本发明涉及一种治疗运动神经疾病特别是肌萎缩性侧索硬化的新方 法。还涉及能长时间表达治疗因子并可用于治疗ALS的载体和药物组合 物。更准确地讲，本发明涉及系统性给予治疗基因治疗ALS的方法。

肌萎缩性侧索硬化(ALS或SLA)，也称为Charcot病和Lou Gehrig 病，由Charcot在1865年第一次报道。ALS是一种由运动神经元和皮层 背髓束的退化造成的致死性疾病。ALS现今的新增病例发生率为 2.5/100000并在持续增长，新旧病例总发生率为6-10/100000，在发达国 家在大部分仍年轻的成人(50-60岁之间)中有90000人患ALS。该病伴有 进展性麻痹，导致运动和呼吸功能的完全丧失，然后导致死亡，这在症状 第一次出现后的2-8年期间(平均3年)发生。

5％的ALS病例是家族源性的，而95％的病例是偶发的。偶发型ALS 的病理生理学起因仍然未知，但提出过多种假设。神经元退化可能造成谷 氨酸代谢的改变，导致运动皮层和脊髓中这种兴奋性氨基酸的浓度增加 (“兴奋毒性”假说，见Rothstein，1995中的综述)。基于在某些病人中存 在抗电压敏感性钙通道的自身抗体，还提出了自身免疫的可能性(见Appel 等，1995中的综述)。环境因素的参与也是可能的，如某些病毒的感染(见 Gastant，1995的综述)或与铝的接触(Yase，1984)。

对遗传性ALS的研究已显示铜和锌超氧化物歧化酶基因(位于染色体 21q 22-1上)中的一些点突变对20％家族性ALS的病因负责(Rosen等， 1993，综述见Rowland，1995)。这些突变并不引起超氧化物歧化酶(SOD) 活性的减弱(综述见Rowland，1995)。这些突变的酶产生潜在细胞毒性的 羟基自由基，而野生型SOD并不产生这种自由基(Yim等，1996)。对于 突变对SOD酶活性和细胞存活的功能效应的深入研究可能最终使人理解 家族型ALS的病生学，进而明了各种形式ALS的病生学。

对于可能影响运动神经元存活的因子的研究显示许多神经营养因子 有潜在神经保护作用(Windebank，1995的综述；Henderson，1995)。例 如，已在体外观察到BDNF(Oppenheim等，1992，Yan等，1992， Sendther等，1992，Henderson等，1993，Vejsada等，1995)、NT-3 (Henderson等，1993)、GDNF(Henderson等，1994，Oppenheim 等，1995)、三种细胞因子CNTF、LIF(Henderson，1995的综述)和 心脏营养素-1(cardiotrophine-1，Pennica等，1996)、及IGF-1(Lewis 等，1993)和FGF家族的成员(Hughes等，1993)的运动神经元保护作 用。这些资料总体上提示，所述神经营养因子在不同的实验条件下增强运 动神经元的存活力。但神经营养因子在ALS动物模型中的应用或在人的 临床应用中迄今还没有给出有说服力的结果。这种应用从未显示过治疗效 果，而且总伴随着不希望的付作用，如体重减少、炎症、发热等，这都限 制了营养因子在ALS治疗中的意义，并导致了由Regeneron进行的第一 批ALS-CNTF临床试验(系统给药)半途中止(Barinaga等，1994)。因而 迄今仍不能证实神经营养因子对ALS治疗的意义，也不能探索其作为一 种可能治疗途经的特点。

鉴于此，现今还不存在任何治愈ALS的方法，具有疗效的药物也很 少。Rilutek是现有的唯一治疗途径。给予riluzole(Rilutek)能延缓疾病 的述展，但它没有显示出对运动功能的治疗效果。另外，给予CNTF的 临床试验也由于没有结果而半途中止(Barinaga等，1994)。因而现今确 实而且迫切地需要一种治疗运动神经元疾病特别是ALS的方法。

本发明的目的特别在于提供一种治疗运动神经元疾病如ALS的基于 基因治疗的新途径。更具体地讲，本发明描述了通过有效持久表达某些营 养因子能直接改善这种疾病中涉及的运动神经元存活力的载体系统。

本发明第一方面涉及一种ALS的治疗方法，包括系统性给予编码神 经营养因子的核酸。本发明的另一方面涉及编码神经营养因子的核酸在制 备用于治疗ALS的药物组合物中的应用。本发明的另一方面在于特别载 体的构建，该载体能表达对ALS治疗有效量的营养因子。本发明的另一 方面涉及能产生一种或多种营养因子的表达系统在治疗中的施用，以及含 有这些表达系统的药物组合物。本发明还涉及能在体内共同表达几种营养 因子的几种新载体的构建。

因而本发明更准确地讲涉及一种基于营养因子的体内持续表达的 ALS的新治疗方法。

本发明现证明通过神经营养因子的体内产生可能获得特别显著的体 内疗效。本申请人特别证实体内系统性注射神经营养因子表达系统，能够 获得治疗因子的持续产生，并且治疗剂的产生足以在神经元疾病特别是 ALS中取得疗效。例如，申请人证实施用这些表达系统可导致存活期的 非常显著的提高，伴随着运动肌回应的改善，后者如可用肌电描记术测 得。所述的这些结果证明这种给药途径能获得神经营养因子的适当生物利 用度，而无毒性作用。因而这种治疗途径能够产生治疗活性量的分子，而 保持在这些分子的毒性阈之下。因而，神经营养因子类蛋白系统给药时由 于存在血脑屏障只能低效穿至神经系统中，而本发明的方法却意外地能获 得显著疗效。另外，本发明的方法还能使用低于毒性阈值的治疗因子剂 量，不会引起付作用。

本发明的目的之一是一种ALS的治疗方法，包括系统性给予一种神 经营养因子的表达系统。本发明的另一目的是一种神经营养因子的表达系 统在制备用于系统性给药治疗ALS的药物组合物中的应用。本发明还涉 及一种延长患ALS之哺乳动物寿命的方法，包括系统性给予一种神经营 养因子的表达系统。

