本发明提供了来自棒状细菌(coryneform bacteria)的编码lysR2 基因的核苷酸序列，和通过弱化lysR2基因发酵生产氨基酸尤其L- 赖氨酸和L-缬氨酸的方法。lysR2基因编码LysR2蛋白，其是LysR 家族的一种转录调节物。

现有技术

L-氨基酸特别是L-赖氨酸和L-缬氨酸用于人用药物和制药工 业，食品工业，特别是动物营养。

已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而 生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产 方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成 如发酵期间的糖浓度，或例如通过离子交换层析对产物形式的加工 方法，或微生物本身的固有生产性质。

为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选 择等方法，以此方法可获得对抗代谢物有抗性或重要的调节代谢物 缺陷的并产生氨基酸的菌株。

一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于改良棒杆菌菌株生 产L-氨基酸的能力。

发明目的

本发明人的目的是为发酵生产氨基酸，尤其L-赖氨酸和L-缬氨 酸提供改良的新方法。

发明描述

本发明提供了来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包含编码 lysR2基因的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自：

a)与编码包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的多核苷酸至 少70％相同的多核苷酸，

b)编码包含与SEQ ID NO：2氨基酸序列至少70％相同的氨 基酸序列的多肽的多核苷酸，

c)与a)或b)多核苷酸互补的多核苷酸，及

d)包含a)，b)或c)多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的 多核苷酸，

所述多肽优选具有转录调节物LysR2活性。

本发明还提供了上述多核苷酸，其优选是一种能复制的DNA， 包含：

(i)SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，或

(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序

列，或    

(iii)与(i)或(ii)序列的互补序列杂交的至少一个序列，

及任选地，

(iv)(i)中中性功能的有义突变，其不改变所述蛋白质/多 肽的活性。

本发明还提供了：

a)多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的 第1-231位的至少15个连续核苷酸，

b)多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的 第232-1161位的至少15个连续核苷酸，

c)多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的 第1162-1364位的至少15个连续核苷酸。

本发明还提供了：

一种DNA，其是能复制的并包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

一种多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多 肽；

一种载体，其含有本发明的多核苷酸的部分，至少是所述序列 的15个连续核苷酸；及

棒状细菌，其中lysR2基因尤其是通过插入或缺失而弱化。

本发明还提供了多核苷酸，其基本上包含一种多核苷酸序列， 所述多核苷酸可通过用具有相应于SEQ ID NO：1所述多核苷酸或 其片段的序列的探针杂交合适的基因文库，并分离所述的DNA序列 来筛选获得，所述的文库包括具有相应于SEQ ID NO：1所述多核 苷酸序列的完整基因。

本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探 针，以分离编码LysR2蛋白的全长核酸或多核苷酸或基因，或分离 与lysR2基因的序列具有高度序列相似性的核酸、多核苷酸或基因。 它们也适于掺入所谓的“阵列”，“微阵列”或“DNA芯片”中，以 检测和确定相应的多核苷酸。

另外，含有本发明序列的多核苷酸还适用作引物，借助于其通 过聚合酶链反应(PCR)，可以制备编码LysR2蛋白的基因的DNA。

作为探针或引物的这种寡核苷酸包含至少25，26，27，28，29 或30个、优选至少20，21，22，23或24个、特别优选至少15，16， 17，18或19个连续核苷酸。长度至少为31，32，33，34，35，36， 37，38，39或40个，或至少41，42，43，44，45，46，47，48，49 或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。具有至少100，150，200， 250或300个核苷酸的寡核苷酸也任选是适当的。

“分离的”是指从其天然环境中分离出来。

“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷 酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。

本发明的多核苷酸包括SEQ ID NO：1所示多核苷酸或从中制备 的片段，或者与SEQ ID NO：1所示多核苷酸具有至少70-80％，优 选至少81％-85％，特别优选具有至少86％-90％，及非常优选至 少91％，93％，95％，97％或99％相同性的那些多核苷酸，或从中制 备的片段。

“多肽”应理解为包含经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或 蛋白质。

本发明的多肽包括SEQ ID NO：2的多肽，特别是具有LysR2 蛋白生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO：2的多肽至少70-80 ％，优选至少81-85％，特别优选至少86-90％，及非常优选至少 91％，93％，95％，97％或99％相同并具有所述活性的多肽。

本发明另外还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌发酵生产 氨基酸的方法，在该棒状细菌中编码lysR2基因的核苷酸序列被弱 化，尤其是被消除或低水平表达，所述生产的氨基酸选自L-天冬酰 胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱 氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸， L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，L-精氨酸，尤其是L- 赖氨酸和L-缬氨酸。

