本发明涉及调节GRC的分子,其在GABA的α-2亚单位上具 有选择性效能从而产生在治疗上有用的效应而没有副作用。本发明 进一步涉及由化学式I表示的取代的喹诺酮,其作为通过GABAA 受体复合物(GRC)介导的GABA促进的氯离子流动的增强子。
本发明还涉及治疗GABA对GABA受体的增强作用起反应的 哺乳动物障碍的方法,具体是:通过给予有效量的化学式I的化合 物以及通过新颖部位的激活作用,该新颖部位介导化学式I的化合 物的作用如本文中所述。该新颖部位是通过排他标准来进行定义, 其中化学式I的化合物并不作用于GRC的已知部位,该已知部位 包括用于下述的作用部位:GABA、苯并二氮杂、刺激神经的类 固醇、叔丁二环磷酰
硫酸盐(t-butylbicyclophosphorothionate)/木防 已苦毒素、巴比妥酸盐(或酯)、4’-氯地西泮、抗菌喹诺酮、伊维 菌素、氯瑞唑/甲芬那酸、呋喃苯胺酸以及普鲁泊福(propofol)(E.R. Korpi,G.Grunder,H.Luddens,Progress Neurobiology 67:113-159, 2002)。
本发明的化合物,是用于GRC上独特部位的配体,因而适用 于治疗和/或
预防各种中枢神经系统障碍。这样的障碍包括焦虑性障 碍,如有或没有旷野
恐怖症的恐慌性障碍,无恐慌性障碍史的旷野 恐怖症,动物和其他恐怖症包括社交恐怖症,强迫性神经失调,应 激障碍包括
创伤后应激障碍和急性应激障碍,以及泛化性或药物诱 发性
焦虑症;神经机能病;惊厥;急性和慢性
疼痛;
认知障碍;失 眠症;偏头痛;以及
抑郁症或双相性障碍,例如,单发作或复发严 重的抑郁性障碍、心境恶劣障碍、双相I型和双相II型躁狂症以及 循环性
精神障碍。
本发明的另一个方面在于应用介导了化学式I的化合物的活性 的部位作为GABA促进氯离子电导(其通过GABAA受体复合物介 导)的增强子或
抑制剂。GABA介导的氯离子电导的增强可用于治 疗和预防这样的障碍如焦虑和应激相关障碍、抑郁和其他情感障 碍、癫痫症和其他癫痫发作、失眠症和相关的
睡眠障碍、以及急性 和慢性疼痛。抑制GABA介导的氯离子电导可用于治疗和预防与学 习和记忆有关的障碍如轻度认知缺损、与年龄相关的认知衰退、老 年性痴呆、阿尔茨海默氏病、涉及减弱觉醒的睡眠障碍如发作性睡 病和特发性睡眠过度。
此外,本发明的一个方面是提供一种药物组合物,其可用于治 疗通过GRC介导的对GABA促进的氯离子流动的增强作用起反应 的障碍,该药物组合物在含有一种或多种药用载体或稀释剂的混合 物中含有有效量的化学式I的化合物。
迄今还未报道过在本发明中有用的化合物。因而,本发明的目 的还在于提供具有化学式I结构的新颖的取代喹诺酮。
此外,本发明目的还在于提供用3H、35S、36Cl、125I、131I和14C放射性标记的化学式I的化合物以及将其用作在GRC上用于其结 合部位的放射性配体。
本发明的另外的具体
实施例和优点将部分地在以下描述中进 行陈述,以及部分内容通过该描述将是显而易见的,或部分内容可 以通过实施本发明而知道。通过在所附
权利要求书中特别指出的要 素和组合将可以了解本发明的具体实施例和优点。
应当明了,上面的一般描述和以下的详细描述仅是示例性和说 明性的而不是用来限制本发明的。
附图说明
图1描述了在胚胎大鼠海
马神经元中7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4- 四氢
萘基-1-氨基)-4-
氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(C3,5μM)对GABA (G,10μM)诱导的氯离子电流的增强效应。这些数据表明,C3是 GABA门控型氯离子通道的正效力调节器。
图2描述了在表达的人类GABAA受体(该GABAA受体含有 α1β2γ2与α2β2γ2亚单位)中7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基) -4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(化合物3,CMP3)与地西泮(DZP) 对GABA诱导电流(IGABA)的受体亚单位选择性和剂量依赖的正 效力。
图3描述了在焦虑的小鼠光照-黑暗转换模型中7-氯-1-乙基-6- (1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(化合物3) 和地西泮(DZP)对在黑暗中度过时间的比较。这些数据表明,化 合物3的抗焦虑效应,如由在黑暗中度过时间的增加所示,和DZP 相差不大。