在本发明中，术语“表达系统”指能在体内表达编码神经营养因子之 核酸的任何构建物。该表达系统最好包括处于一种转录启动子控制下的编 码神经营养因子的核酸(表达盒)。这种核酸可以是DNA或RNA。对于 DNA，可以使用cDNA、gDNA或杂合DNA，即含有gDNA一个或多 个(但不是全部)内含子的DNA。DNA还可以是合成的或半合成的，特别 是用于优化密码子或构建截短形式核酸的人工合成DNA。

转录启动子可以是在一种哺乳动物细胞(优选人细胞)中有功能的任 何启动子。当在相关细胞或机体中可能有功能时，可以是负责所用神经营 养因子表达的天然启动子区。也可以是不同来源的启动子区(负责其他蛋 白的表达，或甚至是合成的)。特别是真核基因或病毒基因的启动子区。 例如，可以用来自靶细胞基因组的启动子区。在真核启动子中可以使用刺 激或抑制基因转录的任何启动子或衍生序列，这种刺激或抑制可以是特异 性或非特异性的，可诱导或不可诱导的，强的或弱的。特别可以使用遍在 性启动子(HPRT、PGK、α-肌动蛋白、微管蛋白等基因的启动子)，中 间丝蛋白的启动子(GFAP、结蛋白、波形蛋白、神经丝、角蛋白等基因 的启动子)，治疗基因的启动子(如MDR、CFTR、VIII因子、ApoA I 等基因的启动子)，组织特异性启动子(丙酮酸激酶、绒毛蛋白、脂肪酸结 合肠蛋白、平滑肌α-肌动蛋白等基因的启动子)或对刺激物应答的启动子 (类固醇激素受体、视黄酸受体等)。同样，可以使用来自病毒基因组的启 动子序列，例如腺病毒E1A和MLP基因的启动子，CMV早期启动子， 或RSV的LTR启动子等。另外，这些启动子区可被修饰，如加入活化序 列、调节序列或使得能组织特异性(或主要)表达的序列。

在本发明中最好使用真核或病毒的组成型启动子，特别是选自如下的 启动子：HPRT、PGK、α-肌动蛋白、微管蛋白基因的启动子，或腺 病毒E1A和MLP基因的启动子，CMV的早期启动子，或RSV的LTR 启动子。

另外，表达盒中最好带有指导合成产物至靶细胞分泌途径中的信号序 列。这种信号序列可以是合成产物的天然信号序列，但也可以是任何其他 功能性信号序列，或是一种人工信号序列。

最后，表达盒一般含有位于3′端的一个区，它编码转录终止信号和 多聚腺苷酸化位点。

可用于本发明的营养因子基本分为三个家族：神经营养因子家族、神 经因子家族和TGFβ家族(综述见Henderson Adv.Neurol.68(1995) 235)。

在神经营养因子家族中本发明更优选使用BDNF、NT-3或NT- 4/5。

由Thoenen(神经科学趋势(Trends in Neurosci)，14(1991)165) 报道的大脑衍生的神经营养因子(BDNF)是一种118个氨基酸的蛋白，分 子量为13.5kD。在体外，BDNF刺激轴突的形成和视网膜节神经元、中 隔胆碱能神经元及中脑多巴胺神经元的培养存活期(综述见Lindsay在《神 经营养因子》(Neurotrophic Factors)，(1993)257，Academic Press中 的文章)。编码人BDNF和大鼠BDNF的DNA序列(Maisonpierre等，基 因组(Genomics)10(1991)558)、特别是编码猪BDNF的序列(Leibrock 等，自然(Nature)341(1989)149)已被克隆和测序。尽管这些营养因子的 特性可能令人感兴趣，但BDNF的治疗应用遇到了许多障碍。特别是 BDNF缺乏生物可利用性，限制了其任何治疗应用。本发明中产生的大脑 衍生神经营养因子(BDNF)可以是人BDNF或动物BDNF。

神经营养因子3(NT3)是一种119个氨基酸的分泌蛋白，其在体外甚 至在很低浓度下也能改善神经元的生存(Henderson等，自然363，266- 270(1993))。已报道了编码人NT3的cDNA的序列(Holn等，自然344 (1990)339)。

TGF-β家族特别包括神经胶质细胞衍生的神经营养因子。神经胶质 细胞衍生的神经营养因子GDNF(L.-F.Lin等，科学(Science)，260， 1130-1132(1993))是一种134个氨基酸的蛋白质，分子量为16kD。它具 有体外促进多巴胺能神经元和运动神经元存活的重要特性(综述见 Henderson，1995)。本发明中产生的GDNF可以是人GDNF或动物 GDNF。编码人GDNF和大鼠GDNF的cDNA序列已被克隆并测序(C.- F.Lin，D.Doherty，J.Lile，S.Besktesh，F.Collins，科学，260，1130- 1132(1993))。

可用于本发明的另一神经营养因子是CNTF(“ Ciliary NeuroTrophic Factor”睫状神经营养因子)。CNTF是一种可能阻止神 经元死亡的神经因子。如前文所提到的，临床试验由于没有结果而半途中 止。本发明现能单独或与其他营养因子一起在体内持久连续地产生 CNTF，用于治疗ALS。人和鼠CNTF的cDNA和基因已被克隆和测序 (EP385060；WO91/04316)。

可用于本发明的其他神经营养因子例如有IGF-1(Lewis等，1993) 和成纤细胞生长因子(FGFa，FGFb)。特别是IGF-1和FGFa，它们是 特别有意义的侯选物。FGFa基因的序列以及其体内表达载体在文献中 已有报道(WO95/25803)。

