一种生物杀菌剂及其制备方法
阅读：320发布：2023-03-08
专利汇可以提供一种生物杀菌剂及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 生物 杀菌剂 及其制备方法，该生物杀菌剂为N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼，由绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36在液体培养基中进行二级 发酵 培养制得，所述的菌株SN36在中国 微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC？No.7846。与 现有技术 相比，本发明的生物发酵产物对多种 农作物 真菌 病害 的防治具有显著的防治效果，而且通过工业化能够批量生产。，下面是一种生物杀菌剂及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种生物杀菌剂，其特征在于，该生物杀菌剂为N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰胼，由绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36培养制得，所述的菌株SN36在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.7846。
2.一种如权利要求1所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36在液体培养基中进行二级发酵培养，其中第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A，第二级为发酵培养，所用培养基为液体培养基B；在接种种子液前，加入黏稠剂，接种种子液后，进行发酵培养和流加补料液C的补料发酵培养，发酵结束后，从上述发酵培养液中收集生物农药N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼。
3.根据权利要求2所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的培养基和补料液具体组分按g/m1计为：
液体培养基A：葡萄糖0.8％-6.0％，蛋白胨0.4％-6.0％，牛肉膏0.2％-3.0％，硫酸镁0.06％-1.0％，磷酸二氢钾0.2％-1.0％；
液体培养基B：玉米淀粉2.0％-10.0％，黄豆粉3.0％-12.0％，黄豆芽汁
5.0％-15.0％，硫酸镁0.1％-1.2％，磷酸二氢钾0.4％-1.5％；
补料液C：1.0％-6.0％葡萄糖稀释液。
4.根据权利要求2所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的黏稠剂为明胶、琼脂、可溶性淀粉、糊精、黄原胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠CMC中的一种或几种；添加黏稠剂的浓度范围为0.1-100.0g/L发酵液。
5.根据权利要求4所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的黏稠剂的浓度范围为0.5-20.0g/L发酵液。
6.根据权利要求2所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的黏稠剂的流加补料液C的方式为连续流加方式或间歇式流加方式。
7.根据权利要求6所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的黏稠剂的连续流加方式为匀速或非匀速连续流加方式，以0.01-5.0L/h的速度连续流加补料液C，直至停止发酵前8小时。
8.根据权利要求6所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的黏稠剂的间歇式流加的间歇时间为每隔3-24小时补料1-6次，每次补料量为发酵液总体积的
0.01％-1.0％。
9.根据权利要求8所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的黏稠剂的间歇式流加每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。
10.根据权利要求2所述的生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述的二级发酵培养的温度为26℃-37℃，pH为6-8，时间为3-6天。
一种生物杀菌剂及其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)主要来源于绿针假单胞菌株的次生代谢产物，具有广谱抗病性和不易产生抗药性等优点，被认为是一种天然的、具有高效抑制植物病原菌的抗菌物质。具有强烈的抗真菌特性，也抑制部分细菌的活性。但是目前还没有N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼作为生物杀菌剂及其制备方法方面的报道。 发明内容
[0004] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种生物杀菌剂，其特征在于，该生物杀菌剂为N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼，由绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36培养制得，所述的菌株SN36在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7846；保藏时间：2013-7-03，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名：绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis。
[0005] 一种生物杀菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36在液体培养基中进行二级发酵培养，其中第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A，第二级为发酵培养，所用培养基为液体培养基B；在接种种子液前，加入黏稠剂，以达到细胞富集培养，减少发酵过程泡沫产生，增加IturinA及其同系物产量的目的。接种种子液后，进行发酵培养和流加补料液C的补料发酵培养，发酵结束后，从上述发酵培养液中收集生物农药N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼。 [0006] 所述的培养基和补料液具体组分按g/m1计为：
[0009] 补料液C：1.0％-6.0％葡萄糖稀释液。