图4描述了7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代 -1,4-二氢喹啉-3-羧酸(CMP3)和地西泮(DZP)对惩罚反应的比 较,其通过测量在焦虑的Vogel模型中利用口渴了24小时的大鼠在 3分钟内舌舔次数所得到。这些数据表明,化合物3的抗焦虑效应, 如由增加的惩罚性舌舔所示,和DZP相差不大。
图5描述了在没有(空心圆)或有3μM(实心圆)和10μM (实心方
块)GABAA受体拮抗物(+)-比枯枯灵碱的情况下7-氯-1- 乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(化 合物3)对结合于大鼠皮质的2nM[35S]TBPS的影响。这些数据表 明:化合物3对GABA的绝对依赖为有效力以及化合物3变构地偶 联于但不直接作用于[35S]TBPS部位。
图6描述了7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代 -1,4-二氢喹啉-3-羧酸(化合物3,实心圆)、氯硝西泮(空心圆)、 以及5α-孕烷-3α-醇-20-酮(3α,5α-P,空心方块)对结合于大鼠皮 质的BZ受体的0.2nM[3H]氟硝西泮的影响。这些数据表明化合物3 变构地偶联于但不直接作用于BZ受体。
图7描述了7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代 -1,4-二氢喹啉-3-羧酸(化合物3,实心圆)和GABA(空心圆)对 结合于大鼠皮质的GABAA受体的5nM[3H]蝇蕈醇的影响。这些数 据表明化合物3并不直接作用于GABAA受体。
图8描述了10μM 7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基) -4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(化合物3,实心圆)或100nM 3α,5α-P (空心方块)对5α-孕烷-3α,20α-二醇(5α,20α-二醇,空心圆)抑 制结合于大鼠皮质的2nM[35S]TBPS的影响。如所预期的,增加 5α,20α-二醇(部分激动剂)的浓度可以拮抗3α,5α-P(全激动剂) 的效应。5α,20α-二醇不能拮抗化合物3的效应,表明化合物3并不 直接作用于GRC的神经类固醇部位。
图9描述了在没有(空心圆)或有30μM诺氟沙星(实心圆) 以及100μM诺氟沙星(实心方块)的情况下7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4- 四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(化合物3)对结合 于大鼠皮质的2nM[35S]TBPS的影响。诺氟沙星不能产生化合物3 剂量-反应曲线的剂量依赖性向右平移,表明化合物3并不直接作用 于和抗菌喹诺酮诺氟沙星相同的部位。
图10描述了2nM[35S]TBPS结合自大鼠皮质的解离,其是在 没有(实心方块)或有(实心三
角形)30μM戊巴比妥的情况下由 10μM 7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢 喹啉-3-羧酸(化合物3)所引发。戊巴比妥
加速结合的[35S]TBPS 解离的能力,其表明化合物3和巴比妥酸盐戊巴比妥并不共有共同 的作用部位。
图11描述了在没有(空心圆)或有0.3μM(实心圆)、1μM (实心方块)、以及30μM Ro5-4864(4’-氯地西泮,实心三角形) 的情况下7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二 氢喹啉-3-羧酸(化合物3)对结合于大鼠皮质的2nM[35S]TBPS的 影响。4’-氯地西泮不能产生化合物3/[35S]TBPS剂量-反应曲线的剂 量依赖性向右平移,表明化合物3并不直接作用于和4’-氯地西泮 相同的部位。
图12描述了2nM[35S]TBPS结合自小鼠前脑的解离,其是在 没有(空心圆)或有(实心方块)10μM伊维菌素的情况下由10μM 7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3- 羧酸(化合物3)所引发。伊维菌素加速结合的[35S]TBPS解离的能 力,其表明化合物3和伊维菌素并不共有共同的作用部位。
图13描述了2nM[35S]TBPS结合自小鼠前脑的解离,其是在 没有(空心圆)或有(实心方块)10μM甲芬那酸的情况下由10μM 7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3- 羧酸(化合物3)所引发。甲芬那酸加速结合的[35S]TBPS解离的能 力,其表明化合物3和甲芬那酸并不共有共同的作用部位。
