3.一种在测试患者中预测心肌梗塞后心脏重塑的方法，所述方法包括
(a)检测一种或多种lncRNA在心肌梗塞后获自所述测试患者的样品中的表达水平，所述lncRNA选自SEQ ID NO:1-8，和
(b)将所述一种或多种lncRNA的表达水平与这些一种或多种lncRNA在心肌梗塞后获自对照患者的样品中的表达水平进行比较，其中所述对照患者心肌梗塞后不显示心脏重塑，其中
(i)所述样品在心肌梗塞后约2周的时间框内获自所述测试患者和所述对照患者，并且相较于对照患者样品，所述一种或多种lncRNA的至少一种在测试患者样品中失表达大于2倍指示测试患者未来的心脏重塑，和/或
(ii)所述样品在心肌梗塞后超过约2周获自所述测试患者和所述对照患者，并且相较于对照患者样品，所述一种或多种lncRNA的至少一种在测试患者样品中过表达大于2倍则指示测试患者未来心脏重塑。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述心脏重塑包括或是左心室重塑。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述约2周的时间框是约10天的时间框，优选约7天的时间框。
6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述大于约2周是大于约3周，优选大于约
4周。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中检测所述一种或多种lncRNA表达水平包括
(i)定量PCR，优选定量实时PCR，或
(ii)模板/RNA扩增法，然后用基于荧光或发光的定量方法测定所述一种或多种lncRNA表达水平。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种lncRNA包括SEQ ID NO:1且在PCR中，SEQ ID NO:19和20的引物序列用于检测SEQ ID NO:1的表达水平。
9.一种确定患者是否有心力衰竭或有发生心力衰竭的风险的方法，所述方法包括检测在获自所述患者样品中选自SEQ ID NO:1-8的一种或多种lncRNA的表达，其中如果在样品中检测到选自SEQ ID NO:1-8的一种或多种lncRNA表达，则该患者有心力衰竭或有发生心力衰竭的风险。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种lncRNA是或包括SEQ ID NO:1的lncRNA。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是血液且优选血浆样品。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括在检测长非编码RNA的表达水平前，预扩增测试患者样品和/或对照患者样品内RNA的步骤。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种lncRNA是至少3种lncRNA，优选至少5种lncRNA，最优选所有8种lncRNA。
14.一种预测患者心肌梗塞后心脏重塑和/或预测具有慢性心力衰竭的患者的死亡率和/或预测患者心力衰竭的试剂盒，所述试剂盒包含检测选自SEQ ID NO:1-8的一种或多种lncRNA的表达水平的手段以及如何使用试剂盒的说明书。
15.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述手段是用于特异性检测选自SEQ ID NO:1-8的一种或多种lncRNA的表达水平的引物对。
用于预测心力衰竭和心肌梗塞患者中疾病进展的线粒体非编
码RNA
[0001] 本发明涉及预测慢性心力衰竭测试患者死亡率的方法，包括(a)检测在获自所述慢性心力衰竭测试患者的样品中一种或多种长非编码RNA(lncRNA)的表达水平，所述lncRNA选自SEQ ID NO:1-8，(b)将所述一种或多种lncRNA的表达水平与获自具有慢性心力衰竭的对照患者的样品中的这些一种或多种lncRNA的表达水平进行比较，其中所述对照患者在诊断慢性心力衰竭后存活至少约3年，在测试患者样品中所述一种或多种lncRNA的至少一种相较于对照患者样品过表达大于2倍则指示测试患者未来心血管死亡的可能性增加；和/或(b’)将所述一种或多种lncRNA的表达水平与获自具有慢性心力衰竭的对照患者的样品中这些一种或多种lncRNA的表达水平进行比较，其中所述对照患者在诊断慢性心力衰竭后约3年内死于心血管事件，在测试患者样品中所述一种或多种lncRNA的至少一种相较于对照患者样品失表达大于2倍则指示测试患者长期存活的可能性增加。本发明还涉及在测试患者中预测心肌梗塞后心脏重塑的方法，包括(a)检测在获自所述心肌梗塞后测试患者的样品中一种或多种lncRNA的表达水平，所述lncRNA选自SEQ ID NO:1-8，和(b)将所述一种或多种lncRNA的表达水平与获自心肌梗塞后对照患者的样品中的这些一种或多种lncRNA的表达水平进行比较，其中所述对照患者不显示心肌梗塞后心脏重塑，其中(i)样品在心肌梗塞后约2周时间框内获自所述测试患者和所述对照患者，在测试患者样品中所述一种或多种lncRNA的至少一种相较于对照患者样品失表达大于2倍则指示测试患者未来心脏重塑，和/或(ii)样品在心肌梗塞后超过约2周获自所述测试患者和所述对照患者，在测试患者样品中所述一种或多种lncRNA的至少一种相较于对照患者样品过表达大于2倍则指示测试患者未来心脏重塑。
[0002] 在本说明书中，引用包括专利申请和厂商手册在内的许多文献。这些文献的公开内容通过引用全文纳入本文，而不视作与本发明专利性相关。更特别地，所有参考文献通过引用纳入，就好像各独立文献通过引用特定和单独表示纳入。
[0003] 几十年前已知胞外核酸的存在(Mandel P和Metais P.Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme.C R Acad Sci Paris.1948；142:241-243)。在最初发现癌症患者血浆内的特异性胞外RNA后认识到体液中RNA的诊断潜力(Kang Y and Massague J.Epithelial-mesenchymal transitions:twist in development and metastasis.Cell.2004；118:277-279，和Antos CLet al.,Activated glycogen synthase-3 beta suppresses cardiac hypertrophy in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A.2002；99:907-912)。长非编码RNA(lncRNA)通常定义为长度大于200核苷酸的转录物，没有蛋白编码能力(Kung Jt et al.,noncoding RNAs:past,present,and future.Genetics.2013；193:651-669)。识别lncRNA在人疾病中的作用揭示了新的机制理解并会产生新型诊断和治疗方法(Batista PJ and Chang HY.Long noncoding RNAs:
cellular address codes in development and disease.Cell.2013；152:1298-1307)。