编码BDNF、GDNF、CNTF及NT3的基因对实施本发明特别有 意义。

根据第一种实施方案，本发明的表达系统在体内只产生一种神经营养 因子。这时，该表达系统只含有一种表达盒。优选本发明的表达系统可在 体内产生一种选自神经营养因子、神经因子和TGF的神经营养因子。更 优选为选自BDNF、GDNF、 CNTF、NT3、FGFa和IGF-I的一种 因子。

根据本发明的另一实施方案，本发明的表达系统能在体内产生两种神 经营养因子。在此实施方案中，该表达系统要么含有两种表达盒，要么含 有能同时表达两种核酸的一种表达盒(双顺反子单元)。对于含两种表达盒 的系统，两种表达盒可以使用相同或不同的启动子。

优选本发明的表达系统可在体内产生如下的神经营养因子组合： BDNF+GDNF；BDNF+NT3；GDNF+NT3；CNTF+BDNF； CNTF+NT3；CNTF+GDNF。

有利的是，申请人已证明施用两种神经营养因子的表达系统可产生强 治疗效果。在两种神经营养因子的表达系统中，使用相同或相似效力的启 动子，相同或相似的核酸拷贝数。一般体内产生的两种因子的量相当接 近。但在某些情形下优选产生不同量的每种因子。此时可使用不同效力的 启动子、或对不同基因存在不同拷贝数的系统、或变化施用剂量。

在本发明的表达系统中，所述一种或多种表达盒最好是载体的一部 分，特别是病毒载体或质粒载体。在含多个表达盒的表达系统中，这些表 达盒载于分立的载体中或同一个载体中。

所用的载体可以是标准的质粒载体，除本发明的表达盒外，其含有复 制起点和标志基因。另外已报道了不同类型的改进载体，它们不含标志基 因和复制起点(PCT/FR96/00274)或含有例如条件性复制起点 (FR9510825)。这些载体可有利地用于本发明中。

所用的载体还可以是一种病毒载体。已从病毒构建了许多载体，其具 有转移较大基因的特性。可特别举出腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒 (AAV)和疱疹病毒。为了用作转移基因的载体，修饰这些病毒使其不能在 靶细胞中自主复制。这些病毒被称为复制缺陷型。一般用一个或多个表达 盒取代病毒复制所必需的区域来修饰基因组。

本发明中优选使用衍生自腺病毒的病毒载体。腺病毒是一些约 36kb(千碱基)长的线性双链DNA病毒。它们的基因组特别含有每一末端 的反向重复序列(ITR)、衣壳化序列(Psi)、早期基因和晚期基因。主要早 期基因含于E1、E2、E3和E4区中，其中含于E1区中的基因是病毒 繁殖必需的。主要晚期基因含于L1至L5区中。腺病毒Ad5的基因组已 被完全测序，并可从数据库中得到(特别是Genebank M73260)。同样， 其他腺病毒基因组(Ad2、Ad7、Ad12等)的部分甚至全部也已被测序。

为了用作基因转移载体，已通过引入不同的治疗基因制备了衍生自腺 病毒的不同构建物。更具体地讲，现有技术中描述的构建物是缺失病毒复 制必需的E1区并在其位置插入了外源DNA序列的腺病毒(Levrero等， 基因(Gene)101(1991)195；Gosh-Choudhury等，基因50(1986)161)。 另外，为了改善这种载体的特性，已有人提出在腺病毒基因组中制造其他 的缺失或修饰。例如已在突变体ts125中引入了一种热敏感性点突变，使 72kDa的DNA结合蛋白(DBP)失活(Van der Vliet等，1975)。其他载体 包括对病毒复制和/或增殖必需的另一区域E4区的缺失。实际上E4区参 与晚期基因表达的调节、晚期核RNA的稳定性、宿主细胞蛋白表达的消 除和病毒DNA复制的效率。因而缺失了E1和E4区的腺病毒载体中病毒 基因转录和表达的背景噪音很低。这种载体已在例如专利申请 WO94/28152、WO95/02697、WO96/22378中描述。另外还在 WO96/10088中描述了在基因IVa2处有修饰的载体。

文献中描述的重组腺病毒从不同血清型的腺病毒制得。实际上存在不 同的腺病毒血清型，其结构和特性有所区别，但具有相似的基因结构。更 具体地讲，这些重组腺病毒可源自人或动物。对于人源的腺病毒，可优选 举出划归C组的那些，特别是2型(Ad2)、5型(Ad5)、7型(Ad7)或12 型(Ad12)腺病毒。对于源自动物的不同腺病毒，可优选举出源自狗的腺病 毒，特别是腺病毒CAV2的任何毒株[例如manhattan株或A26/61(ATCC VR-800)]。源自动物的其他腺病毒特别在专利申请WO94/26914(引入本 文作为参考)中述及。

在本发明的另一优选实施方案中，重组腺病毒是C组的人腺病毒， 更优选腺病毒Ad2或Ad5。

这些重组腺病毒是在衣壳化细胞系中产生的，即反式补充重组腺病毒 基因组中一种或多种缺陷功能的细胞系。这些细胞系之一例如为293细胞 系，其中已整合了腺病毒基因组的一部分。更准确地讲，293细胞系是一 种人胚肾细胞系，含有血清型5腺病毒(Ad5)基因组的左端(约11-12％)， 包括左侧ITR、衣壳化区、E1区(包括Ela和Elb)、编码蛋白pIX的区 域和编码蛋白pIVa2的区域。该细胞系能够反式补充E1区缺陷的重组腺 病毒(即不含E1区全部或部分)，能够产生高滴度的病毒原液。该细胞系 还能够在一定温度(32℃)下产生另外含有热敏感性E2突变的病毒原液。 已报道了能够补充E1区的其他细胞系，特别是基于人肺癌细胞 A549(WO94/28152)或人成视网膜细胞(人类基因治疗(Hum.Gen. Ther.)(1996)215)的细胞系。另外，还报道了能反式补充腺病毒多种功能 的细胞系。特别可举出补充E1和E4区的细胞系(Yeh等，病毒学杂志(J. Virol.)70(1996)559；癌症基因治疗(Cancer Gen.Ther.)2(1995)322； Krougliak等，人类基因治疗 6(1995)1575)和补充E1和E2区的细胞 系(WO94/28152，WO95/02697，WO95/27071)。一般通过在衣壳化细胞系 中引入病毒DNA，然后在约2或3天后裂解细胞(腺病毒循环的动力学为 24-36小时)。裂解细胞后，在氯化铯梯度中离心分离重组腺病毒颗粒。其 他替代方法已在专利申请RF9608164(引入本文作为参考)中描述。