文中术语“弱化”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶 (蛋白质)的胞内活性的降低或消除，例如通过使用弱启动子或编 码低活性相应酶的基因或等位基因，或失活相应基因或酶(蛋白质)， 及如果需要组合使用这些方法。

本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖 蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产氨基酸特别是L-赖氨酸和 L-缬氨酸。所述微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。 在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知 其生产L-氨基酸的能力。

适当的棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生 型菌株：

谷氨酸棒杆菌ATCC 13032

醋谷棒杆菌ATCC 15806

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539

黄色短杆菌ATCC 14067

乳发酵短杆菌ATCC 13869和

扩展短杆菌ATCC 14020

或从中获得的生产L-氨基酸的突变体或菌株，例如生产L-赖 氨酸的菌株：

谷氨酸棒杆菌FERM-P1709

黄色短杆菌FERM-P1708

乳发酵短杆菌FERM-P1712

谷氨酸棒杆菌FERM-P6463

谷氨酸棒杆菌FERM-P6464

谷氨酸棒杆菌DM58-1

谷氨酸棒杆菌DG52-5

谷氨酸棒杆菌DSM 5715和

谷氨酸棒杆菌DSM 12866

或例如生产L-缬氨酸的菌株：

谷氨酸棒杆菌DSM 12455

谷氨酸棒杆菌FERM-P9325

乳发酵短杆菌FERM-P9324

乳发酵短杆菌FERM-BP1763。

本发明人已成功地从谷氨酸棒杆菌中分离编码LysR2蛋白的新 lysR2基因，该蛋白是LysR家族的一种转录调节物。

为了分离谷氨酸棒杆菌的lysR2基因或其他基因，首先在大肠 杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册 建立基因文库。例如由Winnacker所著教材：基因与克隆，基因工 程入门(Verlag Chamie，Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所 著手册：分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50，495-508 (1987))在入载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。 Bathe等(分子及普通遗传学，252：255-265，1996)阐述了借助 于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the National Academy of Sciences USA，84：2160-2164)，在E.coli K-12菌株 NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)中建立的 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。Bormann等(分子微生物 学6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohm和Collins，基因11， 291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。

为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒 如pBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或pUC9(Viera 等，1982，基因19：259-268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺 陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5α(Jeffrey H.Miller：“细 菌遗传学短期教材，针对大肠杆菌和相关细菌的实验指导和手册”， 冷泉港实验室出版社，1992)。

然后将借助于粘粒或其它λ载体克隆的长DNA片段，亚克隆入 适于DNA测序的常规载体中。

DNA测序方法参见于Sanger等(美国科学院院报74：5463- 5467，1977)所述。

获得的DNA序列然后可以使用已知公式或序列分析程序加以检 测，如Staden(核酸研究14，217-232(1986))所述，Marck(核 酸研究16，1829-1836(1988))所述，或Butler所述GCG程序(生 物化学分析方法39，74-97(1998))。

以此方式可获得编码lysR2基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序 列，示作SEQ ID NO：1，是本发明的一部分。另外，用前述方法从 此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得lysR2基 因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO：2表示。已知宿主中内源性酶 可以断裂所形成的蛋白质的N末端甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸。

通过遗传密码的简并性产生自SEQ ID NO：1的编码DNA序列 也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1 的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，本领域技术人 员已知，蛋白质中的保守氨基酸置换如用丙氨酸置换甘氨酸，或用 谷氨酸置换天冬氨酸，是有义突变，其不引起所述蛋白质活性的任 何改变，即它们是中性的。另外，已知在蛋白质N末端和/C末端的 变化基本不损害其功能而且甚至还稳定其功能。本领域技术人员可 以找到关于这方面的信息，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169：751 -757(1987))，O'Regan等(基因77：237-251(1989))，Sahin-Toth 等(蛋白质科学3：240-247(1994))，Hochuli等(生物/技术6：1321 -1325(1988))及熟知的遗传和分子生物学教材。以适当方式产生 自SEQ ID NO：2的氨基酸序列也是本发明的一部分。

最后，使用得自SEQ ID NO：1的引物通过聚合酶链反应(PCR) 产生的DNA序列是本发明的一部分。这种寡核苷酸典型地具有至少 15个核苷酸。

通过杂交鉴别DNA序列的指导可见于Boehringer Mannheim GmbH(德国曼海姆，1993)的“滤膜杂交的DIG系统使用指导”， 和Liebl等(国际系统细菌学杂志41：255-260(1991))。用聚合酶链 反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册：寡核苷酸合 成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham： PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。

本发明人发现，在lysR2基因弱化后，棒状细菌以改良方式生 产氨基酸，尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸。