LncRNA通常形成二级结构，且相对更稳定，这有利于其在体液如尿和血液中作为游离核酸检出(Reis EM and Verjovski-Almeida S.Perspectives of Long Non-Coding RNAs in Cancer Diagnostics.Front Genet.2012；3:32)。由于lncRNA与多种癌症的明确关联，之前已研究其作为体液中癌症生物标志物的潜在作用。尿中的前列腺特异性lincRNA PCA3被鉴定为检测前列腺癌的最特异的生物标志物，特异性高于广泛使用的PSA(前列腺特异抗原)测试(de Kok et al.,DD3(PCA3),a very sensitive and specific marker to detect prostate tumors.Cancer Res.2002；62:2695-2698；和Hessels D et al.,DD3(PCA3)-based molecular urine analysis for the diagnosis of prostate cancer.Eur Urol.2003；44:8-15；讨论15-6)。PCA3测定已批准用于检测前列腺癌，并且易于临床应用。
另外，数个其他研究突出了lncRNA作为检测多种癌症的候选生物标志物的潜能(Kim K et al.,HOTAIR is a negative prognostic factor and exhibits pro-oncogenic activity in pancreatic cancer.Oncogene.2013；32:1616-1625；Kumarswamy R and Thum T.Non-coding RNAs in cardiac remodeling and heart failure.Circ Res.2013；
113:676-689；和Savoye C et al.,REmodelage VEntriculaire study group.Left ventricular remodeling after anterior wall acute myocardial infarction in modern clinical practice(from REmodelage VEntriculaire[REVE]study group).Am J Cardiol.2006；98:1144-1149)。
cellular address codes in development and disease.Cell.2013；152:1298-1307)。
LncRNA通常形成二级结构，且相对更稳定，这有利于其在体液如尿和血液中作为游离核酸检出(Reis EM and Verjovski-Almeida S.Perspectives of Long Non-Coding RNAs in Cancer Diagnostics.Front Genet.2012；3:32)。由于lncRNA与多种癌症的明确关联，之前已研究其作为体液中癌症生物标志物的潜在作用。尿中的前列腺特异性lincRNA PCA3被鉴定为检测前列腺癌的最特异的生物标志物，特异性高于广泛使用的PSA(前列腺特异抗原)测试(de Kok et al.,DD3(PCA3),a very sensitive and specific marker to detect prostate tumors.Cancer Res.2002；62:2695-2698；和Hessels D et al.,DD3(PCA3)-based molecular urine analysis for the diagnosis of prostate cancer.Eur Urol.2003；44:8-15；讨论15-6)。PCA3测定已批准用于检测前列腺癌，并且易于临床应用。
另外，数个其他研究突出了lncRNA作为检测多种癌症的候选生物标志物的潜能(Kim K et al.,HOTAIR is a negative prognostic factor and exhibits pro-oncogenic activity in pancreatic cancer.Oncogene.2013；32:1616-1625；Kumarswamy R and Thum T.Non-coding RNAs in cardiac remodeling and heart failure.Circ Res.2013；
113:676-689；和Savoye C et al.,REmodelage VEntriculaire study group.Left ventricular remodeling after anterior wall acute myocardial infarction in modern clinical practice(from REmodelage VEntriculaire[REVE]study group).Am J Cardiol.2006；98:1144-1149)。
[0004] 尽管lncRNA可潜在用作绝大部分疾病尤其心血管疾病的生物标志物，但其作为生物标志物的作用尚未发掘。然而，心血管疾病是导致死亡的主要原因(Hoyert D and Xu J.Deaths:Preliminary Data for 2011,Natl Vital Stat Rep.2012；61:1-65)。尽管对HF的理解和治疗取得进展，其仍然预后不良(Emdin M et al.,Old and new biomarkers of heart failure.Eur J Heart Fail.2009；11:331-335)。因此，一直需要用于心血管疾病的新的生物标志物和诊断方法。此需求由本发明解决。
[0005] 因此，本发明的第一方面涉及预测慢性心力衰竭测试患者死亡率的方法，包括(a)检测在获自所述慢性心力衰竭测试患者的样品中一种或多种lncRNA的表达水平，所述lncRNA选自SEQ ID NO:1-8，(b)将所述一种或多种lncRNA的表达水平与获自具有慢性心力衰竭的对照患者的样品中的这些一种或多种lncRNA的表达水平进行比较，其中所述对照患者在诊断慢性心力衰竭后存活至少约3年，在测试患者样品中所述一种或多种lncRNA的至少一种相较于对照患者样品过表达大于2倍则指示测试患者未来心血管死亡的可能性增加；和/或(b’)将所述一种或多种lncRNA的表达水平与获自慢性心力衰竭对照患者的样品中的这些一种或多种lncRNA的表达水平进行比较，其中所述对照患者在诊断慢性心力衰竭后约3年内死于心血管事件，在测试患者样品中所述一种或多种lncRNA的至少一种相较于对照患者样品失表达大于2倍则指示测试患者长期存活的可能性增加。
[0006] 从此方法的措辞可见，该方法使用分离样品开始。因此，所述方法一般体外进行且优选不包括从患者获得样品的侵入性步骤。
[0007] 本发明第一方面所述方法还可包括检测和比较一种或多种lncRNA的表达水平，所述lncRNA与SEQ ID NO:1-8中任一种具有至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％和至少99.5％相同性，依次更优选。本领域已知测定序列相同性的手段和方法。优选地，BLAST(基本局部比对搜索工具)程序用于测定涉及一种或多种选自SEQ ID NO:
1-8的lncRNA的序列相同性。本发明第一方面所述方法还可涵盖检测和比较一种或多种lncRNA的表达水平，所述lncRNA与SEQ ID NO:1-8中任一种差异不超过10个，如5、4、3、2或1个核苷酸，依次更优选。核苷酸差异可以是添加、缺失和/或取代核苷酸。比较其表达的序列尽管同源，也可彼此差异不超过10个，如5、4、3、2或1个核苷酸，依次更优选。