图14描述了在没有(空心圆)或有30μM呋喃苯胺酸(实心 圆)的情况下7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4- 二氢喹啉-3-羧酸(化合物3)对结合于大鼠小脑的2nM[35S]TBPS 的影响。呋喃苯胺酸不能产生化合物3剂量-反应曲线的剂量依赖性 向右平移,表明化合物3并不直接作用于和
袢利尿剂呋喃苯胺酸在 GRC上的相同部位。
在本发明的这个方面有用的化合物是由化学式I表示的取代的 喹诺酮:
或其药用盐、药物前体或
溶剂化物,其中:
R1是选自由氢、可选取代的烷基、氨基、芳基以及芳烷基组成 的组;
每个R2是选自由氢和可选取代的烷基组成的组;
每个R3是选自由氢、可选取代的烷基、基团OR11和基团 NR12R13组成的组;
R5、R7以及R8是独立地选自由氢、可选取代的烷基以及卤素 组成的组;
R9和R10是独立地选自由氢、可选取代的烷基、芳烷基、环烷 基以及环芳烷基组成的组;或R9和R10与和它们相连的氮
原子一起 形成杂环,但须R9和R10不同时为氢;
R11是选自由氢、碱金属、阴电荷以及可选取代的烷基组成的 组;
R12和R13是独立地选自由氢、可选取代的烷基、芳烷基、芳基、 环烷基以及环芳烷基组成的组;或R12和R13与和它们相连的氮原 子一起形成杂环。
本发明还涉及由化学式II表示的喹诺酮:
或其药用盐、药物前体或
溶剂化物,其中:
R1是选自由氢、可选取代的烷基以及芳烷基组成的组;
每个R2是选自由氢和可选取代的烷基组成的组;
R5、R7以及R8是独立地选自由氢、可选取代的烷基以及卤素 组成的组;
R9和R10是独立地选自由可选取代的烷基、芳烷基、环烷基以 及环芳烷基组成的组;或R9和R10与和它们相连的氮原子一起形成 杂环。
此外,本发明还涉及化学式III的化合物:
或其药用盐、药物前体或溶剂化物,其中:
R1、R2、R5、R7、R8、R9是先前相对于化学式I和II所定义的, 而n是整数0、1、2、3或4。
就用于药物而言,化学式I-III的化合物的盐是药用盐。然而, 其他盐也可以用于制备根据本发明的化合物或其药用盐。本发明的 化合物的适当药用盐包括
酸加成盐,其可以,例如,通过混合根据 本发明的化合物的溶液和药用
酸溶液而形成,如
盐酸、硫酸、甲磺 酸、富马酸、马来酸、丁二酸、乙酸、苯
甲酸、
草酸、
柠檬酸、酒 石酸、或
磷酸。此外,在本发明的化合物含有酸性部分的情况下, 其适当的药用盐可以包括碱金属盐,例如,钠盐或
钾盐;碱土金属 盐,例如,
钙盐或镁盐;以及由适当的有机配体形成的盐,例如, 季铵盐。
本发明在其范围内包括上述化学式I的化合物的药物前体。一 般而言,这类药物前体应该是化学式I的化合物的官能衍生物,其 容易在体内转
化成所需要的化学式I的化合物。选择和制备适当药 物前体衍生物的常规方法描述于,例如,Design of Prodrugs,ed.H. Bundgaard,Elsevier,1985中。
在根据本发明的化合物具有至少一个不对称中心的情况下,它 们可以相应地作为对映异构体存在。在根据本发明的化合物具有两 个或更多不对称中心的情况下,它们还可以作为非对映异构体存 在。应当明了,所有这类异构体和其任何比例的混合物是包括在本
发明的范围内的。
有用的卤素基团包括氟、氯、溴以及碘。
有用的烷基基团包括直链和支链的C1-20烷基基团,更优选为 C5-20烷基基团。典型的C5-20烷基基团包括正戊基、正己基、正 庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十 三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正 十八烷基、正十九烷基以及二十烷基。
有用的芳基基团是C6-14芳基,尤其是C6-10芳基。典型的C6-14 芳基基团包括苯基、萘基、蒽基、茚基以及联苯基。
有用的芳烷基基团包括用任何上述C6-10芳基基团取代的任何 上述的C1-20烷基基团。有用的芳烷基基团包括苄基和苯乙基。
有用的环烷基烷基基团包括用任何上述环烷基基团取代的任 何上述C1-20烷基基团。有用的环烷基烷基基团的实例包括环己基 甲基和环丙基甲基。
有用的卤代甲基基团包括被一个或多个氟、氯、溴或碘原子取 代的C1-20烷基基团,包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基以及1,1- 二氟乙基。
有用的羟烷基基团包括被羟基取代的C1-20烷基基团,包括羟 甲基、1-和2-羟乙基以及1-羟丙基。
有用的烷氧基基团包括氧取代的上述C1-20烷基基团之一。