[0010] 所述的黏稠剂为明胶、琼脂、可溶性淀粉、糊精、黄原胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠CMC中的一种或几种；添加黏稠剂的浓度范围为0.1-100.0g/L发酵液。 [0011] 所述的黏稠剂的浓度范围为0.5-20.0g/L发酵液。
[0012] 所述的黏稠剂的流加补料液C的方式为连续流加方式或间歇式流加方式。 [0013] 所述的黏稠剂的连续流加方式为匀速或非匀速连续流加方式，以0.01-5.0L/h的速度连续流加补料液C，直至停止发酵前8小时。
[0014] 所述的黏稠剂的间歇式流加的间歇时间为每隔3-24小时补料1-6次，每次补料量为发酵液总体积的0.01％-1.0％。
[0015] 所述的黏稠剂的间歇式流加每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。 [0016] 所述的二级发酵培养的温度为26℃-37℃，pH为6-8，时间为3-6天。 [0017] 发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值至2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
[0018] 采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
[0019] 采用本发明工艺，在第二级发酵时，液体培养基只流加补料而不用出料，可以维持发酵工艺需求的较好的碳氮比；通过采用一定比例的黏稠剂，提高发酵体系中细菌细胞的浓度，实现较高密度的发酵，大大减少发酵过程产生的泡沫，有利于控制溶解氧浓度、温度等技术参数，从而提高生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1- 甲酰肼)的产量。 [0020] 在优选的具体实施方案中，本发明还采用例如新菌株等技术方案来进一步提高生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的产量。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0022] 一、采用液体培养基流加补料发酵，可以维持发酵工艺需求的较好的碳氮比，可以大幅提高生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的产量。
[0023] 二、采用一定比例的黏稠剂，有利于提高发酵体系中细菌细胞的浓度，实现较高密度的发酵，大大减少发酵过程产生的泡沫，有利于控制溶解氧浓度、温度等技术参数，从而提高生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)物的产率。
[0024] 三、提取工艺流程简单，回收率高，操作方便。
具体实施方式
[0025] 实施例1
[0026] 用1000mL三角瓶10个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖2.0％、蛋白胨3.0％、牛肉膏0.5％、硫酸镁0.35％和磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的绿针假单胞菌属菌株SN36菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-10％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、2％黏稠剂(糊精，或黄原胶，或海藻酸钠，或羧甲基纤维素钠(CMC))的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％、乳糖1.0％、蔗糖1.0％、甘油0.5％、葡萄糖1.0％、蛋白胨1.0％、花生粉5.0％、黄豆粉水解液2.0％、生物氮素3.0％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.5％和硫酸铁0.5％)。在28℃2-30℃温度下，通气搅拌发酵8-15小时后，以0.1-1.0L/h的速度连续流加培养基C(培养基C：蔗糖2.0％、甘油
1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖1.0％、蛋白胨2.0％、黄豆粉水解液3.0％、花生粉水解液2.0％和生物氮素2.0％)，直至停止发酵(下罐)前约12小时。发酵PH6-8，发酵周期4天。 [0027] 发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集合生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯 苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖1.0％、蛋白胨2.0％、黄豆粉水解液3.0％、花生粉水解液2.0％和生物氮素2.0％)，直至停止发酵(下罐)前约12小时。发酵PH6-8，发酵周期4天。 [0027] 发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集合生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯 苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
[0028] 采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
[0029] 经检测，经过4天发酵，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)1.2g/L发酵液，产品回收率达75％以上。
[0030] 实施例2
[0031] 用1000mL三角瓶12个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖2.0％、蛋白胨3.0％、牛肉膏0.5％、硫酸镁0.35％和磷酸二氢钾0.3％)，于120℃2灭菌30分钟，冷却后接种活化后的绿针假单胞菌属菌株SN36菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-10％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、5％黏稠剂(琼脂，或可溶性淀粉，或海藻酸钠，或羧甲基纤维素钠(CMC))的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉3.0％、乳糖2.0％、甘油0.6％、废糖蜜3.0％、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.1％、花生粉水解液5.0％、黄豆粉水解液2.0％、生物氮素2.0％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.5％和硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以0.5-2.0L/h的速度连续流加培养基℃(培养基C：糖蜜3.0％、甘油1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖1.0％、蛋白胨4.0％、黄豆粉5.0％、花生粉3.0％和生物氮素3.0％)，直至停止发酵(放罐)前约12小时。发酵PH6-8，发酵周期5天。 [0032] 发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集含生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