为获得弱化，可降低或消除lysR2基因的表达或酶蛋白的催化 活性。两种措施可任选地组合。

可通过适当控制培养或通过遗传修饰(突变)用于基因表达的 信号结构而实现降低基因表达。用于基因表达的信号结构例如是阻 遏基因、激活基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、 起始密码子和终止子。本领域技术人员可在如下文献中发现此方面 的信息，例如专利申请WO96/15246，Boyd & Murphy(细菌学杂志 170：5949(1988))，Voskuil & Chambliss(核酸研究26：3548(1998))， Jensen & Hammer(生物技术和生物工程58：191(1998))，Patek等 (微生物学142：1297(1996))，Vasicova等(细菌学杂志181：6188 (1999))，以及已知的遗传学和分子生物学教科书如Knippers的教 科书(分子遗传学，第6版，Georg Thieme Verlag，德国斯图加特， 1995)，或Winnacker的教科书(基因和克隆，VCH Verlagsgesellschaft， Weinheim，德国，1990)。

导致酶蛋白催化活性的变化或降低的突变是现有技术中已知 的，可提及的例如Qiu和Goodman的工作(生物化学杂志272：8611 -8617(1997))，Sugimoto等(生物科学生物技术和生物化学61：1760 -1762(1997))以及Mockel(谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱水酶：酶的变 构调节和结构，Berichte des Forschungszentrums Julichs，Jul- 2906，ISSN09442952，Julich，德国，1994)。综述可参见遗传学和分子 生物学的已知教科书，如Hagemann的教科书(＂Allgemeine Genetik＂， Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。

合适的突变是转换、颠换、插入和缺失。根据氨基酸置换对酶 活性的影响，分别为错义突变或无义突变。在基因中插入或缺失至 少一个碱基对(bp)导致移码突变，其结果是插入不正确的氨基酸 或者翻译过早终止。缺失几个密码子典型地导致酶活性的完全丧失。 产生此类突变的指导属于现有技术并可在遗传学和分子生物学的已 知教科书中找到，如Knippers的教科书(分子遗传学，第6版，Georg Thieme Verlag，德国斯图加特，1995)，Winnacker的教科书(基因 和克隆，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)或Hagemann 的教科书(＂普通遗传学＂，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。

在谷氨酸棒杆菌中突变基因的一般方法是基因破坏和基因置换 方法，如Schwarzer和Puhler所述(生物/技术9，84-87(1991))。

在基因破坏方法中，将所述基因编码区的中心部分克隆在质粒 载体中，所述载体能在宿主中复制(典型在大肠杆菌中复制)，但在 谷氨酸棒杆菌中不能复制。适当的载体例如pSUP301(Simon等， 生物/技术1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer 等，基因145，69-73(1994))，pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jager 等，细菌学杂志174：5462-65(1992))，pGEM-T(Promega公司， Madison，Wis.，美国)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994))，生物化学 杂志269：32678-84；美国专利No.5487993)，pCRBlunt(Invitrogen， Groningen，Netherlands；Bernard等，分子生物学杂志234：534-541 (1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志173：4510-4516)。 然后将含有所述基因编码区中心部分的质粒载体通过接合或转化移 至所需谷氨酸棒杆菌菌株中。接合方法例如Schafer等(应用和环境 微生物学60，756-759(1994))所述。转化方法例如Thierbach等 (应用微生物学及生物技术学29，356-362(1988))，Dunican和 Shivnan(生物/技术7，1067-1070(1989))及Tauch等(FEMS微 生物学通信123，343-347(1994))所述。在通过“交换”同源重 组后，相应基因的编码区被载体序列间断，并获得两个不完整的等 位基因，一个缺失3’末端，一个缺失5’末端。这个方法例如已经由 Fitzpatrick等使用，以消除谷氨酸棒杆菌中的recA基因(应用微生 物学和生物技术42，575-580(1994))。

图1示出质粒载体pCR2.llysR2int，利用其可破坏或消除lysR2 基因。

在基因置换方法中，突变例如缺失，插入或碱基置换是在体外 在相应基因中产生的。然后将产生的等位基因克隆入在谷氨酸棒杆 菌中不复制的载体中，接着将其通过转化或接合移至所需谷氨酸棒 杆菌宿主中。在通过实现整合的第一次“交换”事件，及实现靶基 因或靶序列中的切除的第二次“交换”事件的同源重组后，实现掺 入突变体或等位基因。这种方法例如已经由Peters-Wendisch等使用， 以通过缺失而消除谷氨酸棒杆菌中的pyc基因(微生物学144，915 -927(1998))。

