背景

在进化过程中，人体已经发展了处理热量摄入不足的精巧方法， 并且直到最近我们才开始认识到这些代谢网络的复杂性.在当前发达 国家中热量被大量摄入期间，该精致且复杂的系统开始对我们产生消 极影响，导致肥胖症和相关的代谢疾病严重流行。

脂肪组织是人体中的必需组分。然而，太多体脂肪导致肥胖症， 其是严重的医学状况，当前影响美国约1/3的成年人，和约14％的儿 童和青少年。发达国家中能源丰富以及久坐的生活方式已经使得肥胖 症成为全世界的现象。在美国，可以说肥胖症是当前仅次于吸烟的可 预防性死亡的第二名主要的病因(www.obesity.org)。

肥胖症是环境因素和遗传因素联合导致的典型的多因子疾病.例 如，在单卵双生中身体组成的家族性群集和高度一致性中可以看到人 类肥胖症的遗传组分的强有力证据.然而，遗传因素的作用是复杂的 并且可能通过几个基因的相互作用决定，每种基因可能具有相对小的 影响。此类基因称作“易感性”基因并且在它们相互组合以及与环境因 素如营养摄入、身体活动和吸烟组合中看到它们的表型效应。

迄今为止，已经报导至少约80种基因与肥胖症有关(见，例如， http://obesitygene.pbrc.edu的肥胖基因图谱数据库(Obesity Gene Map Database))。这些基因的许多种在脂肪组织的形成和维持 中起调节作用.

肥胖症通常与其他疾病有关。例如，与腹部肥胖相关并且包括葡 萄糖耐受不良、脂质异常血症(dyslipidemia)和高血压的“代谢簇” 有时也称作代谢综合征X(Reaven，1988)或者腹部肥胖症-代谢综合 征(Bjorntorp，1991)。该症状联合的根本原因似乎是腹部脂肪模 式、全身肥胖和胰岛素抵抗的密切相互作用。肥胖症也通常是成年发 作的非胰岛素依赖性糖尿病(II型糖尿病)和多种其他疾病的预先存 在的状况。尽管在脂肪组织代谢的知识方面取得了进展，但是脂肪组 织代谢疾病的当前治疗方案仍然存在不足并且希望开发新的疗法。

发明概述

本发明涉及围脂滴蛋白(perilipin)基因座上新的遗传性变型 或者多态性和它们在肥胖症和相关代谢疾病的诊断和预后应用中的 用途。

本发明提供了确定个体中肥胖症和肥胖症相关疾病的增加的危 险的方法，其包括步骤：a)确定从该个体得到的生物样品中PLIN1 6209T/C、PLIN3 10171A/T、PLIN4 11482G/A、PLIN5 13041A/G、PLIN6 14995A/T基因座的基因型；b)基于步骤(a)确定的PLIN基因型产生 单元型；和c)将所述单元型与该个体的人种背景关联，其中与该个 体的人种背景相关的选自PLIN5-G/PLIN6T、PLIN5-A/PLIN6-T、 PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-T、PLIN1-T/PLIN4-G、PLIN1- T/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A、PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-APLIN5- A/PLIN6-T、PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN/4-A/PLIN5-G/PLIN6-T、 PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T、PLIN4-A/PLIN5-G/PLIN6-T、PLIN4- G/PLIN5-G/PLIN6-A、PLIN1-T/PLIN3-A的单元型表明该个体中肥胖 症和肥胖症相关疾病的增加的危险。

在一个实施方案中，提供了确定高加索人血统个体中肥胖症和肥 胖症相关疾病的增加的危险的方法，其包括步骤：a)确定从该个体得 到的生物样品中PLIN1 6209T/C、PLIN4 11482G/A、PLIN5 13041A/G、 PLIN6 14995 A/T基因座的基因型；b)基于步骤(a)确定的PLIN基因 型产生单元型；和c)将所述单元型与该个体的人种背景关联，其中 选自PLIN5-G/PLIN6T、PLIN5-A/PLIN6-T和PLIN1-T/PLIN4- G/PLIN5-G/PLIN6-T的单元型表明该高加索人血统个体中肥胖症和 肥胖症相关疾病的增加的危险。

在一个实施方案中，提供了确定地中海人血统个体中肥胖症和肥 胖症相关疾病的增加的危险的方法，其包括步骤：a)确定从该个体得 到的生物样品中PLIN1 6209T/C、PLIN4 11482G/A、PLIN5 13041A/G、 PLIN6 14995 A/T基因座的基因型；b)基于步骤(a)确定的PLIN基因 型产生单元型；和c)将所述单元型与该个体的人种背景关联，其中 选自PLIN1-T/PLIN4-G、PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A、 PLIN1-T/PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-T的单元型表明该地中海人血统 个体中肥胖症和肥胖症相关疾病的增加的危险。

在一个实施方案中，提供了确定马来人血统个体中肥胖症和肥胖 症相关疾病的增加的危险的方法，其包括步骤：a)确定从该个体得到 的生物样品中PLIN16 209T/C、PLIN3 10171A/T、PLIN4 11482G/A、 PLIN5 13041A/G、PLIN6 14995 A/T基因座的基因型；b)基于步骤(a) 确定的PLIN基因型产生单元型；和c)将所述单元型与该个体的人种 背景关联，其中选自PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T、 PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN/4-A/PLIN5-G/PLIN6-T、PLIN4-A/PLIN5- A/PLIN6-T、PLIN4-A/PLIN5-G/PLIN6-T、PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6- A、PLIN1-T/PLIN3-A的单元型表明该马来人血统个体中肥胖症和肥 胖症相关疾病的增加的危险。

在一个实施方案中，提供了确定印度人血统个体中肥胖症和肥胖 症相关疾病的增加的危险的方法，其包括步骤：a)确定从该个体得到 的生物样品中PLIN1 6209T/C、PLIN3 10171A/T、PLIN4 11482G/A、 PLIN5 13041A/G、PLIN6 14995A/T基因座的基因型；b)基于步骤(a) 确定的PLIN基因型产生单元型；和c)将所述单元型与该个体的人种 背景关联，其中选自PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T、 PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-T、PLIN4-G/PLIN5-G/PLIN6-T和PLIN1- T/PLIN3-A的单元型表明该印度人血统个体中肥胖症和肥胖症相关疾 病的增加的危险。

在一个实施方案中，提供了确定高加索人血统个体中肥胖症和肥 胖症相关疾病的增加的危险的方法，其包括确定从该个体得到的生物 样品中PLIN5 13041A/G和PLIN6 14995A/T基因座的基因型，其中 PLIN5基因座中等位基因G的纯合性或者PLIN6基因座中等位基因T 的纯合性表明该高加索人血统个体中肥胖症和肥胖症相关疾病的增 加的危险。

在一个实施方案中，提供了确定马来人或者印度人血统个体中肥 胖症和肥胖症相关疾病的增加的危险的方法，其包括确定从该个体得 到的生物样品中PLIN6 14995A/T基因座的基因型，其中PLIN6基因 座中等位基因T的纯合性表明该马来人或者印度人血统个体中肥胖 症和肥胖症相关疾病的增加的危险.

在一个实施方案中，提供了确定马来人或者印度人血统个体中肥 胖症和肥胖症相关疾病的增加的危险的方法，其包括确定从该个体得 到的生物样品中PLIN4 11482G/A基因座的基因型，其中PLIN4基因 座中等位基因A的纯合性表明该马来人或者印度人血统个体中肥胖 症和肥胖症相关疾病的增加的危险。

在一个实施方案中，提供了确定马来人或者印度人血统个体中肥 胖症和肥胖症相关疾病的增加的危险的方法，其包括确定从该个体得 到的生物样品中PLIN5 13041A/G基因座的基因型，其中PLIN5基因 座中等位基因G的纯合性表明该马来人或者印度人血统个体中肥胖 症和肥胖症相关疾病的增加的危险。

在一个实施方案中，评估其肥胖症和肥胖症相关疾病的增加的危 险的个体是女人。

在一个实施方案中，评估其肥胖症和肥胖症相关疾病的增加的危 险的个体已接受体重减轻饮食。

在一个实施方案中，肥胖症相关疾病是心血管疾病。

在一个实施方案中，肥胖症相关疾病是代谢综合征。

在另一个实施方案中，提供了确定个体中肥胖症和肥胖症相关疾 病的减小的危险的方法，其包括步骤：a)确定从该个体得到的生物样 品中PLIN1 6209T/C、PLIN3 10171A/T、PLIN4 11482G/A、PLIN5 13041A/G、PLIN6 14995 A/T基因座的基因型；b)基于步骤(a)确定 的PLIN基因型产生单元型；和c)将所述单元型与该个体的人种背景 关联，其中与该个体的人种背景相关的选自PLIN5-A/PLIN6-A、 PLIN1-C/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A、PLIN1-C/PLIN4-A、PLIN1- C/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-A、PLIN1-T/PLIN3-T/PLIN4-G/PLIN5- A/PLIN6-A、PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN/4-G/PLIN5-A/PLIN6-A和 PLIN1-C/PLIN3-T的单元型表明肥胖症和肥胖症相关疾病的减小的 危险。

在一个实施方案中，提供了确定高加索人血统个体中肥胖症和肥 胖症相关疾病的减小的危险的方法，其包括步骤：a)确定从该个体得 到的生物样品中PLIN16 209T/C、PLIN4 11482G/A、PLIN4 13041A/G、 PLIN6 14995A/T基因座的基因型；b)基于步骤(a)确定的PLIN基因 型产生单元型；和c)将所述单元型与该个体的人种背景关联，其中 选自PLIN5-A/PLIN6-A和PLIN1-C/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A的单 元型表明该高加索人血统个体中肥胖症和肥胖症相关疾病的减小的 危险。

在一个实施方案中，提供了确定地中海人血统个体中肥胖症和肥 胖症相关疾病的减小的危险的方法，其包括步骤：a)确定从该个体得 到的生物样品中PLIN16 209T/C、PLIN4 11482G/A、PLIN5 13041A/G、 PLIN6 14995A/T基因座的基因型；b)基于步骤(a)确定的PLIN基因 型产生单元型；和c)将所述单元型与该个体的人种背景关联，其中 选自PLIN1-C/PLIN4-A和PLIN1-C/PLIN4-A/PLIN5-A/PLIN6-A的单 元型表明该地中海人血统个体中肥胖症和肥胖症相关疾病的减小的 危险。

在一个实施方案中，提供了确定马来人血统个体中肥胖症和肥胖 症相关疾病的减小的危险的方法，其包括步骤：a)确定从该个体得到 的生物样品中PLIN1 6209T/C、PLIN3 10171A/T、PLIN4 11482G/A、 PLIN5 13041A/G、PLIN6 14995A/T基因座的基因型；b)基于步骤(a) 确定的PLIN基因型产生单元型；和c)将所述单元型与该个体的人种 背景关联，其中选自PLIN1-T/PLIN3-T/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A、 PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A和PLIN1-C/PLIN3-T 的单元型表明该马来人血统个体中肥胖症和肥胖症相关疾病的减小 的危险.

在一个实施方案中，提供了确定印度人血统个体中肥胖症和肥胖 症相关疾病的减小的危险的方法，其包括步骤：a)确定从该个体得到 的生物样品中PLIN1 6209T/C、PLIN3 10171A/T、PLIN4 11482G/A、 PLIN5 13041A/G、PLIN6 14995A/T基因座的基因型；b)基于步骤(a) 确定的PLIN基因型产生单元型；和c)将所述单元型与该个体的人种 背景关联，其中选自PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6A、 PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5-A/PLIN6-A和PLIN1-C/PLIN3-C的 单元型表明该印度人血统个体中肥胖症和肥胖症相关疾病的减小的 危险.

在一个实施方案中，评估其肥胖症和肥胖症相关疾病的减小的危 险的个体是女人.

本发明还提供了试剂盒，其包含用于扩增覆盖PLIN1 6209T/C、 PLIN3 10171A/T、PLIN4 11482G/A、PLIN5 13041A/G和PLIN61 4995 A/T多态性的相酸区域的引物对，和说明书，其包括与肥胖症增加的 或者减小的危险相关的单元型和它们与人种群的关联.

在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于扩增覆盖PLIN1多态性 的核酸区域的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2引物对；用于扩增覆盖 PLIN3多态性的核酸区域的SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8引物对； 用于扩增覆盖PLIN4多态性的核酸区域的SEQ ID NO：10和SEQ ID NO： 11引物对；用于扩增覆盖PLIN5多态性的核酸区域的SEQ ID NO：13 和SEQ ID NO：14引物对；和用于扩增覆盖PLIN6多态性的核酸区域 的SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17引物对；和说明书，其包括与肥 胖症增加的或者减小的危险相关的单元型和它们与人种群的关联.

附图简述

图1显示了PLIN多态性的命名.本研究中检查的多态性的位置 表示为垂直短线，其下面为名称.基因图上面的方框显示了包括我们 的命名中表示为“+1”的核苷酸的序列(SEQ ID NOS 19-20).起始甲 硫氨酸密码子ATG的A表示为粗斜体字母，其上面标出它在参考序列 (GenBank检索号GI21431190)上的基因组位置.还阐明了对应的氨基 酸.具有斜杠线的方框表示可能发生可变剪接的区域.

图2显示了对来自样本1的女人中PLIN5和PLIN6进行调整后 PLIN1和PLIN4 SNP的组合基因型的BMI.年龄-调节的平均值；误差 条：SEM.