有用的烷硫基基团包括硫取代的上述C1-20烷基基团之一, 包括癸硫基和十六烷硫基。
有用的烷氨基基团和二烷氨基基团是-NHR9和-NR9R10,其中 R9和R10是C1-20烷基。
有用的二烷氨基烷基基团包括用任何上述二烷氨基基团取代 的任何上述C1-20烷基。
有用的烷硫羟基基团包括用-SH基团取代的任何上述C1-20烷 基。
羧基基团是-COOH。
氨基基团是-NH2。
在本文中,术语杂环是用来指饱和的、或完全不饱和或部分不 饱和的3-7元单环、或7-10元二环系统,其包括
碳原子和独立地选 自O、N以及S的一至四个杂原子,其中氮和硫杂原子可以可选地 被氧化,氮可以可选地被季铵化,并且包括任何二环基团,其中任 何上述定义的杂环被稠合于苯环,并且如果生成的化合物是稳定 的,则其中杂环可以在碳或氮上被取代。实例包括但不限于吡咯烷、 哌啶、哌嗪、吗啉、1,2,3,4-四氢喹啉以及类似物。
在R1至R13上的可选取代基包括上述的任何基团之一:卤基、 卤代(C1-20)烷基、芳基、环烷基、C1-20烷基、芳基(C1-20)烷基、 环烷基(C1-20)烷基、羟基(C1-20)烷基、氨基(C1-20)烷基、烷 氧基(C1-20)烷基、氨基、羟基、硫羟、烷氧基、以及C1-20烷硫羟 基。优选的可选取代基包括:卤基、卤代(C1-6)烷基、氨基(C1-6) 烷基、烷氧基、以及氨基。
化学式I中其中R7=Cl以及R10=H的化合物的合成,可以通 过在1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中将伯胺R9NH2和7-氯-1-乙基-6- 氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸(2,可购自Acros公司,见图解1) 进行反应来完成。
图解1
R9NH2的实例包括取代的苄胺、取代的苯乙胺、3-苯基氨基丙 烷、1-氨基茚满以及1-氨基-1,2,3,4-四氢化萘。
对于在R1不是乙基和环丙基的化学式I的化合物6-氟-7-氯起 始材料(8)的合成,可以如在图解2中从购得的2,4-二氯-5-氟苯 甲酰氯(4,Lancaster合成法)开始进行制备。
图解2
R1NH2的实例包括2-氟乙胺、可选取代的苄胺以及可选取代的 苯乙胺。可以使用如在Atkins等人的Org.Process Res.& Develop. (1997),1,185-197中所述的其他组合喹诺酮环的方法,。
体外结合测定1
[35S]TBPS结合测定。来自雄性Sprague-Dawley大鼠(重量 160-200g)的皮质在实施断头术后立即被除去并在
冰上进行解剖。 如先前所述进行P2匀浆的制备并将其用于结合测定(Gee KW公司 的苯基喹啉PK 8165和PK 9084通过新颖的Ro5 4864部位变构地 调节在大鼠脑中结合于氯离子载体的[35S]叔丁二环磷酰
硫酸盐。J. Pharmacol.Exp.Ther.240:747-753,1987)。在0.32M
蔗糖(J.T.Baker 化学制品公司,Phillipsburg,NJ,USA)中用
覆盖了聚四氟乙烯的研 棒对组织进行匀化,然后在1,000Xg下离心10分钟。收集上清液 并在9,000Xg下离心20分钟。将生成的P2小球再悬浮于冰冷的含 有200mM NaCl(J.T.Baker)的50mM磷酸钠钾(J.T.Baker)缓冲 液(pH7.4)中,并立即用于结合测定。在有或没有5μM GABA (Sigma化学制品公司,St.Louis,MO)的情况下将2nM浓度的 [35S]TBPS(86 Ci/mmol;New England Nuclear公司,Boston,MA, USA)用100μl的组织匀浆(10%w/v)进行温育,然后将试验药 物的5μl等分试样溶解在二甲亚砜(Sigma化学制品公司)(≤10μl 的溶剂用于所有测定)中。在所用的浓度(≤1%)下,二甲亚砜对 特异性[35S]TBPS结合没有影响。用含有200mM NaCl的50mM磷 酸钠钾缓冲液(pH7.4)使所有测定达到1ml的最终体积。非特异 性结合被定义为:在有2μM TBPS(NEN公司,Boston,MA)的情 况下的结合,并且该结合占总结合的约30%。在25℃下稳态温育 90分钟后通过用玻璃
纤维过滤器(no.32;Schleicher & Schuell公司, Keene,N.H.)迅速过滤而终止测定。结合的[35S]TBPS的解离过程 动力学测定如下:通过将饱和浓度的[35S]TBPS结合的已知抑制剂 或试验化合物加入到用2nM[35S]TBPS进行预平衡的组织匀浆中来 引发解离过程,接着在加入已知抑制剂或试验化合物以后的不同时 间点进行过滤。已知抑制剂或试验化合物的变构调节器将改变在这 些条件下的解离速率,而作用于共同部位的制剂对该速率将没有影 响。过滤器结合的(filter-bound)放射性是通过液体闪烁分光光度 法来进行量化的。这些数据用非线性回归进行评估(GraphPad公司, San Diego,CA)以获得IC50(浓度,在该浓度下发生放射性配体的 半最大抑制)值。