[0033] 采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品，所用条件：色谱柱℃1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
[0034] 经检测，经过5天发酵，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品产量可达到1.3g/L发酵液，产品回收率达80％以上。
[0035] 实施例3
[0036] 用1000mL三角瓶15个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖3.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.8％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120灭菌30分钟，冷却后接种活化后的绿针假单胞菌属菌株SN36菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-20％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、8％黏稠剂(可溶性淀粉，或糊精，或海藻酸钠)的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％、乳糖2.5％、甘油1.5％、废糖蜜3.0％、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、花生粉5.0％、黄豆粉2.0％、生物氮素4.0％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.5％和硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以间歇式流加培养基C(培养基C：蔗糖、糖蜜2.0％、甘油1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖
1.0％、蛋白胨2.0％、黄豆粉水解液5.0％、花生粉2.0％和生物氮素3.0％)，间歇时间为大约间隔6小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。发酵PH6-8，发酵周期5天。
1.0％、蛋白胨2.0％、黄豆粉水解液5.0％、花生粉2.0％和生物氮素3.0％)，间歇时间为大约间隔6小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。发酵PH6-8，发酵周期5天。
[0037] 发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值至2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集含生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
[0038] 采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
[0039] 经检测，经过5天发酵，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)量可达到1.1g/L发酵液，产品回收率达80％以上。
[0040] 实施例4
[0041] 用1000mL三角瓶12个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖3.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.8％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟， 冷却后接种活化后的绿针假单胞菌属菌株SN36菌液，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-20％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、4％黏稠剂(明胶，或糊精，或海藻酸钠，或羧甲基纤维素钠(CMC))的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％、乳糖2.5％、甘油1.5％、废糖蜜3.0％、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、花生粉5.0％、黄豆粉2.0％、生物氮素4.0％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.5％和硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以0.5-2.0L/h的速度连续流加培养基C(培养基C：蔗糖3.0％、甘油1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖1.0％、蛋白胨4.0％、黄豆粉5.0％、花生粉3.0％和生物氮素3.0％)，直至停止发酵(放罐)前约12小时。发酵PH6-8，发酵周期5天。 [0042] 发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集含生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
[0043] 采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
[0044] 经检测，经过5天发酵，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)可达到1.0g/L发酵液，产品回收率达75％以上。
[0045] 实施例5