1-8的lncRNA的序列相同性。本发明第一方面所述方法还可涵盖检测和比较一种或多种lncRNA的表达水平，所述lncRNA与SEQ ID NO:1-8中任一种差异不超过10个，如5、4、3、2或1个核苷酸，依次更优选。核苷酸差异可以是添加、缺失和/或取代核苷酸。比较其表达的序列尽管同源，也可彼此差异不超过10个，如5、4、3、2或1个核苷酸，依次更优选。
[0008] 本文所用的术语“预测死亡率”定义确定慢性心力衰竭患者未来会死于心血管死亡还是长期存活的可能性。长期是至少约2年，至少约3年和至少约5年，依次更优选。
[0009] 在这点上，“心血管死亡”是心血管疾病导致的死亡，所述疾病根据本发明包括慢性心力衰竭。术语“心血管事件”指可导致心肌损伤的任何事件。心血管疾病是全球导致死亡的主要原因。估计2008年有1730万人死于心血管事件，占所有全球死亡的30％(Global status report on noncommunicable diseases 2010，日内瓦，世界卫生组织，2011年)。这些死亡中，估计730万归因于冠心病，620万归因于中风。死于心血管事件主要是心脏病和中风的人数目预期到2030年增加至2330万。
[0010] 术语“慢性心力衰竭”指心脏不能提供足够的泵作用来维持血流以满足身体需求。心力衰竭能导致许多症状，包括气促、腿肿胀和运动不耐受。所述病症通过患者体检诊断并由超声波心动描记术确认。血液检验能额外帮助确定病因。心力衰竭的常见病因包括心肌梗塞和其它形式的冠心病、高血压、心脏瓣膜病和心肌症。
[0012] 本文所指的“患者”或“对象”是人。
[0013] 本文所用的术语“ncRNA”或“非编码RNA”指未翻译成蛋白的功能性RNA分子。从其转录非编码RNA的DNA序列通常在本领域称为RNA基因。本领域常用的术语“lncRNA”或“长非编码RNA”指包含大于200个核苷酸的ncRNA。SEQ ID NO:1-8覆盖346-25090个核苷酸的长度范围。
[0014] 术语“检测ncRNA表达水平”指确定ncRNA量或产量。lncRNA初始表达于细胞内。根据本发明发现，SEQ ID NO:1-8的lncRNA能在患者样品中检测到，尤其是血液样品，如血清或血浆样品。这显示lncRNA离开细胞且在细胞外是稳定的(见图7)。因此，“样品中表达的”lncRNA是其表达水平能通过下文进一步所述手段和方法能在样品中检测到的lncRNA。由此，一种或多种选自SEQ ID NO:1-8的lncRNA表达水平能根据本发明方法在样品中检测到。如果ncRNA的量或产量高于对照样品中相应ncRNA的量或产量，则ncRNA在试验样品中过表达。同样，如果ncRNA的量或产量低于对照样品中相应ncRNA的量或产量，则ncRNA在试验样品中失表达。此背景下，术语“相应ncRNA”指例如测试样品中SEQ ID NO:1的lncRNA表达水平与对照样品中SEQ ID NO:1的lncRNA表达水平作比较，或同样，测试样品中SEQ ID NO:2的lncRNA表达水平与对照样品中SEQ ID NO:2的lncRNA表达水平作比较。这参照适用于测定多于一种选自SEQ ID NO:1-8的lncRNA表达的情况。例如，如果SEQ ID NO:1-8的所有8种lncRNA表达水平在试验样品中测定，其与对照样品中SEQ ID NO:1-8的所有8种lncRNA表达水平作比较。
[0015] 样品中的表达水平能通过本领域可用的任何适当手段和方法定量。一般，可使用相对和绝对定量手段和方法。在绝对定量方面，不需要已知标准或对照。表达水平能直接定量。如本领域熟知，绝对定量可取决于预先确定的标准曲线。在相对定量中，表达水平相对于参照(如已知对照表达水平)定量。同样，在没有对照的情况下，当比较例如荧光强度时，可相对定量表达水平。合适的手段和方法如下文进一步详述。
[0016] 任何合适方法可根据本发明使用以确定一种或多种SEQ ID NO:1-8的lncRNA的表达水平。例如，评价RNA浓度的方法可包括测量结合核酸并在结合时选择性发荧光的染料的荧光强度。这种方法包括逆转录反应和生成cDNA，其中测定cDNA的量，从而间接测定RNA的量。所述基于荧光的方法特别用于以下情况：RNA浓度过低以至于有时无法用分光光度法精确评估和/或在260nm吸收的污染物使得分光光度法精确定量困难或不可能。包括测量荧光强度的方法如下文进一步详述。
[0017] 比较一种或多种lncRNA在不同样品间的表达水平时，优选通过纳入不变的内源对照(参照基因表达)以就潜在样品间变化校正，提高比较的可靠性。在本领域，这种涉及不变内源对照的标准化是常规进行的。例如，很好地建立了用于表达水平标准化的手段和方法，如实时RT-PCR(参见例如Bustin,Journal of Molecular Endocrinology,(2002)29,23–39)或微阵列表达分析(参见例如Calzaand Balwitan,Methods Mol Biol.2010；673:37-
52)。还建立了小RNA序列表达水平标准化的方法(参见例如Mestdagh et al.,(2009)Genome Biol.；10(6):R64)。在RT-PCR或微阵列用于根据本发明测定表达水平的情况中，表达水平优选通过加入的(spiked-in)RNA标准化(参见例如McCormick et al.,(2011),Silence,2:2)。已知量的加入的RNA与样品在制备期间混合。更优选地，RNA在完成RNA分离过程前外部加入到血浆和/或血清，其中样品是血浆和/或血清。加入RNA技术已熟知且商业试剂盒可获自许多厂商。加入的RNA优选是加入秀丽隐杆线虫(C.elegans)RNA。
52)。还建立了小RNA序列表达水平标准化的方法(参见例如Mestdagh et al.,(2009)Genome Biol.；10(6):R64)。在RT-PCR或微阵列用于根据本发明测定表达水平的情况中，表达水平优选通过加入的(spiked-in)RNA标准化(参见例如McCormick et al.,(2011),Silence,2:2)。已知量的加入的RNA与样品在制备期间混合。更优选地，RNA在完成RNA分离过程前外部加入到血浆和/或血清，其中样品是血浆和/或血清。加入RNA技术已熟知且商业试剂盒可获自许多厂商。加入的RNA优选是加入秀丽隐杆线虫(C.elegans)RNA。
[0018] 测试样品和对照样品优选在患者诊断为有慢性心力衰竭后直接获自慢性心力衰竭患者。在这点上，“直接”指在约3个月、约1个月、约2周和约1周的时间框内，依次更优选。