体外结合测定2
[3H]氟硝西泮结合:测定是在与[35S]TBPS结合测定相同的条件 下并使用同样的组织标本来进行的,不同之处在于将1μM GABA 而不是5μM GABA加入到所有样品中。用0.2nM[3H]氟硝西泮(75 Ci/mmol,New England Nuclear公司,Boston,MA)来标记BZ部位。 非特异性结合被定义为:在有1μM氯硝西泮的情况下的结合。这 些数据用非线性回归进行评估以获得IC50和EC50值。
体外结合测定3
[3H]蝇蕈醇结合测定:来自雄性Sprague-Dawley大鼠的皮质 (160-200g)在施行安乐死后立即被除去并在冰上进行解剖。在15 vol的0.32M蔗糖中对组织进行匀化,接着在1000Xg下离心10 分钟。上清液被转移到38mL的聚碳酸酯管(Beckman Instruments 公司,Palo Alto CA)中,并在20,000Xg下离心20分钟。膜小球 被再悬浮于10vol的去离子
水(dH2O)中,并在8,000Xg下离心 20分钟。生成的小球用去离子水洗涤一次并用无钠离子的测定缓冲 液(40mM KH2PO4,100mM KCl,pH7.4)进行洗涤。小球被再悬 浮于35mL的无钠离子的测定缓冲液中,在37℃温育30分钟,然 后在31,000Xg下离心20分钟。最终的小球被再悬浮于10vol的无 钠离子的测定缓冲液中。通过BCA
试剂蛋白质测定,膜制剂的蛋 白质浓度为约1mg/mL。膜悬浮液的等分试样(100μL)在无钠离 子的测定缓冲液中温育,该测定缓冲液中含有5nM[3H]蝇蕈醇(25 Ci/mmol,New England Nuclear公司,Boston,MA)以及5μL二甲 亚砜(DMSO)或溶解于DMSO中的药物。温育介质的最终体积为 1mL。非特异性结合被定义为:在有1mM GABA的情况下的结合。 在加入膜以后,聚碳酸酯管被短暂地
涡流并在黑暗中于4℃下进行 温育。在60分钟以后,通过用玻璃纤维过滤器迅速过滤来终止温 育,接着用冰冷的测定缓冲液洗涤三次。在经过一夜提取之后,通 过LSC对过滤器结合的放射性进行量化。这些数据用非线性回归进 行评估以获得IC50和EC50值。
电生理测定1
妊娠的Sprague-Dawgue大鼠,其育有妊娠17天-19天的胚胎, 通过施行颈脱位被处死。这些胚胎在无菌条件下被除去而脑被快速
切除并在室温(18-22℃)下放置于汉克平衡盐溶液(HBSS,Gibco 公司)中。将海马进行解剖并切割成碎片(约2mm3)然后转移到 酶溶液中,该酶溶液中含有(单位:mM):NaCl 116、KCl 5.4、NaHCO3 26、NaH2PO4 1、CaCl2 1.5、MgSO4 1、EDTA 0.5、
葡萄糖25、半 胱氨酸1以及木瓜蛋白酶20U/ml(Sigma公司),接着在37℃、 5%CO2、100%
相对湿度下温育1小时。在含有1mg/ml
牛血清白蛋 白(BSA)和1mg/ml卵类粘蛋白(两者均来自Sigma公司)的HBSS 中洗涤组织碎片。组织被转移到另外的3-4ml的这种溶液中并利用 火琢巴斯德移液管轻轻地
研磨成单细胞悬浮液。该单细胞悬浮液在 5ml含有10mg/ml BSA和10mg/ml卵类粘蛋白的HBSS上分层, 并在100Xg下离心10分钟。除去上清液而细胞再悬浮于3-4ml的 无谷氨酰胺的最低必需培养基(MEM,Gibco公司)中,其补充以 热灭活的胎牛血清(5%v/v Gibco公司)、热灭活的马血清(5%v/v Gibco公司)、
链霉素和青霉素(分别为50μg/ml和5000i.u./ml)、 谷氨酰胺和葡萄糖(最终浓度分别为2mM和20mM[Gibco公司和 BDH公司])。大约1-2×105细胞被平皿培养于每个35mm(Falcon “Primaria”)的组织培养皿中,该组织培养皿中含有约1ml的富集 血清MEM。平皿被保持在37℃、5%CO2以及100%相对湿度下直 到用于电生理研究。在开始解离7天后非神经元成分的本底增殖用 阿糖胞苷(10μM,Sigma公司)抑制48小时。
激动剂诱发的膜电流是利用膜片钳技术的全细胞构型记录自 海马神经元。在-60mV下利用List
电子仪器公司的L/M EPC-7转 换头载物台(converter head stage)和
放大器对神经元应用