图3显示了对来自样本1的女人中PLIN1和PLIN4进行调整后 PLIN5和PLIN6 SNP的组合基因型的BMI.年龄-调节的平均值；误差 条：SEM。

图4A和4B显示了具有PLIN4野生型等位基因1的女人和PLIN4 等位基因2的携带者在节食后体重增加或减轻的结果图。该图清楚地 表明具有杂合PLIN4等位基因2的女人如果不继续节食将更容易增 重。

图5显示了研究群体中LD矩阵的图表。四种基因型分析的PLIN SNPs(6209C>T、11482G>A、13041A>G和14995A>T)之间逐 对LD量度(D’)在对角线上方显示，而对应的P值在对角线下方给出。

图6阐明了女人中PLIN1 3041A>G和14995A>T SNP处的基 因型之间体脂肪量度(BMI、百分数体脂肪和腰)的差异和标准误。对 于PLIN13041A>G SNP，11＝AA，12＝AG并且22＝GG。对于14995A> T SNP，11＝AA，12＝AT并且22＝TT。

图7显示了新加坡中人种的LD矩阵图表，五种基因型分析的PLIN SNPs(6209C>T、10171A>T、11482G>A、13041A>G和14995A >T)之间的逐对LD量度(D’)在对角线上方显示，而对应的P值在对 角线下方给出。

图8显示了多种PLINS的优势比(odds ratio)(OR)图。马来人 和印度人中PLIN1 1482G>A、13041A>G和14995A>T的肥胖 (BMI≥30kg/m2)的多变量OR和95％CI。对于每种SNP，将具有野生型 纯合子和杂合子的基因型组用作参照。通过比较纯合变异与参照得到 OR。

发明详述

本发明涉及围脂滴蛋白基因座(PLIN)上新的遗传性变型或者多 态性，包括PLIN1：6209T(等位基因1)>C(等位基因2)；PLIN3 10171(等位基因1)A>T(等位基因2)；PLIN4：11482G(等位基因 1)>A(等位基因2)；PLIN5：13041A(等位基因1)>G(等位基因2)和 PLIN6：14995A(等位基因1)>T(等位基因2)，和它们在肥胖症和相关 代谢疾病的诊断和预后应用中的用途以及它们在治疗肥胖症和相关 代谢疾病中的用途。所提及的序列编号是根据GenBank序列ID

No.gi21431190的。

本发明涉及新的PLIN单元型，其与较低的体重指数(BMI)相关并 且因此保护免于肥胖症和相关代谢疾病，如心血管疾病，以及PLIN 单元型，其与升高的BMI相关并且因此是肥胖症和相关代谢疾病，如 心血管疾病和代谢综合征的危险因素。

如本文所用的“地中海血统的个体”指具有来自地中海地理区的 祖先的人，所述地理区包括但不限于，西班牙、法国、意大利和葡萄 牙。优选地，至少一个祖先来自地中海的地理区。

如本文所用的“高加索人血统的个体”指具有来自北欧、东欧或中 欧的地理区的祖先的人。通常，这些个体具有浅色皮肤颜色并且来自 包括但不限于北美、英国、俄罗斯和德国的区域。优选地，至少一个 祖先来自北欧、东欧或中欧。

如本文所用的“马来人血统的个体”指具有来自马来群岛和周围 地区的地理区的祖先的人，所述地理区包括，但不限于马来西亚、印 尼、文莱和新加坡。优选地，至少一个祖先来自马来群岛或周围地区。

如本文所用的“印度人血统的个体”指具有来自印度和周围地区 的地理区的祖先的人，所述地理区包括，但不限于印度、巴基斯坦、 尼泊尔和孟加拉国。优选地，至少一个祖先来自印度或周围地区。

心血管疾病(CVD)或者循环系统的疾病代表由于冠状动脉、脑动 脉或者外周动脉的动脉粥样硬化损伤导致的多种临床状况。认为现今 CVD是发达国家男人和女人的主要死因。CVD的详细流行病学数据可 以从美国心脏学会(American Heart Association)的“2002 Heart and Statistical Update”得到，其概述了危险因素。61,800,000名美 国人患有一种或多种类型的CVD(Rational diagnosis of cardiovascular disease，Müller M M，Griesmacher A，eJIFCC Vol 14 no 2：

http://www.ifcc.org/ejifcc/vol14no2/1402062003012n.htm)。当 前有几种标记可以诊断急性心血管疾病，包括使用所称作的在局部缺 血状况下从心肌细胞释放的“早期”和“晚期”标记，如嗜肌素 (myotropin)和心肌钙蛋白(Id.)。

代谢综合征的特征是一个人中的一组代谢危险因素。这些因素包 括a)向心性肥胖(腹部中和周围过多脂肪组织)，b)致动脉粥样化的 脂质异常血症(血脂，其促进动脉壁中斑块集结)，c)升高的血压 (130/85mmHg或者更高)，d)胰岛素抵抗或者葡萄糖耐受不良，e)血 栓形成前(prothrombotic)状态(例如，血液中高血纤蛋白原或者纤 溶酶原激活物抑制剂和f)促炎状态(例如，血液中升高的高敏感性C 反应蛋白质).该综合征的根本病因是超重/肥胖症、身体不活动和遗 传因素。具有代谢综合征的人患冠心病、与动脉壁中斑块集结有关的 其他疾病(例如，中风和外周血管疾病)和2型糖尿病的危险增加。

在一个实施方案中，本发明提供了通过测定个体中PLIN单元型 评估心血管疾病和代谢综合征的易感性的新方法。

围脂滴蛋白(PLIN)是激素调节的磷蛋白，其环绕脂肪细胞中脂 质贮藏小滴(Greenberg，A.S.；Bgan，J.J.；Wek，S.A.；Takeda，T.； Londos，C.；Kimmel，A.K.(Abstract)Clin，Res.39：287A only， 1991)。它是脂肪细胞中主要的细胞A-激酶底物，其包被细胞内脂质 小滴并且调节脂肪细胞脂解活性。Nishiu等人从脂肪组织cDNA文库 克隆了编码人围脂滴蛋白的cDNA(Genomics 48：254-257，1998； GenBank Nucleic Acid ID No.gi：3041770)。该人基因编码522个 氨基酸的多肽，其与Greenberg等人(Proc.Nat.Acad.Sci. 90：12035-12039，1993)分离的大鼠同系物具有79％同一性。

本发明基于围脂滴蛋白基因座(PLIN)上几个新的遗传性变型与 肥胖症和相关的代谢疾病以及心血管疾病的关系的鉴定和评估，所述 变型包括PLIN1：6209T>C；PLIN3：10171A>T；PLIN4：11482G>A；PLIN5： 13041A>G和PLIN6：14995A>T。

我们确定了从地中海人群体随机选择的788名男性和801名女性 (样本1)和157名住院的肥胖受试者(样本2)中PLIN多态性和单元 型的关联。令人惊奇地，在整个群体中，围脂滴蛋白的较不常见的等 位基因，即PLIN1等位基因2和PLIN4等位基因2与女人中肥胖症的 减小的危险显著相关(分别为OR＝0.65，95％ CI：0.48-0.88和 OR＝0.60，95％ CI：0.44-0.83)。我们还惊奇地发现在来自样本1的女 人中，与野生型，即等位基因1相比，PLIN1和PLIN4的较不常见的 等位基因与较低的BMI显著相关.在这些女人中，PLIN4也与较低的 腰-臀比、空腹葡萄糖和血浆三酰甘油浓度有关。单元型分析证实了 这些结果并且揭示在所有女人中PLIN1和PLIN4对BMI的协同作用。 在来自样本1的男人中没有发现统计学显著关联。然而，在肥胖男人 中，PLIN4的较不常见等位基因2的携带者比非携带者具有显著较低 的BMI。在肥胖男人和女人两者中，PLIN1和PLIN4的较不常见等位 基因都与较高的血浆葡萄糖相关，并且与样本1不同(相互作用的 P<0.05)。因此，我们的数据表明PLIN-2/PLIN4-2单元型是保护性肥 胖症-易感性单元型，并且与代谢综合征和心血管疾病的发展有关。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了评估个体中的肥胖症和 肥胖症相关疾病的个体素因的方法。该方法包括鉴定和分析从该个体 得到的分离的核酸样品中的PLIN多态性，其中PLIN1等位基因1和 PLIN4等位基因1一起在所述核酸样品中的相同染色单体上存在(例 如，PLIN1-1/PLIN4-1单元型)表明该个体中肥胖症和相关代谢疾病 的遗传素因。优选地，所述个体是地中海人或者高加索人血统。

在一个实施方案中，本发明提供了评估个体对心血管疾病的素因 的方法，其中该方法包括鉴定和分析从该个体所得分离的核酸样品中 的PLIN多态性，其中PLIN1等位基因1和PLIN4等位基因1一起在 所述核酸样品中的相同染色单体上存在(例如，PLIN1-1/PLIN4-1单 元型)表明对心血管疾病的素因.优选地，所述个体是地中海人或者 高加索人血统。

备选地，在一个实施方案中，本发明提供了鉴定较不可能增重和 节食后预期更好地保持所减少的体重的个体的方法.该方法包括分析 来自个体的分离的核酸的PLIN等位基因，其中PLIN1和PLIN4的等 位基因2的存在表明在该个体中存在肥胖症保护性基因型。优选地， 所述个体是地中海人或者高加索人血统。

本发明还提供了用于诊断处于患肥胖症和/或肥胖症相关疾病， 包括，但不限于心血管疾病的危险中的个体的单元型。这些单元型之 一由包括PLIN1、PLIN4、PLIN5和PLIN6的多态性组成。因此，单元 型1111由所有上面鉴定的基因座的等位基因1组成，单元型2222由 所有上面鉴定的基因座的等位基因2组成.来自个体，优选女人的核 酸样品中的单元型2211表明该个体患肥胖症和/或心血管疾病的危 险减小。相反地，具有单元型1122或者1111的个体具有患肥胖症和 /或心血管疾病的增加的危险。优选地，当使用这些单元型进行预后 和/或诊断时，所述个体是高加索人或者地中海人血统.

在再一个实施方案中，本发明提供了鉴定节食后有再次增重危险 的个体的方法.该方法包括分析来自该个体的核酸样品中的PLIN4基 因座，其中PLIN4基因座的一个或两个等位基因中等位基因2的存在 表明再次增重的危险增加。

我们还确定了多人种亚洲群体中多种PLIN基因座和PLIN单元型 中单独的多态性的关联.我们检查了围脂滴蛋白(PLIN)基因座 PLIN1、PLIN3、PLIN4、PLIN5和PLIN6上5种常见单核苷酸多态性 (SNP)，其中所述多态性分别为：PLIN6209C>T、10171A>T、11482G >A、13041A>G和14995A>T。我们研究了它们与肥胖症危险和与 代谢综合征相关的其他变量的关联。研究群体包括来自新加坡的三个 人种群(中国人、马来人和印度人)的4,131个受试者。分析表明单元 型11212由马来人和印度人共有并且与最常见的单元型21111相比与 增加的肥胖症危险显著相关(对于马来人，OR＝1.65，95％CI 1.11- 2.46，对于印度人OR＝1.94，95％CI 1.06-3.53)。在正LD中使用SNP 的亚组(11482G>A、13041A>G和14995A>T)相互进行的单元型 分析表明，调节协变量后，单元型212(OR＝2.04，95％CI1.28-3.25) 和222(OR＝2.05，95％CI 1.35-3.12)与马来人中增加的肥胖症危险 相关，并且单元型212(OR＝2.16，95％CI 1.10-4.26)与印度人中增加 的肥胖症危险显著相关，所述协变量包括年龄、性别、吸烟、酒精消 费、锻炼和糖尿病状态。单独的SNP分析证明调节协变量后，PLIN 14995A>T SNP与马来人(OR＝2.28，95％CI 1.45-3.57)和印度人 (OR＝2.04，95％CI 1.08-3.84)中增加的肥胖症危险显著相关。而PLIN 11482G>A((OR＝1.94，95％CI 1.22-3.08)和PLIN 13041A>G (OR＝1.87，95％CI 1.08-3.25)仅与马来人中增加的肥胖症危险相 关。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了评估马来人或者印度人 血统个体中患肥胖症相关疾病的增加的危险的方法.该方法包括鉴定 和分析从该个体得到的分离的核酸样品中的PLIN多态性，其中单元 型PLIN4-2/PLIN6-2，即PLIN4等位基因2和PLIN6等位基因2一起 存在于核酸样品中的相同染色单体上表明该个体中患肥胖症和相关 疾病的危险。

在一个实施方案中，本发明提供了评估马来人或者印度人血统个 体中心血管疾病的素因的方法，其中该方法包括鉴定和分析从该个体 得到的分离的核酸样品中PLIN多态性和单元型，其中单元型 PLIN4-2/PLIN6-2，即PLIN4等位基因2和PLIN6等位基因2一起存 在于核酸样品中的相同染色单体上表明心血管疾病的素因。

在另一个实施方案中，本发明提供了评估马来人或者印度人血统 的任一个体中肥胖症和肥胖症相关疾病的素因的方法，其中该方法包 括鉴定和确定从该个体得到的分离的核酸样品中PLIN6基因座的基 因型，其中在PLIN6存在T等位基因(等位基因2)的纯合性表明该马 来人或者印度人血统个体中肥胖症和相关疾病的增加的危险。

在另一个实施方案中，本发明提供了评估马来人或者印度人血统 的任一个体中肥胖症和肥胖症相关疾病的素因的方法，其中该方法包 括鉴定和确定从该个体得到的分离的核酸样品中PLIN4基因座的基 因型，其中在PLIN4存在A等位基因(罕见等位基因)的纯合性表明该 马来人或者印度人血统个体中肥胖症和相关疾病的增加的危险。

在另一个实施方案中，本发明提供了评估马来人或者印度人血统 的任一个体中肥胖症和肥胖症相关疾病的素因的方法，其中该方法包 括鉴定和确定从该个体得到的分离的核酸样品中PLIN5基因座的基 因型，其中在PLIN5存在G等位基因(罕见等位基因)的纯合性表明该 马来人或者印度人血统个体中肥胖症和相关疾病的增加的危险。

本发明还提供了用于诊断患肥胖症和/或肥胖症相关疾病的危险 增加的马来人或印度人的单元型。一种单元型由包括PLIN1、PLIN3、 PLIN4、PLIN5和PLIN6的多态性组成。因此，单元型11111由所有 上面鉴定的基因座的等位基因1组成，且单元型22222由所有上面鉴 定的基因座的等位基因2组成。来自马来人血统个体的核酸样品中单 元型11212或11222表明该个体患肥胖症和/或心血管疾病的危险增 加。来自印度人血统个体的核酸样品中单元型11212表明该个体患肥 胖症和/或心血管疾病的危险增加。来自马来人血统个体的核苷酸样 品中单元型12111或21111与肥胖症的减小的危险有关。此外，来自 印度人的核苷酸样品中单元型21111与肥胖症的减小的危险有关。

用于诊断马来人和印度人血统个体的另一种单元型由包括 PLIN4、PLIN5和PLIN6的多态性组成。因此，单元型111由所有上 面鉴定的基因座的等位基因1组成，且单元型222由所有上面鉴定的 基因座的等位基因2组成，其中来自马来人血统个体的单元型212、 222或121表明该个体患肥胖症和/或心血管疾病的危险增加。来自 印度人血统个体的核酸样品中单元型212或者122的存在表明该个体 患肥胖症和/或心血管疾病的危险增加。