以此方式可以在lysR2基因中掺入缺失，插入或碱基置换。

另外，除了lysR2基因的弱化之外，特定生物合成途径、糖酵 解、回补代谢、柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶的增强特别 是过表达，对L-氨基酸尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸的生产也可以是 有益的。

术语“增强”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶的 胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或用强启动子或编 码高活性相应酶(蛋白质)的基因，及任选地组合使用这些方法。

因此，例如为生产L-赖氨酸，选自以下的一或多种基因可以 同时增强尤其过表达：

·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B- 0197335)，

·编码烯醇化酶的eno基因(DE：19947791.4)，

·编码zwf基因产物的zwf基因(JP-A-09224661)，

·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物 学144，915-927(1998))，

·编码赖氨酸输出的lysE基因(DE-A-19548222)，

·编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(EP-B-0387527； EP-A-0699759)，

·编码Zwal蛋白的zwal基因(19959328.0，DSM13115)。

因此，例如为生产L-缬氨酸，选自以下的一或多种基因或等位 基因可以同时增强、尤其过表达：

·编码乙酰羟酸合酶的ilvBN基因(Keilhauer等，(1993)，细 菌学杂志175：5595-5603)，或

·编码二羟酸脱水酶的ilvD基因(Sahm和Eggeling(1999)， 应用和环境微生物学65：1973-1979)，或

·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲 生物化学杂志254，395-403(1998))。

为生产氨基酸尤其L-赖氨酸，除了弱化lysR2基因之外，同时 弱化选自以下的一或多种基因也是有益的：

·编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因(DE19950409.1， DSM13047)，

·编码编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US09/396478， DSM12969)，

·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE：19951975.7，DSM13114)，

·编码Zwa2蛋白的zwa2基因(DE：19959327.2，DSM13113)。

最后，为生产氨基尤其L-赖氨酸，除了弱化lysR2基因之外， 同时弱化尤其消除选自以下的一或多种基因的表达也是有益的：

·编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因(EP-A-0131171)，

·编码高丝氨酸激酶的thrB基因(Peoples，O.W.等，分子微 生物学2(1988)：63-72)，

·编码天冬氨酸脱羧酶的panD基因(EP-A-1006192)。

弱化高丝氨酸脱氢酶也可以通过氨基酸置换实现，例如将酶蛋 白第59位的L-缬氨酸置换为L-丙氨酸，L-甘氨酸或L-亮氨酸，将 酶蛋白第104位的L-缬氨酸置换为L-异亮氨酸，L-缬氨酸或L-亮氨 酸，和/或酶蛋白的第118位L-天冬酰胺置换为L-苏氨酸或L-丝氨 酸。

弱化高丝氨酸激酶也可以通过氨基酸置换实现，例如将酶蛋白 第133位的L-丙氨酸置换为L-缬氨酸，L-甘氨酸或L-亮氨酸，和/ 或将酶蛋白第138位的L-脯氨酸置换为L-苏氨酸，L-异亮氨酸或L- 丝氨酸。

弱化天冬氨酸脱羧酶也可以通过氨基酸置换实现，例如将酶蛋 白第36位的L-丙氨酸置换为L-甘氨酸，L-缬氨酸或L-异亮氨酸。

另外，除lysR2基因的弱化之外，抑制非所需的二级反应对氨 基酸尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸的生产也是有益的(Nakayama：“生 产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl， Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。

本发明还提供了根据本发明制备的微生物，其可连续培养或在 分批方法，或在补料分批法或重复补料分批法中分批培养以生产L -氨基酸尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸。已知的培养法由Chmiel(生 物方法技术学1，生物工程入门，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991) 所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag， Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。

所用培养基必须以适当方式符合特定菌株的需求，关于各种微 生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华 盛顿D.C.，USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如 葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和 脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂 酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独 或混合使用。

可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏， 麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵， 氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可单独或混合使用。

可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠 盐。另外培养基还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。 最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素， 此外，可将适当前体加入培养基中。上述物质可以单批形式或在培 养期间以适当方式加入培养物中。

可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或 酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值，抗泡沫剂例如 脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例 如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合 气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在 20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至所需产物形成最大量。 此目的通常在10～160小时范围达到。

L-氨基酸的分析方法是现有技术中已知的，分析可如Speckman 等(分析化学，30，(1958)，1190)所述通过阴离子交换层析，随 后经茚三酮衍生化作用进行，或通过反相HPLC，如Lindroth等(分 析化学(1979)51：1167-1174)进行。

以下微生物以纯化培养物形式于2000年7月28日，根据布达 佩斯条约，保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德 国)：