电压钳技 术。给细胞灌注外(槽)记录溶液,该溶液含有(单位mM):NaCl140、KCl2.8、MgCl22、CaCl22以及HEPES-NaOH10(pH7.2)。 河豚毒素(TTX,0.3μM)包括在记录溶液中用以抑制突触活性。 外溶液是通过Watson-Marlow液流
泵经非无菌管进行递送(约2 ml/min),该非无菌管连接于塑料
插管(端部直径1mm)。输入插管 是安装在Prior显微操作器上并非常接近(<1mm)于要研究的细胞。 经过19G针从皿中排出槽液,其中针通过柔性管连接于培养槽抽吸 泵。记录
电极装满内溶液,其包括(单位mM):CsCl或KCl140、 MgCl22、CaCl20.1、EGTA1.1(游离的Ca2+约10-8M)、HEPES-NaOH10以及ATP-Mg2+2。记录电极是在Narishige PB7二级玻璃电极拉 管器上由玻璃血细胞容量管(Kimble公司的钠钙管73811)制作的。 电极在端部的100μm内覆盖有“Sylgard”(Dow Corning公司)并 在使用前进行火琢。利用Picospritzer II装置(General Valve公司) 并通过从改进的记录移液管的端部加压排出(1.4Kpa,10-80msec, 0.1-0.033Hz)而将激动剂局部施加于电压钳神经元的体组织。利用 Leitz显微操作器将含有激动剂的移液管定位在细胞的0.1mm内。
显微镜和显微操作器都安装在放置于
法拉第笼内的无振动隔振
风 动
工作台(Wentworth公司)上。激动剂诱发的全细胞电流是用存 储示波器(Tektronix 2212)进行监测与记录的,在数字脉冲编码调 制(
频率响应14kHz,Sony PCM 701)以后,并显示于多迹 (Electromed公司)描笔式图表记录器(频率响应0.5kHz)上。除 了激动剂,所有药物都通过
过冷液灌注(superfusion)系统施加于 细胞。激动剂诱发的全细胞电流是在其峰值处进行测量。在有药物 的情况下的响应表示为:算术平均值±没有(对照)药物的情况下 响应的标准平均误差(SEM)。
电生理测定2
利用Dulbecco的改良Eagle培养基,GABAA亚单位
转染的HEK 细胞被保持在37℃和5%CO2下,其中该培养基含有L-谷氨酰胺但 没有丙
酮酸钠(Irvine Scienticif#9031,Irvine CA)并且补充以10% 胎牛血清(Irvine Scienticif#3000),10U/ml潮霉素B(Calbiochem #400051),以及包括100μg/ml硫酸链霉素、0.25μg/ml两性霉素B、 100单位/ml青霉素G的抗生素混合剂(Gibco 15240-096, Gaithersburg MD)。用磷酸缓冲盐水(PBS)pH7.4对细胞洗涤两次 并当融合达到约90%时利用在PBS中的1X胰蛋白酶/EDTA溶液 (0.5mg/ml胰蛋白酶,0.2mg/ml EDTA,Irvine Scienticif#9342)对 细月包进行抬高。
在
载玻片上,GABAA亚单位转染的HEK细胞生长到约70%融 合。细胞被转移到连续灌注以胞外盐水的槽中。细胞外培养基含有 145mM NaCl、3mM KCl、1.5mM CaCl2、1mM MgCl2、5.5mM d- 葡萄糖以及10mM HEPES,pH7.4,重量渗摩尔浓度为 320-330mosM。在室温下利用全细胞膜片钳技术进行记录。膜片移 液管溶液(patch pipette solution)含有147mM N-甲基-D-葡糖胺盐 酸盐、5mM CsCl、5mM K2ATP、5mM HEPES、1mM MgCl2、0.1 mM CaCl2以及1.1mM EGTA,pH7.2,重量渗摩尔浓度为315 mosM。移液管至槽的
电阻通常为3-5Mohms。在-60mV对细胞应 用电压钳技术,而氯离子平衡电位约为0mV。药物溶解于细胞外 培养基中并通过局部灌注迅速施加于细胞。
电动机驱动的多通道开 关系统在大约20ms内调换溶液。
体内药理学
Vogel冲突
成年雄性大鼠被随机分成每组6只大鼠。动物被阻止饮水过夜 (24小时)。在口渴时可以自由获得食物。在注射(i.p.)试验药物 30分钟后,阳性对照药物(地西泮,1mg/kg)、或载体对照大鼠被 放置在方形Plexiglas盒中,其包括连接于液耗仪
电路一侧的不锈
钢 底部。在液耗仪电路的另一侧连接水瓶,如此放置以便饮水管延伸 到Plexiglas盒中。当受验者自瓶中饮水时,电路断开,并在记录7 次舌舔后在管中给予电击。记录在3分钟时间内舌舔的次数。抗焦 虑药将增加动物为获得水而愿意忍受电击的次数。
光照-黑暗转换
