发明领域：

本发明涉及杀线虫化合物的鉴定方法，如抑制线虫的驱肠虫药的 鉴定方法。详细地说，本发明涉及一种摄食测定法，可用于对候选杀 线虫化合物进行高通量地鉴定和评价。

发明背景：

有多种类型的线虫是在医疗、兽医和农业领域具有重大影响的寄 生虫。例如，圆线虫目(Strongylida)、粪类圆线虫目 (Strongyloides)、蛔虫目(Ascaradida)、尖尾目(Oxyurida) 和毛首目(Trichocephalida)的线虫中有许多可引发人、羊、牛、猪 和其他动物的疾病。此外，垫刃目(Tylenchida)和滑刃目 (Aphelenchida)等线虫有一些是重要农作物和真菌的寄生物。

由于抗性(如驱肠虫药抗性)的产生和对现有杀线虫化合物的安 全性的担心(例如，广泛使用的土壤熏蒸剂溴甲烷可破坏臭氧层；使 用的其他杀线虫化合物则由于其毒性广泛而备受关注)，人们越来越 需要一种方法来鉴定新的驱虫化合物。并且在农业领域还需要鉴定一 些能被引入植物和真菌以赋予其线虫抗性的DNA序列。

新获得的有效杀线虫化合物及抗性基因产物的一个可能作用部位 是肌性咽泵，该部位与线虫的摄食有关，并参与线虫结构及活动性所 需的内静水压的维持。本发明申请一种测定方法，该方法以测量咽泵 功能为基础，用于对能够促进或抑制咽泵功能的候选化合物进行高通 量地鉴定和评价。

发明内容：

一方面，本发明提供一种测定方法，用于鉴定和/或评价候选杀线 虫化合物，该方法的步骤包括：

(i)在适合于线虫摄食的条件下对一种线虫样品(即“测试线虫 样品”)进行培养，该线虫样品含有预定数量的线虫和一种带有易检 测标记的可吸收底物，其中，所述培养是在存在所述候选杀线虫化合 物的情况下进行，或是在用候选杀线虫化合物对该线虫样品预培养之 后进行，以及

(ii)确定该候选杀线虫化合物是否影响线虫摄食，方法是检测 被吸收底物与不用候选杀线虫化合物培养的对照线虫样品吸收的底物 相比的增加或减少情况。

“对照线虫样品”含有与测试线虫样品相同种或相同品系的线 虫，并且含有与测试线虫样品的预定数量相同的线虫，培养的条件和 持续时间也基本与测试线虫样品相同。此外，培养对照线虫样品时的 可吸收底物使用量与测试线虫样品相同。当在悬浮液中培养时，可以 将对照线虫样品的容积进行一定调整(用水或磷酸缓冲盐溶液或M9缓 冲液；Brenner，S.，雅致新小杆线虫(Caenorhabditis elegans) 遗传学.Genetics，Vol.77，pp71-94，1974)，以说明省略的候 选杀线虫化合物。

培养可以在固体培养基上进行(如琼脂)，更优选的则是在悬浮 液中进行(例如在M9或磷酸缓冲盐溶液中)。培养可以在适合于线虫 摄食的任何温度下进行。但为了方便，优选的是在室温下(即约22℃) 进行培养。培养的持续时间可以是正常情况下能够在此期间出现线虫 摄食的任何长度的时间。优选的培养时间约为0.25-5小时，更优选的 约为0.5-2小时，最优选的约为1小时。

进行培养时，可任选地使用一定量的已知能刺激线虫摄食的制剂 (例如80μM-5mM的血清素，对咽泵产生最佳刺激的浓度约为2.5mM， 而获得对咽泵拮抗剂或抑制剂的最佳敏感性的浓度约为0.15- 0.5mM)。

当测定方法涉及利用候选杀线虫化合物对线虫样品进行预培养 时，可以在固体培养基上或在悬浮液中进行预培养。优选的是在室温 进行预培养。优选的预培养时间约为0.1-24小时，更优选的为0.5-2 小时。但是当候选杀线虫化合物选自肽、多肽、蛋白及核酸时，预培 养的持续时间可以长达线虫样品中线虫的至少约一代的时间。以雅致 新小杆线虫(C.elegans.)为例，该时间约为3天。

