一、技术领域：

本发明涉及一种内皮抑素蛋白及其制备方法和应用，尤其涉及一种人重组分泌型 内皮抑素蛋白及其制备方法和应用。

二、背景技术：

正常角膜组织透明无血管。但在临床上，因配戴角膜接触镜、角膜创伤、手术、感 染、酸碱烧伤等，导致从角膜缘血管网形成的新生毛细血管逐渐侵入角膜，引起角膜新 生血管(corneal neovascularization，CNV)的出现。尽管在特定条件下，CNV对疾病 有一定的积极作用。但是，CNV的过度形成常导致角膜透明度下降，不同程度地影响患 者视力，甚至导致患者失明，是临床上致盲的主要原因之一。同时CNV也改变了角膜“相 对免疫赦免”的解剖特点，是角膜移植失败的首要原因。因此，CNV的预防和治疗对维 持角膜透明性及增加角膜移植的成功率均具有重要的意义。此外，新生血管还可出现在 虹膜、脉络膜、视网膜并伴有出血、渗出、增生等一系列病理改变，严重破坏眼的结构 和功能，导致患者失明，也是目前致盲的主要原因。

目前常用于预防和治疗CNV及其他眼部新生血管性疾病的方法主要包括：

(一)药物：糖皮质激素(如地塞米松)、非激素类抗炎药(如消炎痛)、抗增殖药 物(如丝裂霉素C)、血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体、白细胞介素-1受体(IL-1R) 拮抗剂等。但以上药物有的存在毒性作用(如丝裂霉素C可引起角膜溃疡)，有的可引 起较多并发症(如糖皮质激素可引起激素性青光眼、白内障和感染)，有的在临床应用 受到限制(如VEGF单抗为鼠源性，在人体应用会引起超敏反应或因产生抗抗体而导致 疗效降低)。

(二)激光：激光光凝疗法可用于CNV的治疗。如利用氩激光可直接凝固位于角膜 缘处的单支或吻合较少的新生血管，但对密集吻合成网的新生血管则疗效较差，且容易 造成对邻近正常组织的损伤。

(三)同位素：90锶敷贴角膜，其释放的β射线可抑制新生血管，但对深层血管和 粗大血管效果较差，而且对眼部其他组织有可能造成辐射伤。

(四)手术：如角膜缘移植、角膜缘移植联合板层或穿透性角膜移植、培养的角膜 缘干细胞移植、羊膜移植等，以上眼表重建手术可以阻截CNV的形成，但取材不便，且 有时疗效不稳定。

因此，如何寻找到一种疗效显著、特异性好、副作用小的治疗CNV及其他眼部新生 血管性疾病的方法是国内外研究者所关注的焦点。

内皮抑素(endostatin)是1997年由澳瑞雷(O’Relly)首次发现的一种内源性 血管内皮细胞增殖的强效抑制剂[O’Reilly MS，BoehmT，Shing Y，et al.Endostatin：An endogenous inhibitor of angiognesis and tumor growth.Cell，1997，88(2)：277]。 研究发现内皮抑素能特异性抑制处于增殖状态的新生血管内皮细胞，并伴有诱导凋亡的 作用[Dhanabal M，Ramchaneran R，Waterman MJ，et al.Endostatin induces endothelial cell apoptosis.J Biol Chem，1999，274(17)：11721]。近年来，国内外学者对内皮抑 素的研究主要集中在它对肿瘤的治疗作用。研究结果显示其能够特异性抑制新生血管内 皮细胞的生长，从而阻断肿瘤细胞的血液供应和营养，使肿瘤消退。现已进入II期临 床实验。内皮抑素作用的突出特点是：1、疗效显著，特异性强。2、无明显毒副作用。 对人正常成熟状态下静止的内皮细胞或其它细胞无影响。3、反复用药，不产生耐药性 [Boehm T，Folkman J，Browder T，et al.Antiangiogenic therapy of experomantal cancer does not induce acquired drug resistance.Nature.1997，390(6658)：404]。

内皮抑素在肝脏中含量最多，但从肝脏提取纯化操作复杂且费用太高。目前，在我 国人内皮抑素已克隆表达成功，但多是在原核细胞，如大肠杆菌中表达[樊燕蓉，徐根 兴，刘新卷等。重组人Endostatin/MBP融合蛋白的体内外抗肿瘤作用研究。中国肿瘤 生物治疗杂志，2000，7(2)：150]。这种以原核表达系统表达的内皮抑素以非折叠的 形式存在，水溶性差，其抑制内皮细胞增殖的活性会受影响。即使有在真核细胞如酵母 菌中表达，也多为非分泌型融合蛋白，不利于纯化。[孙陆果，姜颖，于永利。人内皮抑 素在酵母细胞中的表达及其促成纤维细胞有丝分裂活性。中国免疫学杂志，2000，16(5)： 231]或使用的酵母表达载体是pPIC9需要甲醇诱导[冯怡，崔立斌，刘传暄等。人内皮 抑素在毕赤酵母菌中的表达、纯化与生物功能研究。生物工程学报，2001，17(3)： 278]。

眼部新生血管的形成与血管内皮细胞的增殖密切相关，在眼部应用属局部用药，用 药量少，且可制备成眼药水局部点眼，这样既方便患者，又可减轻患者的经济负担。因 而眼部新生血管性疾病将是应用内皮抑素进行治疗的一个良好的适应症。然而，至今为 止，还未见有将人的重组分泌型内皮抑素蛋白用于治疗眼部新生血管性疾病的报道。

三、发明内容：

针对上述获得重组内皮抑素方法及应用的不足，本发明主要解决的问题是提供一种 人重组分泌型内皮抑素蛋白及其制备方法和其在制备治疗眼部新生血管性疾病的药中 的应用。

本发明所述的人重组分泌型内皮抑素蛋白可通过下述方法制得：

(1)从新鲜胎肝组织中抽提总RNA；

(2)利用内皮抑素互补DNA(cDNA)序列，设计上下游引物P1、P2，其中在上游加 入EcoR I酶切位点，下游加入Not I酶切位点；

(3)以上述抽提的总RNA为模板，进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)，获得内皮抑 素cDNA；