在另一实施方案中，本发明提供了评估马来人或印度人血统个体 中患肥胖症和肥胖症相关疾病的素因的方法，其中该方法包括确定从 个体分离的核酸中PLIN1和PLIN3基因座的基因型并产生包含这两种 基因座的表型，其中单元型PLIN1-1/PLIN-3/1，即PLIN1等位基因1 和PLIN3等位基因1一起存在于相同染色单体中表明患肥胖症和/或 心血管疾病的增加的危险。

在另一实施方案中，本发明还提供了鉴定马来人或印度人血统的 较不可能增重和节食后预计更好地保持减轻的体重的个体的方法。该 方法包括确定从个体得到的分离的核酸中PLIN1和PLIN3基因座的基 因型并产生PLIN等位基因的单元型，其中单元型PLIN1-1/PLIN3-2， 即PLIN1等位基因1和PLIN3等位基因2一起存在于相同染色单体中 表明该个体中存在肥胖症保护性基因型。

我们还进行了研究以确定来自美国的高加索人血统个体中PLIN 多态性和单元型的关联。对参与居住生活方式介入计划的734名白人 受试者(373名男人和361名女人)确定了四种PLIN SNP(PLIN 6209T> C、11482G>A、13041A>G和14995A>T)的基因型。多变量分析 证明在女人中，两种SNP(13041A>G和14995A>T)与百分数体脂 肪(对于13041A>G，P＝0.016，对于14995A>T，P＝0.010)和腰围 显著相关(对于13041A>G，P＝0.020，对于14995A>T，P＝0.045)。 而且，使用这两种SNP进行的单元型分析表明单元型PLIN5- A/PLIN6-T和PLIN5-G/PLIN6-T当与单元型PLIN5-A/PLIN6-A相比较 时都与显著增加的肥胖症危险相关(对于单元型PLIN5-A/PLIN6-T， OR＝1.76，95％CI 1.07-2.90，并且，对于单元型PLIN5-G/PLIN6-T， OR＝1.73，95％CI 1.06-2.82)。在男人中没有发现PLIN变异和肥胖 症之间的显著相关。从而，PLIN是高加索人中肥胖症危险的重要的 遗传决定因子，并且女人比男人对围脂滴蛋白的遗传效应更敏感。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了评估高加索人血统个体 的肥胖症和肥胖症相关疾病的个体素因的方法。该方法包括确定从高 加索人血统个体得到的分离的核酸样品中PLIN多态性的基因型和单 元型，其中单元型PLIN5-2/PLIN6-2或PLIN5-1/PLIN6-2在所述核酸 样品中的存在表明该个体中患肥胖症和相关疾病的危险增加。优选 地，所述个体是女人。

在一个实施方案中，本发明提供了评估高加索人血统个体对心血 管疾病素因的方法，其中该方法包括确定从高加索人血统个体得到的 分离的核酸样品中PLIN多态性的基因型和单元型，其中单元型 PLIN5-2/PLIN6-2或PLIN5-1/PLIN6-2在所述核酸样品中的存在表明 患心血管疾病的危险增加。优选地，所述个体是女人。

备选地，在一个实施方案中，本发明提供了鉴定高加索人血统的 较不可能增重和节食后预计更好地保持减轻的体重的个体的方法。该 方法包括从个体分离核酸，确定PLIN基因座的基因型，其中PLIN5 和PLIN6的等位基因1的存在表明该个体中存在肥胖症保护性基因型 且表明该个体在节食后更可能不增重。优选地，所述个体是女人。

本发明还提供了用于诊断处于患肥胖症和/或肥胖症相关疾病， 包括，但不限于心血管疾病的危险中的高加索人血统个体的单元型。 这些单元型之一由基因座PLIN1、PLIN4、PLIN5和PLIN6中等位基因 组成。因此，单元型1111由所有上面鉴定的基因座的等位基因1组 成，且单元型22222由所有上面鉴定的基因座的等位基因2组成，其 中来自高加索人血统个体的核酸样品中单元型1122表明该个体对肥 胖症和/或心血管疾病更易感，并且其中具有单元型2111的高加索人 对患肥胖症和/或心血管疾病较不易感(见表15)。

本发明还提供了新的PLIN多态性和用于通过跨本发明的单核苷 酸多态性位点扩增来分析该新的PLIN多态性的寡核苷酸。本发明还 提供了用于对所述扩增的序列测序的寡核苷酸。

在一个实施方案中，用于扩增PLIN1、PLIN2、PLIN3、PLIN4、 PLIN5、和PLIN6的引物分别是SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：4和 5、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：10和11、SEQ ID NO：13和14 和SEQ ID NO：16和17中描述的核酸序列。

本发明还提供了下面的新的多态性：PLIN1：6209 T(等位基因 1)>6209 C(等位基因2)；PLIN3 10171(等位基因1)A>T(等 位基因2)；PLIN4：11482 G(等位基因1)>11482 A(等位基因2)； PLIN5：13041A>13041 G(等位基因2)和PLIN6：14995 A(等位基 因1)>14995T(等位基因2)。见下表。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了多态性，其是地中海人 个体中体重增加和/或心血管疾病的危险因素倾向。在一个实施方案 中，所述多态性是PLIN1的等位基因1(6209 T)。在另一实施方案 中，所述多态性是PLIN4的等位基因1(11482 G)。

在另一个实施方案中，本发明提供了多态性，其是高加索人血统 个体中体重增加和/或心血管疾病的危险因素倾向。当鉴定为PLIN基 因座中纯合子时，它们与体重增加的增加的危险有关。在一个实施方 案中，所述多态性是PLIN5的等位基因G(13041 G)。在另一实施方 案中，所述多态性是PLIN6的等位基因T(14995 T)。

在另一个实施方案中，本发明提供了多态性，其当作为纯合等位 基因存在时，是马来人或者印度人血统个体中体重增加和/或心血管 疾病的危险因素倾向。所述多态性是PLIN6(14995 T)基因座的等位 基因2，即PLIN6中T/T是危险因素。

在另一实施方案中，本发明提供了多态性，其是马来人血统个体 中体重增加和/或心血管疾病的危险因素倾向。在一个实施方案中， 所述多态性是PLIN5的等位基因2(13041 G)。在另一实施方案中， 所述多态性是PLIN4的等位基因2(11482 A)。

本发明还提供了用于鉴定较不易于患肥胖症和肥胖症相关疾病 的个体的诊断方法，其包括步骤：从个体得到核酸样品，分析所分离 的核酸，确定样品中所述等位基因变体的基因型和从该基因型产生单 元型。表15阐明了这样的单元型，其如果存在于所指出的人种群的 个体中，则表明该个体较不易于患肥胖症和肥胖症相关疾病.表15 中的单元型垂直阅读，例如，单元型(a)是PLIN5-A/PLIN6-A，而单 元型(h)是PLIN1-C/PLIN3-A/PLIN4-G/PLIN5A/PLIN6A.

本发明还提供了用于鉴定肥胖症和肥胖症相关疾病，如心血管疾 病的危险增加的个体的诊断方法。所述方法包括步骤：从个体得到核 酸样品，分析所分离的核酸，确定样品中所述等位基因变体的基因型 和从该基因型产生单元型。表16阐明了这样的单元型，其如果存在 于所指出的人种群的个体中，则表明该个体患肥胖症和肥胖症相关疾 病的危险增加。表16中的单元型垂直阅读，例如，单元型(k)是 PLIN5-G/PLIN6-T并且单元型(w)是PLIN1-T/PLIN3-A/PLIN4- A/PLIN5A/PLIN6T。

在另一实施方案中，本发明提供了鉴定处于患肥胖症和肥胖症相 关疾病，如心血管疾病危险中的女性的诊断方法，其包括步骤：从女 性个体得到核酸样品，使用用于跨多态性位点扩增的适宜的PLIN-PCR 引物扩增序列，检测所述样品中的等位基因变体，并分析结果。

用作分离本发明中核酸的来源材料的生物样品包括固体材料(例 如，组织、细胞沉淀物、活组织检查)和生物流体(例如，血液、唾液、 羊水、漱口水、尿)。本发明的核酸分子包括DNA和RNA并且可以使 用本领域公知的许多方法的任一种从特定生物样品分离，所选的所述 特定分离方法适于该特定生物样品。如上述分离和分析核酸变体的方 法是本领域技术人员公知的并且可以见例如Molecular Cloning：A Laboratory Manua l，3rd Ed.，Sambrook和Russel，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001。

使用如下技术可以从分离的核酸检测本发明的PLIN多态性，所 述技术包括直接分析所分离的核酸，如DNA印迹杂交(DNA)或者直接 核酸测序(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Ed.， Sambrook和Russel，Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001)。

根据本发明用于直接分析PLIN多态性的备选方法是测 定(Third Wave Technologies，Inc(Madison，WI))。该测定通常 基于多种酶的结构特异性核酸酶活性，所述酶用于切割依赖靶的切割 结构，从而表明样品中存在特定核酸序列或者其特定变异(见，例如， 美国专利号6,458,535)。

优选地，使用基于PCR的技术.PCR后，可以鉴定多态核酸，其 中使用例如用经标记的引物，如放射性或者荧光标记的引物进行的直 接测序；单链构象多态性分析(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)；和 化学切割分析，它们全部都例如在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Ed.，Sambrook和Russel，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001中详细解释。

优选使用易于自动化的方法，如用于引物延伸分析的不同方法分 析多态性。可以使用本领域技术人员已知的任意方法进行引物延伸分 析，所述方法包括PYROSEQUENCINGTM(Uppsala，瑞典)；质谱分析法， 包括MALDI-TOF，或者基质辅助激光解吸电离-飞行时间；基因组核酸 阵列(Shalon等人，Genome Research 6(7)：639-45，1996；Bernard 等人，Nucleic Acids Research24(8)：1435-42，1996)；固相微 型测序技术(美国专利号6,013,431，Suomalainen等人，Mol. Biotechnol.Jun；15(2)：123-31，2000)；离子对高效液相层析 (Doris等人，J.Chromatogr.A May 8；806(1)：47-60，1998)；和 5’核酸酶测定或者实时RT-PCR(Holland等人，Proc Natl Acad Sci USA 88：7276-7280，1991)，或者美国专利号6,355,433中描述的引物 延伸方法。核酸测序，例如使用任意自动化测序系统和标记引物或者 经标记的终止二脱氧核苷酸的核酸测序可以用于检测多态性.用于自 动化序列分析的系统包括，例如，Hitachi 和Hitachi II荧光扫描仪(Fluorescent Scanners)(Hitachi Genetic Systems，Alameda，CA)；SCE 9610全自动化96-毛细 管电泳遗传分析系统(Fully Automated 96-Capillary Electrophoresis Genetic Analysis System)(SpectruMedix LLC， State College，PA)；ABI 377 DNA测序仪；373 DNA测 序仪；ABI 310 Genetic Analyzer；ABI 3100 Genetic Analyzer；ABI 3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems， Headquarters，Foster City，CA)；Molecular Dynamics FluorImagerTM575和SI荧光扫描仪和Molecular Dynamics FluorImagerTM595荧光扫描仪(Amersham Biosciences UK Limited， Little Chalfont，Buckinghamshire，英国)；GenomyxSCTMDNA测序系 统(Genomyx Corporation(Foster City，Calif.)；Pharmacia ALFTM DNA测序仪和Pharmacia ALFexpressTM(Amersham Biosciences UK Limited，Little Chalfont，Buckinghamshire，英国)。

使用设计用于扩增和检测多态性PLIN核苷酸的引物可以在相同 的或者单独反应中进行一种核酸样品的PCR、核酸测序和引物延伸反 应。

在一个实施方案中，本发明提供了核酸芯片，其包括多态性 PLIN1、PLIN3、PLIN4、PLIN5和PLIN6等位基因，所述核酸芯片用 于筛选具有PLIN相关的肥胖症和/或肥胖症相关疾病，包括心血管疾 病的危险的个体，或者具有免于肥胖症和/或肥胖症相关疾病，如心 血管疾病的PLIN相关的保护的个体。此类芯片可以包括任一数目的 其他肥胖症相关的突变和多态性，包括但不限于苗条蛋白、苗条蛋白 受体、MC4R等。肥胖症相关基因和多态性的列表可以见例如Chagnon， Y.C.，Pérusse，L.，Weisnagel，S.J.，Rankinen，T.和Bouchard， C.The Human Obesity Gene Map：The 1999 Update.Obesity Research 8(1)：89-117，2000和网站http://www.obesity.chair.ulaval.ca/ genemap.html。

可用于阵列分析的方法和技术已描述于U.S.S.N 09/536,841、 WO00/58516、美国专利号412,087、6,147,205、6,262,216、 6,310,189、5,889,165和5,959,098、5,143,854、5,242,974、 5,252,743、5,324,633、5,384,261、5,405,783、5,424,186、 5,451,683、5,482,867、5,491,074、5,527,681、5,550,215、 5,571,639、5,578,832、5,593,839、5,599,695、5,624,711、 5,631,734、5,795,716、5,831,070、5,837,832、5,856,101、 5,858,659、5,936,324、5,968,740、5,974,164、5,981,185、 5,981,956、6,025,601、6,033,860、6,040,193、6,090,555、 6,136,269、6,269,846和6,428,752，PCT申请号PCT/US99/00730(国 际公开号WO99/36760)和PCT/US01/04285，将这些文献为了所有目的 完整引入本文作为参考。样品制备的其他方法和用于减小核酸样品的 复杂性的技术描述于例如，Dong等人，Genome Research 11，1418 (2001)，美国专利号6,361,947、6,391,592和美国专利申请号 09/916,135、09/920,491、09/910,292和10/013,598。

在芯片上进行多核苷酸杂交测定的方法在本领域中是成熟的。杂 交测定步骤和条件将取决于应用，并且根据一般结合方法选择，所述 一般结合方法已知包括如下文献中涉及的方法：Maniatis等人 Molecular Cloning：A Laboratory Manua l(2nd Ed.Cold Spring Harbor，N.Y，1989)；Berger和Kimmel Methods in Enzymology， Vol.152，Guide to Molecular Cloning Techniques(Academic Press， Inc.，San Diego，CA，1987)；Young和Davism，P.N.A.S，80：1194 (1983)。用于进行重复和受控制的杂交反应的方法和装置已经描述于 例如美国专利5,871,928、5,874,219、6,045,996和6,386,749、 6,391,623，将所述文献每一个都引入本文作为参考。

用于信号检测和强度数据处理的方法和装置的实例描述于例 如，美国专利号5,143,854、5,547,839、5,578,832、5,631,734、 5,800,992、5,834,758、5,856,092、5,902,723、5,936,324、 5,981,956、6,025,601、6,090,555、6,141,096、6,185,030、 6,201,639、6,218,803和6,225,625，美国专利申请60/364,731和 PCT申请PCT/US99/06097(公开为WO99/47964)，将所述文献为了所 有目的完整引入本文作为参考.