[0019] 尽管许多研究探索了小RNA如微小RNA(miRNA)作为心力衰竭(HF)潜在生物标志物(Kumarswamy R and Thum T.Non-coding RNAs in cardiac remodeling and heart failure.Circ Res.2013；113:676-689)，但就发明者所知，循环lncRNA在心脏病中的诊断效用尚未研究。下文实施例证明用样品尤其是血浆样品中SEQ ID NO:1-8的lncRNA表达水平作为心力衰竭预后生物标志物的潜能。在患者心肌梗塞(MI)后的前瞻性超声波心动描记术研究中，能鉴定SEQ ID NO:1-8的lncRNA的初始lncRNA筛选根据左心室(LV)重塑水平进行。在现代临床实践中依然频繁的LV重塑(Savoye Cet al.,Left ventricular remodeling after anterior wall acute myocardial infarction in modern clinical practice(from REmodelage VEntriculaire[REVE]study group).Am J Cardiol.2006；98:1144-1149)是MI后HF的众所周知的替代物(St John Sutton M et al.,Quantitative two-dimensional echocardiographic measurements are major predictors of adverse cardiovascular events after acute myocardial infarction.The protective effects of captopril.Circulation.1994；89:68-75)。测试了SEQ ID NO:1的lncRNA与HF的关联，以及其在2个进一步独立收缩性心力衰竭患者群中的预后价值。
[0020] 根据本发明发现，所有SEQ ID NO:1-8的lncRNA由线粒体基因组编码。线粒体基因组表达是经过充分研究的。已知mtDNA的重(H)和轻(L)链转录可产生覆盖几乎整个基因组的巨大的多顺反子转录物(Shabel(2008),Am J Pathol,172(6):1445–1456)。这些长的前体线粒体转录物经历加工形成功能性RNA以及ncRNA。此外，线粒体基因组的表达由一小组细胞组分调节，主要包括单体RNA聚合酶(POLRMT)以及线粒体转录因子A(TFAM)和B2(TFB2M)(Falkenberg et al.(2007),Annu Rev Biochem 76:679-99)。因此，显然SEQ ID NO:1-8的lncRNA表达水平彼此相联并通过常见细胞机器控制。
[0021] 如上所解释，在心肌梗塞(MI)后不久的患者中研究所有SEQ ID NO:1-8的lncRNA。发现所有SEQ ID NO:1-8在MI后不久的患者中失表达，所述患者稍后发展出左心室(LV)重塑。此外，测试SEQ ID NO:1的lncRNA与HF的关联。意外发现SEQ ID NO:1在慢性心力衰竭患者中过表达(与MI后即刻失表达相反)，所述患者在初次诊断慢性心力衰竭后3年内死亡。尽管这仅就SEQ ID NO:1实验证实，显然考虑到(i)线粒体转录物的相关和通常受控制的表达水平以及(ii)MI后，所有SEQ ID NO:1-8表现相同-即失表达-SEQ ID NO:2-8的lncRNA表现就如同SEQ ID NO:1。因此，也预期本发明所述SEQ ID NO:2-8的lncRNA在慢性心力衰竭患者中过表达，所述患者在初次诊断慢性心力衰竭后3年内死亡。
[0022] 根据本发明第一方面的优选实施方式，所述慢性心力衰竭是收缩性心力衰竭。
[0023] 舒张性心力衰竭(DHF)和收缩性心力衰竭(SHF)是慢性心力衰竭的2个常见临床亚组(Chatterjee et al.(2007),Journal of Cardiac Failure 13(7):569-576)。收缩功能障碍由心脏收缩功能或泵功能受损引起，而舒张功能障碍由心室舒张受损引起。依从性不总是与表征为低心排或充血的征兆和症状的临床心力衰竭相关。此外，在SHF中，通过心室充盈特征变化评价的舒张功能障碍是常见的，尤其是在晚期心力衰竭中。在舒张性心力衰竭中，左心室收缩性能、功能和收缩性一般保持正常。为了诊断慢性心力衰竭是DHF或是SHF，因而测量左心室射血分数。如果射血分数保持，则是DHF，如果减少，则是SHF。
[0024] 在收缩性心力衰竭中，约50％的死亡是突然的，且收缩性心力衰竭的猝死率相较一般人群高6-9倍(American Heart Association.Heart disease and stroke statistics 2003update.Dallas,TX:American Heart Association；2002)。因此，提供预测收缩性心力衰竭患者死亡率的方法具有特殊意义。
[0025] 本发明的第二方面涉及在测试患者中预测心肌梗塞后心脏重塑的方法，包括(a)检测在获自所述心肌梗塞后测试患者的样品中一种或多种lncRNA的表达水平，所述lncRNA选自SEQ ID NO:1-8，和(b)将所述一种或多种lncRNA的表达水平与获自心肌梗塞后对照患者的样品中的这些一种或多种lncRNA的表达水平进行比较，其中对照患者在心肌梗塞后不显示心脏重塑，其中(i)样品在心肌梗塞后约2周的时间框内获自所述测试患者和所述对照患者，测试患者样品中所述一种或多种lncRNA的至少一种相较于对照患者样品失表达大于2倍则指示测试患者未来心脏重塑，和/或(ii)样品在心肌梗塞后大于约2周获自所述测试患者和所述对照患者，测试患者样品中所述一种或多种lncRNA的至少一种相较对照患者样品过表达大于2倍则指示测试患者未来心脏重塑。
[0026] 从此方法的措辞还可见，该方法使用分离样品开始。因此，所述方法一般体外进行且优选不包括从患者获得样品的侵入性步骤。
[0027] 本发明第二方面的方法还可包括检测和比较一种或多种lncRNA的表达水平，所述lncRNA与SEQ ID NO:1-8中任一种具有至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％和至少99.5％的相同性，依次更优选。本发明第二方面所述方法还可涵盖检测和比较一种或多种lncRNA的表达水平，所述lncRNA与SEQ ID NO:1-8中任一种差异不超过10个，如5、4、3、2或1个核苷酸，依次更优选。比较其表达的序列尽管同源，也可彼此差异不超过10个，如5、4、3、2或1个核苷酸，依次更优选。
[0028] 术语“心肌梗塞”或“MI”定义通常称为心脏病发作的事件。其发生在血液停止适当流动到部分心脏时且心肌由于氧供应不足而受损。通常此发生是因为向心脏供血的冠状动脉之一产生阻塞，例如归因于白血球、胆固醇和脂肪积聚不稳定。
[0029] 本文所用的术语“心脏重塑”指MI后心脏的尺寸、形状、结构和生理机能变化。MI后，可发生一系列组织病理学和结构变化，其在大部分情况下涉及左心室心肌且导致左心室功能逐步下降。最终，心脏重塑可导致收缩(心脏收缩)功能减少和心博量下降。
[0030] 在心肌梗塞(MI)后不久的患者中研究所有SEQ ID NO:1-8的lncRNA。更详细地，样品获自出院患者，所述患者一般根据心肌梗塞事件计算不超过约2周以内。发现所有SEQ ID NO:1-8在MI后不久的患者中失表达，所述患者稍后发展出左心室(LV)重塑。在延伸研究中，样品还获自MI后稍晚阶段的患者，即MI后1个月、3个月和12个月。如从下文实施例可见，意外发现SEQ ID NO:1的lncRNA在患者MI后的这些后期阶段中过表达，所述患者稍后发展出左心室(LV)重塑。尽管这仅就SEQ ID NO:1实验证实，再次显然考虑到(i)线粒体转录物的相关和通常受控制的表达水平以及(ii)MI后，所有SEQ ID NO:1-8表现相同，即SEQ ID NO:2-8的lncRNA表现就如同SEQ ID NO:1。因此，也预期本发明所述SEQ ID NO:2-8的lncRNA在患者MI后的后期阶段中过表达，所述患者稍后发展出左心室(LV)重塑。选择LV重塑用于准备本发明实施例作为测定心脏重塑的手段，因为大部分心脏重塑的特征是LV重塑。然而，第二方面所述方法不限于预测LV重塑，但一般能用于预测心脏重塑。