(4)通过凝胶电泳、质粒抽提、离心法回收内皮抑素cDNA；

(5)以上述回收的cDNA，与克隆质粒(pGEM-T)连接，转化大肠杆菌JM109。

(6)以P1、P2为引物进行PCR扩增，筛选扩增阳性的含内皮抑素基因的克隆，抽提 质粒DNA，测序鉴定；

(7)以常规方法利用限制性内切酶EcoR I、Not I双酶切含内皮抑素(endostatin) 基因的克隆质粒(pGEM-endostatin)，实现与pGAPZαA酵母表达质粒的连接；

(8)取步骤7的连接产物转化大肠杆菌JM109，筛选含内皮抑素(endostatin)基 因的阳性重组表达载体工程菌，抽提质粒DNA，测序鉴定；

(9)以限制性内切酶Avr II单酶切含endostatin基因的重组酵母表达质粒pGAPZα A-endostatin，0.8％琼脂糖电泳回收完全线性化的质粒DNA，与酵母菌GS115的感 受态菌液混合进行电转化；

(10)利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选重组阳性表达酵母菌；

(11)取上述重组阳性表达酵母菌经Sepharose G25和肝素亲和层析柱过柱分离、纯 化，制得内皮抑素(endostatin)表达蛋白，即人重组分泌型内皮抑素蛋白，分子 量约为：32KD，包括至少183个氨基酸。 上述逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)，扩增内皮抑素cDNA所用引物P1、P2为：

P1：5’T GGT  GAA TTC CAC AGC CAC CGC GAC TT 3’

            EcoR I

P2：5’TAA  TGC GGC CGC CTT GGA GGC AGT CAT G 3’

            Not I

上述逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)的反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性1 分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；  进行35个循环后，72℃延伸5分钟。

上述酵母菌表达载体是pGAPZαA质粒DNA。

上述人重组分泌型内皮抑素蛋白的制备方法，包括如下顺序的步骤：

(一)内皮抑素基因的克隆：

①引物设计：

    根据内皮抑素互补DNA(cDNA)序列(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/

Genebank/)，设计上下游引物P1、P2(Primer1、Primer2)及限制性内切酶位点，

其中在上游加入EcoR I酶切位点，下游加入 Not I酶切位点

P1：5’T GGT  GAA TTC CAC AGC CAC  CGC GAC TT 3’

             EcoR I

P2：5’TAA  TGC GGC CGC CTT GGA GGC AGT CAT G 3’

             Not I

②  胎肝组织总RNA的抽提：

    取液氮冻存之新鲜胎肝0.75g，迅速加入Trizol试剂7.5ml，研磨至液体澄清

后，加入等体积氯仿/异戊醇12000rpm 10分钟离心，吸取上清，以无水乙醇沉淀

后，溶于50μl DEPC处理的水中，-20℃保存备用；

③  内皮抑素(endostatin)cDNA的制备：

    采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增endostatin基因，以抽提的总RNA为

模板，进行逆转录反应，扩增cDNA第一链，反应体系为：

  RNA模板                        18μl

  5×缓冲液                      10μl

  寡脱氧胸腺嘧啶Oligo(dT)        2.5μl(150ng)

  二硫苏糖醇(DTT)                    5μl(0.01M)

  RNA酶抑制剂(Rnasin)                1.5μl(60U)

  逆转录酶(M-MuLV)                   3μl(600U)

  脱氧ATP、TTP、GTP、CTP(dNTP)       10μl(0.5mM)

混匀后，37℃，1小时扩增，再置100℃ 5分钟终止，取逆转录反应产物25μl， 以P1、P2为引物，PCR扩增内皮抑素(endostatin)cDNA，反应体系为：

  逆转录(RT)反应产物                 25μl

  10×缓冲液                         10μl

  P1                                 2.5μl(0.5μM)

  P2                                 2.5μl(0.5μM)

  脱氧ATP、TTP、GTP、CTP(dNTP)       8μl(0.2μM)

  耐热高保真DNA多聚酶(pfu Taq酶)     1μl(5u)

  补足双蒸水至                       100μl

反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃，延伸 1分钟；进行35个循环后，72℃延伸5分钟；

不加逆转录(RT)反应产物为阴性对照；

④内皮抑素(endostatin)cDNA的回收：

RT-PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，切下550bp的目的DNA条带，经25℃、 -20℃反复冻融后，置于质粒抽提盒微粒中(普洛麦格，Promega公司产品)，10000rpm离 心5分钟后，收取滤过液体，加入2倍体积无水乙醇，置于-20℃，30分钟后，12000rpm 4℃条件下离心10分钟，沉淀即为纯化的目的DNA；

⑤内皮抑素(endostatin)基因的T-A克隆：

将1-2μl回收的cDNA中加入dATP和Taq酶及10×缓冲液各1μl，补足双蒸水 至10μl，72℃条件下，延伸15分钟加A尾，并纯化回收cDNA；取此种目的基因DNA 及pGEM-T载体(普洛麦格，Promega公司产品)各1μl，加入T4连接酶1μl，10×缓 冲液1μl及双蒸水6μl，4℃条件下，16-18小时，完成T-A配对；

⑥重组克隆的筛选、鉴定：

常规制备大肠杆菌JM109感受态，取2μl步骤⑤制备的连接产物，以CaCl2法转化 大肠杆菌JM109感受态，转化产物涂布于含200mg/ml x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖)40μl及20mg/ml IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)4μl的LA板中，随机 挑选7-12个白色单菌落37℃活化12小时后，抽提质粒DNA，以P1、P2为引物进行 PCR扩增，挑选扩增阳性的克隆，抽提质粒DNA，测序；