本发明的实践还可以使用常规生物学方法、软件和系统。本发明 的计算机软件产品通常包括计算机可读介质，其具有用于执行本发明 方法的逻辑步骤的计算机可执行指令.适宜的计算机可读介质包括软 盘、CD-ROM/DVD/DVD-ROM、硬盘驱动器、闪存(flash memory)、 ROM/RAM、磁带等等。所述计算机可执行的指令可以以适宜的计算机 语言或者几种语言的组合编写。基本计算生物学方法描述于例如， Setubal和Meidanis等人，Introduction to Computational Biol ogy Methods(PWS Publishing Company，Boston，1997)；Salzberg， Searles，Kasif，(Ed.)，Computational Methods in Molecular Biology，(Elsevier，Amsterdam，1998)；Rashidi和 Buehler，BioinformaticsBasics：Application in Biological Science and Medicine(CRC Press，London，2000)和Ouelette和 Bzevanis Bioinformatics：A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins(Wiley & Sons，Inc.，2nd ed.，2001).

本发明还利用多种计算机程序产品和软件用于多种目的，如探针 设计、数据管理、分析和仪器操作。见，例如，美国专利号5,593,839、 5,795,716、5,733,729、5,974,164、6,066,454、6,090,555、 6,185,561、6,188,783、6,223,127、6,229,911和6,308,170。

此外，本发明可以具有优选实施方案，其包括用于在网络如因特 网上提供遗传信息的方法。

本发明还提供了诊断试剂盒.在一个实施方案中，本发明提供了 试剂盒，其包含能够扩增包含本发明的肥胖症相关的多态核苷酸的 PLIN核酸区的一种或多种引物对；用于PCR反应的缓冲液和核苷酸 混合物；用于在相同或单独容器中进行PCR反应的适宜的酶，以及手 工限定PCR条件，例如，如下面实施例中所述的条件，以及列出本说 明书中描述的肥胖症相关等位基因和单元型的说明书。该试剂盒可以 还包含核酸探针，优选表1中所列探针，其为管中或者小瓶中的干燥 形式或者缓冲液形式.在优选实施方案中，这些引物为表1中所列引 物。引物还可以在试剂盒中以管或者小瓶中的干燥形式提供，或者备 选地，溶于适宜的水性缓冲液中。试剂盒还可以包含用于引物延伸方 法的引物，所述方法用于检测如上述的特定PLIN多态性。

试剂盒还优选包括列出多种人种群中的肥胖症危险单元型的 表，如本文所示的表15和16。

在一个实施方案中，试剂盒的组分是试剂盒的部分，其提供了本 领域技术人员已知的多种肥胖症相关的基因、多态性和突变。

DNA单元型，即几种多态性标记(例如，SNP)的相位决定的关联， 是比使用仅一种标记确定疾病关联在统计学上更有效的方法。确定或 者鉴定根据本发明的单元型的方法包括通过例如小鼠细胞系杂种物 理分离同源染色体，克隆到质粒和等位基因特异的PCR以及单元型的 计算法确定。

根据本发明，可以用于确定PLIN基因座中单元型SNP的方法包 括，但不限于，单链构象多态性(SSCP)分析(Orita等人(1989)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 86：2766-2770)、异源双链分析(Prior等 人(1995)Hum.Mutat.5：263-268)、寡核苷酸连接(Nickerson等 人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8923-8927)和杂交测定 法(Conner等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：278- 282)。基于常规Taq聚合酶PCR的策略，如PCR-RFLP，等位基因特 异的扩增(ASA)(Ruano和Kidd(1989)Nucleic Acids Res.17： 8392)，单分子稀释(SMD)(Ruano等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci. USA87：6296-6300)，和偶联的扩增和测序(CAS)(Ruano和Kidd (1991)Nuc leicAcids Res.19：6877-6882)是容易进行的并且对于 确定本发明的单元型是高度灵敏的方法(Michalatos-Beloin等人 (1996)Nucleic Acids Res.24：4841-4843；Barnes(1994)Proc. Natl.Acad.Sci.USA91：5695-5699；Ruano和Kidd(1991)Nucleic Acids Res.19：6877-6882)。

在一个实施方案中，用大尺度PCR(LR-PCR)确定本发明SNP的单 元型。使用本领域技术人员已知的基因型分析方法确定LR-PCR产物 的SNP基因型，并用数学方法推导单元型(例如，Clark算法(Clark (1990)Mol.Biol.Evol.7：111-122))。

在一个实施方案中，用于根据本发明的单元型分析方法是通过克 隆物理分离等位基因，然后测序。用于根据本发明的单元型分析的其 他方法包括，但不限于单等位基因突变分析(MAMA)(Papadopoulos等 人(1995)Nature Genet.11：99-102)和碳纳米管(nanotube)探针 (Woolley等人(2000)Nature Biotech.18：760-763)。美国专利申 请号US 2002/0081598也公开了有用的单元型分析方法，其包括使用 PCR扩增。

计算算法，如期望-最大化(EM)、减法和PHASE是单元型的统计 学估计的有用方法(见，例如，Clark，A.G.Inference of haplotypes from PCR-amplified samp les of diploid populations.Mol Biol Evol 7，111-22.(1990)；Stephens，M.，Smith，N.J.& Donnelly， P.A new statistical method for haplotype reconstruction from population data.Am J Hum Genet 68，978-89.(2001)；Templeton， A.R.，Sing，C.F.，Kessling，A.& Humphries，S.A cladistic analysis of pheno type associations with haplotypes inferred from restriction endonuclease mapping.II.The analysis of natural populations.Genetics 120，1145-54.(1988))。

所有上面讨论的方法都是有用的方法，其可以用于确定根据本发 明方法的单元型。

实施例

实施例1：PLIN多态性对来自西班牙的东部地中海海岸个体中肥 胖症相关变量的性别特异的作用

材料和方法

受试者和研究设计

该报告中总共包括1746名不相关的白种人受试者。该研究群体 包含随机选自西班牙的东部地中海海岸Valencia区的1589名个体 (样本1)和来自位于相同地理区的大学综合医院(University General Hospital)的157名肥胖受试者(样本2)。简言之，样本1 由788名男人和801名女人组成，他们的年龄为18-85岁，他们选自 参与目的在于确定地中海西班牙人群体中的遗传和环境心血管危险 因子的普遍性的研究的个体(14，15)。该样本包含使用不断更新的计 算机化人口注册随机选择的工人，以及从一般群体随机选择的受试者 (15，16)。所有这些受试者都在1999和2002年间检查。样本2由年 龄为18-78岁的29名男人和128名女人组成，他们随机选自Valeincia 的大学综合医院的内分泌科(Endocrinology Unit)，选自那些在2001 和2002年间持续进行体重减轻治疗的个体。该研究使用基线数据。 研究方案得到Valencia University和大学综合医院的伦理委员会的 批准。为所有包括的受试者提供了参加的知情同意并且检查了可利用 的PLIN基因型和其他变量的数据。样本1的受试者的平均年龄为 41.5±13.4岁，样本2的为47.0±13.7岁。在统计学分析中应用了横 断面方法以及病例对照方法.在病例对照方法中，将438名受试者 (157名来自医院，281名来自一般群体)在如果他们的体重指数 (BMI)≥30Kg/m2时分类为肥胖的。剩余的1308名来自一般群体的受 试者分类为不肥胖的。

人体测量和血压测量

使用标准技术进行人体测量：通过数字秤测量穿轻衣服的体重； 通过固定的测距仪测量不穿鞋的身高.BMI计算为体重(kg)/身高 (m2)。在水平平面中肋骨下缘和髂嵴间的中间位置测量腰围。在臀部 产生最大周长的点测量臀围。用校准的水银血压计按照WHO MONICA 方案测量血压，第一次和第五次Korotkoff声音的两次连续读数的平 均值分别用于收缩血压和舒张血压(SBP和DBP).

生物化学、临床和生活方式数据

指示参加者在早晨检查前禁食至少12小时。将静脉血收集到含 有BDTA的玻璃管中。通过Technicon Chem 1测定法(Technicon Instruments，Tarrytown，NY)确定血浆总胆固醇和TAG，用肝素-氯 化锰沉淀含有载脂蛋白B的脂蛋白后测量上清液中的高密度脂蛋白 胆固醇(HDL-C)。对于血清TAG浓度低于400mg/dL的样品，根据 Friedewald等人(17)的等式计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。用 己糖激酶试剂盒测量新鲜样品中的空腹葡萄糖。

通过如前报导的自身施用的问卷法评估关于性别、出生日期、种 族划分、婚姻状况、教育、医疗、健康问题、2型糖尿病史、吸烟、 酒精消费和身体活动的数据。(14)当前的吸烟者定义为每天吸至少一 支烟的个体。通过关于在工作日和周末使用酒精性饮料的一组22个 问题仔细评价酒精消费。从关于常规的空闲时间身体运动，以及每周 花费在每种活动的平均小时数的问题估计身体活动。根据类型和时 间，将受试者分类为久坐的(无体育运动)、中等的(一种运动小于3 小时/周)和高度的(一种运动大于3小时/周或者超过2种运动/周)。 然后将该变量二分为久坐的(无体育运动)和活动的(中等的加上高度 的)。将教育分为三类：初等、中等和大学[包括周期I(3年)和周期 II(5年或以上)](14，15)。

DNA提取和基因型分析

通过酚-氯仿提取和乙醇沉淀从白细胞分离基因组DNA。在该研 究中检查的6种单核苷酸多态性(SNP)的描述和名称在图1和表1中 给出。根据最近的推荐命名多态性(18)。参照序列为GI21431190 (GenBank)。用单核苷酸延伸实施基因型分析.首先，通过多重聚合 酶链反应(PCR)扩增包括4个多态性的DNA片段。所用的引物在表1 中给出.对于PLIN1、PLIN2、PLIN3、PLIN4、PLIN5和PLIN6，PCR 产物分别为422bp、391bp、318bp、350bp、190bp和469bp。在含有 0.2mmol/l每种dNTP、0.2μmol/l每种引物、3.0mmol/l氯化镁和 0.8U Qiagen Hotstar Taq聚合酶的10μl反应体积中进行PCR扩增。 PCR循环条件为95℃ 10分钟，然后是7个循环的95℃ 30秒、70℃ 30 秒和72℃ 1分钟，然后是41个循环的95℃ 30秒、65℃ 30秒和72℃ 1 分钟。在方案结束时包括72℃ 2分钟的最终延伸阶段.将PCR产物与 2.5U每种外切核酸酶I(New England Biolabs，Inc.Beverly，MA)和 小牛小肠磷酸酶(New Bngland Biolabs，Inc.Beverly，MA)在37℃ 温育60分钟以除去未掺入的dNTP和引物。然后在75℃温育15分钟 以灭活所述酶。

随后，用ABI Prism SnaPshot多重系统(Applied Biosystems， Foster City，CA)进行单核苷酸延伸。用于单核苷酸延伸的探针在表 1中列出。用PCR热循环仪在含有1.5μl Snapshot Ready Reaction Mastermix(Applied Biosystems，Foster City，CA)、1.0μl水和 1.5μl多重PCR产物和1.0μl探针混合物(对于PLIN1、PLIN2、PLIN3 和PLIN4为1.5μmol/l，和对于PLIN5和PLIN6为2.0μmol/l)的5μl 反应混合物中进行延伸反应。反应条件为35个循环的96℃30秒、50 ℃ 30秒和60℃ 30秒。将反应产物与3U小牛小肠磷酸酶在37℃温育 60分钟以除去未掺入的dNTP，然后在75℃温育15分钟以灭活酶。 用终产物在ABI Prism 3100遗传分析仪(Applied Biosystems， Foster City，CA)上使用Genotyper版本3.7(Applied Biosystems， Foster City，CA)进行基因型分析。

统计学分析

通过基因计数估计等位基因频率，并计算95％置信区间(CI)。 用χ2检验(Pearson，Fisher精确检验，或者Monte Carlo方法)测试 观察频率和期望频率之间的差异，从而假设Hardy-Weinberg平衡， 检验连锁不平衡，并检验百分数的差异。通过LINKAGE程序估计逐对 连锁不平衡系数.计算D和D’(D/Dmax)系数。通过EH程序估计单元 型，该程序使用期望-最大化算法得到单元型频率的最大似然估计。 检查所有连续变量的正态分布。对数转化甘油三酯以提高正态性。应 用参数检验以比较平均值。此外，当每个亚组中病例数非常小时，应 用非参数检验(Mann-Whitney或Kruskal-Wallis)。用对于分类项具 有虚变量的多变量线性回归分析检验遗传性变型和肥胖症相关表型 之间无关联的虚假设。这些统计学模型允许我们对于协变量进行调节 后估计遗传多态性与每个因变量(肥胖症相关的表型)的关联。主要协 变量是性别、年龄、BMI或者生活方式因素(吸烟、酒精消费、身体 活动和教育).从所述模型估计回归系数和每个预测值的调整平均 数。通过在更简约的线性回归模型中引入相互作用的对应项检验根据 性别或者遗传或者环境因素的等位基因效应的均匀性。用标准回归诊 断方法确保这些模型的适当性。在分类分析中，将肥胖症二分地定义 为BMI≥30kg/m2。拟合对数回归模型以估计危险：与野生型相比，与 每种遗传性变型的存在相关的肥胖症的优势比(OR)和95％置信区间 (CI)。还拟合有和没有相互作用项的多重对数回归模型以对协变量和 效应修饰因子的作用进行调整。使用用于windows的SPSS(版本10.0) 进行关联分析。

结果

鉴定新的多态性、频率和连锁不平衡

我们使用两种不同的策略来搜寻PLIN基因座上的多态性(图 1)。首先，我们对40名不相关受试者中PLIN基因的5’区测序以寻找 可能涉及PLIN基因的调节的常见突变。我们集中于在人和鼠序列之 间显著保守的那些区(21)。这些分析没有揭示所检查到的区中的任何 常见突变.我们的第二种方法是基于寻找一个公共SNP数据库中的常 见多态性(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi？locusId＝5346)。我们 基于下面的标准选择最初的靶：1)外显子中的SNP优于内含子中的 SNP；2)如果几个SNP在狭窄区中聚簇，那么仅选择它们之一。最初 选择了6种报导的SNP(表1)，它们的两种(PLIN2和PLIN3)不是多态 性的，并且我们的分析基于其他四种SNP(PLIN1、PLIN4、PLIN5和 PLIN6)。