测试线虫样品和对照线虫样品中使用的线虫预定量可以是任何适 当的量。为方便起见，可利用相同体积的线虫储备悬浮液来制备测试 线虫样品和对照线虫样品。本发明的一项优选实施方案是在96孔板的 一个孔中进行培养。此时，所用线虫的优选预定量为压缩后(packed) 的(1×重力)成体线虫约占最终测定体积的2.5％(v/v)-15％(v/v)， 相当于100μl测试体积中含有约400-2600条成体线虫。更优选的线虫 量为10％(v/v)，相当于100μl测试体积中含有约1700条成体线虫 或500μl的测试体积中含有约8500条成体线虫。

可吸收底物带有一种易检测标记，如放射性同位素标记，更优选 的是荧光标记。优选的是所用可吸收底物含有一些离散微粒，这些微 粒的大小使其能够被咽泵抽吸。同样优选的还有，所用可吸收底物在 被摄取后不会立即穿过线虫消化道，而是能在消化道中保持一段时 间，该时间要长于培养的持续时间。最优选的是可吸收底物含有微球 珠粒，优选的是这些珠粒由惰性聚合物制成，如聚苯乙烯、聚乙烯化 合物或其共聚物，这些珠粒的平均直径小于约5μm，更优选的则约为 0.9-1.5μm。还可以采用平均直径小于约0.25μm的微球珠粒，用于对 口锥进食线虫进行测定。

候选杀线虫化合物可选自无机化合物或有机化合物(包括肽、多 肽、蛋白及核酸)或其混合物。肽、多肽、蛋白及核酸可位于细菌或 其他宿主细胞的表面或被包含在内部，并以此方式呈现至测试线虫样 品。

为确定候选杀线虫化合物是否影响线虫摄食，可以检测被吸收的 底物量，并与对照线虫样品吸收的底物量进行比较。其实现首先需要 中断线虫摄食，方法有，例如，将线虫与可吸收底物分离，或更优选 的是将线虫固定或处死(如添加叠氮化钠至10-20mM或加热水)，然 后检测被吸收的底物量，作为选择，也可以在培养结束后检测剩余的 底物量(即未被吸收的剩余量)。

为方便起见，可以在底部为筛网的容器中进行培养，这样可以将 未吸收底物清洗掉，从而使其与线虫分离。例如，可使用底部为筛网 的96孔板，如Millipore Multiscreen N20板(客户订购编号 SE3R090M6)，其主体为透明的聚苯乙烯类材料，孔底为熔接的尼龙网。 将主体及筛网与一种热塑性导流暗管接合即形成过滤垫圈。所用尼龙 网的孔径为5-25μm，这取决于被测线虫的直径和可吸收底物颗粒的平 均直径。以雅致新小杆线虫为例，可选用11-20μm的孔径，优选的是 20μm。

作为选择，还可使用含有磁性微球珠粒的可吸收底物，这样就可 以通过磁性分离方法方便地将未吸收底物从线虫中除去。

测试线虫样品的摄食水平增加或减少的检测结果说明，候选杀线 虫化合物可能对咽泵的功能具有促进或抑制的作用。如上文所述，对 咽泵功能的促进或抑制作用可以因饥饿、静水压失衡或线虫能量储备 的耗尽而导致线虫死亡。

本发明的测定方法可用于对候选杀线虫化合物进行高通量地鉴定 和评价。因而该测定方法适用于天然产物收集物中的化合物、化学合 成化合物库中的化合物、组合库中的化合物，以及基因库中的化合物 (例如，用含有或表达单链或双链RNA、DNA或蛋白等不同形式的库基 因的细菌喂养线虫)。该测定方法还适用于两种或多种化合物的组合， 从而可对杀线虫化合物的协同性“合剂”进行鉴定和(或)评价。

