技术领域
[0001] 本
发明涉及生物传感技术领域，尤其是涉及一种检测有机磷农药的电化学检测方法。
背景技术
[0002] 农药在农业生产中发挥着重要的作用，它们为确保
农作物的正常生长和人类食物供给做出了巨大的贡献。据估计，
杀虫剂的使用有助于保证全球近三分之一的作物生产。2013年，联合国粮食和农业组织报告显示农药同样帮助中国和印度在2012年作物产量分别为126和95百万吨。由于不加控制地使用农药造成的污染已经在世界范围内引起严重的环境污染和
食品安全等问题，严重威胁人类健康，已经成为追求可持续发展的最令人担忧的挑战之一。
[0003] 在各类农药中，有机磷农药的使用是全球最为广泛的一类农药(Obare，S.O.，De，C.，Guo，W.，Haywood，T.L.，Samuels，T.A.，Adams，C.P.，Masika，N.O.，Murray，D.H.，Anderson，G.A.，Campbell，K.，Fletcher，K.Fluorescent chemosensors for toxic organophosphorus pesticides：A Review[J].Sensors.2010，10(7)：7018-7043)，占据了整个农药使用量的38％(Singh，B.K.Organophospho-rus-degrading bacteria：ecology and industrial applications[J].Nature Reviews Microbiology.2009，7(2)：156-164)。我国使用的农药中80％以上是有机磷农药或其为主的混配农药。
[0004] 虽然农药直接用于
植物和
土壤，但只有1％的农药被送到预定的目标。由于倾洒，管道
泄漏，地下储存罐，垃圾堆和地下
水而意外释放的农药因其
半衰期很长可能导致其长期持续存在于环境中(Knapton，D.，Burnworth，M.，Rowan，S.J.，Fluorescent organometallic sensors for the detection of chemical-warfare-agent mimics[J].Angew.Chem.Int.Edit.2006.45(35)：5825-58292006)。
[0005] 由于农药在各种农业活动中的应用大大增加，为了保护
生态系统和食品供应，准确地监测其浓度水平已成为当务之急。农药测定方法主要有色谱分析法、
光谱传感检测法、免疫分析法、
生物传感器法。如CN106483218A公开了一种分子印迹固相萃取-液相色谱同时检测敌百虫和久效磷的方法，该方法虽然可以同时检测敌百虫和久效磷，但是前处理复杂，不能实现现场快速检测；CN103454338A公布了液相色谱
串联质谱/质谱法同时测定
棉花中多种农药残留的方法，该方法实现了多种农药定量检测，但是样品前处理复杂，检测时间长。尽管有许多传统方法可用于检测农药，但分析周期长，仪器大型且昂贵，不能满足现场快速检测的需要。
[0006] 因此，建立快速、灵敏和实用的有机磷农药检测的分析器件和方法，对于环境保护和食品安全等具有重要的现实意义。电化学生物传感器因为具有灵敏度高、响应快、操作简便、样品需要量少、可微型化、价格低廉可以实现现场在线检测分析等显著特点，从而扩大了传统系统如气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)所能实现的农药检测系统的范围和适用性，更加适用于农药的快速检测。CN105136887A公布了
石墨烯酶电化学生物传感器的制备及对有机磷农药残留的检测，实现了快速检测的目的，然而工作
电极制作方法繁琐，对有机磷农药的检出限为3.3mol/L，灵敏度不高，不利于有机磷农药的电化学检测方法的推广应用。
发明内容
[0007] 针对
现有技术存在的上述问题，本
申请提供了一种检测有机磷农药的酰胺化碳点生物传感器。本发明具有灵敏度高，制备简单，操作方便，能快速检测有机磷农药的优点。
[0008] 本发明的技术方案如下：