(二)内皮抑素(endostatin)基因的表达

①pGAPZαA酵母表达质粒的扩增、提取：

大肠杆菌JM109按常规活化后制备感受态，取pGAPZαA质粒DNA(Invitrogen公司 产品)1μl，常规CaCl2法转化JM109，将转化后的JM109菌液涂布于含25μg/ml Zeocin (抗生素，Invitrogen公司产品)的低盐LB平板中，18-22小时后取单菌落，扩增， 并以质粒抽提试剂盒(普洛麦格，Promega公司产品)抽提质粒；

上述低盐LB平板的配方为：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％， pH7.5；

②内皮抑素(endostatin)基因的亚克隆：

限制性内切酶EcoR I、Not I(上海生物工程公司产品)分别双酶切含endostatin 基因的克隆质粒(pGEM-endostatin)和空表达载体pGAPZαA，经0.8％琼脂糖电泳， 分别回收约550bp的目的DNA和3kb的表达载体DNA凝胶块于1.5ml管中，-20℃、25 ℃反复冻融三次后，置于质粒抽提盒微粒中，10000rpm离心5分钟后，收取滤过液体， 加入2倍体积无水乙醇，置于-20℃ 30分钟后，12000rpm 4℃条件下，离心10分钟， 沉淀DNA加入1ml 75％乙醇漂洗，12000rpm 4℃条件下，离心10分钟，弃上清；将回收 的目的DNA和表达载体DNA一起溶于8μl双蒸水中，加入1μl T4连接酶及2μl 5× 缓冲液，室温连接16-18小时后，取连接产物10μl转化JM109，并涂布于含25μg/ml Zeocin的低盐LB平板中，同时以转化不含endostatin基因的pGAPZαA质粒作为空白对 照；

③内皮抑素(endostatin)亚克隆的筛选、鉴定：

从Zeocin低盐LB平板中挑选单克隆，接种于含Zeocin的低盐LB培养基中，37℃ 避光培养，抽提质粒DNA，分别以酶切、PCR法筛选上述含endostatin基因的阳性重组 菌，抽提质粒DNA，测序；

上述低盐LB培养基的配方为：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，pH7.5；

④酵母菌GS115(Invitrogen公司产品)的感受态制备：

取毕赤酵母菌(GS115)菌种10μl，接种于2ml YPD培养基中，30℃摇床振荡12-16 小时后，取GS115菌液100μl，接种于100mlYPD中，30℃振荡培养12-16小时；当菌 液OD600为1.3-1.5时，取出，2500rpm 4℃离心7分钟，沉淀以200μl的1M D-山梨 醇重悬，置冰浴中；

上述YPD培养基配方为：酵母抽提物1％，胰蛋白胨2％，D-葡萄糖2％；

⑤电转化实验：

以限制性内切酶AvrII(TaKaRa公司产品)单酶切含endostatin基因的重组酵母表 达质粒pGAPZαA-endostatin，以前述方法，用0.8％琼脂糖电泳回收完全线性化的质粒 DNA，溶于10μl双蒸水中；取GS115感受态菌液80μl与10μl线性化质粒DNA混合， 冰浴5分钟后，加入0.2cm规格的电转杯，以电转仪(伯乐公司产品)，1500V电压电击， 立即加入1ml的1M山梨醇溶液，转移至一无菌管中，30℃静置1-2小时后，分别取50、 100、200、400μl涂布于含100μg/ml Zeocin的YPDS平板上，30℃避光培养三天后， 同时以不含endostatin的空质粒pGAPZαA电转化GS115作对照，挑取单克隆至1ml YPD 中，30℃振荡培养至对数生长期，-20℃冻存；

上述YPDS平板的配方为：酵母提取物1％，胰蛋白胨2％，D-葡萄糖2％，山梨醇1M，琼 脂2％；

⑥SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌：

电转后的单克隆冻存菌10μl经活化后，以1∶100接种于100ml YPD培养液中， 30℃振荡培养，每隔24小时取菌液5ml，高速离心后去菌体沉淀，将上清分装，-20℃ 保存待测；电泳前，取500μl培养上清，加入2倍体积无水乙醇，-20℃ 30分钟，12000rpm 离心5分钟，沉淀浓缩蛋白，蛋白浓缩后溶于20μl 6×载样缓冲液中，100℃ 3分钟变 性后，上样于12％聚丙烯酰胺凝胶，50mA电泳；

⑦内皮抑素(endostatin)表达蛋白的纯化：

取2L步骤⑥筛选的重组阳性酵母菌(定名为酵母菌B1-3)及2L转化空载体pGAPZ αA的酵母菌(定名为酵母菌SC3-1，作为对照)第4天培养上清，分别经8000rpm离心 15分钟后，去除沉淀，上清经超滤20倍浓缩(分别定名为B1-3浓缩液和SC3-1浓缩液)， Sepharose G25柱先经50mM NaCl 10mM Tris.Cl平衡后，将浓缩液上样，经Sepharose G25过柱后去盐及低分子物质，收集蛋白峰，肝素(Heparin)亲和层析柱(法莫西亚， Phamacia公司产品)按说明安装后，先经50mM NaCl 10mM Tris.Cl平衡，将G25洗脱 后的各波峰上样，以50mM-2M NaCl 10mM Tris.Cl梯度缓冲液洗脱，收集到两个蛋白峰， 其中1M NaCl 10mM Tris.Cl洗脱的蛋白峰(定名为1M洗脱蛋白)即为人重组分泌型内 皮抑素蛋白，分子量约为：32KD，包括至少183个氨基酸；0.5M NaCl 10mM Tris.Cl洗脱的蛋白峰(定名为0.5M洗脱蛋白)为非目的蛋白。