[0031] 根据本发明第二方面，获自心肌梗塞后患者的样品在心肌梗塞后约3个月、约2个月、约1个月、约2周、约10天和约1周内获得，依次更优选。
[0032] 根据本发明第二方面的一个优选实施方式，心脏重塑包括或是左心室重塑。
[0033] 如所讨论，下文实施例采用LV重塑检测以确定患者是否患心脏重塑。根据本发明，LV重塑定义为左心室舒张末期容积(LVEDV)在基线(即MI后即刻)与MI后12个月之间的变化超过20％。
[0034] 根据本发明第二方面的另一优选实施方式，约2周的时间框是约10天的时间框，优选约7天的时间框。根据本发明第二方面的另一优选实施方式，大于约2周是大于约3周，优选大于约4周。
[0035] 在这点上，术语“约”优选是±1天。术语“约2周的时间框”指“约14天或更少”，约10天的时间框指“约10天或更少”，约7天的时间框指“约7天或更少”。大于约2周指“长于约14天”，大于约3周指“长于约21天”，长于约4周指“大于约28天”。测试样品获自MI患者，一是在MI后即刻(即出院时)，再一次是MI后1个月和更晚。MI后的早期lncRNA失表达指示未来心脏重塑，而MI后的稍后阶段情况不同。在MI后的稍后阶段，lncRNA过表达指示未来心脏重塑。认为表达水平的转折时间点在MI事件后约2周。预期时间框在患者间变化。因此，在进一步的优选实施方式中，2周的时间框是10天的时间框，优选7天的时间框和/或大于2周是大于3周，优选大于4周。
[0036] 根据本发明第一和第二方面的一个优选实施方式，大于2倍的失表达和/或过表达是大于2.5倍的失表达和/或过表达，优选大于3倍的失表达和/或过表达。
[0037] 根据本发明，至少一种SEQ ID NO:1-8的lncRNA失表达和/或过表达2倍对于预测心肌梗塞后的心脏重塑和/或预测慢性心力衰竭患者死亡率具有巨大价值。然而，还已知诊断方法的置信水平可通过增加表达水平阈值来提高，所述阈值假定指示某一事件。为此，大于2倍的失表达和/或过表达优选是大于2.5倍的失表达和/或过表达，更优选大于3倍的失表达和/或过表达。
[0038] 根据本发明第一和第二方面的另一优选实施方式，测试患者和对照患者通过年龄、性别、糖尿病、心力衰竭病因和种族中的一种或多种来匹配。
[0039] 如附图3可见，图3所示结果根据年龄(2个分析组都是59岁)和性别(2个分析组都是8％女性)调整。通过年龄、性别、糖尿病、心力衰竭病因和种族中的一种或多种来匹配测试患者和对照患者会额外提高本发明方法可靠性，因为能排除由年龄、性别、糖尿病状态、心力衰竭病因和/或种族差异导致的任何潜在的表达水平差异。
[0040] 根据本发明第一和第二方面的另一优选实施方式，对照患者为至少3个患者，优选至少5个患者，更优选至少10个患者。
[0041] 患者数增加到至少3个患者，优选至少5个患者和更优选至少10个对照患者，预期会额外提高本发明方法可靠性，因为给定对照患者的潜在表达水平异常由其他对照患者标准化。
[0042] 根据本发明第一和第二方面的另一优选实施方式，检测一种或多种lncRNA表达水平包括(i)定量PCR，优选定量实时PCR，或(ii)模板/RNA扩增法，然后用基于荧光或发光的定量方法测定一种或多种lncRNA的表达水平。
[0044] 在终点半定量PCR中，扩增反应完成后收集荧光数据，通常在30–40次循环后，且此终荧光用于反算PCR前存在的模板量。
[0045] 更敏感和可重复的实时PCR法随着扩增进行而测量每循环的荧光。这使得模板定量能基于扩增指数期中的荧光信号，在限制试剂、抑制剂积聚或聚合酶失活开始对扩增效率产生影响前进行。这些反应较早循环的荧光读数会测量扩增模板量，其中反应在样品间的可重复性远大于终点。
[0046] 模板/RNA扩增法然后用基于荧光或发光的量化方法测定一种或多种lncRNA表达水平的一个非限制性实施例是组合转录介导扩增(TMA)与杂交保护实验(HPA)的方法。更详细地，这种方法可包括杂交一种或多种寡核苷酸(“捕捉寡核苷酸”)，所述寡核苷酸与SEQ ID NO:1-8互补。在靶向2种或更多SEQ ID NO:1-8的情况中，单独的捕捉寡核苷酸用于选自SEQ ID NO:1-8的各序列。然后，杂交的靶序列被捕获到磁性微粒上，后者在磁场中与样品分开。洗涤步骤可用于移出无关(extraneous)组分。靶扩增通常经TMA发生，TMA是基于转录的核酸扩增法，采用2种酶即莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶和T7RNA聚合酶。独特引物组用于选自SEQ ID NO:1-8的各靶序列。逆转录酶用于产生靶序列的DNA拷贝(含T7RNA聚合酶的启动子序列)。T7RNA聚合酶从DNA拷贝生成多拷贝的RNA扩增子。检测lncRNA表达水平通过HPA完成，使用与一个或多个扩增子互补的单链、化学发光标记的核酸探针。优选地，可区分标记的探针用于各靶扩增子。标记的核酸探针特异性结合扩增子。然后，“选择试剂”通过灭活未杂交探针上的标记来区分杂交和未杂交探针。检测步骤中，杂交探针生成的化学发光信号在光度计中测量并报告为“相对光单位”(RLU)，从而定量lncRNA表达水平。
[0047] 根据本发明第一和第二方面的更优选实施方式，一种或多种lncRNA包括SEQ ID NO:1且在PCR中，序列为SEQ ID NO:19和20的引物序列用于检测SEQ ID NO:1表达水平。
[0048] 如下文实施例可见，在测量SEQ ID NO:1的lncRNA表达水平方面，发明人使用引物对SEQ ID NO:19和20是有利的。
[0049] 本发明的第三方面涉及确定患者是否有心力衰竭或有发生心力衰竭的风险的方法，包括检测在获自所述患者样品中一种或多种选自SEQ ID NO:1-8的lncRNA的表达，其中如果在样品中检测到一种或多种选自SEQ ID NO:1-8的lncRNA表达，则该患者有心力衰竭或有发生心力衰竭的风险。
[0050] 本发明第三方面所述方法还可包括检测一种或多种lncRNA的表达水平，所述lncRNA与SEQ ID NO:1-8中任一种具有至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％和至少99.5％相同性，依次更优选。本发明第三方面所述方法还可涵盖检测一种或多种lncRNA的表达水平，所述lncRNA与SEQ ID NO:1-8中任一种差异不超过10个，如
5、4、3、2或1个核苷酸，依次更优选。
5、4、3、2或1个核苷酸，依次更优选。
[0051] 根据本发明，意外发现SEQ ID NO:1-8表达无法在健康对象中检测到，而仅在MI后患者或心力衰竭患者中测得。由此，SEQ ID NO:1-8在获自健康对象样品中的没有表达或表达低于检测极限。优选地，检测极限在实时PCR中的Ct(循环阈值)值大于34，优选大于36，更优选大于38，最优选大于40。实时PCR测定中，通过荧光信号积累来检测阳性反应。Ct定义为荧光信号跨过阈值(即超过背景水平)所需的循环数。Ct水平与样品中的靶核酸量成反比(即Ct水平越低，样品中的靶核酸量越高)。
[0052] 因此，检测一种或多种SEQ ID NO:1-8在患者样品中的表达可指示患者有心力衰竭或有发生心力衰竭的风险。患者是否有心力衰竭或有发生心力衰竭的风险能通过常规心脏诊断进一步评估。常规诊断的非限制性示例是超声波心动描记术或心电图。
[0053] 根据本发明第一、第二和第三方面的一个优选实施方式，一种或多种lncRNA是或包括SEQ ID NO:1的lncRNA。