另一方面，本发明提供一种测定方法，用于鉴定和/或评价候选杀 线虫化合物，该方法的步骤包括：

(i)在适合于线虫摄食的条件下对一种线虫样品(即“测试线虫 样品”)进行培养，该线虫样品含有预定数量的线虫和一种带有易检 测标记的可吸收底物，

(ii)然后，将该线虫样品暴露于所述候选杀线虫化合物，以及

(iii)确定该候选杀线虫化合物是否影响被吸收底物通过线虫消 化道。

对添加有一种可吸收底物的线虫样品的培养可按照上文关于第一 方面的描述进行。所用可吸收底物的性质和预定量也如上文所述。

将线虫样品暴露于候选杀线虫化合物可采用上文第一方面所述预 培养的类似方式来实现。但此时的优选暴露时间为0.5-2小时，更优 选的则约为1小时。

在第二种方法中使用的候选杀线虫化合物可选自无机化合物或有 机化合物(包括肽、多肽、蛋白及核酸)或其混合物。肽、多肽、蛋 白及核酸可位于细菌或其他宿主细胞的表面或被包含在内部，并以此 方式呈递至测试线虫样品。

在确定候选杀线虫化合物是否影响被吸收底物通过的步骤中，确 定的方法可以是检测被吸收底物通过线虫消化道的速率的提高或降低 情况。其实现方法可以是，在用候选杀线虫化合物培养后，每隔一定 时间对已通过线虫消化道或仍保留在消化道中的被吸收底物的量进行 测量，或是两种都测量，并与同样测量的对照线虫样品(即未暴露于 候选杀线虫化合物的样品)的结果进行比较。

第三方面，本发明提供一种由第一种测定方法或第二种测定方法 鉴定出的杀线虫化合物。

在该申请书中使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是指包 括所述步骤、成分或特征或步骤、多个成分或多个特征，并且包括或 不包括其他步骤、成分或特征或步骤、多个成分或多个特征。

下文将通过以下非限制性实施例和附图对本发明做进一步描述。

附图简述：

图1显示5mM血清素及培养时间对雅致新小杆线虫(C.elegans.) 的咽泵抽吸荧光微球珠粒的影响。荧光显微镜视野显示从含有相同雅 致新小杆线虫群体的24孔板的两个孔中取出的试样。每孔中的线虫均 用荧光微球珠粒培养3小时。上方的5个小图中显示的线虫未添加血 清素，而下方的5个小图中显示的线虫添加了5mM血清素，除此之外， 所有样品的培养、放大倍数、暴露及扫描条件均相同。培养条件是在 M9缓冲液中含有10％(v/v)的线虫和0.1％(w/v)的珠粒。放大倍数 约为40-50倍。在指定的时间点，从24孔板的孔中移取相同的两份试 样至底部为筛网的96孔板的孔中，添加叠氮化钠至10mM，以终止其进 一步的活动。在实验结束时，清洗掉未吸收的珠粒，并在荧光显微镜 下观察样品。此外还在荧光计中测量了试样的荧光密度，结果如图2 所示。在以类似条件进行的其他实验中，用高放大倍数进行的检验结 果说明被处理的线虫中约有80％吸收了一个或多个微球珠粒。强标记的 线虫估计至少含有数百个微球珠粒。

图2显示图1所述样品的荧光测定。在增益为30的条件下用BMG PolarStar平板荧光计对图1所示样品的试样进行读数。第180分钟 的时间点未进行读数，原因是剩余的线虫不足以充当完整的试样份。 带有误差线的点表示96孔板中各包含约1700条线虫的两个重复孔(而 不是两次重复实验)的平均值±标准偏差。

图3提供血清素影响咽泵抽吸速率的对数剂量反(响)应曲线， 也就是影响珠粒吸收速率的对数剂量反应曲线。在几次独立实验中(数 据未显示)，通过在Nomarski干涉显微镜下对线虫进行视频录象的方 法都证明所示剂量的血清素能够直接影响咽泵的抽吸速率，其方式均 与图中提供的数据相符。该测定是在24孔板中进行，并且使用M9缓 冲液、0.1％的荧光小珠和10％(v/v)的线虫。培养条件为室温60分 钟。在测定的最后阶段，将线虫试样移至底部为筛网的平板中，用于 按图2所述进行荧光测定。增益为30时，可以在低剂量血清素条件下 获得最高的灵敏度，但是在更高剂量下，荧光计的信号会达到饱和(蓝 色曲线的平顶)。因此在三种不同的增益设定值下对含有线虫的平板 进行读数，以获得高浓度及低浓度血清素条件下的最大值信息。应该 看到，高浓度血清素(5mM)并不是最理想的，产生最强的相对信号的 是2.5mM血清素。带有误差线的点表示96孔板中各包含约1700条线 虫的两个重复孔(而不是两次重复实验)的平均值±标准偏差。