治疗基因的表达盒可按现有技术中描述的技术插入在重组腺病毒基 因组的不同位点。首先可插入在E1缺失部位。还可以插入在E3区部位， 序列插入或替代均可。表达盒还可以位于缺失的E4区部位。为了构建带 两种表达盒的载体，可将一种插入在E1区部位，另一种插入在E3或E4 区部位。两种表达盒也可以插入在同一区域。

如同前文提到的，对于带多个表达盒的表达系统，这些表达盒可载于 分立的多个载体中，或载于同一个载体中。本发明更具体地涉及对治疗活 性量GDNF、BDNF、NT3和CNTF的体内投送特别有效或可定位投 送的载体的制备。更准确地讲，本发明涉及系统性注射含两种基因转移载 体的表达系统，每种载体含有编码一种神经营养因子的基因。本发明还涉 及系统性注射能使两种基因共表达的含双顺反子载体的表达系统。优选 地，本发明涉及系统性注射含两种载体的表达系统，一种带有编码CNTF 的基因，另一种带有编码NT3的基因，或一种带有编码CNTF的基因， 另一种带有编码BDNF的基因，或一种带有编码GDNF的基因，另一种 带有编码NT3的基因。

更优选所用的基因转移载体是腺病毒载体。实际上，申请人在处理不 同的ALS动物模型时证明了静脉注射使用编码神经营养因子的腺病毒的 有效性。特别是，在实施例中给出的结果第一次在家族性ALS动物模型 (FALSG93A小鼠)上显示出寿命的显著延长，并伴有肌电图的改善。现今提 出的对ALS患者的唯一治疗是riluzole(Rilutek)，它能提高病人预期寿 命达几个月。还证明了给FALSG93A小鼠施用riluzole可提高其平均寿命 13天(Gurney等，1996)。因而可以预言提高FALSG93A小鼠寿命大于13 天的治疗可能对病人带来优于riluzole的疗效。实施例中显示的结果表明 本发明的治疗途径可提高FALSG93A小鼠平均寿命达30天左右。这构成 了对存活期的非常显著的改善，代表着在ALS模型上显示重要疗效。

pmn小鼠是ALS的另一模型，其特征是运动神经元较早较快的退 化，和平均寿命约40天。实施例中给出的结果证明本发明的治疗方法可 将pmn小鼠的寿命从40天延长至53天，这构成大于30％的显著改善。 被治疗pmn小鼠的寿命延长伴随着运动神经元退化的显著降弱。

这种新疗法所得总体结果第一次在两种不同的ALS模型上证明了临 床、肌电图和组织学不同参数的重要改善。

根据本发明，营养因子的体内产生是通过系统给药获得的。在实施例 中给出的结果证明这种给药方法可通过患者自身的机体规律地、连续地产 生营养因子，且这种产生足以造成显著的疗效。这种系统性给药优选为静 脉内或动脉内注射，特别优选静脉内注射。这种注射方法就耐受性和易接 近性而言也是有利的。另外静脉注射可以比肌肉注射注入更大的量，也可 以重复注射。

本发明还涉及包含两种神经因子的表达系统的任何药物组合物。本发 明的药物组合物有利地含有注射制剂用的药物可接受的载体。特别是无菌 等渗盐水溶液(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯 化镁等，或这些盐的混合物)，或干组合物特别是冻干品，通过根据情况 加入无菌水或生理血清可产生可注射溶液。也可以使用其他赋形剂，如稳 定性蛋白质(特别是血清白蛋白：RF9603074)或水凝胶。这种水凝胶可从 任何生物相容的无毒聚合物(均聚或共聚)制得。一些这样的聚合物已在例 如专利申请WO93/08845中描述过。其中的一些已商业化，如从环氧乙 烷和/或环氧丙烷获得的那些。另外，当表达系统由质粒载体组成时，在 本发明药物组合物中最好加入有利于基因转移的化学或生物化学试剂。对 此，特别可提及如WO95/21931中所描述的聚赖氨酸、(LKLK)n、(LKKC)n 型阳离子聚合物、聚乙烯亚胺(WO96/02655)和DEAE葡聚糖或阳离子脂 类或脂转染试剂。这些试剂具有凝聚DNA并促进其与细胞膜结合的特 性。其中也以举出脂聚胺(如WO95/18863或WO96/17823中所描述的 lipofectamine，transfectam)、不同的阳离子或中性脂类(DOTMA、 DOGS、DOPE等)，以及核源肽(WO96/25508)，它们可以是为了靶向 某些组织而官能化的。使用这种化学载体的本发明组合物的制备按本领域 技术人员已知的任何技术进行，一般是将各种成分简单地接触。

表达系统的给药剂量取决于多种因素，特别是所用的载体、涉及的营 养因子、所用的启动子类型、病程或寻求治疗的持续时间。一般而言，表 达系统以含0.1-500mg DNA/kg，优选1-100mg DNA/kg的剂量给药。一 般使用约10mg DNA/kg的剂量。

对于重组腺病毒，最好将其配制并以104至1014pfu、优选106至 1010pfu的剂量给药。术语pfu(空斑形成单位)相应于腺病毒溶液的感染能 力，通过适当的细胞培养物的感染来测定，并一般在15天后测定被感染 细胞的空斑数目。对病毒溶液pfu滴度的测定技术在文献中有充分的描 述。