[0046] 用1000mL三角瓶16个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖2.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.5％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的绿针假单胞菌属菌株SN36，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-10％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％、乳糖2.5％、甘油0.6％、蔗糖3.0％、葡萄糖2.0％、蛋白胨0.5％、花生粉水解液5.0％、黄豆粉水解液2.0％、生物氮素3.0％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.5％和硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-20小时后，以0.3-1.5L/h的速度连续流加培养基C(培养基C： 蔗糖2.0％、甘油1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖1.0％、蛋白胨2.0％、黄豆粉水解液4.0％、花生粉水解液2.0％和生物氮素5.0％)，直至停止发酵(放罐)前约12小时。
发酵PH6-8，发酵周期5天。
发酵PH6-8，发酵周期5天。
[0047] 发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析，以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集含生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即生物农药(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
[0048] 采用高效液相色谱法检测生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
[0049] 经检测，经过5天发酵，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)量可达到1.2g/L发酵液，产品回收率达80％以上。
[0050] 实施例6
[0051] 用1000mL三角瓶15个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖3.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.8％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的绿针假单胞菌属菌株SN36菌液，置于30C温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-20％的接种量接种于内装50L灭菌培养基B、和10％黏稠剂(可溶性淀粉，或黄原胶，或羧甲基纤维素钠(CMC))的100L发酵罐中，(培养基B：淀粉2.0％、乳糖2.5％、甘油1.5％、废糖蜜3.0％、葡萄糖1.0％、蛋白胨0.5％、花生粉5.0％、黄豆粉2.0％、生物氮素4.0％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钠0.5％和硫酸铁0.5％)，在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵10-15小时后，以间歇式流加培养基C(培养基C：蔗糖/糖蜜2.0％、甘油1.0％、葡萄糖2.0％、乳糖1.0％、蛋白胨2.0％、黄豆粉水解液5.0％、花生粉2.0％和生物氮素3.0％)，间歇时间为大约间隔6小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。发酵PH6-8，发酵周期5天。
[0052] 发酵结束后，发酵液除去菌体和其它固形物，用硫酸或盐酸调发酵液的pH值2-5，或者用饱和度在40％-70％的硫酸铵进行盐析。收集沉淀，进行硅胶柱层析， 以乙醇、甲醇和三氯甲烷作为洗脱溶剂，以硅胶薄层层析方法检测(展层剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=100∶5∶20)。收集含生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的洗脱液，经浓缩后在静置和搅拌情况下，逐渐冷却，生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)以固体形式析出，经收集，洗涤，干燥，即得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品。
[0053] 采用高效液相色谱法检测I生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)产品，所用条件：色谱柱C1810.7φ°-250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm。
[0054] 经检测，经过5天发酵，生物农药(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)0.9g/L发酵液，产品回收率达75％以上。
[0055] 应用实例1
[0056] 生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)防治蔬菜真菌病害：番茄叶霉病。
[0057] 试验方法
[0058] 番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)孢子纸片法
[0059] 一、生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)用二甲基甲酰胺溶解， [0060] 乙醇稀释溶解、稀释步骤：
[0061] 1、母液：20mg样品→5mL二甲基甲酰胺，微加热溶解=4mg/mL=4000μg/mL母液。 [0062] 2、 工 作 液：0.1mL 母 液 → 4mL 乙 醇 稀 释。0.1mL×4000μg/mL=400μg→400μg/4mL=100μg/mL。
[0063] 3、加入量1mL=100μg；0.8mL=80μg；0.6mL=60μg；0.4mL=40μg；0.2mL=20μg；皿中对应浓度5μg/mL；4μg/mL；3μg/mL；2μg/mL；1μg/mL。
[0064] 二、利用含药平皿法测定上述菌株的最小抑菌浓度和有效抑菌浓度，将上述菌株定量加入PDA培养基中，制成含药平皿，然后将沾过叶霉菌孢子悬浮液直径6mm的无菌滤纸片贴于PDA培养基表面，25℃下培养3d后，观察、测量菌落直径，纸片上无叶霉菌长出的浓度为该摇瓶培养液的最小抑菌浓度(MIC)，以μL/mL表示；用游标卡尺测量各菌落直径，样品浓度以1og值计，菌落平均直径转为抑菌机率值，计算出剂量浓度与抑菌机率值的回归方程，得到有效抑菌浓度(EC50)。生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰N-吩嗪-1-甲酰肼的对番茄叶斑病有效抑菌浓度(EC50)评 估值为2.5μL/mL。制得的生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)对番茄叶霉病菌生物效价测定结果见表3：生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对番茄叶霉病菌室内生物测定结果。
