技术领域
[0001] 本
发明涉及泥鳅疫苗技术领域，具体为一种泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的制备和使用方法。
背景技术
[0002] 我国
水产养殖业发展迅速，养殖种类丰富多样。泥鳅是我国
水产养殖的主要种类之一，但由于养殖集约化程度的增强，泥鳅
疾病频发，因此抗生素大量使用，使细菌产生一定的耐药性，产品也存在抗生素残留的
风险。相比之下，使用疫苗来抑制鱼类疾病具有毒
副作用小、药物残留少、大大增强
机体免疫
力及无耐药性产生等优点而更具安全性。
[0003] 在我国，水产疫苗的研制及应用，起步较晚且发展缓慢，极不符合我国世界第一水产养殖大国之称，更与建成水产养殖强国的前景相距甚远。同时，国内对凡隆气单胞菌的研究，大部分仍处在分离及生理生化鉴定阶段，凡隆气单胞菌疫苗的研制及免疫学研究在国内鲜有报道，仅李正伟制备的灭活疫苗对鲫鱼和草鱼有较好的免疫保护性，陈亨利等制备的灭活疫苗能诱导锦鲤机体产生较好的免疫应答及简灯通过提取灭活疫苗的外膜蛋白，添加
铝佐剂制成不同疫苗来研究对草鱼的免疫效果。因此，本实验通过制备凡隆气单胞菌疫苗对泥鳅进行免疫接种并对其免疫效果进行初步研究，探讨其灭活疫苗是否能对泥鳅产生一定的免疫保护效应，为凡隆气单胞菌灭活疫苗在水产动物上的应用提供参考。
发明内容
[0004] (一)解决的技术问题
[0005] 针对
现有技术的不足，本发明提供了一种泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的制备和使用方法，解决了现有国内凡隆气单胞菌疫苗处于研发
瓶颈阶段以及尚未有凡隆气单胞菌疫苗对泥鳅免疫保护的研究的问题。
[0006] (二)技术方案
[0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种泥鳅凡隆气单胞菌疫苗，包括以下原料：凡隆气单胞菌、泥鳅(体重在14-21g之间)、胰蛋白胨10g、
酵母提取物5g、
氯化钠10g、15g琼脂粉(液体不加)、蒸馏水1000mL、甲
醛、酸性
磷酸酶和超
氧化物歧化酶
试剂盒。
[0008] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的制备，包括以下步骤：
[0009] S1)制备LB液体培养基：将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、15g琼脂粉(液体不加)、蒸馏水1000mL倒进实验用烧杯，搅拌溶解，调节pH至7.4，再经121℃高压灭菌，常温保存；
[0010] S2)凡隆气单胞菌菌株的复壮：用移液枪准确吸取0.2mL实验室(-70℃)保存的凡隆气单胞菌，加入LB液体培养基中，在28℃振荡
培养箱中振摇12小时后，将复苏的凡隆气单胞菌通过接种环于LB液体培养基上以三区划线的方式进行菌落平板划线，在28℃生化培养箱培养15小时后，保存于4℃
冰箱中备用；
[0011] S3)疫苗的制备：用接种环挑取单个菌落，接种培养于LB液体培养基，28℃振荡培养箱培养12小时，通过平板计数法计算菌液浓度，将菌液浓度调整至109CFU/mL，使用终浓度为0.2％的甲醛溶液在28℃条件下以及恒温灭活24小时的方式制得疫苗，置于4℃的冰箱中保存备用。
[0012] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对S2中复壮的凡隆气单胞菌菌株菌落形态特征及革兰氏
染色观察如下：将已复壮的凡隆气单胞菌菌株进行平板划线，于28℃生化培养箱培养24小时后，观察其菌落形态，并进行革兰氏染色观察。
[0013] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中对S3中制得的109CFU/mL菌液进行人工感染实验如下：以
腹腔注射的方式向10尾泥鳅注射0.3mL浓度为108CFU/mL的菌液，观察并记录一周内泥鳅的发病及死亡情况。
[0014] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对疫苗的半致死浓度(LD50)的测定如下：用接种环挑取单个菌落接种于LB液体培养基，28℃振荡培养箱培养12小时之后，通过平板计数法计算培养的菌液浓度，将菌液浓度调整至109CFU/mL，将该浓度的菌液以10-1，10-2，10-3以及10-4倍比稀释，将60尾健康泥鳅平均分为6组，其中5组分别对应一种稀释度，以腹腔注射的方式向其注射0.3mL菌液，同时对照组注射等量0.85％生理盐水，将试验泥鳅放置在水族箱内饲养，不换水不喂食，观察记录注射后7天内泥鳅的发病及死亡情况；