可通过不同的装置进行注射，特别是注射器或通过灌注法。优选借助 于注射器注射。另外可进行重复注射以进一步提高疗效。

根据本发明的一种变化方案，这种治疗还可以与riluzole联合应用。 因而本发明涉及一种药物组合物，其含有本发明的一种表达系统和药理有 效量的riluzole，以在时间上同时或分开给药。

下文给出的结果只是说明本发明而不限制其范围。这些结果证明本发 明方法的特别有利的特性，据我们所知，这是第一次在动物模型上证明了 对ALS的治疗意义。

附图说明

图1：给予或不给予CNTF-GDNF联合表达系统的FALSG93A小鼠 的肌电图行为比较。

图2：给予或不给予NT3表达系统的FALSG93A小鼠的肌电图行为比 较。

图3：给予或不给予CNTF表达系统的pmn小鼠存活的比较。pmn 小鼠的存活(天)用所分析动物的百分数表示。用CNTF表达系统给药处理 的pmn小鼠：100％，n＝7(粗线)；未处理的pmn小鼠100％，n＝14(正 常线)。

图4：给或不给予CNTF表达系统的pmn小鼠中运动神经元退化的 比较。在25天龄时检查小鼠膈神经中有髓神经纤维的数目。结果：用 CNTF表达系统处理的pmn小鼠(145，n＝10)；无CNTF表达系统处理 的pmn小鼠(122，n＝8)；用AdlacZ处理的pmn小鼠(111，n＝8)；“正 常”Xt小鼠(263，n＝4)。竖线代表平均标准误(SEM)。

实施例

1.材料和方法

以下描述的全部实验(腺病毒构建、给小鼠的注射、功能测定)都是在 L3封闭实验室中进行的。

1-动物

已建立了多种品系的表达SOD突变形式(致家族型ALS)的转基因小 鼠，试图获得ALS的鼠模型。超量表达93位甘氨酸被丙氨酸取代的突变 人SOD的转基因小鼠具有进行性运动神经元退化，表现为四肢麻痹，在 4-6个月龄时死亡(Gurney等，1994)。最早的临床症状是大约90天时四 肢颤抖，随后在125天时步长减小(Chiu等，1995)。组织学方面，从大 约37天可以在运动神经元中观察到来自线粒体的液泡，从90天开始可能 观察到运动神经元的丢失(Chiu等，1995)。有髓神经轴突的感染主要在 腹面骨髓中，在背面区很少。在运动板处观察到代偿性侧突重支配象现 (Chiu等，1995)。对实施例2-10，我们选择使用FALSG93A小鼠。 FALSG93A小鼠是研究ALS病生机制及开发其治疗策略的很好的动物模 型。它与家族型ALS具有共同的病生来源(SOD突变)、大量的组织病理 学和肌电图特征。

因而，我们在实验室鉴定了FALSG93A小鼠的肌电图行为并证明 FALSG93A小鼠可满足ALS的Lambert标准(Kennel等，1996)：(1)运 动单元数目减少，同时侧突重支配；(2)在前肢和后肢中存在失支配的自 发活动(纤维性颤动)和自发性收缩；(3)与运动回应降低有关的运动传导 速度的改变；(4)无感觉器官损害。另外我们已证明面部神经的损害很少 见，甚至在年老的FALSG93A小鼠中也是如此，在病人中也是这样。

FALSG93A小鼠来自Transgenic Alliance(L′Arbresle，法国)。妊娠雌 鼠每周发放，并在室验室动物中心产仔。患病杂合幼鼠通过取一段尾巴并 提取DNA进行PCR来鉴定。

还有其他具有运动神经元退化的动物模型(Sillevis-Smilt & De Jong， 1989；Price等，1994)，这是由急性神经毒性损害造成的(用IDPN、兴 奋毒素处理)，或由于遗传错误造成(wobbler、pmn、Mnd小鼠、 HCSMA狗)。在遗传性动物模型中，pmn小鼠在临床、组织学 (Schmalbruch 1991)和肌电图(Kennel，1996)方面已有特别好的表征。 pmn突变以隐性常染色体方式传递，并已定位在第13号染色体上。纯合 pmn小鼠在2-3周龄开始患肌肉萎缩和麻痹并表现在后肢上，然后扩展至 全身。所有未处理的pmn小鼠都在6-7周龄前死亡。其神经元的退化开 始于神经末稍并导致运动神经中有髓神经纤维的大量丧失，特别是保证横 隔神经支配的隔神经中(Schmalbruch 1991)。与FALSG93A小鼠不同，这 种肌肉的失神经支配是很快的，基本不伴有由轴突旁侧重新生长引起的重 支配现象。在肌电图方面，肌肉失神经支配过程的特征是纤维性颤动的出 现和超强电刺激神经后肌肉反应幅度的大大降低(Kennel等，1996)。

转基因小鼠品系Xt/pmn也用作ALS的另一鼠模型。这些小鼠按如 下获得：C57/B156或DBA2雌性小鼠与Xtpmn+/Xt+pmn雄性小鼠(129 系)第一次杂交，然后是杂合的Xt pmn+/Xt+pmn+雌性子代(N1)与原雄性 之间第二次交杂。在小鼠子代(N2)中，选择了带有等位基因Xt(由赘指表 型显示)和等位基因pmn(PCR测定)的双杂合子Xt pmn+/Xt+pmn(称为 “Xt pmm”小鼠)用于进一步杂交。

2.表达系统

2.1.质粒载体

可使用能表达一种或两种神经营养因子的不同质粒载体。例如可举出 质粒pCR II-BDNF和pSh-Ad-BDNF，它们含有一个表达和分泌BDNF 的盒子(WO95/25804)。还可以提及在LTR启动子控制下含有编码GDNF 的核酸的质粒p-LTR-IX-GDNF(WO95/26408)，以及质粒p-LTR-IX- preNGF/CNTF，其在βNGF信号序列之后含有CNTF基因的序列，还 含有腺病毒基因组的反向重复序列(ITR)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子的 LTR序列、衣壳化序列及同源重组所必需的腺病毒序列。应理解，任何 含有一个复制起点和标志基因的质粒都可用于通过插入神经营养因子的 一个或多个表达盒来构建本发明的表达系统。可在真核细胞或原核细胞宿 主中制备这些质粒。