[0065] 应用实例2
[0066] 用2％的生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)简称(邻-吩-肼)悬浮剂稀释1000倍-2000倍，作田间喷施，防治番茄叶霉病，防治效果分别为88.7％、86.8％、84.2％。田间试验结果见表4：生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对番茄叶霉病菌田间试验结果。
[0067] 应用实例3
[0068] 生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)防治禾本科真菌病害水稻纹枯病。
[0069] 试验方法
[0070] 水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solan)菌饼法
[0071] -、生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)用二甲基甲酰胺溶解，乙醇稀释溶解、稀释步骤：
[0072] 1、母液：20样品→5mL二甲基甲酰胺，微加热溶解=4mg/mL=4000μg/mL母液。 [0073] 2、 工 作 液：0.1mL 母 液 → 4mL 乙 醇 稀 释。0.1mL×4000μg/mL=400μg→400μg/4mL=100μg/mL。
[0074] 3、加入量1mL=100μg；0.8mL=80μg；0.6mL=60μg；0.4mL=40μ.g；0.2mL=20μg；皿中对应浓度5μg/mL；4μ/g/mL；3μg/mL；2μg/mL；1μg/mL。
[0075] 二、(参照农业部农药室内生物测定试验准则《杀菌剂第2部份：抑制病原真菌菌丝生长试验平皿法》)用游标卡尺测量各菌落直径，样品浓度以1og值计，菌落平均直径转为抑菌机率值，计算出剂量浓度与抑菌机率值的回归方程，得到有效抑菌浓度(EC50)。生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰N-吩嗪-1-甲酰肼对水稻纹枯病的有效抑菌浓度(EC50)评估值为2.0μL/mL。制得的生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)对水稻纹枯病生物效价测定结果见表3：生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对水稻纹枯病室内生物测定结果。
[0076] 应用实例4
[0077] 用2％的生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)简称(邻-吩-肼) 悬浮剂稀释1000倍-2000倍，作田间喷施，防治水稻纹枯病，防治效果分别为92.85％、88.26％、86.80％。田间试验结果见表4：生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对水稻纹枯病田间试验结果。
[0078] 实施例7
[0079] 将绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36在液体培养基中进行二级发酵培养，其中第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A(葡萄糖0.8％，蛋白胨0.4％，牛肉膏0.2％，硫酸镁0.06％，磷酸二氢钾0.2％，按g/ml计)，第二级为发酵培养，所用培养基为液体培养基B(玉米淀粉2.0％，黄豆粉3.0％，黄豆芽汁5.0％，硫酸镁0.1％，磷酸二氢钾0.4％，按g/ml计)；在接种种子液前，加入黏稠剂(黏稠剂为明胶、琼脂、可溶性淀粉、糊精、黄原胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠CMC中的一种或几种；添加黏稠剂的浓度范围为0.1g/L发酵液)，以达到细胞富集培养，减少发酵过程泡沫产生，增加IturinA及其同系物产量的目的。接种种子液温度为26℃2-27℃，pH为6-8，时间为3天后，在培养基B中进行发酵培养，温度为26C-27℃，pH为6-8，时间为3天，并以4L/h的速度连续流加补料液C(6.0％葡萄糖稀释液，按g/ml计)，直至停止发酵前8小时，发酵结束后，从上述发酵培养液中收集生物农药N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼。
[0080] 实施例8
[0081] 将绿针假单胞菌属菌株的遗传改良菌株SN36在液体培养基中进行二级发酵培养，其中第一级为种子液培养，所用培养基为液体培养基A(葡萄糖6.0％，蛋白胨6.0％，牛肉膏3.0％，硫酸镁1.0％，磷酸二氢钾1.0％，按g/ml计)，第二级为发酵培养，所用培养基为液体培养基B(玉米淀粉10.0％，黄豆粉12.0％，黄豆芽汁15.0％，硫酸镁1.2％，磷酸二氢钾1.5％，按g/mi计)；在接种种子液前，加入黏稠剂(黏稠剂为明胶、琼脂、可溶性淀粉、糊精、黄原胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠CMC中的一种或几种；添加黏稠剂的浓度范围为99-100.0g/L发酵液)，以达到细胞富集培养，减少发酵过程泡沫产生，增加Iturin A及其同系物产量的目的。接种种子液温度为36℃-37℃，pH为6-8，时间为6天后，在培养基B中进行发酵培养，温度为36℃-37℃，pH为6-8，时间为6天，并以5.0L/h的速度连续流加补料液C(6.0％葡萄糖稀释液，按g/ml计)，直至停止发酵前8小时，发酵结束后，从上述发酵培养液中收集生物农药N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼。
[0082] 所得生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼)的结构如下 [0083]
[0084] 表1 生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对番茄叶霉病菌 [0085] 室内生物测定结果
[0086]
[0087] 表2 生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对番茄叶霉病菌 [0088] 田间试验结果
[0089]
[0090] 表3 生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对水稻纹枯病菌 [0091] 室内生物测定结果
[0092]
[0093]
[0094] 表4 生物杀菌剂(N-邻氯苯乙酰-N-吩嗪-1-甲酰肼对水稻纹枯病菌 [0095] 田间试验结果
[0096]
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