上述的人重组分泌型内皮抑素蛋白在制备治疗眼部新生血管性疾病的药中的应用。

上述的人重组分泌型内皮抑素蛋白在制备治疗角膜新生血管性疾病的药中的应用。

上述的人重组分泌型内皮抑素蛋白在制备治疗角膜新生血管性疾病的药中，所使 用的有效浓度为40μg/ml-60μg/ml。

上述的人重组分泌型内皮抑素蛋白在制备治疗角膜新生血管性疾病的药中，特别 适用的范围是哺乳类。

采用上述技术方案，本发明利用从中国人胎肝中克隆的内皮抑素(endostatin)基 因，构建出一种新型的endostatin分泌型酵母表达载体pGAPZαA-endostatin。此表达 载体具有引导蛋白出胞的α-信号肽，可使产物分泌出胞，有利于产品的纯化和生产； pGAPZαA利用编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的启动子，可组成性表达外源基 因而不需要甲醇诱导，表达量较诱导型载体高；且具有多聚组氨酸尾和部分myc的序列， 有利于表达后产物的检测和纯化。通过电转化方法导入毕赤酵母菌中进行表达，从酵母 菌的培养上清中获得有活性的endostatin蛋白，经纯化后可用于治疗角膜新生血管形 成、新生血管性青光眼、老年黄斑变性、糖尿病引起的视网膜增生等一系列与新生血管 形成有关的眼部疾病，具有比较显著的效果。具体实施效果如下： (一)体外实验—人重组分泌型内皮抑素蛋白对血管内皮细胞增殖抑制实验

取对数生长期人脐静脉内皮细胞(ECV-304细胞)5×104/ml接种于96孔板， 100μl/孔，37℃，5％CO2孵箱内培养24小时后吸弃上清，分别加入100μl不同稀释 度的0.5M洗脱蛋白、1M洗脱蛋白、B1-3浓缩液和SC3-1浓缩液，继续培养2天后， 以MTT法(四甲基偶氮唑盐)测定细胞增殖抑制率。抑制率＝1-(实验组OD/对照组OD)。 结果：MTT试验显示，经2、3、4、5倍稀释的B1-3浓缩液均可有效抑制血管内皮细胞 的增殖，最高抑制率可达74％(见表1)，形态观察显示B1-3的抑制作用伴有细胞的凋亡， 作用20分钟后，细胞即全部变圆，核出现浓缩，而空白菌SC3-1第4天后培养上清则 无此作用(见图1)。经2、3、4、5倍稀释的1M洗脱蛋白同样可明显抑制ECV-304 增殖，最高抑制率可达86％(见表1)。

10倍稀释的B1-3浓缩液及1M洗脱蛋白对ECV-304的增殖无抑制作用。

同样条件下，肝癌细胞(HepG2.2.15细胞系)的MTT实验证实，B1-3及SC3-1的 培养上清均不能抑制肝癌细胞的增殖(见图2)。

由上述实验结果表明，人重组分泌型内皮抑素蛋白纯化前后均可有效抑制血管内 皮细胞的增殖，而对非内皮细胞来源的其它细胞无影响。 (二)体内实验—人重组分泌型内皮抑素蛋白对兔角膜新生血管的抑制作用

利用角膜缝线法制备兔眼角膜新生血管动物模型，随机分为2组，分别为：

(1)人重组分泌型内皮抑素蛋白治疗组：于术后当天，在球结膜下注射40-60μg/ml 重组内皮抑素0.4ml，隔日一次，连续8-12次。

(2)生理盐水对照组：于术后当天，在球结膜下注射生理盐水0.4ml，隔日一次， 连续8-12次。

另外设空白对照组：不做任何处理。 结果：空白对照组角膜透明无血管，治疗组比生理盐水对照组新生血管生长缓慢且较稀 疏(见表2及图3)。治疗组球结膜未见充血、水肿，角膜也未见混浊、水肿。病理结果 显示，治疗组角膜上皮正常，基质层缝线周围新生血管少，有少数浆细胞及成纤维细胞。 生理盐水对照组角膜上皮正常，基质层新生血管多，管腔大，聚集大量浆细胞，成纤维 细胞少。

病理结果表明，其它脏器：心、肝、肾、脾、肺、睾丸，治疗组与生理盐水对照组 无明显区别。人重组分泌型内皮抑素蛋白可有效抑制兔眼角膜新生血管的生长，而对眼 球及其它重要脏器无明显毒副作用。

四、附图说明： 图1人重组分泌型内皮抑素蛋白对脐静脉血管内皮细胞(ECV-304)的抑制作用

其中A：作用前的正常血管内皮细胞    B：B1-3浓缩液作用20分钟，

    C：B1-3浓缩液作用1天           D：B1-3浓缩液作用2天

    E：SC3-1浓缩液作用2天 图2人重组分泌型内皮抑素蛋白对肝癌细胞(HepG2.2.15细胞系)的作用

其中A：B1-3浓缩液作用2天

    B：正常肝癌细胞对照 图3人重组分泌型内皮抑素蛋白对兔角膜新生血管的抑制作用

其中图3(A)人重组分泌型内皮抑素蛋白治疗组兔角膜新生血管生长情况

图3(B)生理盐水对照组兔角膜新生血管生长情况

图3(C)空白对照组兔角膜 图4 RT-PCR扩增endostatin基因结果

其中A：RT-PCR产物   B：Marker    C：阴性对照 图5表达载体pGAPZαA-endostatin的酶切电泳鉴定结果

其中1：pGAPZαA-endostatin EcoR I单酶切

    2：Marker

    3：pGAPZαA-endostatin EcoR I、Not I双酶切 图6表达载体pGAPZαA-endostatin的测序结果

其中图6(A)：表达载体pGAPZαA-endostatin的序列图

    图6(B)：表达载体pGAPZαA的序列图 图7 B1-3浓缩前后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图

其中1：标准蛋白  2：B1-3浓缩前  3：低分子量蛋白Marker  4：B1-3浓缩后 图8 B1-3浓缩液纯化后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图