2.2.腺病毒

如前文所提及的，病毒载体、特别是腺病毒构成本发明一个特别优选 的实施方案。

以下所用的重组腺病毒是按现有技术中描述的方法通过同源重组获 得的。简言之，是在293细胞中通过如下重组构建的，线性化病毒基因组 (dl324)和含有左侧ITR、衣壳化序列、转基因及其启动子和重组所需病 毒序列的质粒之间的重组。病毒在293细胞中扩增。在我们的P3实验室 中定期对其再纯化。病毒基因组还可以在原核细胞中按WO96/25506中 描述的技术制备。更具体地使用了下列病毒：

-Ad-CNTF：Ad5血清型重组腺病毒，在其基因组中被缺失的E1区处含 有一个CNTF基因的表达盒，该表达盒由转录启动子(特别是RSV的LTR) 控制下的编码CNTF的cDNA组成。在WO94/08026中给出了构建的详 情。其他构建物包括在E4区中的互补性缺失(如WO96/22378中所述)或 在E3区中的互补性缺失。

-Ad-GDNF：Ad5血清型重组腺病毒，在其基因组中被缺失的E1区处含 有一个GDNF基因的表达盒，该表达盒由转录启动子(特别是RSV的LTR) 控制下的编码GDNF的cDNA组成。在WO95/26408中给出了构建的详 情。另一构建物包括在E4区中的互补性缺失(如WO96/22378中所述)。 -Ad-NT3：Ad5血清型重组腺病毒，在其基因组中被缺失的E1区处含有 一个NT3基因的表达盒，该表达盒由转录启动子(特别是RSV的LTR) 控制下的编码NT3的cDNA组成。另一构建物包括在E4区中的互补性 缺失(如WO96/22378中所述)。

-Ad-BDNF：Ad5血清型重组腺病毒，在其基因组中被缺失的E1区处含 有一个BDNF基因的表达盒，该表达盒由转录启动子(特别是RSV的LTR) 控制下的编码BDNF的cDNA组成。在WO95/25804中给出了构建的详 情。另一构建物包括在E4区中的互补性缺失(如WO96/22378中所述)。

-Ad-FGFa：Ad5血清型重组腺病毒，在其基因组中被缺失的E1区处含 有一个FGFa基因的表达盒，该表达盒由转录启动子(特别是RSV的LTR) 控制下的编码FGFa的cDNA组成。在WO95/25803中给出了构建的详 情。另一构建物包括在E4区中的互补性缺失(如WO96/22378中所述)。

所构建病毒的功能性通过感染培养中的成纤维细胞来验证。用 ELISA和/或通过显示上清液对神经元初级培养物的营养特性分析培养上 清中相应的神经营养因子的存在。

3.重组腺病毒的给药

编码神经营养因子的腺病毒经静脉途径给予成年或新生的动物。对于 成年FALSG93A小鼠，借助于Hamilton型微注射器将109pfu的每种腺病 毒注射至尾静脉内。对于新生的pmn小鼠(2-3天龄)(由无赘指来鉴别)， 借助于装有30G针的胰岛素型微注射器将2×109pfu(终体积20μl)的 病毒悬液注射至视网膜静脉内。新生动物用乙醚轻度麻醉并处在低体温状 态。

4.其他技术

肌电图

只要其身体状况充许，腹膜内注射2μg/g和60μg/g体重的安定 (Valium，Roche，法国)和盐酸氯胺酮(Ketalar，Parke-Davis，法国)的 混合物将动物麻醉。

所用的肌电描记仪是带有获取和处理肌电图信号所需要的成套软件 的最新一代仪器(Keypoint)。该仪器是从Dantec公司(法国Les Ulis)租借 的。

刺激-检测的肌电图：运动刺激反应(REM)

当在神经上施加电刺激时，由该神经支配的肌肉是电反应的所在地。 这种反应发生在一段时间之后(远程潜伏期)，即相当于刺激传导至突触的 时间加上信号在突触内的传递时间。这种反应的幅度与受神经支配的肌肉 纤维的量成比例。

纯粹出于实践的原因，我们选择刺激坐骨神经并在腿肚腓肠肌处接收 运动刺激反应。将5只针式电极按如下方式植入并与肌电图描记仪连接： (a)放置两个刺激电极，一个(主电极)在坐骨神经通道上，另一个(参考电 极)在尾根部；(b)植入两个检测电极，一个在腓肠肌中(主电极)，另一个 在相应的腱上(参考电极)；(c)最后一个电极接地并植入在动物大腿中两 个主电极之间。测量肌肉响应于对其运动神经刺激的REM的幅度和潜伏 期。在相当于可获得最大动作潜力之强度150％的所谓超强强度下， REM历时200毫秒。在成年小鼠中，如果所研究的神经和肌肉健康，在 上述条件下，刺激反应的幅度大于或等于80mV，潜伏时间一段等于0.6 毫秒。

组织学分析

用过量的氯仿处死动物并且心内灌注戊二醛溶液。将隔神经分离、取 出、用四氧化锇后固定并放在环氧树脂中。在近横隔处切割隔神经，3μ m厚的切片用对苯二胺染色并用光学显微镜分析。

5.给予表达CNTF基因的表达系统

注射腺病毒载体

2-3天龄的纯合Xt+pmn/Xt+pmn小鼠(“pmn小鼠”)(由不存在赘 指来鉴别)用于注射腺病毒载体。将腺病毒原液稀释在盐水-磷酸盐缓冲液 (PBS)中至2×109pfu/μl制得腺病毒CNTF的悬液，按第3点描述的条 件给药。在大肠杆菌中编码β-半乳糖苷酶的AdlacZ(Stratford- Perrieaudet，1992)用作对照腺病毒载体。