[0054] 如实施例所证明，在SEQ ID NO:1-8的线粒体lncRNA中，SEQ ID NO:1的lncRNA(实施例中指定为uc022bqs.1)与MI后不久的LV重塑关联最密切。因此，选择SEQ ID NO:1以研究MI之后与稍后的LV重塑的关联以及与HF关联。由于这些原因，在使用SEQ ID NO:1-8的lncRNA中使用SEQ ID NO:1的lncRNA是最优选的。
[0055] 在本发明第一、第二和第三方面的上下文中还优选，所述一种或多种lncRNA是或包括SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的lncRNA。从实施例可见，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的lncRNA都独立显示可以预测患者的未来心脏重塑。
[0056] 根据本发明第一、第二和第三方面的另一优选实施方式，样品是血液且优选血浆样品。
[0057] 术语“血液样品”涵盖全血以及任何血液衍生的样品，尤其是血浆或血清。血液样品最优选是血浆样品。
[0058] 根据本发明第一、第二和第三方面的一个不同的优选实施方式，所述方法包括在检测长非编码RNA表达水平前，测试患者样品和/或对照患者样品内RNA的预扩增步骤。
[0059] 执行预扩增步骤在仅少量(测试和/或对照)样品可用的情况中特别有优势。预扩增步骤能在分析表达水平前增加样品内的RNA量。预扩增RNA的手段和方法为本领域熟知(参见例如Vermeulen et al(2009)BMC Res Notes.,2:235)。在测试和对照样品的RNA都预扩增的情况中，优选预扩增步骤采用同一方法，从而维持测试样品相较对照样品的RNA相对量。在仅测试或对照样品的RNA预扩增或2种RNA样品由不同方法预扩增的情况中，表达水平数据可就预扩增步骤标准化；参见例如Mestdagh et al.(2009),Genome Biology 2009,10:R64。
[0060] 根据本发明第一、第二和第三方面的另一优选实施方式，一种或多种lncRNA是至少3种lncRNA，优选至少5种lncRNA，最优选所有8种lncRNA。
[0061] 采用SEQ ID NO:1-8的至少3种lncRNA，优选至少5种lncRNA和最优选所有8种lncRNA会额外提高本发明方法的可靠性。尽管SEQ ID NO:1-8的lncRNA都通过线粒体基因组编码，其表达由常见机制调节，采用SEQ ID NO:1-8的至少3种lncRNA，优选至少5种lncRNA和最优选所有8种lncRNA可平衡与特定探针或方法相关的潜在差异，所述探针或方法用于检测SEQ ID NO:1-8中任一种的表达水平。
[0062] 本发明的第四方面涉及预测患者心肌梗塞后心脏重塑和/或预测慢性心力衰竭患者死亡率和/或预测患者心力衰竭的试剂盒，所述试剂盒包括检测一种或多种选自SEQ ID NO:1-8的lncRNA表达水平的手段以及如何使用试剂盒的说明书。
[0063] 检测一种或多种选自SEQ ID NO:1-8的lncRNA表达水平的手段优选是以下所需的手段：(i)定量PCR，优选定量实时PCR，或(ii)模板/RNA扩增法，然后用基于荧光或发光的量化方法测定一种或多种lncRNA表达水平。这些手段如上文进一步详述，且可包括在试剂盒内。因此，所述手段优选包括寡核苷酸，如荧光杂交探针或引物，其特异性杂交一种或多种选自SEQ ID NO:1-8的lncRNA。所述试剂盒的其它成分可以是荧光或发光染料，优选偶联所述寡核苷酸。所述试剂盒的其它成分也可以是酶，如逆转录酶和/或聚合酶。
[0064] 根据本发明的试剂盒，检测一种或多种选自SEQ ID NO:1-8的lncRNA表达水平的手段优选包括检测SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的lncRNA的手段。
[0066] 根据本发明第四方面的一个优选实施方式，所述手段是用于特异性检测一种或多种选自SEQ ID NO:1-8的lncRNA表达水平的引物对。
[0067] 在实施例中，引物对用于特异性检测一种或多种选自SEQ ID NO:1-8的lncRNA表达水平(见表6)。引物对优选包括能用于特异性检测SEQ ID NO:1的lncRNA表达水平的引物对。能用于特异性检测所选的SEQ ID NO:1的lncRNA表达水平的引物对优选由SEQ ID NO:19和20反映。
附图说明
[0068] 图1：在多个心力衰竭人群中进行lncRNA筛选和验证的工作流程图示。本研究共采用1526个样品，收集自REVE 2组的246名患者(Fertin M et al.,Usefulness of serial assessment of B-type natriuretic peptide,troponin I,and C-reactive protein to predict left ventricular remodeling after acute myocardial infarction(from the REVE-2study).Am J Cardiol.2010；106:1410-1416)；患者有第一前壁Q波MI，是根据在MI阶段后1年中有LV重塑筛选的并在4个不同时间点(基线，之后1、3和12个月)进行收集，344名慢性心力衰竭患者，以及198名来自慢性心力衰竭患者病例/对照研究的患者。此方法鉴定LIPCAR，一种长基因间非编码RNA，预测心力衰竭患者的心脏重塑和存活。红点指示显著受调控的lncRNA(>2倍；p≤0.05)。黑点指示7个受调控的线粒体lncRNA。黑色箭头指示LIPCAR。
[0069] 图2：基于HF患者中循环lncRNA水平的分层聚类，所述患者有(P1、P2、P3)或没有(P4、P5、P6)左心室重塑。比较2个患者组(重塑vs非重塑)后，各lncRNA倍数变化和对应p值的火山图(B)。
[0070] 图3：基线和LV重塑处循环lncRNA之间的关系。数据表示为每1个标准偏差的优势比(OR)和95％置信区间。LV重塑定义为左心室舒张末期容积(LVEDV)从基线到1年随访的变化>20％。根据年龄、性别和基线LVEDV调整分析。
[0071] 图4：根据有/没有LV重塑，在基线以及MI后1个月、3个月和12个月的LIPCAR水平。LV重塑定义为从基线到1年随访的LVEDV变化>20％。*P<0.01vs无LV重塑，P<0.05vs无LV重塑。
[0072] 图5：慢性HF组中有缺血性和非缺血性病因的患者的LIPCAR水平。MI后1年有显著LV重塑的患者中的LIPCAR水平显示为参照。***P<0.0001vs MI后1年的LV重塑。
[0073] 图6：在病例/对照研究中，未来心血管死亡患者vs无心血管死亡患者的LIPCAR水平。***P<0.0001vs无心血管死亡。
[0074] 图7：在3个健康对照血浆中检测7种不同lncRNA。RNA分离自新鲜血浆(0h)以及室温保持多至24h的血浆和经历4个冷冻/解冻循环的血浆。实施例
[0075] 实施例1-方法
[0076] 心力衰竭患者群