使用雄性NSA小鼠(25-30g)。装置包括顶部开口的盒,其通 过底层有孔的隔板分成较小和较大的区域。较小的隔间漆成黑色而 较大的隔间漆成白色。白色隔间用灯光进行照明而黑色隔间用红光 照明。在5分钟试验期间记录在明亮与黑暗隔间度过的时间和在两 隔间之间转移的次数。载体或试验化合物是在试验前30分钟给予。 给予(i.p.)地西泮(2mg/kg)作为阳性对照。抗焦虑药将减少动物 愿意在黑暗隔间度过的时间并增加在两隔间之间转移的次数。
载体
除给予作为天然化学药品的化合物以外,本发明的化合物可以 作为药物制剂的一部分给予,该药物制剂含有包括赋形剂和助剂的 适当的药用载体,其促进化合物进入制剂的过程,其可以药用。优 选地,这些制剂,特别是那些可以口服和可以用于优选
给药类型的 制剂,如片剂、糖衣丸、以及胶囊剂,还有可以直肠给药的制剂, 如栓剂,以及通过注射或口服给药的适当溶液,其与赋形剂一起, 含有约0.01%至99%、优选约0.25%至75%的活性化合物。
适当的赋形剂,尤其是填充剂如糖类,例如乳糖或蔗糖、甘露 醇或山梨醇,
纤维素制剂和/或磷酸钙,例如磷酸三钙或磷酸氢钙, 以及
粘合剂如
淀粉糊,使
用例如,玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、 马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧 甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要的话,可以加入崩解 剂,如上述淀粉以及羧甲基淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海 藻酸或其盐,如海藻酸钠。助剂,最主要的是流动调节剂和
润滑剂, 例如,
硅石、滑石粉、
硬脂酸或其盐,如硬脂酸镁或硬脂酸钙和/ 或聚乙二醇。给糖衣丸核提供适当的包衣,如果需要的话,其可以 耐胃液。为此目的,可以使用浓缩的糖类溶液,其可以可选地含有 阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化
钛、 漆用(lacquer)溶液和适当的
有机溶剂或溶剂混合物。为了产生耐 胃液的包衣,可以使用适当的纤维素制剂溶液,如邻苯二甲酸乙酰 纤维素酯或邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素酯。染料或颜料可以加入 片剂或糖衣丸包衣中,例如,用于识别或为了表征活性化合物剂量 的组合。
其他可以口服的药物制剂包括由明胶制成的推入配合胶囊剂、 以及由明胶和
增塑剂如甘油或山梨醇制成的软质
密封胶囊剂。推入 配合胶囊剂可以含有颗粒形式的活性化合物,其可以与填充剂如乳 糖、粘合剂如淀粉、和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁、以及可选地, 与稳定剂进行混合。在软质胶囊剂中,活性化合物优选溶解或悬浮 在适当的液体中,如脂肪油、或液体
石蜡中。此外,还可以加入稳 定剂。
可以直肠使用的可能的药物制剂包括,例如栓剂,其包括一种 或多种活性化合物与栓剂基质的组合。适当的栓剂基质为,例如, 天然或合成的甘油三酯、或链烷
烃。此外,也可以使用明胶直肠胶 囊剂,其包括活性化合物与基质的组合。可能的基质材料包括,例 如,液体甘油三酯、聚乙二醇、或链烷烃。
用于胃肠外给药的适当剂型包括水溶形式的活性化合物的水 溶液,例如,
水溶性盐溶液和水溶性碱性溶液。此外,可以给予活 性化合物的悬浮液,其是作为合适的油状注射悬浮液。适当的亲脂 溶剂或载体包括脂肪油,例如,麻油,或合成
脂肪酸酯,例如,油 酸乙酯或甘油三酯或聚乙二醇-400(这些化合物可溶于PEG-400)。 含水注射悬浮液可以含有一些物质,其增加悬浮液的
粘度,并且包 括,例如,
羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或右旋糖酐。可选地,悬浮 液也可以含有稳定剂。
实施例1
7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹 啉-3-羧酸
通过