图4显示不同比例的线虫和荧光微珠对信号强度的影响。该测定 是在96孔板的孔中进行，一式两份。并且是在含有2.5mM血清素的M9 缓冲液中室温测定60分钟。增益设定值为30。带有误差线的点表示 96孔板中各包含约1700条线虫的两个独立重复孔的平均值±标准偏 差。

图4a显示在底部为筛网的96孔板中进行整个测定和读数的所得 结果。

图4b显示将4a的样品从底部为筛网的平板中移至标准的透明聚 苯乙烯微量滴定板以进行荧光测定的结果。

应该注意到，当在底部为筛网的平板中读数时(4a)，尽管信号 的绝对强度很高，但在线虫浓度较高的情况下，信号会明显降低。并 且还观测到非常大的百分率偏差。此时用5％(v/v)的线虫和0.1％ (w/v)的微珠获得的信号强度最高。当把相同的线虫样品移至标准的 透明96孔板进行荧光测定时(4b)，虽然信号较低，但是却随着线虫 浓度的增加而持续增加，直到线虫浓度达到15％，并且两个重复孔的百 分率偏差一般较小。这种差异的原因在于，底部为筛网的平板中存在 的高密度线虫会使激发波长和/或发射波长产生某些形式的自吸收或 散射。这种现象在底部为筛网的平板中较为严重的原因还不清除，尽 管这些平板的荧光本底和总反射率要高于传统的透明96孔板。

实施例： 方法与材料

1.室温下在涂布于含有增强型NGM3％(w/v)琼脂(Avery，L.， and Horvitz，H.R.1990.饥饿和神经刺激性药物对雅致新小杆线虫 摄食的影响。J.Exp.Zool.253：263-270)的150mm培养皿的HMS174 大肠杆菌(Campbell，J.L.，Richardson，C.，and Studier，F.W. 1978.T7噬菌体与T7 DNA克隆片段之间的遗传重组和互补。Proc. Natl.Acad.Sci.USA.75：2276-2280)上培养Bristol N2品系雅 致新小杆线虫(Brenner，S.1974.雅致新小杆线虫遗传学。Genetics 77：71-94)，直到出现良好的成体形成群体，但食物储备并未耗尽。 (如果需要，也可以在悬浮液中进行大规模线虫培养。)

2.收集线虫，方法是用10ml M9缓冲液清洗，再用5ml M9缓冲 液清洗，然后用20μm尼龙网(Nytal——目录号：BCNY-HD002-20) 过滤，以保留成体线虫。

3.用巴斯德吸管从筛网上收集成体线虫，并置于微量离心管中， 在1g条件下沉降10分钟。所得的压缩体积用于在实验和测定中计算 线虫的量，转移时可将线虫重悬于2-10体积的M9缓冲液。线虫的定 量转移采用Gilson Pipetman P200或类似装置以及尖末端截去5mm 的黄色吸头。

4.进行测定前，将底部为筛网的96孔板封闭，以使荧光微球珠 粒的非特异性吸附减至最小。封闭方法是在板中添加200μl 0.1％ (w/v)的无荧光微球珠粒悬浮液，这些珠粒已经过暗蓝染色，平均直 径为0.95μm，并且带有亲水性表面涂层(目录号DC03B，羧基化修饰 的聚苯乙烯/聚乙烯共聚物)(由Bangs Laboratories，Inc.9025 Technology Drive，Fishers，INDIANA 46038-2886，USA生产和提 供)，然后在70rpm环形振荡的条件下室温培养过夜。测定前利用 Millipore Multiscreen汇流管真空去除珠粒悬浮液。将平板清洗3 次，方法是在每个孔中吸入200μl M9缓冲液，将平板静置5分钟，然 后吸出悬浮液。

5.测定是在实底24孔板的孔中进行，最终测定体积为0.5- 1.0ml，或是在底部为筛网的96孔板(Millipore Multiscreen N20 板，客户订购编号SE3R090M6)的孔中进行。后一种情况的最终测定 体积始终为100μl。两种情况使用的测定缓冲液均为M9。调整M9储液 及双蒸(馏)水的添加体积，以获得预期测定体积的终浓度为1×M9。 在测定孔中添加足够体积的线虫悬浮液，以根据实验要求获得2.5％- 15％(v/v)的最终百分率。在平板的孔中添加药物或测试化合物(如 血清素)的储液至所需的终浓度。添加足够体积的悬浮于双蒸(馏) 水的荧光微球珠粒悬浮液，以根据实验要求获得0.025％-0.1％(w/v) 的终浓度。