·大肠杆菌菌株TOPl0F/pCR2.llysR2int，保藏号DSM 13617。

本发明的方法用于发酵生产氨基酸，尤其L-赖氨酸和L-缬氨酸。

本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。

从大肠杆菌中分离质粒DNA及所有的限制、Klenow处理和碱 性磷酸酶处理方法，均如Sambrook等所述进行(分子克隆实验手册， 1989，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y美国)。大肠杆菌的转化 方法也见于这本手册。

常用的培养基如LB培养基或TY培养基的组分也得自Sambrook 等所著手册。

实施例1制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组粘粒基因文 库

如Tauch等(1995，质粒33：168-179)所述分离谷氨酸棒杆 菌ATCC13032的染色体DNA并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02) 部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼 海姆，产品描述SAP，编号1758250)将DNA片段去磷酸化。将得 自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试 剂盒，编号251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)美国科学 院院报84：2160-2164)的DNA，用限制性内切酶XbaI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI，编号27-0948-02)酶 切并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。

粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia， Freiburg，德国，产品描述BamHI，编号27-0868-04)酶切。将以 此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA片段混合，并用 T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4 -DNA-连接酶，编号27-0870-04)处理。连接混合物然后用 Gigapack II XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述 Gigapack II XL包装提取物，编号200217)包装进噬菌体中。

为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16： 1563-1575)，将细胞置于10mM MgSO4并与噬菌体悬浮液混合。 如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒 文库的感染和滴定，细胞在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂 (Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。在37℃保温过夜后，选 择重组克隆。

实施例2 lysR2基因的分离和测序

用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden， 德国)根据厂商指导分离一个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶 Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI， 编号27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编号1758250)将DNA 片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产 品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp 的粘粒片段。

得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克 隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-l的DNA用限制 性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述 BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分 子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1 中的连接，DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech，Freiburg，德 国)保温过夜。然后将这一连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS 微生物学通信，123：343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990， 美国科学院院报87：4645-4649)并在含有50μg/ml的zeocin的LB 琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。

重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen， Hilden，德国)进行。测序用Zimmeermann等(1990，核酸研究18： 1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74：5463-5467) 的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号 403044，Weiterstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”。 在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism 377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(29： 1)(产品号A124.1，Roth，Karlsruhe，德国)中进行凝胶电泳分离和 序列分析。

得到的原始序列资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14： 217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续 重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14：217-231) 制备计算机辅助编码区分析。同源性分析用“BLAST搜索程序” (Altschul等，1997，核酸研究，25：3389-3402)对“国家生物技 术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行。

获得的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。对该核苷酸序列的 分析显示一933碱基对的开放读框，其被称为lysR2基因。lysR2基 因编码310个氨基酸的多肽。

实施例3  用于lysR2基因的整合诱变的整合载体的制备

用Eikmanns等的方法(微生物学140：1817-1828(1994))从 菌株ATCC 13032中分离染色体DNA。基于实施例2已知的谷氨酸 棒杆菌的lysR2基因的序列，选择如下寡核苷酸进行聚合酶链反应：

lysR2intA：

5′-CCA TCG TCG CAG AAT TCA AC-3′

lysR2intB：

5′-GCT TCT TCG GCT AAT GCA TC-3′。

所述引物由MWG生物技术公司(Ebersberg，德国)合成，根 据Innis等的标准PCR方法(PCR方案，方法和应用指南，1990， 学术出版社)，用来自曼海姆宝灵格公司的Pwo聚合酶进行PCR反 应。借助于聚合酶链反应，分离了lysR2基因的一个439bp长的内 部片段，示作SEQ ID NO：3。

用来自Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carsbad，CA， USA；目录号K4500-01)，将扩增的DNA片段连接进载体pCR2.1- TOPO(Mead等，(1991)生物/技术9：657-663)中。

然后将这一连接混合物转化进大肠杆菌菌株TOP10F(Hanahan， DNA克隆实用方法，卷I，IRL出版社，Oxford，华盛顿特区，美 国，1985)。通过将转化混合物在补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂 (Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社， 冷泉港，纽约，1989)上铺板，选择携带质粒的细胞。用来自Qiagen 的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化子中分离质粒DNA，并用限 制酶EcoRI限制消化及琼脂糖凝胶电泳(0.8％)而证实。质粒命名 为pCR2.llysR2int。

实施例4  lysR2基因在赖氨酸生产菌株DSM 5715和缬氨酸生 产菌株FERM BP-1763中的整合诱变

根据Tauch等的电穿孔方法(FEMS微生物学通信123：343- 347(1994))，将实施例3中的载体pCR2.llysR2int电穿孔进谷氨酸棒 杆菌DSM 5715和乳发酵短杆菌FERM BP-1763中。菌株DSM5715 是AEC抗性赖氨酸生产菌(EP-B-435132)。菌株FERM BP-1763是 需要异亮氨酸和甲硫氨酸的缬氨酸生产菌(US-A-5188948)。载体 pCR2.llysR2int在DSM 5715或FERM BP-1763中不能独立复制，只 有在其整合进DSM5715或FERM BP-1763的染色体中后才能在细 胞中保持。通过将电穿孔混合物在补加15mg/l卡那霉素的LB琼脂 (Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社， 冷泉港，纽约，1989)上铺板，选择携带整合进染色体的pCR2.llysR2int 的克隆。