[0015] 根据数据，利用下列改进寇氏法计算凡隆气单胞菌的半致死浓度；
[0016] 计算公式为：lgLD50＝Xk-d(∑Pi-0.5)
[0017] 公式中：Xk：最大对数剂量；
[0018] d：邻近两组对数剂量差值；
[0019] Pi：死亡率；
[0020] i：组号。
[0021] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对疫苗中的凡隆气单胞菌生长曲线的测定如下：向装有50mL新鲜LB液体培养基的锥形瓶中加入2.5mL过夜培养(约12小时)的凡隆气单胞菌液，混匀后，分别吸取5mL
混合液加入到已标好序号的9只无菌试管中，于28℃摇床进行震荡培养，重复3组；培养0、1.5、3、5、7、9、11、13和15小时后，将对应时间的试管取出，于4℃保存，最后将9个时间段一同于OD600处的测定吸光度，取3组的平均值，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制凡隆气单胞菌的生长曲线。
[0022] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对疫苗的无菌及安全性检测如下：取适量上述所制疫苗，于LB液体培养基中，28℃条件下振荡培养箱培养18小时，吸取0.2ml培养液涂布到LB液体培养基中，同样
温度培养24小时，重复3组，观察有无细菌长出；随机挑选备用泥鳅7尾，分别接种0.3mL灭活疫苗，正常喂食，观察7天内试验泥鳅有无发病及死亡情况；若平板未观察到细菌，且试验泥鳅也未发病及死亡，所制疫苗即安全。
[0023] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对疫苗的接种方案如下：向30尾试验组泥鳅注射0.3mL浓度为109CFU/mL的灭活疫苗，对照组泥鳅则注射等量0.85％生理盐水，接种疫苗后的泥鳅放回水族箱内饲养直到进行攻毒，于第一次接种后第
28天后进行第二次免疫接种，第二次接种的疫苗及生理盐水量与第一次的接种量保持一致。
[0024] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对接种疫苗后的泥鳅的血液采集如下：每周(从接种疫苗开始，持续49天)从水族箱中随机
抽取的3尾泥鳅，通过断尾取血的方式收集血液，将
血液样本于室温冷凝1小时、4℃冰箱中过夜，使用高速离心机在4℃条件下以12000rpm离心10min，取上层血清，用于血清
抗体效价、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶的测定。
[0025] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对疫苗血清抗体效价的测定如下：采用微量滴定凝集试验测定血清抗体效价，反应
抗原采用灭活的疫苗，将灭活的凡隆气单胞菌培养液12000rpm离心后用等量0.85％灭菌生理盐水重悬，60℃水浴锅水浴30分钟，于96孔板上，使用移液枪向第1孔加入80μL的0.85％生理盐水，其余各孔只加50μL(至第10孔)；接着使用移液枪向第1个孔加入20μL的血清样本，吹吸混匀后用移液枪吸取50μL混合液加至第2孔；再吹吸混匀后，从第2孔吸取50μL混合液加至第3孔；重复上述操作至第9孔，将第九孔中混合液直接弃去50μL，第10孔则作为对照(仅含生理盐水)，向每个孔各加入50μL灭活疫苗并吹吸混匀，将96孔板置于37℃恒温培养箱中孵育1小时后，于4℃条件下过夜，第二天观察是否有沉淀产生。
[0026] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对酸性磷酸酶(ACP)和超氧化物歧化酶(SOD)的测定如下：采用ACP试剂盒进行ACP测定，利用紫外可见分光光度计，使用1cm光径的比色皿，于OD520中，使用空白管调零，进行比色测定，根据下式计算ACP活力：
[0027]
[0028] 采用SOD试剂盒进行SOD测定，利用紫外可见分光光度计，使用1cm光径的比色皿，于OD550中，使用双蒸水调零，进行比色测定：
[0029]