其中1：1M洗脱蛋白    2：0.5M洗脱蛋白    3：低分子量蛋白Marker

五、具体实施方式： 实施例1：人重组分泌型内皮抑素蛋白对血管内皮细胞的体外抑制作用 (1)引物设计：根据内皮抑素互补DNA(cDNA)序列(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ Genebank/)，设计上下游引物P1、P2(Primer1、Primer2)及限制性内切酶位点，其中 在上游加入EcoR I酶切位点，下游加入Not I酶切位点

P1：5’T GGT  GAA TTC CAC AGC CAC CGC GAC TT 3’

              EcoR I

P2：5’TAA  TGC GGC CGC CTT GGA GGC AGT CAT G 3’

              Not I (2)胎肝组织总RNA的抽提：取液氮冻存之新鲜胎肝0.75g，迅速加入Trizol试剂7.5ml， 研磨至液体澄清后，加入等体积氯仿/异戊醇12000rpm 10分钟离心，吸取上清，以无 水乙醇沉淀后，溶于50μl DEPC处理的水中，-20℃保存备用； (3)内皮抑素(endostatin)cDNA的制备：采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增 endostatin基因，以抽提的总RNA为模板，进行逆转录反应，扩增cDNA第一链，反应 体系为：

RNA模板                        18μl

5×缓冲液                      10μl

寡脱氧胸腺嘧啶Oligo(dT)        2.5μl(150ng)

二硫苏糖醇(DTT)                  5μl(0.01M)

RNA酶抑制剂(Rnasin)              1.5μl(60U)

逆转录酶(M-MuLV)                 3μl(600U)

脱氧ATP、TTP、GTP、CTP(dNTP)     10μl(0.5mM)

混匀后，37℃，1小时扩增，再置100℃ 5分钟终止，取逆转录反应产物25μl， 以P1、P2为引物，PCR扩增内皮抑素(endostatin)cDNA，反应体系为：

   逆转录(RT)反应产物                  25μl

   10×缓冲液                          10μl

   P1                                  2.5μl(0.5μM)

   P2                                  2.5μl(0.5μM)

   脱氧ATP、TTP、GTP、CTP(dNTP)        8μl(0.2μM)

   耐热高保真DNA多聚酶(pfu Taq酶)      1μl(5u)

   补足双蒸水至                        100μl

反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃，延伸 1分钟；进行35个循环后，72℃延伸5分钟；

不加逆转录(RT)反应产物为阴性对照；(结果见图4) (4)内皮抑素(endostatin)cDNA的回收：RT-PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，切 下550bp的目的DNA条带，经25℃、-20℃反复冻融后，置于质粒抽提盒微粒中(普洛 麦格，Promega公司产品)，10000rpm离心5分钟后，收取滤过液体，加入2倍体积无 水乙醇，置于-20℃，30分钟后，12000rpm 4℃条件下离心10分钟，沉淀即为纯化的目 的DNA； (5)内皮抑素(endostatin)基因的T-A克隆：将1μl回收的cDNA中加入dATP和Taq 酶及10×缓冲液各1μl，补足双蒸水至10μl，72℃条件下，延伸15分钟加A尾，并 纯化回收cDNA；取此种目的基因DNA及pGEM-T载体(普洛麦格，Promega公司产品) 各1μl，加入T4连接酶1μl，10×缓冲液1μl及双蒸水6μl，4℃条件下，17小时， 完成T-A配对； (6)重组克隆的筛选、鉴定：常规制备大肠杆菌JM109感受态，取2μl步骤⑤制备的 连接产物，以CaCl2法转化大肠杆菌JM109感受态，转化产物涂布于含200mg/ml x-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖)40μl及20mg/ml IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳 糖苷)4μl的LA板中，随机挑选8个白色单菌落。37℃活化12小时后，抽提质粒DNA， 以P1、P2为引物进行PCR扩增，挑选扩增阳性的克隆，抽提质粒DNA，测序鉴定； (7)pGAPZαA酵母表达质粒的扩增、提取：大肠杆菌JM109按常规活化后制备感受态， 取pGAPZαA质粒DNA(Invitrogen公司产品)1μl，常规CaCl2法转化JM109，将转化 后的JM109菌液涂布于含25μg/ml Zeocin(抗生素，Invitrogen公司产品)的低盐LB 平板中，20小时后取单菌落，扩增，并以质粒抽提试剂盒(普洛麦格，Promega公司产 品)抽提质粒；

上述低盐LB平板的配方为：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％， pH7.5； (8)内皮抑素(endostatin)基因的亚克隆：限制性内切酶EcoR I、Not I(上海生物工 程公司产品)分别双酶切含endostatin基因的克隆质粒(pGEM-endostatin)和空表达 载体pGAPZαA，经0.8％琼脂糖电泳，分别回收约550bp的目的DNA和3kb的表达载体 DNA凝胶块于1.5ml管中，-20℃、25℃反复冻融三次后，置于质粒抽提盒微粒中， 10000rpm离心5分钟后，收取滤过液体，加入2倍体积无水乙醇，置于-20℃ 30分钟 后，12000rpm 4℃条件下，离心10分钟，沉淀DNA加入1ml75％乙醇漂洗，12000rpm 4 ℃条件下，离心10分钟，弃上清；将回收的目的DNA和表达载体DNA一起溶于8μl双 蒸水中，加入1μl T4连接酶及2μl 5×缓冲液，室温连接17小时后，取连接产物10 μl转化JM109，并涂布于含25μg/ml Zeocin的低盐LB平板中，同时以转化不含 endostatin基因的pGAPZαA质粒作为空白对照； (9)内皮抑素(endostatin)亚克隆的筛选、鉴定：从Zeocin低盐LB平板中挑选单克 隆，接种于含Zeocin的低盐LB培养基中，37℃避光培养，抽提质粒DNA，分别以酶切、 PCR法筛选上述含endostatin基因的阳性重组菌，抽提质粒DNA，测序鉴定；(结果见 图5、图6)