通过用来自宝灵格公司的Dig杂交试剂盒，根据宝灵格曼海姆 有限公司的“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国， 1993)的方法标记lysR2int片段，以检测整合已经发生。根据Eikmanns 等的方法(微生物学140：1817-1828(1994))，从潜在整合子中分 离染色体DNA，并分别用限制酶SalI，SacI和HindIII切割。经琼脂 糖凝胶电泳分离得到的片段，并用来自宝灵格公司的Dig杂交试剂 盒在68℃杂交。实施例3中的质粒pCR2.llysR2int已插入DSM5715 和FERM BP-1763染色体中的染色体lysR2基因内。该菌株命名为 DSM5715::pCR2.llysR2int和FERM BP-1763::pCR2.llysR2int。

实施例5  L-赖氨酸和L-缬氨酸的生产

实施例4中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715::pCR2.llysR2int 和乳发酵短杆菌FERM BP-1763::pCR2.llysR2int在适于生产L-赖 氨酸和L-缬氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中的L- 赖氨酸和L-缬氨酸含量。

为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有卡那霉素 (25mg/l)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这些琼脂板培养物开 始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的 培养基是完全培养基CgIII。

培养基CgIII

NaCl                    2.5g/l

Bacto-肽胨              10g/l

Bacto-酵母膏            10g/l

葡萄糖(单独高压灭菌)    2％(w/v)

pH调节为7.4。

向此培养基中加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm 振荡培养预培养物24小时。以此预培养物接种主培养物，从而主培 养物的起始光密度(OD，660nm)是0.1。培养基MM用作主培养 基。

培养基MM：

CSL(玉米浆)             5g/l

MOPS(吗啉代丙磺酸)      20g/l

葡萄糖(单独高压灭菌)    50g/l

盐：

(NH4)2SO4            25g/l

KH2PO4                0.1g/l

MgSO4·7H2O           1.0g/l

CaCl2·2H2O           10mg/l

FeSO4·7H2O           10mg/l

MnSO4·H2O            5.0mg/l

生物素(过滤灭菌)        0.3mg/l

硫胺素·HCl(过滤灭菌)   0.2mg/l

CaCO3                  25g/l

用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加 入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。针对 培养DSM5715，在培养基中额外加0.1g/l亮氨酸。针对培养FERM BP-1763，在所述培养基中额外加0.1g/l异亮氨酸和0.1g/l甲硫氨 酸。

以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养，加入卡 那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。

72小时后，用Biomek1000(Beckmann仪器有限公司，慕尼黑) 确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基 酸分析仪(汉堡，德国)，经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生 化而确定形成的L-赖氨酸和L-缬氨酸的量。

所得结果示于表1和2。

表1 菌株     OD   (660nm) 赖氨酸HCl     g/L  DSM5715     7.5     13.01  DSM5715::pCR2.llysR2int     7.2     14.68

表2 菌株     OD   (660nm)   缬氨酸     g/L  FERM BP-1763     12.1     7.49  FERM BP-1763::pCR2.llysR2int     13.4     10.90

附图简述

图1：质粒pCR2.llysR2int图谱。

图中所采用的缩写和符号有如下含义：

KmR：卡那霉素抗性

EcoRI：限制酶EcoRI的酶切位点

lysR2int：lysR2基因的内部片段

ColEl ori：质粒ColE1的复制源点

                         序列表 <110>德古萨股份公司 <120>编码lysR2基因的核苷酸序列 <130>000181 BT <140> <141> <160>5 <170>PatentIn Ver.2.1 <210>1 <211>1364 <212>DNA <213>Corynebacterium glutamicum <220> <221>CDS <222>(232)..(1161) <223>lysR2基因 <400>1 cctgcgtgca ataaagacca ttgaaagcag caagaccggc ggccagcatc gcaaacacag  60 cgcgcttgta attgcgtgtt cctcgctcga tgccttcgtg gccttcgtgg ccttcgtgtg  120 cctcgacctt gctatctatt gcttggctca tggagttcat catgcgccaa cagcaaatat  180 tagtaaaatg ttagaaatag ctgtttttga ttcactttgt gcatgtaggc t gtg acc   237