表2显示了该研究中检查的1746名不相关受试者的人口统计、 生物化学和生活方式特征：1589名来自一般群体(样本1)，157名住 院的病态的肥胖症患者(样本2)。在样本1中，BMI的范围为16.2到 52.5Kg/m2，仅4％的受试者具有BMI≥35Kg/m2。在样本2中，BMI的 范围为30.1到79.1Kg/m2，其中88％的受试者具有BMI≥35Kg/m2。 群体样本1的PLIN基因型、等位基因频率和连锁不平衡系数在表3 中给出。基因型分布不与Hardy-Weinberg期望偏离。由于基因型分 布中性别的差异对于任一多态性都不显著，所以将男人和女人的数据 合并，并对整个样本估计等位基因频率和逐对连锁不平衡参数.PLIN5 基因座的等位基因2(G)在样本1中是最普遍的基因变体(等位基因频 率：0.385；95％CI0.368到0.402)；而PLIN4基因座的等位基因 2(A)是较不普遍的(等位基因频率：0.262；95％CI 0.247到0.278)。 在PLIN1多态性和PLIN4多态性之间发现最强的逐对连锁不平衡 (D’：0.958；p<0.001)。在其他多态性间观察到的阳性连锁不平衡尽 管是统计学显著的，但是低得多，D’系数为0.453到0.149(表3)。 样本2中PLIN多态性之间的普遍性和连锁不平衡不与样本1不同。 同样地，样本2中基因型分布在男人和女人间没有不同。样本2中 PLIN1、PLIN4、PLIN5和PLIN6多态性的较不常见的等位基因频率分 别为0.37(0.32-0.43)；0.24(0.19-0.29)；0.40(0.35-0.46)和 0.38(0.33-0.46)。然而，该组的小样本大小很大程度上影响了这些 估计的随机误差。从而，仅从样本1中所有确定基因型的个体估计单 元型(表4)。估计所有16种可能的四种多态性单元型都存在于该地 中海人群体中。由每种多态性的频率最高的等位基因组成的单元型 ((“6209T/11482G/13041A/14995A”，还称作“1111”)是最普遍的，具 有0.388的相对频率。在15种剩余的单元型中，仅4种具有高于0.08 的等位基因频率，包括由每种多态性的频率最小的等位基因组成的单 元型(“6209C/11482A/13041G/14995T”，也称作“2222”)。

PLIN多态性和肥胖症相关表型之间的关联。单一多态性基因型 分析

我们接着检查PLIN多态性和肥胖症相关变量之间的关联。考虑 到样本1和样本2之间临床差异和生活方式差异，对来自一般群体的 受试者和肥胖症患者单独进行关联分析。为了增加统计检测能力，并 且在证实与显性或至少共显性遗传模型相容的等位基因效应的存在 后，将个体分类为对每一多态性的最常见等位基因的纯合子或者较不 常见等位基因的携带者(1/2+2/2)。

样本1中的关联

首先，我们评估了性别产生的遗传效应的均匀性并证明了几种重 要的相互作用。因此，我们单独分析每种性别.表5显示了根据四种 PLIN多态性每一种内等位基因2变体的携带者状态，来自样本1男 人中BMI和其他肥胖症相关变量的年龄调节的平均值.我们没有发现 基因型组之间关于BMI、体重、腰-臀比、葡萄糖、总胆固醇、HDL-C、 LDL-C、TAGs和血压的显著差异。然而，我们发现在来自样本1的女 人中对于PLIN1和PLIN4多态性的基因型之间BMI显著不同，其中等 位基因2与较低的BMI相关(表6)。对于PLIN1多态性，BMI的平均 值为1/1纯合子中26.3±0.3Kg/m2，相对于携带等位基因2的女人中 为25.3±0.2Kg/m2(p＝0.004)；对于PLIN4多态性，BMI的平均值为1/1 纯合子中26.1±0.2Kg/m2，相对于等位基因2携带者中为 25.2±0.3Kg/m2(p＝0.004)。同样地，PLIN1基因座上等位基因2的携 带者的体重显著小于(p＝0.007)野生型基因型纯合的女人。对于在 PLIN4基因座频率较低的等位基因的携带者也是这样(p＝0.01)。此 外，与1/1纯合子相比，PLIN4多态性的等位基因2的女人携带者显 现出较低的腰-臀比(p＝0.032)，较低的空腹葡萄糖(p＝0.008)和较低 的血浆TAG浓度(p＝0.005)。对于PLIN1多态性发现相似的差异，其 中空腹葡萄糖的边界线P值为0.090，且TAG的为0.099。两种 SNP(PLIN1和PLIN4)表现出决定BMI和体重的显著的基因-性别相互 作用.此外，对于PLIN4多态性，我们发现决定腰-臀比(p＝0.023)和 TAGs(p＝0.009)的显著的基因*性别相互作用。对于PLIN5多态性和 PLIN6多态性都没有检测到显著的基因*性别相互作用。

每种多态性的等位基因2的携带者和非携带者对于男人和女人 中吸烟、酒精消费、教育、身体活动和糖尿病都没有显著差异(结果 未显示)。因此，对PLIN1和PLIN4多态性发现的差异甚至在对于这 些潜在混淆因素(confounder)调节后也保持统计学显著性(对于 PLIN1多态性，对于BMI和体重，p＝0.012和p＝0.020；对于PLIN4 多态性，对于BMI、体重、腰-臀比、葡萄糖和TAG分别为p＝0.014， p＝0.029，p＝0.046，p＝0.003和p＝0.042)。对BMI和药疗法的额外 调节没有改变空腹葡萄糖和血浆脂质和PLIN4基因型之间关联的显 著性[非携带者中为116.4±1.3mg/dL，相对于等位基因2的携带者 中为113.7±1.7mg/dL(p＝0.010)]。然而，TAG浓度中的差异不是统 计学上显著的(p＝0.327)。

样本2中的关联

当我们在病态肥胖症受试者组(样本2)中进行相似的关联分析 时，在男人和女人中都检测到与PLIN1和PLIN4多态性中等位基因2 相关的BMI的减小。该减小在携带PLIN4多态性中等位基因2的男人 中更高并且是统计学上显著的。与在来自一般群体的男人中观察到的 结果相反，在主要是病态肥胖男人的该组中，PLIN SNP与BMI中的 显著差异相关。从而，对于PLIN4，在非携带者中，BMI的年龄调节 的平均值为45.9±1.9Kg/m2，相对于在2等位基因的男人携带者中 BMI的年龄调节的平均值为35.6±1.3Kg/m2(p＝0.001)。同样地，在非 携带者中，体重的调节的平均值为141.3±6.0Kg，相对于在2等位 基因的携带者中为107.9±6.3Kg(p＝0.001)。尽管病例数目小，但肥 胖男人中这些结果是一致的并且在参数以及非参数检验中是统计学 上显著的。在来自样本2的肥胖女人中，在PLIN4多态性的等位基因 2的携带者中观察到的BMI和体重降低类似于来自一般群体的女人中 观察到的结果，然而，因为该组中女人数较低，所以该差异没有达到 统计学显著性[年龄调节的平均值为：PLIN4SNP的等位基因2的非 携带者相对于携带者中分别为43.1±0.9Kg/m2相对于 41.1±6.3Kg/m2(p＝0.199)和108.2±2.1Kg相对于102.4±2.9 Kg(p＝0.112)]。吸烟、酒精消费、教育、身体活动和糖尿病的进一步 多变量调节不影响这些结果的统计学显著性。尽管BMI的降低与这些 肥胖受试者中等位基因2有关，但是TAG浓度不就基因型而言显著不 同。此外，在这些受试者中，PLIN4多态性的等位基因2的携带者比 非携带者显示出更高的血浆葡萄糖浓度。该影响在男人和女人中都注 意到，并且与来自一般群体受试者中的相同等位基因所观察到的不 同。从而，在来自样本2的男人中，在PLIN42等位基因的非携带者 相对于携带者中，血浆空腹葡萄糖浓度为94.5±7.9mg/dL相对于 117.1±7.7mg/dL(相互作用的P：PLIN4*肥胖＝0.028)，而在来自样 本1的男人中，没有注意到差异。相反地，在来自一般群体的女人中， 发现与等位基因2相关的血浆葡萄糖的降低，而在来自样本2的女人 中，观察到血浆葡萄糖浓度的增加(PLIN4 2等位基因的非携带者相 对于携带者中分别为102.4±3.5mg/dL相对于108.2±3.9mg/dL)。 在测定空腹葡萄糖浓度中，关于肥胖症的PLIN1、PLIN5和PLIN6多 态性也得到了统计学显著的相互作用项。

PLIN单元型与代谢综合征相关变量的关联

我们还评价了PLIN单元型对与代谢综合征危险相关的几个变量 (BMI、TAG和空腹葡萄糖)的影响。16种可能的单元型的11种以非常 低的相对频率(低于5％)发生。因此，我们使用了假单元型方法，通 过比较最常见单元型的纯合性的影响与基因型的所选组合的影响来 进行，这取决于它们的频率和所进行的特定关联分析。首先通过在多 元回归模型中包括这些变量作为对照因子，对于其他多态性的相应混 杂影响调节来自表5和6中的结果。考虑到PLIN1和PLIN4之间更高 的关联，不相互同时调节这些变量以便避免多重共线性偏倚。从而， 对于PLIN5和PLIN6多态性调节PLIN1和PLIN4关联，对于PLIN4 和PLIN6调节PLIN5，和对于PLIN4和PLIN5调节PLIN6.女人中PLIN1 多态性和BMI之间的关联在这些调节后保持统计学显著性 (p＝0.002)。此外，女人中PLIN1多态性与空腹葡萄糖的边界线统计 学显著关联在对于PLIN6多态性调节后达到统计学显著性 (p＝0.032)，且甘油三酯的P值在对于PLIN5(p＝0.056)和PLIN6 (p＝0.085)调节后稍微下降。同样地，对于PLIN5和PLIN6多态性调 节后，女人中PLIN4多态性的独立效果得到证实，并且前面在表6 中报导的关联在这些调节后保持统计学上显著的(同时对于PLIN5 和PLIN6调节后，BMI、空腹葡萄糖和TAG分别为p＝0.023；p＝0.015； p＝0.035)。在男人中，当表5中的结果对于额外的遗传性变型调节 后没有检测到显著改变。

我们还研究了PLIN1和PLIN4和相关变量之间的潜在协同关联。 将来自样本1的受试者分成三类：1)在PLIN1和PLIN4 SNP对等位基 因1都纯合；2)PLIN1或PLIN4的2等位基因的携带者，和3)PLIN1 和PLIN4等位基因2的携带者。图2显示了根据来自样本1的女人中 组合的基因型，BMI的年龄调节的平均值。此外，对于PLIN5和PLIN6 SNP调节模型。所组合的两种SNP变量与BMI显著关联(p＝0.007)， 其中来自最常见的单元型“11”的女人纯合子比携带PLIN1和PLIN4 SNP的至少一个等位基因2的女人(25.1±0.3Kg/m2)显示出更高的 BMI(26.3±0.3Kg/m2；p＝0.002).PLIN1或者PLIN4 SNPs的至少一 个2等位基因的携带者具有中间BMI表型。我们还发现组合的SNP变 量和TAG之间的统计学显著关联(p＝0.020)以及和葡萄糖之间的统计 学显著关联(p＝0.040)，对于具有最高浓度的最常见的单元型是纯合 的。

当对PLIN5和PLIN6多态性进行该组合的基因型分析时，在对 PLIN1和PLIN4的额外调整后，没有检测到来自样本1的男人或女人 中该单元型变量和任何肥胖症相关参数之间的关联。图3显示了根据 女人(样本1)中组合的基因型，BMI的年龄调节的平均值。尽管不是 显著的，但是频率最高单元型的纯合携带者与其他单元型相比具有最 低的BMI值。

我们使用所有四种多态性进行了类似分析。为此，我们考虑了四 个组：1)最常见等位基因纯合的受试者-单元型“1111”；2)PLIN1和 PLIN4的最常见等位基因的纯合子和PLIN5和PLIN6处等位基因2的 携带者；3)PLIN1和PLIN4处等位基因2的携带者和PLIN5和PLIN6 处最常见等位基因的纯合子；4)PLIN1、PLIN4和PLIN5和PLIN6处2 等位基因的携带者。在这些分析中不包括携带任何其他基因型组合的 受试者。为了增加统计检测能力，合并来自样本1和样本2的个体并 一起分析。图7显示了根据合并的基因型，男人和女人中体重和BMI 的年龄调节的平均值。在女人中，发现合并的基因型变量和体重与 BMI之间高度统计学显著的关联，其中PLIN1和PLIN4基因座上等位 基因2的携带者和PLIN5和PLIN6上最常见等位基因的纯合子显示出 最低值。在男人中，我们没有发现遗传组和BMI或者体重之间的任何 显著关联。

与PLIN基因变异相关的肥胖症危险

最后，为了估计与PLIN变体相关的肥胖症的危险，将来自样本1 和样本2的受试者合并，并根据BMI分类细分：非肥胖受试者(BMI<30 kg/m2)，和肥胖的(BMI≥30kg/m2)。在男人中，没有检测到肥胖和非 肥胖之间任何PLIN多态性普遍性中的显著差异。然而，在女人中， 对于PLIN1多态性，检测到与非肥胖受试者相比，肥胖受试者中携带 等位基因2的受试者的较低的普遍性(50.2％相对于60.4％； p＝0.004)。因为肥胖和非肥胖受试者年龄不同，所以在对数回归模型 中，对年龄调整危险估计(OR)。该调整后，携带PLIN1多态性处等位 基因2的女人与非携带者相比具有较低危险的肥胖症：OR：0.65；95％ CI，0.48到0.88。同样地，携带PLIN4多态性处等位基因2的女人 的普遍性在肥胖组中低于非肥胖组(32.5％对45.2％；p<0.001)。 对年龄调整后，PLIN4基因座上等位基因2始终与女人中肥胖症的较 低危险关联，OR：0.60；95％CI，0.44到0.83。此外，对吸烟、酒 精消费、身体活动、糖尿病和教育调整后，这些估计保持统计学显著 性。在两种多态性组合的基因型分析中并且在对年龄调整后，携带 PLIN1和PLIN4SNP上等位基因2的女人具有较低的肥胖症危险(与 最常见等位基因的纯合子相比，(OR：0.56；95％CI 0.39到 0.79；p＝0.001)，而在PLIN1或者PLIN4基因座上仅一个等位基因2 的携带者与最常见等位基因纯合子相比没有显示出肥胖症危险的统 计学显著差异(OR：0.95；95％CI：0.63到1.43)。这些结果在对 于PLIN5和PLIN6多态性进一步调整后没有改变.对于PLIN5和PLIN6 基因座，在单一多态性分析和组合的基因型分析中都没有发现与肥胖 症危险相关的统计学显著关联.