[0030] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对注射疫苗后的泥鳅的攻毒及相对免疫保护力的测定如下：免疫后第28天，用浓度为50LD50的活菌分别以腹腔注射的方式对试验组和对照组的泥鳅进行注射；攻毒后，将泥鳅放回水族箱内饲养，攻毒结束3天后重新开始喂食并换水，观察并统计14天的死亡率；
[0031] 按下式计算相对免疫保护力：
[0032]
[0033] (三)有益效果
[0034] 本发明提供了一种泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的制备和使用方法。具备以下[0035] 有益效果：
[0036] (1)、本发明通过多次试验论证以及采用了大量的试验数据计算，并且依据长时间的科学记载和推断，最终得出该泥鳅凡隆气单胞菌疫苗在对于提高泥鳅的免疫保护中，起到了显著地效果，在对该泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的试验中，多次采用了对照试验的方式，得出了显著的试验对比效果，为实验提供了有效的说服力，并且还对该泥鳅凡隆气单胞菌疫苗对于泥鳅的致死浓度进行了细致的研究，得出了安全的疫苗浓度，为后续该泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的生产和推广提供了强有力的科学依据，同时也为凡隆气单胞菌灭活疫苗在水产动物上的应用提供参考，解决了现有国内凡隆气单胞菌疫苗的研究困难，填补了现今尚未有凡隆气单胞菌疫苗对泥鳅免疫保护的研究的空白。
附图说明
[0037] 图1为本发明攻毒后泥鳅的死亡率和相对免疫力对照表；
[0038] 图2为本
发明人工感染实验中感染泥鳅与健康泥鳅症状比较表；
[0039] 图3为本发明凡隆气单胞菌对泥鳅的半致死量实验表；
[0040] 图4为本发明凡隆气单胞菌的生长曲线图；
[0041] 图5为本发明泥鳅血清抗体效价的测定表；
[0042] 图6为本发明疫苗对泥鳅血清中ACP活力的影响曲线图；
[0043] 图7为本发明疫苗对泥鳅血清中T-SOD活力的影响曲线图；
[0044] 图8为本发明凡隆气单胞菌菌落形态图；
[0045] 图9为本发明凡隆气单胞菌染色后的革兰氏染色图。
具体实施方式
[0046] 下面将结合本发明
实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0047] 如图1-9所示，本发明提供一种技术方案：一种泥鳅凡隆气单胞菌疫苗，包括以下原料：凡隆气单胞菌、泥鳅(体重在14-21g之间)、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、15g琼脂粉(液体不加)、蒸馏水1000mL、甲醛、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶试剂盒。
[0048] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的制备，包括以下步骤：
[0049] S1)制备LB液体培养基：将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、15g琼脂粉(液体不加)、蒸馏水1000mL倒进实验用烧杯，搅拌溶解，调节pH至7.4，再经121℃高压灭菌，常温保存；
[0050] S2)凡隆气单胞菌菌株的复壮：用移液枪准确吸取0.2mL实验室(-70℃)保存的凡隆气单胞菌，加入LB液体培养基中，在28℃振荡培养箱中振摇12小时后，将复苏的凡隆气单胞菌通过接种环于LB液体培养基上以三区划线的方式进行菌落平板划线，在28℃生化培养箱培养15小时后，保存于4℃冰箱中备用；
[0051] S3)疫苗的制备：用接种环挑取单个菌落，接种培养于LB液体培养基，28℃振荡培养箱培养12小时，通过平板计数法计算菌液浓度，将菌液浓度调整至109CFU/mL，使用终浓度为0.2％的甲醛溶液在28℃条件下以及恒温灭活24小时的方式制得疫苗，置于4℃的冰箱中保存备用。
[0052] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对S2中复壮的凡隆气单胞菌菌株菌落形态特征及革兰氏染色观察如下：将已复壮的凡隆气单胞菌菌株进行平板划线，于28℃生化培养箱培养24小时后，观察其菌落形态，并进行革兰氏染色观察，在LB平板上培养24小时后，观察菌落形态特征如图8所示，菌落圆形，整体呈不透明的灰白色，表面光滑，边缘整齐，中央隆起，染色后如图9所示可观察到该菌为革兰氏阴性杆菌，菌体无芽孢，两端顿圆，大小约为(2.6-3.91)μm×(0.77-1.86)μm，与Santos等研究结果相比，本研究所使用的菌株与之形态相似，但菌体相对较大。