                                                      Met Thr

                                                       1 atg ggc aac gac ggc gga gac ctg cga atc gac gac cta cgc agc ttc    285 Met Gly Asn Asp Gly Gly Asp Leu Arg Ile Asp Asp Leu Arg Ser Phe

      5                  10                  15 att tca gtc gct caa tca ggc cac ctc acc gaa act gcc gaa aga tta    333 Ile Ser Val Ala Gln Ser Gly His Leu Thr Glu Thr Ala Glu Arg Leu

 20                  25                  30 ggc atc ccg cag ccc aca ctt tcc aga cga atc age cga gtg gaa aaa   381 Gly Ile Pro Gln Pro Thr Leu Ser Arg Arg Ile Ser Arg Val Glu Lys  35                  40                  45                  50 cac gca ggc acc cca ctt ttc gac cgc gcc ggc cgc aaa ctc gtc ctc   429 His Ala Gly Thr Pro Leu Phe Asp Arg Ala Gly Arg Lys Leu Val Leu

             55                  60                  65 aac cae cga ggc cac gcc ttc ctc aac cac gcc agc gcc atc gtc gca   477 Asn Gln Arg Gly His Ala Phe Leu Asn His Ala Ser Ala Ile Val Ala

         70                  75                  80 gaa ttc aac tcc gcc gca act gaa atc aaa cgc ctc atg gac cca gaa   525 Glu Phe Asn Ser Ala Ala Thr Glu Ile Lys Arg Leu Met Asp Pro Glu

     85                  90                  95 aaa ggc aca atc cga ctg gac ttc atg cat tcc ttg ggc act tgg atg   573 Lys  Gly Thr Ile Arg Leu Asp Phe Met His Ser Leu Gly Thr Trp Met

 100                 l05                 110 gtc ccc gaa ctt atc cga aca ttc cgc gcc gaa cac ccc aac gta gaa   621 Val Pro Glu Leu Ile Arg Thr Phe Arg Ala Glu His Pro Asn Val Glu 115                 120                 125                 130 ttc caa ctc cac caa gcg gca gca atg ctc ctg gta gat cgt gtt ttg   669 Phe Gln Leu His Gln Ala Ala Ala Met Leu Leu Val Asp Arg Val Leu

            135                 l40                 145 gct gat gaa act gac ctc gca tta gtt ggc ccc aaa cct gcc gag gtt   717 Ala Asp Glu Thr Asp Leu Ala Leu Val Gly Pro Lys Pro Ala Glu Val

        150                 155                 160 ggt acc tct tta ggg tgg gcg cca ctg ctt cgt caa cga ctt gcc cta   765 Gly Thr Ser Leu Gly Trp Ala Pro Leu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Leu

    165                 170                 175 gct gtt ccc gca gat cac cgg ctt gcc tcc ttt tct ggc caa gga gaa   813 Ala Val Pro Ala Asp His Arg Leu Ala Ser Phe Ser Gly Gln Gly Glu

180                 185                 190 ttg ccg ttg att act gcg gcg gaa gaa cct ttc gtg gcg atg cga gca   861 Leu Pro Leu Ile Thr Ala Ala Glu Glu Pro Phe Val Ala Met Arg Ala l95                 200                 205                 210 ggt ttc ggc acc cga ctc ctc atg gat gca tta gcc gaa gaa gcc ggt   909 Gly Phe Gly Thr Arg Leu Leu Met Asp Ala Leu Ala Glu Glu Ala Gly

            215                 220                 225 ttt gtt ccc aat gtg gtt ttc gaa tcc atg gaa ctc acc acc gtc gca   957 Phe Val  Pro Asn Val Val Phe Glu Ser Met Glu Leu Thr Thr Val Ala

         230                 235                 240 ggg ctt gtc agc gca ggt ctc ggc gtt ggt gtg gtt ccg atg gat gat   1005 Gly Leu Val Ser Ala Gly Leu Gly Val Gly Val Val Pro Met Asp Asp

    245                 250                 255 ccg tac ctt ccc aca gtg gga atc gtg caa cgc cca ctt agt cca ccc   1053 Pro Tyr Leu Pro Thr Val Gly Ile Val Gln Arg Pro Leu Ser Pro Pro

260                 265                 270 gct tat agg gaa cta ggt ttg gtg tgg cga ctc aac gcg ggg ccg gca   1101 Ala Tyr Arg Glu Leu Gly Leu Val Trp Arg Leu Asn Ala Gly Pro Ala 275                 280                 285                 290 cct gcg gtg gat aac ttc cgg aag ttc gtg gcg gga tcg agg tat gca   1149 Pro Ala Val  Asp Asn Phe Arg Lys Phe Val Ala Gly Ser Arg Tyr Ala