结果：

用AdCNTF染感的人成纤细胞的Northern印迹分析表明存在长度 分别为1.1和1.6kb的两种重组转录物。ELISA分析揭示感染不同类型 细胞后的上清中存在重组蛋白。在实验系列中所有未治疗的pmn小鼠都 在2个月之前死亡，其平均存活期为40.4±2.4天(n＝14)。对照载体AdlacZ 的施用不改变pmn小鼠的存活期。而静脉内注射AdCNTF处理的pmn 小鼠最长存活至73天(图3)。用AdCNTF治疗的pmn小鼠的平均存活期 被显著改善，为52.7±3.9天(n＝7，p＜0.011)(已用Studentt检验分析了 健康Xt/pmn小鼠、未处理的纯合小鼠和处理的pmn小鼠的结果之间的 差别，数值以均值±平均标准误(SEM)给出。

为了确定用AdCNTF处理的pmn小鼠的存活期延长是否反映了隔神 经纤维数目的增加，在第25天进行了光学显微镜检查，结果表明在未处 理的pmn小鼠中和在静脉接受AdlacZ的pmn小鼠中，隔神经中有髓神 经纤维的数目分别降至122±13(n＝6)和111±11(n＝8)，而健康小鼠中 有髓神经纤维为263±8(n＝4)。在注射AdCNTF的pmn小鼠的膈神经 中有髓神经纤维的数目显著高于对照动物的(145±11，n＝10，p＜0.05)。 因而用AdCNTF对pmn小鼠的处理使有髓神经纤维的丧失降低了 20％(图4)。

6.给予联合产生CNTF-GDNF的表达系统

用微注射器以200μl的终体积给4只99天龄的FALSG93A小鼠注射 (尾静脉)腺病毒Ad-CNTF和Ad-GDNF各109pfu。随着时间跟踪动物的 肌电图行为并与对照组相比较。还记录了平均存活期。

肌电图

所得结果示于图1中，观察到AdCNTF+AdGDNF处理的FALSG93A 小鼠及未处理的FALSG93A小鼠的腓肠肌中运动刺激反应(REM)幅度的降 低。这种降低反映了进行性失神经支配的过程，这是ALS的特征之一。 但治疗小鼠的REM幅度总体上大于对照的，说明治疗后功能损害的减 弱。

寿命

动物的存活期如下表中所示。

       受治疗的动物     动物号     死亡时间     1779-5     188     1779-6     170     1779-7     176     1779-8     155     平均     172.2     SEM     6.86

      未处理的动物     动物号     死亡时间     35-5       142     35-8       135     35-9       151     35-50       125     35-60       147     35-90       155     平均       142.5     SEM       4.51

这些结果表明，治疗组的所有动物死亡时的年龄都大于或等于对照组 中活得最长的动物的年龄。这些结果还表明，与对照动物相比，治疗组的 存活期平均提高30天。这些结果特别出人意料，与Rilutek所得的13天 延长相比，表明本发明方法的治疗潜力。

7.给予产生NT3的表达系统

7(a).给予产生NT3的表达系统(99天龄的小鼠)

用微注射器以200μl的终体积给4只99天龄的FALSG93A小鼠注射(尾 静脉)了109pfu的腺病毒AdNT3。随着时间跟踪动物的肌电图行为并与 对照组比较。所得结果示于图2中，其表明受治疗的小鼠的REM幅度大 于对照组的，说明由于治疗减弱了功能损害。

7(b)-给予产NT3的表达系统(3天龄的小鼠)

用微注射器以20μl的终体积给3天龄的小鼠注射(颞静脉)了5× 108pfu的腺病毒Ad-NT3。

动物的存活期示于下表中。

    受治疗的动物   动物号   死亡时间   73-1   161   73-2   173   73-3   178   73-4   184   73-5   186   73-6   187   73-7   187   73-8   191   73-9   196   73-10   197   74-1   162   74-2   177   74-3   177   74-4   179   74-5   180   74-6   183   74-7   186   37-1   162   37-2   176   37-3   181   37-4   189   37-5   190   37-6   190   均值   181.4   SEM   2.1

    未处理的动物   动物号 死亡时间   1-1   130   1-2   150   1-3   158   1-4   156   1-5   162   1-6   142   1-7   170   39-1   157   39-2   157   39-3   164   39-4   147   39-5   161   43-1   150   43-2   168   43-3   170   43-4   193   43-5   147   43-6   161   43-7   191   45-1   154   45-2   174   45-3   179   45-4   176   45-5   157   45-6   188   45-7   178   45-8   182   59-1   150   59-2   186   59-3   171   59-4   172   34-1   172   34-2   189   34-3   170   34-4   191   34-5   195   34-6   174   34-7   147   34-8   150   34-9   151   34-10   165   34-11   165   34-12   155   34-13   148   均值   165.3   SEM   2.3

这些结果表明用Ad-NT3静脉途径治疗的动物的平均存活期此未处 理的动物提高了16.1天。

8.给予联合产生CNTF-NT3的表达系统

用微注射器以200μl的终体积给4只99天龄的动物注射(尾静脉)了腺 病毒Ad-CNTF和Ad-NT3各109pfu。随着时间跟踪记录动物的肌电图 行为，并与对照组相比较。还记录了平均存活期。

9.给予联合产生BDNF-NT3的表达系统

用微注射器以200μl的终体积给4只99天龄的动物注射(尾静脉)了腺 病毒Ad-BDNF和Ad-NT3各109pfu。随着时间跟踪记录动物的肌电图 行为，并与对照组相比较。还记录了平均存活期。

10.给予产生BDNF的表达系统

用微注射器以200μl的终体积给4只99天龄的动物注射(尾静脉)了 109pfu的腺病毒Ad-BDNF。随着时间跟踪记录动物的肌电图行为，并 与对照组相比较。还记录了平均存活期。

                           参考文献

-AKLIS.等，自然遗传学(Nature genet.)， 3，224-228，1993.