[0009] 本
申请人提供了一种检测有机磷农药的酰胺化碳点生物传感器，在丝网印刷电极表面修饰AChE/N-MAL-CDs，即得到生物传感器；
[0010] 所述AChE/N-MAL-CDs是指将乙酰胆
碱酯酶与N-MAL-CDs混合得到的物质；所述N-MAL-CDs是指经N-
氨基甲酰
马来酰亚胺改性得到的酰胺化碳点。
[0011] 所述N-MAL-CDs的制备方法为：
[0012] (1)碳点的制备：称取1-3g
柠檬酸，将其溶于15mL去离子水中，将配好的溶液转入含有聚四氟乙烯
内衬的水热反应釜中，于烘箱中200℃反应4h，得到碳点溶液；
[0013] (2)EDC/NHS溶液的制备：将0.0575g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
盐酸盐和0.0414g N-羟基琥珀酰亚胺溶解在0.15-025g的2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中；
[0014] (3)N-MAL-CDs的制备：取10mL浓度为0.10-0.20mol/L的碳点溶液，加入到10mL的EDC/NHS溶液中，调节pH＝6.0，在室温下反应一段时间，滴加NaOH调节pH值为6.8-7.6，接着往上述溶液中加入0.12-0.26g N-氨基甲酰马来酰亚胺，在室温下磁
力搅拌反应，即得N-MAL-CDs。
[0015] 所述AChE/N-MAL-CDs的制备方法为：
[0016] 将AChE稀释在0.01mol/L pH值为7.0-7.8的
磷酸缓冲盐溶液中，使其最终浓度为125U/mL；取125U/mLAChE溶液和N-MAL-CDs以体积比等于1∶1的比例直接混合均匀得到AChE/N-MAL-CDs，保存在-10℃的
冰箱里备用。
[0017] 所用电极为SPE，SPE电极的基片上印制有三个电极，一个
工作电极：碳电极，直径4mm；一个
对电极：碳电极和一个参比电极：Ag/AgCl电极；各电极对应连接有一电极引线。
[0018] 在SPE表面修饰AChE/N-MAL-CDs的方法为：
[0019] 在SPE表面滴加6-8μLAChE/N-MAL-CDs，在4℃条件下干燥8-20h，得到AChE/N-MAL-CDs/SPE，并将制备好的电极放于4℃干燥的环境中保存备用。本发明的SPE电极电化学
稳定性好，低成本，易于使用，小巧，通用和可订制化。
[0020] 本发明所用化学物质的全称与简称的对应关系：
[0021] 丝网印刷电极即SPE；
[0022] 乙酰胆碱酯酶即AChE；
[0023] N-羟基琥珀酰亚胺即NHS；
[0024] 2-吗啉乙磺酸即MES；
[0025] 磷酸缓冲盐溶液即PBS；
[0026] 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐即EDC。
[0027] 上述生物传感器制备完成后，通过CV和电化学阻抗(EIS)进行电化学检测，有机磷农药能与乙酰胆碱酯酶有机磷农药强烈结合形成磷
酸化胆碱酯酶，从而导致CV扫描过程的的
氧化
电流强度减弱。基于检测过程中电流强度变化，根据响应电流I和I--log([parathion-methyl(g/mL)])线性回归方程，得到相应有机磷农药的浓度。所得线性回归方程为I＝1.413 log C-11.39，相关系数R2＝0.999。其中I为不同甲基对硫磷浓度时响应电流值(μA)，C为相应氯霉素浓度(g/mL)。
[0028] 所述N-MAL-CDs可保证本发明方法进行有机磷农药检测的高灵敏度；其形态、成分性质，采用JEM-2100型透射
电子显微镜(TEM)和红外光谱((FT-IR)进行分析。
[0029] 本发明有益的技术效果在于：
[0030] 本发明利用有机磷农药对乙酰胆碱酯酶产生影响的性质，并利用N-MAL-CDs来构建超灵敏生物传感器。建立了一种灵敏度高、操作方便、快速的检测方法，且使用丝网印刷电极使样品和