讨论

使用实验模型进行的研究已经证明围脂滴蛋白通过调节基础脂 解作用和激素刺激的脂解作用在脂肪细胞中的TAG存储中起重要作 用(7；11，12)。我们已经研究了在高加索人个体的样本中四种常见的 新的PLIN多态性与肥胖症、脂质代谢和胰岛素敏感性的量度的关 联，并且我们已经首次证明在人PLIN基因座上的变异总是与肥胖症 相关变量有关，从而提示围脂滴蛋白可能在人肥胖症、高甘油三酯血 症和可能对代谢综合征的发展起相关作用。此外，我们已发现在一般 群体中，多数关联是性别特异的，主要影响女人。

PLIN多态性和肥胖症相关表型之间的关联。单一多态性基因型 分析。

在我们的分析中，我们应用病例对照和横断面方法研究PLIN多 态性和肥胖症相关量度之间的关联。在包括来自一般群体的肥胖受试 者和住院肥胖患者的病例-对照设计中，并且在对年龄和其他潜在混 杂因素调节后，我们已经发现了携带PLIN1多态性的等位基因2的女 人中一致并且统计学显著的更低肥胖症危险。在PLIN4 SNP但是不在 PLIN5或PLIN6多态性的等位基因2发现了该关联.PLIN1和PLIN4 之间的强烈连锁不平衡(D′>0.9)和它们与其他两种SNP的较低连锁 支持这些结果。此外，在女人中看到的与PLIN1和PLIN4SNP的较不 常见等位基因相关的肥胖症的较低危险与对围脂滴蛋白无效小鼠的 发现平行，从而将围脂滴蛋白的消除与瘦表型联系起来(11，13).此 外，PLIN基因的灭活也保护Lepr(db/db)小鼠免于患肥胖症， Lepr(db/db)小鼠是苗条蛋白抗性导致的肥胖症的遗传模型(13)。来 自一般群体的男人中显著关联的缺乏强调了性激素因子在调节人中 体重和脂肪分布中的重要性。

在来自一般群体的样本中，PLIN1和PLIN4SNP的较不常见等位 基因的女人携带者比对最常见等位基因纯合的女人具有统计学显著 更低的BMI。此外，我们发现PLIN4SNP的较不常见等位基因的女人 携带者具有显著较低的血浆葡萄糖和TAG浓度。此外，PLIN4多态性 也与女人中降低的腰-臀比关联，提示对腹部(内脏)脂肪库的更大的 作用。该发现尤其重要，因为腹部(内脏)脂肪与代谢综合征：葡萄糖 耐受不良、脂质异常血症、胰岛素抵抗、高血压以及心血管疾病和2 型糖尿病高度关联(19)。此外，该相同等位基因也与较低的空腹葡萄 糖水平关联。在这些系中，我们的研究的一个有趣发现是在确定血浆 葡萄糖浓度中PLIN1多态性和肥胖症之间一致并且统计学显著的相 互作用。相反，在来自一般群体的男人中没有观察到显著关联。

在来自样本2的肥胖女人中，尽管PLIN4 SNP的等位基因2与较 低BMI之间的一致关联性，但是该等位基因与更高的血浆葡萄糖浓度 关联。然而，这些结果与Tansey等人(11)在围脂滴蛋白敲除小鼠中 的观察一致并且与Martinez-Botas等人(13)的发现一致。从脂肪组 织释放的脂肪酸参与2型糖尿病的发展，人们可以预期Peri无效小 鼠对胰岛素抵抗敏感。Martinez-Botas等人(13)不能检测到他们的 Peri无效动物中的葡萄糖耐受不良，并且Tansey等人(11)的更详 细的研究在体重小于30g的动物中重复了Martinez-Botas等人(13) 的发现。然而，在动物超过30g时，与野生型相比，在Peri无效小 鼠中产生显著的葡萄糖耐受不良。这与如下观点一致：一旦个体变得 肥胖，保护免于肥胖症的围脂滴蛋白可以导致更有害的表型。此外， 尽管在来自一般群体的男人中，没有发现PLIN等位基因对血浆空腹 葡萄糖的作用，但是在肥胖男人中，等位基因2也与更高的葡萄糖浓 度有关，进一步证明了肥胖症-相互作用假说的影响。涉及肥胖症和 PLIN SNPs之间相互作用的另一有趣的发现涉及PLIN4基因座上等位 基因2与来自样本2的男人中较低BMI的关联。这些发现与该等位基 因在女人中的作用一致，并且引起了如下假说：需要肥胖男人中特异 的更高的肥胖症或者一些未检测到的环境因素来引发PLIN等位基因 的作用。

这些关联的生物学基础还不清楚.在我们的研究中检查的多态性 没有一种是功能性的。PLIN1和PLIN4两者都是内含子突变。PLIN5 是外显子8中的沉默突变，且PLIN6位于外显子9的非翻译区。这些 突变都不修饰蛋白质结构并且，通常，还没有考虑它们具有调节功 能。然而，一些证据表明内含子多态性还可以通过影响核因子的结合 调节基因表达(20)。围脂滴蛋白是脂肪细胞中包被脂质小滴表面的最 丰富的蛋白质(4-6)。最近的报导后，它们的生理学关联已经变得明 显，所述报导表明PLIN无效的小鼠与野生型小鼠相比具有显著降低 的脂肪存储和它们的分离的脂肪细胞中增加的基础脂解作用(11， 13)。基于这些数据，我们的发现的可能解释是PLIN1和PLIN4多态 性可能与PLIN基因的较低表达或受损的围脂滴蛋白活性有关。备选 假说是这些多态性直接涉及或参与具有改变mRNA剪接的突变的LD。 PLIN4、PLIN5和PLIN6都与受到可变剪接的区域接近(见图1)。所有 围脂滴蛋白共有相同的22-kDa氨基酸末端，它们具有不同长度的不 同羧基末端序列(21)。PLIN基因的两种主要的剪接变体围脂滴蛋白A 和围脂滴蛋白B显示出对PKA激活的不同应答，并且可能发挥对脂解 作用的不同保护。这些剪接变体之间的结构差异，特别是影响小滴表 面包裹的C末端尾的长度可以确定它们的功能.

PLIN基因型的性别特异性作用与脂肪组织的发育和分布，以及 肥胖症相关疾病危险中的性别特异的差异一致。脂解能力，即脂肪组 织积累的最重要决定因素之一，也表明是性别依赖性的(22，23).当 前数据不能确定性激素是否可以修饰PLIN基因的作用，并且当前没 有可利用的数据来解释性激素和围脂滴蛋白功能之间的相互作用。我 们假设雌激素可以通过需要阐明的未知机理扩大PLIN变体的保护效 果，而睾酮对PLIN变体的保护效果没有作用或者使该效果最小化。

PLIN多态性和肥胖症相关表型之间的关联

单元型分析

我们的数据表明携带PLIN1和PLIN4 SNP上等位基因2的女人中 较低的肥胖症危险，提示这些SNP可能以加性或者协同方式作用。复 杂性状易感性通常受到基因内几种不同变体的组合作用的控制。因 此，我们提出这些标记的生物学效应是相关的但是它们不与相同功能 突变关联.

PLIN5和PLIN6 SNPs分别都不与BMI和其他肥胖症相关的量度 有关。然而，单元型分析揭示了更有趣的画面。我们发现携带PLIN1 和PLIN4但不是PLIN5和PLIN6的变体等位基因的女人显示出最低的 体重和BMI(62.9Kg和24.8kg/m2)。相反地，不存在PLIN1和PLIN4 的较不常见等位基因时PLIN5和PLIN6的变体等位基因的存在与最高 的体重和BMI(72.2.Kg和28.7Kg/m2)关联，这是在相反单元型之间 约15％的生物学显著差异。

总之，我们的研究首次报导人类中PLIN基因型和肥胖症相关量 度之间的关联。这与来自连锁分析的最近发现以及来自动物模型的不 断出现的数据一致。留待探索的相关问题涉及这些SNP和饮食因素之 间的潜在相关作用。考虑到围脂滴蛋白表达和脂肪酸代谢之间的关 系，这是有关的(24)。

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实施例II：来自美国的白人群体中围脂滴蛋白(PLIN)基因单元 型与肥胖症危险的性别特异的关联

材料和方法

受试者和研究设计

该研究中包括参与居住生活方式介入计划(The Pritikin Longevity Center，Santa Monica，CA)(19)的共734名白人受试者， 373名男性(平均年龄58.6岁)和361名女性(平均年龄56.1岁)。在 该群体中，报导的当前吸烟者为受试者的10.2％，且酒精消费者(每 周>1次饮用)为受试者的46.8％。药疗法使用如下：10.1％服用降血糖 药，16.1％服用降胆固醇药，14.9％进行甲状腺药疗法，且35.7％的 女性受试者进行激素替代疗法。由于在DNA可用性中的限制，从706 名受试者成功地得到了PLIN6209T>C和13041A>G的基因型， 以及从705名受试者得到了PLIN 11482G>A和14995A>T基因型。 将肥胖症定义为BMI≥30kg/m2。在具有或者没有基因型信息的个体 之间人体测量和生物化学测量中无显著差异。

生物化学测量

从进入该计划的所有受试者抽取空腹血样(基线)。将血样置于含 有SST血块激活凝胶(Becton-Dickinson vacutainer system)的管中 用于脂质和葡萄糖测量，或者置于含有0.1％EDTA的管中用于载脂蛋 白测量。允许用于脂质和葡萄糖测量的样品凝结并通过以2500rpm离 心15分钟分离血清。通过标准自动化酶促方法(Smith-Kline Beecham Laboratories)测量总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、 甘油三酯(TG)和葡萄糖水平，而如前面描述的(20)计算低密度脂蛋 白胆固醇(LDL-C)。

DNA分离和基因型分析

使用QIA amp Blood Kit(Qiagen)从全血分离基因组DNA。首先， 通过多重聚合酶链反应(PCR)扩增含有靶SNP的DNA片段。所用引物 在表1中显示。在含有0.2mmol/l每种dNTP、0.2μmol/l每种引物、 3.0mmol/l氯化镁和0.8U Qi agen Hotstar Taq聚合酶的10μl反应 体积中进行PCR反应。PCR循环条件为95℃ 10分钟，然后是7个循 环的95℃ 30秒、70℃ 30秒和72℃ 1分钟，然后是41个循环的95℃ 30秒、65℃ 30秒和72℃ 1分钟.在该方案结束时包括72℃ 5分钟的 最终延伸阶段。将PCR产物与2.5U每种外切核酸酶I(New England Biolabs.，Inc.Beverly，MA)和小牛小肠磷酸酶(New Bngland Biolabs.，Inc.Beverly，MA)在37℃温育60分钟以除去未掺入的 dNTP和引物，然后在75℃温育15分钟来灭活所述酶。随后使用ABI Prism SnaPshot系统(Applied Biosystems，FosterCity，CA)进行 单核苷酸延伸。所用探针在表1中给出。

用于延伸反应的反应混合物含有1.5μl Snapshot Ready Reaction Mastermix(Applied Biosystems，Foster City，CA)， 1.0μl水和1.5μl多重PCR产物和1.0μl探针混合物(每种探针 2μmol/l).反应条件为35个循环的96℃ 30秒、50℃ 30秒和60℃ 30 秒。将产物与3U小牛小肠磷酸酶在37℃温育60分钟以除去未掺入 的dNTP，然后在75℃温育15分钟以灭活酶.最后，用ABI Prism 3100 遗传分析仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)使用Genotyper 版本3.7(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行基因型分 析。

统计学分析

用多变量线性回归分析检验遗传性变型和表型结果之间无关联 的虚假设，所述表型结果对于协变量(年龄、BMI、吸烟、酒精消费和 药疗法状态)进行了调节。用ANCOVA(Tukey检验)比较基因型组之间 的表型结果，其中对协变量进行多重调节。最后根据所观察到的等位 基因作用使用加性遗传模型(基于每个多态性位点变异等位基因的数 目分组)。通过向该模型中引入对应的乘积项检验性别和PLIN基因型 之间的相互作用.用SAS8.0统计包进行假设检验。认为统计学P值 小于0.05是显著性边界。将空腹葡萄糖和甘油三酯对数地转化成正 态分布后进行统计学检验.用THESIAS程序计算等位基因频率，以检 验逐对连锁不平衡(LD)，和推导单元型。该计算机程序是基于 Tregouet等人(21)描述的最大似然模型。对上述协变量进行多重调 节后，检查单元型与肥胖症危险的关联.