[0053] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中对S3中制得的109CFU/mL菌液进行人工感染实验如下：以腹腔注射的方式向10尾泥鳅注射0.3mL浓度为108CFU/mL的菌液，观察并记录一周内泥鳅的发病及死亡情况，试验泥鳅第2天开始出现死亡，一周内全部死亡，外部体征：部分体表具有出血点，菌液腹腔注射的部位肿大甚至腹腔肌肉腐烂，鳍基充血，肛
门红肿出血，解剖后发现鳃充血且部分有腮丝糜烂现象，肝胰脏充血发黄，肠充血，与健康泥鳅相比，症状如图2所示。
[0054] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对疫苗的半致死浓度(LD50)的测定如下：用接种环挑取单个菌落接种于LB液体培养基，28℃振荡培养箱培养12小时之后，通过平板计数法计算培养的菌液浓度，将菌液浓度调整至109CFU/mL，将该浓度的菌液以10-1，10-2，10-3以及10-4倍比稀释，将60尾健康泥鳅平均分为6组，其中5组分别对应一种稀释度，以腹腔注射的方式向其注射0.3mL菌液，同时对照组注射等量0.85％生理盐水，将试验泥鳅放置在水族箱内饲养，不换水不喂食，观察记录注射后7天内泥鳅的发病及死亡情况；腹腔注射不同浓度的菌液后，泥鳅的死亡情况如图3所示，用改进寇氏法计算得该菌的半致死浓度为2.06×107CFU/mL，杨求华等用其分离到的维氏气单胞菌感染鳗鲡后，测得其半致死浓度为2.15×107CFU/mL，本研究结论与之结果相似，说明两株菌
毒力相近；
[0055] 根据数据，利用下列改进寇氏法计算凡隆气单胞菌的半致死浓度；
[0056] 计算公式为：lgLD50＝Xk-d(∑Pi-0.5)
[0057] 公式中：Xk：最大对数剂量；
[0058] d：邻近两组对数剂量差值；
[0059] Pi：死亡率；
[0060] i：组号。
[0061] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对疫苗中的凡隆气单胞菌生长曲线的测定如下：向装有50mL新鲜LB液体培养基的锥形瓶中加入2.5mL过夜培养(约12小时)的凡隆气单胞菌液，混匀后，分别吸取5mL混合液加入到已标好序号的9只无菌试管中，于28℃摇床进行震荡培养，重复3组；培养0、1.5、3、5、7、9、11、13和15小时后，将对应时间的试管取出，于4℃保存，最后将9个时间段一同于OD600处的测定吸光度，取3组的平均值，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制凡隆气单胞菌的生长曲线，凡隆气单胞菌生长曲线如图4所示，由图可见，0-5小时内增长速度最快，为对数生长期；6-12小时为稳定期，李正伟将其研究的维氏气单胞菌接种于普通肉汤培养基中，0-6小时处于对数生长期，6小时达到最大值，6-20小时进入稳定期，此结论与本研究结果存在一定差异，是因为本实验菌株与其分离得到的菌株活性存在差异。
[0062] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对疫苗的无菌及安全性检测如下：取适量上述所制疫苗，于LB液体培养基中，28℃条件下振荡培养箱培养18小时，吸取0.2ml培养液涂布到LB液体培养基中，同样温度培养24小时，重复3组，观察有无细菌长出；随机挑选备用泥鳅7尾，分别接种0.3mL灭活疫苗，正常喂食，观察7天内试验泥鳅有无发病及死亡情况；若平板未观察到细菌，且试验泥鳅也未发病及死亡，所制疫苗即安全。
[0063] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对疫苗的接种方案如下：向30尾试验组泥鳅注射0.3mL浓度为109CFU/mL的灭活疫苗，对照组泥鳅则注射等量0.85％生理盐水，接种疫苗后的泥鳅放回水族箱内饲养直到进行攻毒，于第一次接种后第
28天后进行第二次免疫接种，第二次接种的疫苗及生理盐水量与第一次的接种量保持一致。