[0077] 图1显示lncRNA筛选和验证策略。在REVE-2组中分析EDTA-血浆中可检测的lncRNA与出现MI后未来LV重塑之间的潜在关联。此前瞻性多中心研究设计成分析循环生物标志物与LV重塑之间的关联(Fertin M et al.《, Usefulness of serial assessment of B-type natriuretic peptide,troponin I,and C-reactive protein to predict left ventricular remodeling after acute myocardial infarction(from the REVE-2study).Am J Cardiol.2010；106:1410-1416)。从2006年2月到2008年9月招募了246名有第一前壁Q波MI的患者。纳入标准是症状出现后24小时内入院且在出院前超声心动图的梗塞区有至少3个无动性LV区段。排除标准是超声波回声检查图像质量不足、限制寿命的非心脏疾病、显著瓣膜病或Q波前(prior Q-wave)MI。所述方案需要出院时(第3天到第7天)以及MI后3和12个月的连续超声波回声检查以评价LV重塑的存在，LV重塑定义为基线与1年之间的LV舒张末期容积(LVEDV)变化>20％。在出院(第3天到第7天)以及MI后1、3和12个月取连续血液样品。机构伦理委员会(Institutional Ethics Commitee)(Centre Hospitalier Universitaire de Lille)批准该研究；从所有患者获得书面知情同意书。患者特征参见表
1。
1。
[0078] 然后，在2个额外患者群中分析所选的lncRNA与HF特征和预后之间的关联；这些患者选自里尔大学心脏病学系的一系列连续的收缩性HF患者(LV射血分数(LVEF)≤45％)。对能走动且临床稳定至少2个月的患者采血用于预后生物标志物研究。机构伦理委员会(Centre Hospitalier Universitaire de Lille)批准该研究；从所有患者获得书面知情同意书。此研究的设计之前已详细公开(de Groote P et al.《, B-type natriuretic peptide and peak exercise oxygen consumption provide independent information for risk stratification in patients with stable congestive heart failure.J Am Coll Cardiol.2004；43:1584-1589；和de Groote P et al.,Right ventricular systolic function for risk stratification in patients with stable left ventricular systolic dysfunction:comparison of radionuclide angiography to echoDoppler parameters.Eur Heart J.2012；33:2672-2679)。首先分析从2006年1月到2010年5月纳入的344个连续患者的lncRNA水平(称为HF组研究)。3年后进行随访以评价临床结果。患者特征参见表2。lncRNA的预后价值在1998年11月到2005年12月之间纳入的198名患者独立群中进一步评估，所述患者经历预后评估，包括临床评估、超声波心动描记术、运动心肺功能检测和BNP测量(称为HF病例/对照研究)。选择预后评估之后3年内心血管死亡的99名患者(病例)；这99名患者与3年后活着的99名HF患者(对照)匹配(年龄、性别和HF病因)。患者特征参见表3。
[0079] 从血浆分离RNA
[0080] 对于各患者，如前所述收集和处理血浆(Bauters C et al.,Circulating miR-133a and miR-423-5p fail as biomarkers for left ventricular remodeling after myocardial infarction.Int J Cardiol.2013；3:168:1837-40)。因此，RNA分离自1526个样品(246个来自REVE 2研究且在4个不同时间点收集，344个来自收缩性HF组和198个来自收缩性HF病例/对照研究)，用miRNeasy96试剂盒(Qiagen，#217061)。内部加入的对照，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)cel-miR-39在分离过程中加入。分离RNA的质量和完整性通过NanoDrop(Thermo scientific)和Bioanalyzer(Agilent)证实。OD260/280之比范围为1.68-1.8且RIN号范围为7.1-7.8。
[0081] lncRNA微阵列分析
[0082] 对于初始lncRNA筛选，血浆RNA分离自15名来自REVE 2组、心肌梗塞后12个月显示明显LV重塑的男性患者和15名无LV重塑的男性患者(如前所定义)。从30名患者获得6个RNA样品，从1个组内的5名患者合并RNA作为“1个样品”。因此，产生来自15名LV重塑患者的3个合并的RNA样品和来自无LV重塑的3个样品。这些库接受基于微阵列的全基因组表达谱分析。RNA首先预扩增且随后进行微阵列(Arraystar Human LncRNA array；2.0版)，这能同时检测33,045个lncRNA。为定义潜在良好生物标记物候选lncRNA，选择以下策略：首先所有纳入微阵列的lncRNA转录物根据其平均信号强度分选。各lncRNA转录物的信号强度范围是5(最低值)-17(最高值)。仅1.3-4.3％的所有lncRNA转录物在血浆中显示>9的信号强度，所述转录物表达自所有体细胞染色体和性染色体(表5)。LncRNA检测接着通过实时PCR验证。为此，分离的RNA用随机引物(lncRNA)逆转录。特异性lncRNA用表6所列并对应SEQ ID NO:
9-22的引物扩增。用TaqMan试验扩增秀丽隐杆线虫-miR-39，作为标准化对照。
9-22的引物扩增。用TaqMan试验扩增秀丽隐杆线虫-miR-39，作为标准化对照。
[0083] LncRNA稳定性测试
[0084] 在3个健康对照血浆中测试7种不同lncRNA的稳定检测。这包括抽血后立即在血浆中测试lncRNA检测和室温保持血浆4h、8h和24h后测试。另外，测试4个重复冷冻/解冻循环对lncRNA表达的影响。总体上，在所有样品中，能稳定检测全部7种所研究的lncRNA，室温保持或重复冷冻/解冻循环没有影响(图7)。
[0085] 统计分析
[0086] 统计分析用R统计包(Statistical Package)3.0版进行。结果表示为均值±SD或患者数(百分数)。所有统计分析中，将lncRNA水平通过取以2为底的对数进行对数转换，以解释(account for)其偏态分布。连续变量用非配对学生t检验比较。离散变量用χ2分析比较。p值<0.05视作统计上显著。多变量逻辑回归分析用于计算优势比(OR)和对应95％置信区间。就标准偏差增加报告OR。7种候选lncRNA基线水平与REVE-2研究中LV重塑的关联用逻辑回归评价，所述逻辑回归根据基线处的年龄、性别和LVEDV调整。在全部两个个HF群中，心血管死亡定义为心血管病因、紧急移植(定义为器官共享联合网络状态1)、或紧急左心室辅助装置植入导致的死亡。选定lncRNA与心血管死亡风险的关联用根据年龄、性别、缺血性病因和糖尿病调整的逻辑回归评估。在病例-对照研究中，所选的lncRNA的独立预后价值通过逻辑回归评估，所述逻辑回归根据年龄、性别、缺血性病因、糖尿病、NYHA分级、LVEF、BNP和运动峰值耗氧量(峰值VO2)调整。为说明选定lncRNA在HF患者中的预后影响，其水平分成四分位数。
[0087] 实施例2-预测心脏状况的循环lncRNA
[0088] 循环lncRNA水平在MI后LV重塑早期过程中改变