试剂消耗量少，可用于实际样品的现场检测，符合我国农药快速检测技术发展和国际化要求，拓宽了农药检测系统的应用范围。
[0031] 本发明提供的检测方法对有机磷农药的
检测限是0.3×10-16g/mL(S/N＝3)和线性范围为1×10-15-1×10-10g/mL。本发明方法对甲基对硫磷的线性检测范围为1×10-15-1×10-10g/mL，检测限为0.3×10-16g/mL。利用常见共存体作为干扰物质，表明本方法对于有机磷农药具有高效选择性。
附图说明
[0032] 图1为响应电流与甲基对硫磷浓度的负对数的线性关系；插图为不同浓度的甲基对硫磷CV图。
[0033] 图2为抗干扰性测试。
具体实施方式
[0034] 为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体
实施例对本发明作进一步说明。应当理解，本文所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。下面实施例中，未注明具体条件和环境的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议的条件。
[0035] 实施例：一种基于酰胺化碳点的检测有机磷农药的传感器的制备方法[0036] (1)碳点的制备：称取1.15g柠檬酸，将其溶于15mL去离子水中，将配好的溶液转入含有聚四氟乙烯内衬的水热反应釜中，于烘箱中200℃反应4h，得到碳点溶液；
[0037] (2)EDC/NHS溶液的制备：将0.0575g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐即EDC和0.0414g N-羟基琥珀酰亚胺即NHS溶解在0.195g 2-吗啉乙磺酸即MES缓冲溶液中；
[0038] (3)N-MAL-CDs的制备：取10mL浓度为0.10-0.20mol/L的CDs溶液，加入到10mL的EDC/NHS溶液中，调节pH＝6.0，在室温下反应20分钟后，滴加NaOH调节pH值为7.5，接着往上述溶液中加入0.14g N-氨基甲酰马来酰亚胺，在室温下磁力搅拌反应4小时，即得N-MAL-CDs。
[0039] (3)AChE/N-MAL-CDs的制备：将AChE稀释在0.01 mol/L pH＝7.5PBS，使其最终浓度为125U/mL。取125U/mL AChE和200μL步骤(2)中N-MAL-CDs以体积比1∶1直接混合均匀得到AChE/N-MAL-CDs，保存在-10℃的冰箱里备用。
[0040] (4)SPE的修饰：在SPE表面滴加8μL AChE/N-MAL-CDs，在4℃条件下干燥8h，得到AChE/N-MAL-CDs/SPE，并将制备好的电极放于4℃干燥的环境中保存备用。
[0041] 测试例1：有机磷农药的检测
[0042] 配置了一系列浓度的甲基对硫磷标准溶液，将6μL不同浓度的甲基对硫磷标准溶液分别滴至AChE/N-MAL-CDs/SPE表面，并且孵化14min。然后用PBS冲洗电极表面，并用N2吹干，接着在电极表面滴加含有2.0mmol/L ATCl的PBS，进行CV扫描。并建立了响应电流与甲基对硫磷浓度工作曲线，如图1所示，采用线性回归法得到I--log([parathion-methyl(g/mL)])线性回归方程为I＝1.413 log C-11.39，其中I为响应电流，C为甲基对硫磷浓度(g/mL)，其相关系数R2＝0.999。最低检测限为0.3×10-16g/mL。
[0043] 测试例2：抗干扰性测试
[0044] 为了证明该方法对于有机磷农药检测的选择性，分别选用不同种类常见农药和常见有机磷农药共存物质进行对照试验，从图2可以看出，本发明提出的检测方法对有机磷类农药和西维因均有明显检测效果，特别是有机磷农药；而对其他种类农药检测和共存物质干扰时，AChE/N-MAL-CDs/SPE没有受到明显的抑制作用，因此吸抑制率没有太大变化。实验结果表明本发明提出的有机磷农药检测方法具有良好的抗干扰性能。