-APPEL S.H.等，作为偶发性肌萎缩性侧索硬化的病因学因素的自体免 疫，见Serratrice G.T.和Munsat T.L编的“肌萎缩性侧索硬化的发病和 治疗”，《神经学进展》(Advances in Neurology)， 68，pp.47-58，1995. Lippincott-Raven publishers，Philadelphia.

-BAJOCCHI G.等，自然遗传学， 3，229-234，1993.

-BARKATS M.等，神经学报道(Neuroreport)， 7，497-501，1996.

-BARINAGA M.科学(Science) 264，772-774，1994.

-CASTEL BARTHE M.N.等，疾病的神经生物学(Neurobiology of Disease)， 3，76-86，1996.

-CHIU A.Y.等，分子细胞神经科学(Mol.Cell.Neurosci.)， 6，349-362， 1995.

-DAVIDSON B.L.等，自然遗传学， 3，219-223，1993.

-DITTRICHf.，神经学年鉴(Ann.Neurol.)， 35，151-163，1994.

-FINIELS F.等，神经学报道， 7，373-378，1995.

-GASTAUT J.L.病毒假说，见Serratrice G.T.和Munsat T.L.编的“肌 萎缩性侧索硬化的发病和治疗，《神经学进展》， 68，pp.135-138，1995. Lippincott-Raven publishers，Philadelphia.

-GURNEY M.E.，PUH.，CHIU A.Y.等，科学， 264，1772-1775，1994.

-GURNEY M.E.，CUTTING F.B.，ZHAIP.等，神经学年鉴， 39，147- 157，1996.

-HENDERSON C.E.，CAMU W.，METTLING C.等，自然， 363，266- 270，1993.

-HENDERSON C.E.等，科学， 266，1062-1064，1994.

-HENDERSON C.E神经营养因子作为肌萎缩性侧索硬化的治疗剂：潜 力和误区，见Serratrice G.T.和MunSat T.L.编的“肌萎缩性侧索硬化的 发病和治疗，《神经学进展》， 68，pp.235-240，1995.Lippineott-Raven publishers，Philadelphia.

-HORELLOU P.，VIGNE E.，CASTEL M.N.等，神经学报道， 6，49- 53，1994.

-HUGHES R.A.等，神经元(Neuron)， 10，369-377，1993.

-KENNEL P.F.，FINIELS F.，REVAH F.等，神经学报道， 7，1427- 1431，1996a.

-KENNEL P.F.等，神经生物学疾病(Neurobiol Disease) 3：137-147， 1996.

-Le GAL La SALLE G.等，科学， 262，430-433，1993.

-LEWIS M.E.等，实验神经学(Exp.Neurol.)， 124，73-88，1993.

-OPPENHEIM R.W.，YIN Q.W.，PREVETTE D.等，自然， 360，755- 757，1992.

-OPPENHEIM R.W.等，自然， 373，344-346，1995.

-PENNICA D.，ARCE V.，SWANSON T.A.等，神经元， 17，63-74， 1996.

-PRICE D.L.等，神经生物学疾病， 1，3-11，1994.

-ROSEN D.R.，SIDDIQUE T.，PATTERSON D.等，自然， 362，59-62， 1993.

-ROTHSTEIN J.D.肌萎缩性侧索硬化发病的兴奋毒性机制Serratrice G.T.和Munsat T.L.编的“肌萎缩性侧索硬化的发病和治疗，《神经学进 展》， 68，pp.7-20，1995.Lippincott-Raven publisher，Philadelphia.

-ROWLAND L.P.美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)， 92，1251-1253，1995.

-RUBIN B.A.和RORKE L.B.腺病毒疫苗，见Plotkin和Mortimer编的 《疫苗》(Vaccines)，pp.492-512，1988.W.B.Saunders，Philadelphia.

-SCHMALBRUCH H.，JENSEN H.S.，BJAERG M.，KAMIENICKA Z. 和KURLAN L.神经病理学实验神经学杂志(J.Neuropathol Exp Neurol.) 50：192-204，1991.

-SENDTNER M.等，自然， 358，502-504，1992a.

-SENDTNER M.，HOLTMANN B.，KOLBECK R.自然， 360，757- 759，1992b.

-SILLEVIS SMITT P.A.E.等，神经科学杂志(J.Neurol.Sci.)， 91，231- 258，1989.

-STRATFORD-PERRICAUDET L.D.，MAKEH I.，PERRICAUDET M.， BRIAND P.临床调查杂志(J.Clin.Invest.) 90，626-630，1992.

-VEJSADA R.，SAGOT Y.和KATO A.C.欧洲神经科学杂志(Eur.J. Neurosci.)， 7，108-115，1995.

-WINDEBANK A.J.生长因子在治疗运动神经元疾病中的应用 Serratrice G.T.和Munsat T.L编的“肌萎缩性侧索硬化的发病和治疗， 《神经学进展》， 68，pp.229-234，1995.Lippincott-Raven publishers， Philadelphia.

-YAN Q.，ELLIOTT J.和SNIDER W.D.自然， 360，753-755，1992.

-YANG Y.，ERTL H.C.J.，和WILSON J.M.免疫(Immunity)， 1，433- 442，1994.

-YANQ.，MATHESON C.，LOPEZ O.T.等，神经科学杂志，14，5281- 5291，1994.

-YASE Y.运动神经元疾病中的金属代谢，见Chen K.M.和Yase Y.编的 亚洲和大洋洲的肌萎缩性侧索硬化》(Amyotrophic lateral sclerosis in Asia and Oceania)，台北，pp.337-356，1984.台湾：National Taiwan University Press.

-YEH P.，DEDIEU J.F.，ORSINI C.等，病毒学杂志(J.Virol.)， 70， 559-565，1996.

-YIM M.B.，等，美国国家科学院院报， 93，5709-5714，1996。