结果

通过对40名不相关受试者中人与小鼠之间保守区的再次测序并 通过检索公共SNP数据库之一(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/ snp_ref.cgi？locusId＝5346)进行PLIN基因座上常见多态性的鉴 定。鉴定了4种常见多态性PLIN 6209T>C、11482G>A、13041A> G和14995A>T并选择用于该研究.这些SNP的编号反映了它们与 PLIN的起始甲硫氨酸密码子ATG的A的相对位置，将所述A编号为“+ 1”(在参考序列上的157157位，检索号GI21431190).基因型分布没 有偏离Hardy-Weinberg期望。所检查的SNP的次要等位基因频率对 于6209T为0.453，对于11482A为0.299，对于13041 G为0.336， 对于14995T为0.360。逐对连锁不平衡(LD)的检查表明PLIN 6209T> C和11482G>A两者都存在于强LD中(D’＝0.92，P<0.001)。在这 些SNP和13041A>G SNP之间没有检测到显著LD(对于6209T> C/13041A>G对，D′＝0.04，P＝0.224，对于11482G>A/13041A>G 对，D′＝0.05，P＝0.110)。最后，如图5中所示，PLIN 14995A>T显 示出不同水平的LD。

对于结果变量，我们发现了PLIN基因型和性别之间的显著相互 作用。因此，我们对男人和女人单独进行分析。首先，我们检查了对 于每种SNP的等位基因和体脂肪量度的关联，所述体脂肪量度包括 BMI、百分数体脂肪和腰围.在女人中，我们发现了百分数体脂肪和 腰围中的显著等位基因差异。对于PLIN 13041A>G，AA、AG和GG 组的平均百分数体脂肪值分别为30.6％，、32.7％和33.3％ (P＝0.0166)。对平均腰围观察到相似的关联：AA、AG和GG受试者分 别为95.1；96.9；和105.1cm(P＝0.020)。我们对PLIN 14995A>T SNP观察到相似的关联。AA、AT和TT受试者中平均百分数体脂肪为 30.5％、32.5％和33.7％(P＝0.0104)；平均腰围分别为95.7、98.9和 102.6cm(P＝0.0453)。在PLIN 13041A>G携带G/A和G/G基因型 的受试者具有比AA受试者高1.25kg/m2和1.60kg/m2的BMI值。 类似地，对于PLIN 14995A>T SNP，AT和TT受试者具有比AA受试 者高0.87kg/m2和2.32kg/m2的BMI(图6)。在女性中PLIN 6209T >C和PLIN 11482G>A基因型和体脂肪量度之间没有发现显著关联。 在男人中，对于所检查的任一种变量没有显著基因型相关差异(数据 未显示)。

我们还检查了PLIN变异和肥胖症危险之间的关联。我们推断了 来自4种SNP的单元型并使用这些组用于进一步的危险分析。在SNP 13041和/或14995含有次要等位基因的单元型倾向于具有增加的肥 胖症危险，而在6209和/或11482含有次要等位基因的单元型倾向在 女人中具有减小的肥胖症危险。它们中，如前文所述对于协变量进行 调节后，单元型T/G/G/T与最高的肥胖症危险有关(OR＝2.09，95％CI 0.83-5.23)，单元型C/G/A/A与最高的肥胖症保护有关(OR＝0.58，95％ CI 0.25-1.34)(表2)。然而，这些关联由于样本大小的限制都没有 达到统计学显著性。为了提高研究检测能力，我们还基于6209T> C/11482G>A或13041A>G/14995A>T单元型分析了单元型关联。 我们没有发现从男人和女人中6209T>C/11482G>A推论的单元型 之间的任何显著关联。当检查从13041A>G/14995A>T推论的单元 型时，与女人中单元型A/A相比，单元型A/T(OR＝1.76，95％CI  1.07-2.90)和单元型G/T(OR＝1.73，95％CI 1.06-2.82)都与肥胖 症的增加的危险显著相关(表8)。我们没有发现13041A>G/14995A> T单元型和男人中肥胖症危险之间的显著关联。

因为体脂肪和能量稳态之间的紧密关系，所以我们分析了PLIN 基因型和与能量稳态相关的一些代谢量度之间的关联。在女性受试者 中，尽管与增加的体脂肪相关，但是PLIN 13041A>G和14995A>T 不与所检查的代谢量度显著关联(表9)。相反，PLIN 6209T>C和 11482G>A与LDL-C水平关联(对于PLIN6209T>C，P＝0.007，对 于PLIN 11482G>A，P＝0.028，表9)。此外，PLIN 11482G>A也 与TC水平关联，具有微小的显著性(P＝0.068)。不像PLIN 13041A> G/14995A>T显示的对体脂肪的加性等位基因作用，仅仅具有PLIN 6209T>C/11482G>A纯合变异的携带者倾向于具有更高的LDL-C和 /或TC，而其他基因型的携带者在这些量度中具有相当的水平。在男 性中，我们发现携带PLIN 13041G的研究受试者与携带野生型纯合子 的受试者相比具有较低的TC和LDL-C水平。注意到此类关联都是微 小的(对于TC，P＝0.051，对于LDL-C，P＝0.049)。此外，还观察到 PLIN13041A>G和HDL-C水平之间的微小关联(P＝0.047)。然而， 似乎LDL-C水平的主要差异在GA组和AA组之间。PLIN 6209T>C、 11482G>A和14995A>T的基因型不与男人中检查的任何代谢量度 有关(表10)。

讨论

自从首次在20世纪90年代早期报导后，围脂滴蛋白正成为脂肪 细胞中的脂解作用和体脂肪积累中的关键调节物(14-17，22-24)。最 近，PLIN基因座上的遗传变异与人脂肪细胞中降低的围脂滴蛋白含 量和增加的脂解活性有关(18)，支持了PLIN作为一般群体中肥胖症 的候选基因的角色.在本研究中，我们检查了具有升高的平均BMI的 白人群体中PLIN基因座上的变异性与人体测量变量和代谢变量之间 的关联。在该群体中鉴定和确定基因型的4种常见SNP中，我们发现 位于3’非翻译区的两种SNP(PLIN 13041A>G和14995A>T)与增加 的百分数体脂肪和腰围显著关联，并且与女性受试者中增加的BMI微 小关联。此外，使用PLIN 13041A>G和14995A>T SNPs对推论 的单元型的分析证明A/T和G/T单元型的肥胖症危险增加。相反地， 在男性中，PLIN多态性不与体脂肪的任何测量的参数显著关联。

围脂滴蛋白主要在脂肪细胞和sterogenic细胞中表达。因为它 们在脂肪库中的物理定位，所以已经检查了围脂滴蛋白在调节脂肪贮 备的动员和体脂肪积累中的作用，并且几种体外研究支持该观点 (13，23，25)。这些作用的其他体内证据来自敲除小鼠模型(15，16)。 我们关于人PLIN基因变体的当前发现也与来自实验模型的结果一 致，提示围脂滴蛋白在不同物种间脂解作用中的保守作用。

已经鉴定了可变剪接导致的几种围脂滴蛋白同种型(9，26)并且 这些同种型可能是功能上不同的(24)。PLIN 13041A>G和14995A> T两者都位于3’非翻译区，而在转录中发生可变剪接。可能这些多态 性可以通过影响剪接改变转录产物。PLIN 13041A>G和14995A>T 相互显著连锁不平衡。因此，我们推测这两种多态性和体脂肪量度之 间所观察到的关联可以指向相同的起因突变，并且考虑到14995T等 位基因总是存在于与增加的肥胖症危险相关的单元型中，我们假设该 等位基因可能与起因突变更密切关联.

在我们的研究中，我们检查了几种人体测量量度(BMI、百分数体 脂肪和腰围).尽管它们显著相关，但是这些量度在代表体脂肪中不 是相同的。从而，BMI不区别脂肪与瘦重量。而且，这些关联是依赖 年龄的(27，28)。另一方面，已经提出腰围为用于鉴定那些具有代谢 综合征的更高危险的个体的更精确的量度(29).尽管存在那些不同， 但是让人安心的是我们已经发现了PLIN多态性和几种肥胖症指数之 间的一致关联.

肥胖症的量度通常与葡萄糖和脂质代谢中的异常相关。然而，在 我们的研究中，我们没有发现PLIN 13041A>G和14995A>T SNPs 和葡萄糖或者脂质相关量度之间的显著关联。已经在实验模型中观察 到类似发现。从而，PLIN敲除小鼠似乎通过激活机制适应由PLIN基 因消除导致的组成型激活的脂解作用，以通过上调氧化分解代谢途径 和下调脂质/固醇合成途径去除这些脂解产物(30)。我们提出当脂解 作用受到抑制时，也可以发生此类补偿机制。

所检查的其他两种SNP(PLIN 6209T>C和11482G>A)不与该 研究中的体肥胖症关联.Mottagui-Tabar等人以前报导PLIN 11482G >A与降低的围脂滴蛋白含量和肥胖女人中增加的脂解作用有关 (18)。因此，我们预期PLIN 11482A将与消瘦表型关联。几种理由可 能解释我们的研究中该多态性和体脂肪量度之间的零相关：首先，我 们的研究群体比一般群体中的肥胖受试者更多(平均BMI＝29.6 kg/m2)。可能这些受试者由于其他基因座的影响而对肥胖症有遗传素 因，并且PLIN 11482A的保护性效应的表达可以在这些条件下受到抑 制。此外，Mottagui-Tabar报导的PLIN 11482G>A多态性是内含 子SNP，其可能与功能突变处于LD中。同样地，通过群体特异的遗 传结构可以实现PLIN 11482G>A和表型变量之间的关联，其中我们 群体中PLIN 11482G>A和功能变异之间的逐对LD的量级可以减小。

携带PLIN 11482AA基因型的女人似乎具有更高的TC和LDL-C 的发现与Mottagui-Tabar的研究符合，其中AA基因型与增加的脂肪 脂解速率关联(18)。循环中升高的脂肪酸将增加它们向肝脏的流量， 从而导致改变的脂质代谢和促进胆固醇产生(31)。因为PLIN6209T>C 和11482G>A几乎完全处于LD，所以我们推测所观察到的PLIN6209和 LDL-C浓度之间的关联可能具有与PLIN 11482G>A SNP相同的遗传基 础。

PLIN基因座不与男性受试者中肥胖症相关量度有关。已经提出 男人和女人可能具有不同组的肥胖症易感性基因(7)。此外，双生子 研究表明该肥胖症可能在女人中比在男人中更可遗传(32)。然而，在 我们得出PLIN不是男人中肥胖症相关表型的候选基因的结论前，需 要更大的研究.男人和女人中围脂滴蛋白的差别表达水平(33)可能造 成他们对PLIN遗传效果的不同敏感性。

总之，我们发现白人女人中PLIN基因的3’非翻译区中两个 SNP(PLIN 13041A>G和14995A>T)与肥胖症危险之间的显著关联。 这两种SNP的变体等位基因的携带者与野生型基因型的携带者相比 具有增加的平均体脂肪含量、腰围和BMI.相反地，在男人中PLIN 多态性和体脂肪量度之间没有发现显著关联.我们的发现支持PLIN 作为女人中肥胖症危险的候选基因的重要角色。

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实施例III：多人种亚洲群体中人围脂滴蛋白基因(PLIN)和与增 加的肥胖症危险关联的单元型的基因内连锁不平衡结构

材料和方法

受试者和研究设计

在该研究中总共包括参与NHS 98的4,131名受试者。NHS 98是 测定新加坡中主要非传染性疾病的危险因素的第一步。以前已经描述 了其详细的方法(11)。用于NHS98的方法基于WHO推荐的用于糖尿病 和其他非传染性疾病现场调查的方案和步骤和用于群体调查的WHO MONICA(Multi-national Monitoring of Trends and Determinants in Cardiovascular Disease)方案。简言之，从National Database on Dwellings选择11,200个个体，他们来自代表整个新加坡居住人 口的房屋类型(社会-经济状况的代表)的地址。通过不成比例的分层 化和系统取样从这些个体选择随机样本。对马来人和印度人过量采 样，以确保这些少数群体的流行率估计是可靠的。共4,723名受试者 参与该研究，并且，人种组成为64％中国人、21％马来人和15％亚 洲印度人。从该调查中所有参与者得到知情同意.该研究得到新加坡 卫生部(Ministry of Health in Singapore)和新加坡综合医院伦理 委员会(the Ethics committee of the Singapore General Hospital) 的批准。

使用应用于面谈者的问卷收集关于生活方式因素的数据。使用常 用于大规模流行病学研究的人体测量量度评估体脂肪，所述人体测量 量度包括体重、体重指数(BMI)、腰围、臀围和腰/臀比(WHR)。简言 之，使用精确度为0.1kg的校准的数字秤(SECA，Hamburg，德国)，测 量不穿鞋只穿轻的室内衣服的体重。使用在墙壁安装的测距仪，用 Frankfurt水平平面测量不穿鞋的身高，精确到0.1cm.通过用身高 的平方除体重(体重(kg)/身高(m2))计算BMI。腰测量精确到0.1cm， 在肋骨下缘和温和呼气结束时的髂嵴之间的中间位置进行测量。直接 在皮肤上进行测量。直接在内衣上最大转子上测量臀围，精确到 0.1cm(12)。将肥胖症二分地定义为BMI≥30kg/m2，并将超重定义为 30kg/m2>BMI≥25kg/m2.使用上面的标准，总共有300名肥胖病 例，其中1,333名受试者归为超重。

在对PLIN基因进行和没有进行基因型分析的受试者的主要人体 测量和生物化学测量中没有发现差异。

DNA分离和基因型分析

用单核苷酸延伸进行基因型分析。首先，通过多重聚合酶链反应 (PCR)扩增包含在PLIN基因座的5个新鉴定的SNP的DNA片段。对 SNP根据它们相对于PLIN的起始甲硫氨酸密码子的ATG的A的位置 编号(6209 T>C、10171A>T、11482 G>A、13041A>G、14995 A>T)，所述ATG的A编号为“+1”(在参考序列上的157157位，检 索号GI21431190)。所用的引物在表1中给出。在含有0.2mmol/l每 种dNTP、0.2μmol/l每种引物、3.0mmol/l氯化镁和0.8U Qiagen Hotstar Taq聚合酶的10μl反应体积中进行PCR扩增。PCR循环条件 为95℃ 10分钟，然后是7个循环的95℃ 30秒、70℃ 30秒和72℃ 1 分钟，然后是41个循环的95℃ 30秒、65℃ 30秒和72℃ 1分钟。在 该方案结束时包括72℃ 2分钟的最终延伸阶段。将PCR产物与2.5U 每种外切核酸酶I(New England Biolabs.，Inc.Beverly，MA)和 小牛小肠磷酸酶(New England Biolabs.，Inc.Beverly，MA)在37 ℃温育60分钟以除去未掺入的dNTP和引物。然后在75℃温育15分 钟来灭活所述酶。

随后使用ABI Prism SnaPshot多重系统(Applied Biosystems， Foster City，CA)进行单核苷酸延伸。用于单核苷酸延伸的探针在表 1中列出。使用PCR热循环仪在5μl反应混合物中进行延伸反应，该 混合物含有1.5μl Snapshot Ready Reaction Mastermix(Applied Biosystems，Foster City，CA)、1.0μl水和1.5μl多重PCR产物和 1.0μl探针混合物(对于6209C>T、10171A>T和11482G>A为 1.5μmol/l；对于13041A>G和14995A>T为2.0μmol/l)。反应 条件为35个循环的96℃ 30秒、50℃ 30秒和60℃ 30秒。将反应产物 与3U小牛小肠磷酸酶在37℃温育60分钟以除去未掺入的dNTP，然 后在75℃温育15分钟以灭活酶.用ABI Prism 3100遗传分析仪 (Applied Biosystems，Foster City，CA)使用Genotyper版本3.7 (Applied Biosystems，FosterCity，CA)进行基因型分析。建立基 因型分析的质量控制，并通过两个研究人员独立地解释结果。

统计学分析

用Arlequin(可以在http://lgb.unige.ch/arlequin/得到)估 计等位基因频率，检验每个SNP基因座上基因型频率与Hardy- Weinberg平衡的一致性，并估计所检查的SNP之间的逐对LD。使用 似然比率检验来检验每对SNP之间LD的统计学显著性。使用THESIAS 程序(可以在 http://ecgene.net/genecanvas/modules/mydownloads/ singlefile.php？cid＝1 & lid＝1得到)推断单元型，所述程序设计用于 检验不相关受试者中单元型的作用，同时对协变量进行调节。该计算 机程序基于Tregouet等人(13)描述的最大似然模型。用SAS(Windows 版本8.0)分析个体关联，并在5％水平上定义统计学显著性。通过χ2 分析来分析肥胖病例和非肥胖对照之间PLIN基因型的普遍性中的差 异。用具有95％置信区间(CI)的优势比(OR)估计肥胖症的相对危险。 用多变量对数回归分析对肥胖症的可能的协变量(年龄、性别、吸烟、 酒精消费、锻炼和糖尿病状态)进行调整。通过向该模型中引入对应 的乘积项来检验遗传效应和性别之间的相互作用.一般遗传模型(对 受试者根据每种SNP的基因型分组)首次用于检查等位基因效应，并 且，最后根据所观察到的等位基因效应使用适宜的遗传模型(显性 的、隐性的，或者加性的).