             295                 300                 305 tta gaa gag ggc tgagctgtaa gtgtcgtggg tgccgtttta aggggttgag       1201 Leu Glu Glu Gly

        310 ttttcccgat gactaggagt tggtccagat tgtgcgttag gggcccctag gggcgattct  1261 ggggctggtg tttttgtggc catgggggtt ggtgttaatc ctggaggctt gctgcasgat  1321 tgctgttaaa cttctcgtca cggatcgctt gggaagcctg gaa                    1364 <210>2 <211>310 <212>PRT <213>Corynebacterium glutamicum <400>2 Met Thr Met Gly Asn Asp Gly Gly Asp Leu Arg Ile Asp Asp Leu Arg   1               5                  10                  15 Ser Phe Ile Ser Val Ala Gln Ser Gly His Leu Thr Glu Thr Ala Glu

         20                  25                  30 Arg Leu Gly Ile Pro Gln Pro Thr Leu Ser Arg Arg Ile Ser Arg Val

    35                   40                  45 Glu Lys His Ala Gly Thr Pro Leu Phe Asp Arg Ala Gly Arg Lys Leu

 50                  55                  60 Val Leu Asn Gln Arg Gly His Ala Phe Leu Asn His Ala Ser Ala Ile 65                  70                   75                  80 Val Ala Glu Phe Asn Ser Ala Ala Thr Glu Ile Lys Arg Leu Met Asp

             85                  90                  95 Pro Glu Lys Gly Thr Ile Arg Leu Asp Phe Met His Ser Leu Gly Thr

        100                 105                 110 Trp Met Val Pro Glu Leu Ile Arg Thr Phe Arg Ala Glu His Pro Asn

    115                 120                 125 Val Glu Phe Gln Leu His Gln Ala Ala Ala Met Leu Leu Val Asp Arg

130                 135                 l40 Val Leu Ala Asp Glu Thr Asp Leu Ala Leu Val Gly Pro Lys Pro Ala l45                 150                 155                 160 Glu Val Gly Thr Ser Leu Gly Trp Ala Pro Leu Leu Arg Gln Arg Leu

            165                 170                 175 Ala Leu Ala Val Pro Ala Asp His Arg Leu Ala Ser Phe Ser Gly Gln

        180                 185                 190 Gly Glu Leu Pro Leu Ile Thr Ala Ala Glu Glu Pro Phe Val Ala Met

    195                 200                 205 Arg Ala Gly Phe Gly Thr Arg Leu Leu Met Asp Ala Leu Ala Glu Glu

210                 215                 220 Ala Gly Phe Val Pro Asn Val Val Phe Glu Ser Met Glu Leu Thr Thr 225                 230                 235                 240 Val Ala Gly Leu Val Ser Ala Gly Leu Gly Val Gly Val Val Pro Met

            245                 250                 255 Asp Asp Pro Tyr Leu Pro Thr Val Gly Ile Val Gln Arg Pro Leu Ser

        260                 265                 270 Pro Pro Ala Tyr Arg Glu Leu Gly Leu Val Trp Arg Leu Asn Ala Gly

    275                 280                 285 Pro Ala Pro Ala Val Asp Asn Phe Arg Lys Phe Val Ala Gly Ser Arg

290                 295                 300 Tyr Ala Leu Glu Glu Gly 305                 310 <2l0>3 <211>439 <212>DNA <213>Corynebacterium glutamicum <220> <223>lysR2int <400>3 ccatcgtcgc agaattcaac tccgccgcaa ctgaaatcaa acgcctcatg gacccagaaa  60 aaggcacaat ccgactggac ttcatgcatt ccttgggcac ttggatggtc cccgaactta  120 tccgaacatt ccgcgccgaa caccccaacg tagaattcca actccaccaa gcggcagcaa  180 tgctcctggt agatcgtgtt ttggctgatg aaactgacct cgcattagtt ggccccaaac  240 ctgccgaggt tggtacctct ttagggtggg cgccactgct tcgtcaacga cttgccctag  300 ctgttcccgc agatcaccgg cttgcctcct tttctggcca aggagaattg ccgttgatta  360 ctgcggcgga agaacctttc gtggcgatgc gagcaggttt cggcacccga ctcctcatgg  420 atgcattagc cgaagaagc                                               439 <210>4 <211>20 <212>DNA <213>Corynebacterium glutamicum <220> <223>引物lysR2intA <400>4 ccatcgtcgc agaattcaac                                               20 <210>5 <211>20 <212>DNA <213>Corynebacterium glutamicum <220> <223>引物lysR2intB <400>5 gcttcttcgg ctaatgcatc                                               20