上述低盐LB培养基的配方为：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH7.5； (10)酵母菌GS115(Invitrogen公司产品)的感受态制备：取毕赤酵母菌GS115菌种10 μl，接种于2ml YPD培养基中，30℃摇床振荡14小时后，取GS115菌液100μl，接种 于100mlYPD中，30℃振荡培养14小时；当菌液OD600约为1.4时，取出，2500rpm 4℃ 离心7分钟，沉淀以200μl的1M D-山梨醇重悬，置冰浴中；

上述YPD培养基配方为：酵母抽提物1％，胰蛋白胨2％，D-葡萄糖2％； (11)电转化实验：以限制性内切酶Avr II(TaKaRa公司产品)单酶切含endostatin基因 的重组酵母表达质粒pGAPZαA-endostatin，以前述方法，用0.8％琼脂糖电泳回收完全 线性化的质粒DNA，溶于10μl双蒸水中；取GS115感受态菌液80μl与10μl线性化 质粒DNA混合，冰浴5分钟后，加入0.2cm规格的电转杯，以电转仪(伯乐公司产品)， 1500V电压电击，立即加入1ml的1M山梨醇溶液，转移至一无菌管中，30℃静置1小 时30分种后，分别取50、100、200、400μl涂布于含100μg/ml Zeocin的YPDS板上， 30℃避光培养3天后，同时以不含endostatin的空质粒pGAPZαA电转化GS115作对照， 挑取单克隆至1ml YPD中，30℃振荡培养至对数生长期，-20℃冻存；

上述YPDS平板的配方为：酵母提取物1％，胰蛋白胨2％，D-葡萄糖2％，山梨醇1M， 琼脂2％； (12)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌：电转后的单克隆冻存菌10μl经活化后， 以1∶100接种于100ml YPD培养液中，30℃振荡培养，每隔24小时取菌液5ml，高速 离心后去菌体沉淀，将上清分装，-20℃保存待测；电泳前，取500μl培养上清，加入 2倍体积无水乙醇，-20℃ 30分钟，12000rpm离心5分钟，沉淀浓缩蛋白，蛋白浓缩后溶 于20μl 6×载样缓冲液中，100℃ 3分钟变性后，上样于12％聚丙烯酰胺凝胶，50mA 电泳； (13)内皮抑素(endostatin)表达蛋白的纯化：取2L步骤⑥筛选的重组阳性酵母菌(定 名为酵母菌B1-3)及2L转化空载体pGAPZαA的酵母菌(定名为酵母菌SC3-1，作为对 照)第4天培养上清，分别经8000rpm离心15分钟后，去除沉淀，上清经超滤20倍浓 缩(分别定名为B1-3浓缩液和SC3-1浓缩液)，Sepharose G25柱先经50mM NaCl 10mM Tris.Cl平衡后，将浓缩液上样，经Sepharose G25过柱后去盐及低分子物质，收集蛋 白峰，肝素(Heparin)亲和层析柱(法莫西亚，Phamacia公司产品)按说明安装后， 先经50mM NaCl 10mM Tris.Cl平衡，将G25洗脱后的各波峰上样，以50mM～2M NaCl 10mM Tris.Cl梯度缓冲液洗脱，收集到两个蛋白峰，其中1M NaCl 10mM Tris.Cl洗脱的蛋白 峰(定名为1M洗脱蛋白)即为人重组分泌型内皮抑素蛋白，分子量约为：32KD，包括 至少183个氨基酸；0.5M NaCl 10mM Tris.Cl洗脱的蛋白峰(定名为0.5M洗脱蛋白) 为非目的蛋白。(见图7、图8) (14)体外实验—人重组分泌型内皮抑素蛋白对血管内皮细胞增殖抑制实验：选择人脐静 脉内皮细胞ECV-304，传代于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，5％ CO2孵箱内 培养。取对数生长期细胞5×104/ml接种于96孔板，100μl/孔，置于37℃，5％CO2孵 箱内培养24小时后吸弃上清，分别加入100μl经2、3、4、5、10倍稀释的0.5M洗脱 蛋白、1M洗脱蛋白、B1-3浓缩液和SC3-1浓缩液，继续培养2天后，各孔加入20μl 5mg/ml的MTT(四甲基偶氮唑盐)，再培养6小时后，各孔轻轻吸出100μl上清，加入 100μl DMSO(二甲基亚砜)，室温振荡10分钟后，OD570测定细胞增殖抑制率。抑制率 ＝1-(实验组OD/对照组OD)

实验时，以同样方法将上述各样品作用于HepG2.2.15肝癌细胞系，作为非血管内 皮细胞的对照。 结果：MTT试验显示，经2、3、4、5倍稀释的B1-3浓缩液均可有效抑制血管内皮细胞 的增殖，最高抑制率可达74％(见表1)，形态观察显示B1-3的抑制作用伴有细胞的凋亡， 作用20分钟后，细胞即全部变圆，核出现浓缩，而空白菌SC3-1第4天后培养上清则 无此作用(见图1)。经2、3、4、5倍稀释的1M洗脱蛋白同样可明显抑制ECV-304增殖， 最高抑制率可达86％(见表1)。

10倍稀释的B1-3浓缩液及1M洗脱蛋白对ECV-304的增殖无抑制作用。

   表1人重组内皮抑素蛋白对ECV-304细胞增殖的抑制作用

       样品              稀释倍数

                  2      3      4      5      10

   B1-3浓缩液*  74％   39％   33％   22％    0

   1M洗脱蛋白*  86％   72％   70％   64％    0

   0.5M洗脱蛋白  0      0      0      0       0

   SC3-1浓缩液   0      0      0      0       0

   *P＜0.05

同样条件下，肝癌细胞(HepG2.2.15细胞系)的MTT实验证实，B1-3及SC3-1的 培养上清均不能抑制肝癌细胞的增殖(见图2)。

由上述实验结果表明，人重组分泌型内皮抑素蛋白纯化前后均可有效抑制血管内皮 细胞的增殖，而对非内皮细胞来源的其它细胞无影响。 实施例2：人重组分泌型内皮抑素蛋白对兔眼角膜新生血管的抑制作用 (1)引物设计：根据内皮抑素互补DNA(cDNA)序列(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ Genebank/)，设计上下游引物P1、P2(Primer1、Primer2)及限制性内切酶位点，其中 在上游加入EcoR I酶切位点，下游加入Not I酶切位点