结果

在新加坡NHS98群体中选择5种常见的二对等位基因多态性 (6209T>C、10171A>T、11482G>A、13041A>G和14995A>T) 并进行基因型分析。这些SNP分别位于内含子2(6209)、内含子5 (10171)、内含子6(11482)、外显子8(13041)和外显子9(14995)。 从4,131名研究受试者得到5种PLIN多态性的基因型信息。基因型 分析的参与者的特征在表11中显示。中国人占67.28％，马来人占 18.16％，且印度人占14.56％。总体上，印度人较老并且中国人较年 轻。在男人中，马来人和印度人具有相当的平均BMI，其比中国人中 的高～1.0kg/m2。在女人中，马来人具有最高的BMI(26.3±5.6 kg/m2)，其次是印度人(25.6±5.0kg/m2)和中国人(22.1±3.6 kg/m2)。对于男人和女人，肥胖症(BMI≥30kg/m2)和超重(BMI≥25 kg/m2)在马来人中最普遍，其次是印度人。这两个人种群中肥胖症和 超重的普遍性比中国人中高得多。印度男人和女人具有最高的糖尿病 率(男人为18.2％，女人为17.4％)，高于马来人中观察到的(男人为 10.9％，女人为14.8％)，而在中国人中，这些数字低得多：男人为 7.2％，女人为6.6％。马来人具有最高比例的当前吸烟者，而酒精在 中国人中消费频率最高.

在三个人种群中，次要等位基因的频率为：PLIN 6209C>T的 为0.320到0.462，PLIN 10171A>T的为0.135到0.255，PLIN 11482G >A的为0.326到0.439，PLIN 13041A>G的为0.296到0.471，且 PLIN 14995A>T的为0.361到0.444。对于三个人种群中所有多态 性，所观察到的和预期的基因型频率都与Hardy-Weinberg平衡一 致.均匀性的卡方检验表明对于5种检查的SNP的任一种，男人和女 人之间基因型/等位基因分布没有显著差异.相反地，我们观察到在 每个多态性位点基因型分布中显著的人种间差异.在每对SNP之间发 现了显著的非随机等位基因关联，如图7中逐对LD的D’所指示。似 乎PLIN内的LD结构不是均匀的。PLIN 6209C>T和10171A>T SNPs 与所有其他SNP都处于负LD，而在三个人种群中，PLIN 11482G>A、 13041A>G和14995A>T SNPs相互处于正LD.在正关联中，在PLIN 11482G>A和14995A>T之间发现最强的LD，其中在三个人种群中 D’范围为0.76到0.83。

我们检查了三个人种群中推断的PLIN单元型和肥胖症(定义为 BMI≥30kg/m2)危险之间的潜在关联。我们使用THESIAS，其基于单 元型重建的最大似然算法(13)。我们没有检测到显著的基因-性别相 互作用。因此，将男人和女人一起分析。使用5种SNP，我们为中国 人、马来人和印度人分别推断了24、18和18种单元型。我们然后检 查常见单元型(频率大于～5％)和肥胖症危险之间的关联(表12)。在 马来人中，我们发现与最普遍的单元型21111相比，单元型 11222(OR＝1.64，95％CI 1.08-2.48)和11212(OR＝1.65，95％CI 1.11-2.46)与肥胖症的增加的危险显著关联。还发现单元型11212 也与印度人中肥胖症危险显著关联(OR＝1.94，95％CI1.06-3.53)。相 反地，与单元型21111相比，单元型12111与肥胖症的降低的危险关 联，在印度人中达到微小显著性(OR＝0.30，95％CI 0.09-1.06)。同 样地，该单元型也与马来人中稍微降低的肥胖症危险关联。对相关协 变量(年龄、性别、吸烟、酒精消费、锻炼和糖尿病状态)的调节没有 改变在马来人中观察到的关联的显著性，但是在印度人中显著性稍微 降低。我们没有发现中国人中PLIN单元型和肥胖症危险之间的显著 关联。

我们还使用SNP亚组(PLIN11482、13041和14995)检查了单元 型关联，所述各SNPs相互处于正LD。在这三种SNP中，我们推断了 每个人种群内的8种单元型.对各个单元型(频率大于～5％)和肥胖 症危险之间关联的检验表明，在马来人中，与最常见的单元型111相 比，单元型212、222和121与肥胖症的增加的优势显著关联(对于 212，OR＝2.12，95％CI 1.36-3.32，对于222，OR＝2.02，95％ CI 1.36-3.01，且对于121，OR＝1.89，95％CI1.05-3.41)。在印度人 中，与单元型111相比，单元型212与肥胖症的增加的优势显著关联 (OR＝2.39，95％CI 1.26-4.50)。单元型122也与增加的肥胖症危险 关联，具有微小显著性。对主要肥胖症危险因素(年龄、性别、吸烟、 酒精消费、锻炼和糖尿病状态)的调节没有改变所观察到的关联，只 是马来人中与单元型121的关联变得微小显著(表13和表14)。

此外，我们检查了每种单独的SNP与肥胖症危险的关联.对PLIN 6209C>T和11482G>A没有发现显著关联。在马来人和印度人中， PLIN 14995A>T处T等位基因的纯合性与其他基因型相比与肥胖症 的增加的优势显著关联(对于马来人，多变量OR＝2.28，95％CI 1.45-3.57，对于印度人，多变量OR＝2.04，95％CI 1.08-3.84)。还 发现对PLIN 11482G>A或13041A>G的罕见等位基因的纯合性与 印度人和马来人中肥胖症的增加的优势关联，但是仅在后一组中达到 统计学显著性(对于PLIN11482G>A，多变量OR＝1.94，95％ CI 1.22-3.08，对于PLIN 13041A>G，多变量OR＝1.87，95％ CI 1.08-3.25)(见图8)。在中国人中没有发现这些多态性和肥胖症危险 之间的显著关联。

讨论

在该研究中，我们已经使用基于SNP和单元型的分析，研究了具 有不同人种背景的4,131名受试者中PLIN基因变体和肥胖症危险之 间的关联。我们对包括三个人种群(中国人、马来人和印度人)的亚洲 群体中肥胖症的候选基因PLIN基因座上5个二对等位基因多态性进 行了基因型分析(PLIN 6209C>T、10171A>T、11482G>A、13041A >G和14995A>T)。通过检查所推断的单元型与肥胖症危险的关联， 我们证明PLIN 11212单元型与马来人和印度人中肥胖症的增加的危 险显著关联。使用处于正连锁不平衡的三种SNP(11482G>A、13041A >G和14995A>T)进行的额外的单元型分析表明在协变量调节后， 单元型212和222与马来人中增加的肥胖症危险关联，且单元型212 与印度人中增加的肥胖症危险显著关联。最后，个体SNP分析表明 PLIN 14995A>T与马来人和印度人中肥胖症危险显著关联。

我们的发现提供了将PLIN考虑为人类中肥胖症危险的候选基因 的强力支持(参考http://obesitygene.pbrc.edu/)。围脂滴蛋白是 脂肪细胞中主要的脂质小滴相关蛋白质(2，3，14)。已经发现围脂滴 蛋白可能在调节脂肪细胞中PKA-介导的细胞内脂解作用和影响储存 的TAG的周转中起重要作用(4，5，15)。体内实验模型已经证明PLIN 基因的产物在确定体脂肪组成中起关键作用(6，7)。在人类中，脂肪 组织中围脂滴蛋白的丰度也与脂解速率关联，并且它的遗传性变型之 一可以影响围脂滴蛋白含量和脂解速率两者(8)。

我们的数据显示了所检查的三个人种的两个人种中PLIN单元型 和肥胖症危险之间的一致关联。在马来人和印度人中，单元型11212 与增加的肥胖症危险一致关联，提示该单元型可能含有功能突变。而 且，使用位点11482、13041和14995的SNP进行单元型分析增加了 关联的量级和统计学显著性。对相关协变量进行调节后，与马来人和 印度人之间野生型单元型(111)相比，单元型212(11482、13041和 14995)与增加的肥胖症危险关联。考虑到两个人种群中与增加的肥胖 症危险的一致关联，我们假设来自11482G>A、13041A>G和14995A >T SNPs的单元型212更可能含有功能突变或者与功能突变共分离。

分析单独SNP的结果提示PLIN 14995A>T是所观察到的单元型 与肥胖症的关联的最重要的单一遗传贡献者.该多态性与马来人和印 度人中的肥胖症危险一致关联并且具有最高的优势比。尽管也发现其 他两种SNP：PL IN 11482G>A和13041A>G与肥胖症的增加的危险 关联，但是该发现的较低量极和仅限于一种人种群这一事实提示它们 的关联可能是由于它们与PLIN 14995A>T SNP的LD。

我们没有发现中国人中PLIN变异和肥胖症危险之间的显著关 联。一些研究人员已经提出应该用较低的截断值来定义亚洲人中的肥 胖(16，17)。然而，在我们的分析中使用较低截断值(27kg/m2和 25kg/m2)没有改变该发现的量极(数据未显示)。备选地，我们假定遗 传效应的差别外显率可能是中国人和其他两个人种群之间关于PLIN 和肥胖症之间关系的所观察到的偏差的根本原因。在新加坡，尽管生 活在相似环境中，但马来人和印度人具有相当的平均BMI，其显著高 于中国人中平均BMI，提示中国人可能对肥胖症具有较低的遗传素 因。

PLIN 13041A>G和PLIN14995A>T SNPs位于这样的区域中， 该区域中在PLIN转录期间发生可变剪接，导致几种围脂滴蛋白同种 型(18)。最近数据表明围脂滴蛋白同种型可能在保护贮存脂肪免于 PKA介导的脂解中以不同效率发挥功能(19)。因此，不希望被理论束 缚，可能与PLIN 13041A>G和PLIN 14995A>T关联的根本遗传效 应是通过影响剪接和不同围脂滴蛋白同种型的表达。还可能PLIN 11482G>A仅代表这些关联中的遗传标记，而不是功能突变。我们 已经注意到亚洲人和高加索人群体之间对于PLIN基因的LD结构中的 重要差异(数据未显示)，并且我们主张不同人种群之间不同的基因内 LD结构可以驱动多种人种群中的不同关联。LD结构中的此类差异可 以解释我们的发现和更早研究的发现之间的差异。Mottagui-Tabar 等人最近报导PLIN 11482G>A SNP上A等位基因与增强的基础和去 甲肾上腺素诱导的脂解作用关联。此外，相同等位基因与肥胖女人中 较低的围脂滴蛋白含量关联(8)。根据该发现，并且与我们的观察相 反，将预期PLIN 11482AA基因型和体脂肪之间的负关联。然而，在 Mottagui-Tabar等人的研究中，受试者是高加索人女性。LD结构中 的人种差异也可以解释中国人中该基因座上遗传性变型与肥胖症之 间关联的缺乏。

总之，我们发现新加坡马来人和印度人中PLIN单元型和增加的 肥胖症危险之间的一致关联。马来人和印度人共有常见的危险单元 型，使这些人种群对肥胖症有素因。单独SNP分析提示PLIN14995A >T可能是所观察到的单元型关联的更相关的遗传标记。

实施例III 参考文献

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将此处和本说明书全文引用的参考文献完整引入本文作为参 考。

表1

1：编号是从变体到起始甲硫氨酸密码子的ATG的A(表示为核苷酸+1) 的碱基数.

2：参考“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp ref.cgi？locusId＝5346”.

3：参考序列(GI21431190)中的基因组位置.4：未检测到

5：所观察到的较不常见的等位基因频率小于2％.

表2.取决于样本选择：样本1(基于群体的)和样本2(基于医院 的)，研究受试者的人口统计、生物化学和生活方式特征

SD：标准差：总-C：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HLD-C：高密度脂蛋白胆固醇. ：在男人和女人比较中P值<0.05.斯氏t检验用于平均值比较，且卡方检验用于百分数. 大学I：3年.大学1I：5年或以上.

表4：样本1中四种PLIN基因座的16种检测的单 元型的频率(男人+女人)

交叉参考

本申请要求2003年9月22日提交的美国临时申请号 60/504,830、2003年11月12日提交的美国临时申请号60/519,109 和2004年2月13日提交的美国临时申请号60/544,524的利益。

政府支持

本发明受到美国农业部(U.S.Department of Agriculture)的 NIH/NHLBI资助号HL54776和合同53-K06-5-10和58-1950-9-001的 支持。美国政府拥有其一定的权利。

序列表

<110>TUFTS UNIVERSITY

<120>肥胖症的遗传标记

<130>700355-54223-PCT

<140>PCT/US2004/018743

<141>2004-06-10

<150>60/504，830

<151>2003-09-22

<150>60/519，109

<151>2003-11-12

<150>60/544，524

<151>2004-02-13

<160>20

<170>PatentIn Ver.3.2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸引物

<400>1

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<213>智人(Homo sapiens)

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<221>CDS

<222>(15)..(59)

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<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

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