[0064] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对接种疫苗后的泥鳅的血液采集如下：每周(从接种疫苗开始，持续49天)从水族箱中随机抽取的3尾泥鳅，通过断尾取血的方式收集血液，将血液样本于室温冷凝1小时、4℃冰箱中过夜，使用高速离心机在4℃条件下以12000rpm离心10min，取上层血清，用于血清抗体效价、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶的测定，注射所制疫苗后，两组泥鳅的血清抗体效价如图5所示，第一次免疫接种后抗体效价呈先上升后下降趋势，于第21天达到最大值1:320；经二次免疫(第28天后)，抗体效价于第42天达到最大水平1:640并维持在这一水平一段时间，对照组的抗体效价均维持在1:20。
[0065] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对疫苗血清抗体效价的测定如下：采用微量滴定凝集试验测定血清抗体效价，反应抗原采用灭活的疫苗，将灭活的凡隆气单胞菌培养液12000rpm离心后用等量0.85％灭菌生理盐水重悬，60℃水浴锅水浴30分钟，于96孔板上，使用移液枪向第1孔加入80μL的0.85％生理盐水，其余各孔只加50μL(至第10孔)；接着使用移液枪向第1个孔加入20μL的血清样本，吹吸混匀后用移液枪吸取50μL混合液加至第2孔；再吹吸混匀后，从第2孔吸取50μL混合液加至第3孔；重复上述操作至第9孔，将第九孔中混合液直接弃去50μL，第10孔则作为对照(仅含生理盐水)，向每个孔各加入50μL灭活疫苗并吹吸混匀，将96孔板置于37℃恒温培养箱中孵育1小时后，于4℃条件下过夜，第二天观察是否有沉淀产生。
[0066] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对酸性磷酸酶(ACP)和超氧化物歧化酶(SOD)的测定如下：采用ACP试剂盒进行ACP测定，利用紫外可见分光光度计，使用1cm光径的比色皿，于OD520中，使用空白管调零，进行比色测定，根据下式计算ACP活力：免疫后，试验组和对照组泥鳅血清中的ACP活力变化如图6所示，可以看出，对照组活力水平保持在4.41-4.91U/100mL，变化不明显，试验组的ACP活力整体呈上升趋势，于28天达到最大值18.82U/100mL，进行二次免疫后，ACP活力出现一段时间的下降，而后上升且大于一次免疫的最大值。试验组ACP活力显著(0.01
[0067]
[0068] 采用SOD试剂盒进行SOD测定，利用紫外可见分光光度计，使用1cm光径的比色皿，于OD550中，使用双蒸水调零，进行比色测定：免疫后，试验组和对照组泥鳅血清中的SOD活力变化如图7所示，免疫接种后，试验组血清中SOD呈缓慢上升趋势，于28天检测到最大值163.40U/mL，二免后保持上升且活力水平大于第一次免疫，对照组则保持在114.48-
124.89U/mL，变化不明显，试验组SOD活力与对照组差异显著(0.01
[0069]
[0070] 优选的，所述泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的使用方法，其中包括对注射疫苗后的泥鳅的攻毒及相对免疫保护力的测定如下：免疫后第28天，用浓度为50LD50的活菌分别以腹腔注射的方式对试验组和对照组的泥鳅进行注射；攻毒后，将泥鳅放回水族箱内饲养，攻毒结束3天后重新开始喂食并换水，观察并统计14天的死亡率；
[0071] 按下式计算相对免疫保护力：3组平行培养基中均未发现有细菌长出，鱼体：注射该灭活疫苗的泥鳅均未出现发病及死亡状况；上述两者的检测结果表明所制疫苗安全，经过14天的攻毒观察，试验组和对照组泥鳅的死亡率和其相对免疫保护力如图1所示，对照组未有存活，试验组仅死亡3尾，计算得相对免疫保护力为70％：
[0072]
[0073] 综上可得，本发明通过多次试验论证以及采用了大量的试验数据计算，并且依据长时间的科学记载和推断，最终得出该泥鳅凡隆气单胞菌疫苗在对于提高泥鳅的免疫保护中，起到了显著地效果，在对该泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的试验中，多次采用了对照试验的方式，得出了显著的试验对比效果，为实验提供了有效的说服力，并且还对该泥鳅凡隆气单胞菌疫苗对于泥鳅的致死浓度进行了细致的研究，得出了安全的疫苗浓度，为后续该泥鳅凡隆气单胞菌疫苗的生产和推广提供了强有力的科学依据，同时也为凡隆气单胞菌灭活疫苗在水产动物上的应用提供参考，解决了现有国内凡隆气单胞菌疫苗的研究困难，填补了现今尚未有凡隆气单胞菌疫苗对泥鳅免疫保护的研究的空白。
[0074] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、
修改、替换和变型，本发明的范围由所附
权利要求及其等同物限定。