    P1：5’T GGT  GAA TTC CAC AGC CAC CGC GAC TT 3’

                  EcoR I

    P2：5’TAA  TGC GGC CGC CTT GGA GGC AGT CAT G 3’

                  Not I (2)胎肝组织总RNA的抽提：取液氮冻存之新鲜胎肝0.75g，迅速加入Trizol试剂7.5ml， 研磨至液体澄清后，加入等体积氯仿/异戊醇12000rpm 10分钟离心，吸取上清，以无 水乙醇沉淀后，溶于50μl DEPC处理的水中，-20℃保存备用； (3)内皮抑素(endostatin)cDNA的制备：采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增 endostatin基因，以抽提的总RNA为模板，进行逆转录反应，扩增cDNA第一链，反应 体系为：

RNA模板                         18μl

5×缓冲液                       10μl

寡脱氧胸腺嘧啶Oligo(dT)         2.5μl(150ng)

二硫苏糖醇(DTT)                 5μl(0.01M)

RNA酶抑制剂(Rnasin)             1.5μl(60U)

逆转录酶(M-MuLV)                3μl(600U)

脱氧ATP、TTP、GTP、CTP(dNTP)    10μl(0.5mM)

混匀后，37℃，1小时扩增，再置100℃ 5分钟终止，取逆转录反应产物25μl， 以P1、P2为引物，PCR扩增内皮抑素(endostatin)cDNA，反应体系为：

   逆转录(RT)反应产物                  25μl

   10×缓冲液                          10μl

   P1                                  2.5μl(0.5μM)

   P2                                  2.5μl(0.5μM)

   脱氧ATP、TTP、GTP、CTP(dNTP)        8μl(0.2μM)

   耐热高保真DNA多聚酶(pfu Taq酶)      1μl(5u)

   补足双蒸水至                        100μl

反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃，延伸 1分钟；进行35个循环后，72℃延伸5分钟；

不加逆转录(RT)反应产物为阴性对照；(结果见图4) (4)内皮抑素(endostatin)cDNA的回收：RT-PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，切 下550bp的目的DNA条带，经25℃、-20℃反复冻融后，置于质粒抽提盒微粒中(普洛 麦格，Promega公司产品)，10000rpm离心5分钟后，收取滤过液体，加入2倍体积无 水乙醇，置于-20℃，30分钟后，12000rpm 4℃条件下离心10分钟，沉淀即为纯化的目 的DNA； (5)内皮抑素(endostatin)基因的T-A克隆：将1μl回收的cDNA中加入dATP和Taq 酶及10×缓冲液各1μl，补足双蒸水至10μl，72℃条件下，延伸15分钟加A尾，并 纯化回收cDNA；取此种目的基因DNA及pGEM-T载体(普洛麦格，Promega公司产品) 各1μl，加入T4连接酶1μl，10×缓冲液1μl及双蒸水6μl，4℃条件下，17小时， 完成T-A配对； (6)重组克隆的筛选、鉴定：常规制备大肠杆菌JM109感受态，取2μl步骤⑤制备的 连接产物，以CaCl2法转化大肠杆菌JM109感受态，转化产物涂布于含200mg/ml x-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖)40μl及20mg/ml IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳 糖苷)4μl的LA板中，随机挑选8个白色单菌落。37℃活化12小时后，抽提质粒DNA， 以P1、P2为引物进行PCR扩增，挑选扩增阳性的克隆，抽提质粒DNA，测序鉴定； (7)pGAPZαA酵母表达质粒的扩增、提取：大肠杆菌JM109按常规活化后制备感受态， 取pGAPZαA质粒DNA(Invitrogen公司产品)1μl，常规CaCl2法转化JM109，将转化 后的JM109菌液涂布于含25μg/ml Zeocin(抗生素，Invitrogen公司产品)的低盐LB 平板中，20小时后取单菌落，扩增，并以质粒抽提试剂盒(普洛麦格，Promega公司产 品)抽提质粒；

上述低盐LB平板的配方为：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％， pH7.5； (8)内皮抑素(endostatin)基因的亚克隆：限制性内切酶EcoR I、Not I(上海生物工 程公司产品)分别双酶切含endostatin基因的克隆质粒(pGEM-endostatin)和空表达 载体pGAPZαA，经0.8％琼脂糖电泳，分别回收约550bp的目的DNA和3kb的表达载体 DNA凝胶块于1.5ml管中，-20℃、25℃反复冻融三次后，置于质粒抽提盒微粒中， 10000rpm离心5分钟后，收取滤过液体，加入2倍体积无水乙醇，置于-20℃ 30分钟 后，12000rpm 4℃条件下，离心10分钟，沉淀DNA加入1ml75％乙醇漂洗，12000rpm 4 ℃条件下，离心10分钟，弃上清；将回收的目的DNA和表达载体DNA一起溶于8μl双 蒸水中，加入1μl T4连接酶及2μl 5×缓冲液，室温连接17小时后，取连接产物10 μl转化JM109，并涂布于含25μg/ml Zeocin的低盐LB平板中，同时以转化不含 endostatin基因的pGAPZαA质粒作为空白对照； (9)内皮抑素(endostatin)亚克隆的筛选、鉴定：从Zeocin低盐LB平板中挑选单克 隆，接种于含Zeocin的低盐LB培养基中，37℃避光培养，抽提质粒DNA，分别以酶切、 PCR法筛选上述含endostatin基因的阳性重组菌，抽提质粒DNA，测序鉴定；(结果见 图5、图6)