[0089] LncRNA阵列以获自患者血浆的RNA进行，所述患者纳入LV重塑研究(图1)。纳入此研究的246名患者特征概括于表1。对226名(92％)患者完成一年超声波心动描记术随访。87名(38.5％)患者中出现LV重塑，其定义为基线与12个月之间的LVEDV变化>20％。此群体中，选择15名有高LV重塑(LVEDV变化＝73±19％)的男性患者和无LV重塑(LVEDV变化＝-10±10％)的男性患者，所述患者在出院时的LVEDV基线相同(高重塑：49±11ml/m2vs非重塑的
49±12ml/m2)。尝试研究循环lncRNA在MI后LV重塑早期的变化，对来自这30名基线患者血浆的RNA进行微阵列。
49±12ml/m2)。尝试研究循环lncRNA在MI后LV重塑早期的变化，对来自这30名基线患者血浆的RNA进行微阵列。
[0090] 分层聚类分析清楚地区分了2组患者，这是基于可检测和显著受调控循环lncRNA的特定特征(图2A)。共768个lncRNA转录物在会发展出LV重塑的患者中特异性去调节(550个lncRNA转录物上调且218个lncRNA转录物下调；各自p<0.05)(图2B)。就高信号强度(≥9)过滤所有去调节转录物且至少3倍去调节产生15个lncRNA候选物，其中7个在用于微阵列的所有个体样品中始终能扩增。当所有可检测lncRNA的丰度与其染色体来源相关时，百分比最高(77.78％)的高丰度lncRNA(信号强度>9)源自线粒体基因组(染色体M)(相较于体细胞染色体和性染色体的1.3-4.3％)。因此，大部分线粒体lncRNA在血浆中大量存在(表5)。有趣的是，所有7种始终能在全部个体样品中扩增的lncRNA源自线粒体基因组且所有这些lncRNA在初始微阵列分析中显著下调(p<0.05)。然后，这7种候选lncRNA表达水平在基线处在246名患者的完整研究群中通过独立实时PCR评价。这7种lncRNA水平彼此正相关(表7)。在整个组中验证时，仅lncRNA uc004cos.4(SEQ ID NO:1)和uc022bqs.1(SEQ ID NO:2)显著下调并预测患者未来心脏重塑(OR分别为0.69[0.49-0.94](P＝0.022)和0.62[0.44-
0.86](P＝0.005)，图3)。由于这2种lncRNA水平正相关(表7)，选择uc022bqs.1(与LV重塑关联最密切)用于进一步分析。此lncRNA由于其性质而在原稿后续章节中称为LIPCAR(SEQ ID NO:1)(预测心脏重塑的长基因间非编码RNA(Long Intergenic non-coding RNA Predicting CArdiac Remodeling))。
0.86](P＝0.005)，图3)。由于这2种lncRNA水平正相关(表7)，选择uc022bqs.1(与LV重塑关联最密切)用于进一步分析。此lncRNA由于其性质而在原稿后续章节中称为LIPCAR(SEQ ID NO:1)(预测心脏重塑的长基因间非编码RNA(Long Intergenic non-coding RNA Predicting CArdiac Remodeling))。
[0091] LIPCAR水平在MI后重塑后期过程中增加
[0092] 其次，在获自REVE-2组患者MI后1、3和12个月的血浆样品中纵向研究LIPCAR水平。整个研究群中，LIPCAR水平在一年随访期内增加。重要的是，如图4所示，在1、3和12个月评估时，发展出LV重塑的患者中的LIPCAR水平显著更高。因此，在LV重塑的患者中，LIPCAR循环水平在基线处下调，但在心力衰竭(HF)发展稍后的过程中显著上调。
[0093] LIPCAR水平在慢性心力衰竭患者中提高
[0094] 由于LIPCAR在患者MI后发展LV重塑的后期中上调，假设其循环水平也能在慢性HF患者中提高。这在另一344名收缩性HF患者的独立组中测试(见表2的患者特征)。这些患者相较于LV重塑研究的患者有类似年龄和性别特征；其在大部分病例中还接受血管紧张素转换酶抑制剂和β受体阻滞剂。HF在约一半病例中有缺血性病因。这些患者的疾病比LV重塑研究的患者更晚期，如其LV射血分数更低所示。如图5所示，慢性HF患者的LIPCAR水平甚至高于MI后1年仍持续LV重塑的患者；这不仅在缺血性HF患者中明显，而且非缺血性HF患者中也明显(P<0.0001vs MI后1年有LV重塑的患者)。接着研究LIPCAR水平是否可与慢性HF患者的未来心血管事件风险相关。在三年临床随访中，纳入时测量LIPCAR的39名HF患者死于心血管病因，而254名在3年后仍活着。纳入时的LIPCAR水平与心血管死亡风险明显相关(OR(根据年龄、性别、缺血性病因和糖尿病调整)＝1.42[1.02-2.01],P＝0.04)。
[0095] LIPCAR作为慢性HF的预后指标
[0096] 由于在事件数量有限的人群中观察到LIPCAR水平升高可能与未来心血管死亡相关，在第三慢性收缩性HF患者群中进一步研究此潜在生物标志物的预后价值。如前所解释，这是病例-对照研究，其中病例在预后评估后3年内发生心血管死亡，而对照在3年后仍活着。如表3所示，病例有更高的NYHA分级和BNP水平和更低的峰值VO2。如图6所示，病例患者在预后评估时的LIPCAR水平高于对照患者(P<0.0001)。相较于第一四分位数的患者的LIPCAR水平，第三和第四四分位数的患者的心血管死亡率增加(OR分别＝6.58[2.76-16.67]和13.23[5.19-36.8]，两者都是P<0.0001)(表4)。在根据年龄、性别、缺血性病因、糖尿病、NYHA分级、LVEF、BNP和峰值VO2调整的模型中，用作连续变量的LIPCAR水平是3年心血管死亡率的独立预测物，调整的OR为4.16[2.67-6.90](P<0.0001)；获得类似结果，LIPCAR水平分成四分位数时(第三vs第一四分位数，OR＝17.12[5.19-66.61](P<0.0001)；第四vs第一四分位数，OR＝32.58[9.62-131.00](P<0.0001))。
[0097] 表1.纳入LV重塑研究的患者特征(n＝246)
[0098]
[0099] LV指示左心室；SD，标准偏差；IU，国际单位；EF，射血分数；ACE，血管紧张素转化酶；EDV，舒张末期容积。
[0100] (1)定义为基线与12个月之间的LVEDV变化>20％。
[0101] (2)226名超声波心动描记术随访患者中。
[0102] 表2.纳入收缩性HF组研究的患者特征
[0103]
[0104] NYHA指示纽约心脏协会；LVEF，左心室射血分数；ACE，血管紧张素转化酶[0105] 表3.纳入收缩性HF病例/对照研究的患者特征
[0106]
[0107] NYHA指示纽约心脏协会；LVEF，左心室射血分数；峰值VO2，运动峰值耗氧量；BNP，B型利钠肽；ACE，血管紧张素转化酶。BNP水平分为低(十分位数1、2和3)、中(十分位数4、5、6和7)和高(十分位数8、9和10)
[0108] 表4.收缩性HF病例/对照研究中LIPCAR水平与心血管死亡率的关联(n＝198名患者)
[0109]
[0110] 根据年龄、性别、HF病因和糖尿病调整；CI指示置信区间
[0111] 表5.所有6个微阵列中检测到平均信号强度≥9的LncRNA
[0112]
[0113] 表6.用于lncRNA检测的寡核苷酸序列
[0114]
[0115] 表7. 7种lncRNA的相关系数
[0116]
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