6.荧光珠粒是带有亲水性表面涂层的均一染色的1.30μm微球珠 粒。荧光的最大激发为420nm，最大发射为485nm(目录号FC04F，羧 基化修饰的聚苯乙烯/聚乙烯共聚物，由Bangs Laboratories，Inc. 9025 Technology Drive，Fishers，INDIANA 46038-2886，USA生 产和提供)。

7.将测定板放置在环形振荡器上，于70rpm、室温及柔和光照的 条件下培养，时间可长达180分钟(一般为60分钟)。

8.当培养结束时，在96孔筛网平板的孔中添加20μl 100mM的叠 氮化钠。若是在24孔板中进行培养，则吸取100μl试样至96孔筛网 平板的孔中，然后在这些试样中添加叠氮化钠。使线虫在叠氮化钠中 停留20分钟，然后进行清洗。

9.清洗共进行5次，每次使用200μl溶于M9缓冲液的1％(w/v) 月桂基硫酸钠(Sigma)。前两次清洗需要在平板的孔中上下吸移溶液， 每次清洗吸移10次。清洗5次后，再只用M9缓冲液清洗5次。每次 清洗步骤完毕时，利用Millipore Multiscreen的真空汇流管经筛网 吸除溶液。

10.在筛网平板的孔中添加50μl M9，然后放在一片黑色硬纸板 上，并在PolarStar荧光计中读数，激发为420nm，发射为485nm。 为了获得最大的测定动态范围，采用的增益设定值有所不同(一般为 20、25或30)。

11.有一些实验是接着把线虫从筛网平板吸到标准的透明或黑色 刚塑性96孔板中。再用100μl M9缓冲液冲洗筛网平板的孔，并将冲 洗液移至透明或黑色96孔板的相应孔中。然后以类似的或更高的增益 设定值在荧光计中对后者进行读数。

12.产生最佳结果的通常是在测试前24小时内获得充足食物供应 的线虫。根据下述比率判定所得结果的质量。在含有2.5mM血清素的 条件下与珠粒保温60分钟的线虫产生的信号强度除以在不含血清素的 条件下与珠粒保温60分钟的线虫产生的信号强度。比率大于3则被认 为合格，因为这样可以在测定中产生足够的动态范围，用以可靠地检 测显效剂和拮抗剂，优选的比率应大于4，最优选的则大于6。 结果

·实验表明，当增益设定值为30时，荧光计的检测极限为 1,000-10,000个珠粒，也就是100条各吸收10-100个珠粒的线虫。

·压缩体积为100μl的成体线虫约含有16-18,000条线虫。

·在一项实验中，含有1,600-1,800条线虫的10μl压缩体积的成 体线虫在培养2小时后产生的信号比对照高6246(任意的荧光强度单 位，增益设定值为30)。因此，经血清素处理的线虫与对照线虫相比， 平均每条多吸收417个微球珠粒。而在以后的实验中，在对条件进行 优化后，用相同体积的线虫获得的高于对照的信号强度约提高了6倍， 说明线虫在这些条件下吸收的平均微球珠粒数量可以比对照线虫约高 出2,400。 讨论

该实施例显示了对培养期间存在血清素时的微球珠粒吸收量增加 进行快捷检测的方法，从而说明本发明所述测定方法的可行性。

观测结果显示，线虫可吸收数百个微球珠粒(这些珠粒最初倾向 于在紧接咽部后侧呈团块聚集，随后存在于整个咽后消化管部位)， 提示可利用在进行荧光测定之前先用一种组织增溶剂消化线虫的方法 来提高该测定(使用荧光标记微球珠粒)的灵敏度。但在实验中用碱 性次氯酸盐溶解线虫的结果是导致信号强度降低，而不是增加。

该领域的技术人员都会意识到，在从广泛意义上描述的本发明的 精神和范围之内，可以对特别实施方案中描述的本发明进行大量变化 和改进。因此，该实施方案从各个方面都应被看做是说明性的，而不 是限制性的。