上述低盐LB培养基的配方为：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，pH7.5； (10)酵母菌GS115(Invitrogen公司产品)的感受态制备：取毕赤酵母菌GS115菌种10 μl，接种于2ml YPD培养基中，30℃摇床振荡14小时后，取GS115菌液100μl，接种 于100mlYPD中，30℃振荡培养14小时；当菌液OD600约为1.4时，取出，2500rpm 4℃ 离心7分钟，沉淀以200μl的1M D-山梨醇重悬，置冰浴中；

上述YPD培养基配方为：酵母抽提物1％，胰蛋白胨2％，D-葡萄糖2％； (11)电转化实验：以限制性内切酶Avr II(TaKaRa公司产品)单酶切含endostatin基因 的重组酵母表达质粒pGAPZαA-endostatin，以前述方法，用0.8％琼脂糖电泳回收完全 线性化的质粒DNA，溶于10μl双蒸水中；取GS115感受态菌液80μl与10μl线性化 质粒DNA混合，冰浴5分钟后，加入0.2cm规格的电转杯，以电转仪(伯乐公司产品)， 1500V电压电击，立即加入1ml的1M山梨醇溶液，转移至一无菌管中，30℃静置1小 时30分种后，分别取50、100、200、400μl涂布于含100μg/ml Zeocin的YPDS板上， 30℃避光培养3天后，同时以不含endostatin的空质粒pGAPZαA电转化GS115作对照， 挑取单克隆至1ml YPD中，30℃振荡培养至对数生长期，-20℃冻存；

上述YPDS平板的配方为：酵母提取物1％，胰蛋白胨2％，D-葡萄糖2％，山梨醇1M， 琼脂2％； (12)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌：电转后的单克隆冻存菌10μl经活化后， 以1∶100接种于100ml YPD培养液中，30℃振荡培养，每隔24小时取菌液5ml，高速 离心后去菌体沉淀，将上清分装，-20℃保存待测；电泳前，取500μl培养上清，加入 2倍体积无水乙醇，-20℃ 30分钟，12000rpm离心5分钟，沉淀浓缩蛋白，蛋白浓缩后溶 于20μl 6×载样缓冲液中，100℃ 3分钟变性后，上样于12％聚丙烯酰胺凝胶，50mA 电泳； (13)内皮抑素(endostatin)表达蛋白的纯化：取2L步骤⑥筛选的重组阳性酵母菌(定 名为酵母菌B1-3)及2L转化空载体pGAPZαA的酵母菌(定名为酵母菌SC3-1，作为对 照)第4天培养上清，分别经8000rpm离心15分钟后，去除沉淀，上清经超滤20倍浓 缩(分别定名为B1-3浓缩液和SC3-1浓缩液)，Sepharose G25柱先经50mM NaCl 10mM Tris.Cl平衡后，将浓缩液上样，经Sepharose G25过柱后去盐及低分子物质，收集蛋 白峰，肝素(Heparin)亲和层析柱(法莫西亚，Phamacia公司产品)按说明安装后， 先经50mM NaCl 10mM Tris.Cl平衡，将G25洗脱后的各波峰上样，以50mM～2M NaCl 10mM Tris.Cl梯度缓冲液洗脱，收集到两个蛋白峰，其中1M NaCl 10mM Tris.Cl洗脱的蛋白 峰(定名为1M洗脱蛋白)即为人重组分泌型内皮抑素蛋白，分子量约为：32KD，包括 至少183个氨基酸；0.5M NaCl 10mM Tris.Cl洗脱的蛋白峰(定名为0.5M洗脱蛋白) 为非目的蛋白。(见图7、图8) (14)角膜新生血管动物模型的制备：健康新西兰大白兔取12只兔，雄性，体重2-2.5kg， 眼部无异常。双眼同时实验，经氯胺酮麻醉，丁卡因术前点眼，无菌条件及显微镜下， 于上方角膜缘内2mm处缝置5-0黑丝线2根，间距为2mm，缝线埋于角膜基质内长3mm。 (15)体内抑制实验：上述12只兔，随机分2组，每组6只，12只眼。

①人重组分泌型内皮抑素蛋白治疗组：于术后当天，在球结膜下注射50μg/ml人 重组分泌型内皮抑素蛋白0.4ml，隔日一次，连续8次。

②生理盐水对照组：于术后当天，在球结膜下注射生理盐水0.4ml，隔日一次，连 续8次。

另外设空白对照组：3只兔，共6只眼，不做任何处理。 (16)观察指标：

I.角膜缝线后开始每日在裂隙灯显微镜下观察角膜新生血管生长情况，连续16天。 并在术后第3天、第4天、第5天、第7天、第10天、第13天、第16天在手术显微 镜下用数码相机定位拍摄角膜新生血管生长状况，直接输入计算机，对新生血管变化进 行图象分析。

II.术后第16天处死兔，进行眼球摘除，取材；另取重要脏器心、肝、肾、脾、肺、 睾丸送病理，进行光镜检查。

III.用药后同时观察球结膜是否充血、水肿，角膜有无混浊水肿以及房水情况。 结果：空白对照组角膜透明无血管，治疗组比生理盐水对照组新生血管生长缓慢且较稀 疏(见表2及图3)。治疗组球结膜未见充血、水肿，角膜也未见混浊、水肿。病理结果 显示，治疗组角膜上皮正常，基质层缝线周围新生血管少，有少数浆细胞及成纤维细胞。 生理盐水对照组角膜上皮正常，基质层新生血管多，管腔大，聚集大量浆细胞，成纤维 细胞少。

病理结果表明，其它脏器：心、肝、肾、脾、肺、睾丸，治疗组与生理盐水对照组 无明显区别。人重组分泌型内皮抑素蛋白可有效抑制兔眼角膜新生血管的生长，而对眼 球及其它重要脏器无明显毒副作用。

      表2  角膜新生血管最大生长面积及最长生长长度的比较(n＝12)

组别       新生血管最大生长面积(mm2)      新生血管最长生长长度(mm) 内皮抑素治疗组      10.88±3.78                    4.52±1.08 生理盐水注射组      24.83±4.31                    6.78±2.25 *P＜0.05