注射器在7-氯-1-乙基-6-氟-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸 (Acros公司;6.02g,22.3mmol)的30mL 1-甲基-2-吡咯烷酮悬浮 液中逐滴地加入纯1,2,3,4-四氢-1-氨基萘(20mL,20.5g,140mmol)。 将生成的淡黄色混合物放置在140℃的油浴中17小时。一旦冷却到 室温后,在反应产物中加入120mL的2N HCl水溶液和冰。通过过 滤分离形成的固体,用2N HCl水溶液(120mL)、水(2×100mL)、 甲醇(3×50mL)和乙酸乙酯(50mL)进行洗涤。剩余的固体然后 从MeOH(1400mL)中再结晶。将形成的黄色针状结晶分离并用 甲醇(2×50mL)洗涤。然后将该固体进行闪蒸柱层析。将固体溶 于35mL 4%MeOH/CH2Cl2中,将该溶液加入到在直径为5cm的柱 中的16cm硅石中。用1L 7.5%和500mL 10%的MeOH/CH2Cl2进 行洗脱,得到968mg(11%)的标题化合物,其为黄色固体,熔点 (mp)为246-247℃。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ15.14(s,1 H),8.66(s,1H),7.80(s,1H),7.63(s,1H),7.32(d,1H,J=7.7Hz), 7.26-7.16(m,3H),4.90(s,2H),4.33(q,2H,J=7.2Hz),2.92-2.80 (m,2H),2.12-2.00(m,2H),1.92-1.86(m,2H),1.60(t,3H, J=7.2Hz)。MS(M+Na)+419。对于C22H21ClN2O3+0.25HCl的分析计 算为:C,65.08;H,5.28;Cl,10.92;N,6.90。实际测定为:C,65.09;H, 5.33;Cl,10.85;N,6.81。
利用上述方法制备了下述化合物:
(R)-7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4- 二氢喹啉-3-羧酸;
(S)-7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4- 二氢喹啉-3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(6-甲氧基-1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4- 二氢喹啉-3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(1-氨基茚满基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(5-甲基-1-氨基茚满基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3- 羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(2-氨基茚满基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(苄氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(2-苯乙基氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸。 反应如在实施例1中所进行,只是未处理的反应混合物用EtOAc进行稀释,得到所需要的化合物,其为白色固体。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ15.15(brs,1H),8.64(s,1H),7.63(s,1H),7.58 (s,1H),7.37-7.33(m,2H),7.29-7.24(m,3H),4.68(t,1H,J=5.4Hz), 4.31(q,2H,J=7.3Hz),3.59(q,2H,J=6.4Hz),3.03(t,2H,J=6.9Hz), 1.58(t,3H,J=7.3Hz);
7-氯-1-甲基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹 啉-3-羧酸;1H NMR(400MHz,CDCl3)δ15.10(s,1H),8.62(s, 1H),7.77(s,1H),7.62(s,1H),7.33(d,1H,J=7.0Hz),7.25-7.17 (m,3H),4.91(brs,2H),3.99(s,3H),2.86(m,2H),2.11-2.01 (m,2H),1.91-1.87(m,2H);
7-氯-1-乙基-6-[4-甲氧基(苯乙氨基)]-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3- 羧酸;
7-氯-1-环丙基-6-[4-甲氧基(苯乙氨基)]-4-氧代-1,4-二氢喹啉 -3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-[3-甲氧基(苯乙氨基)]-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3- 羧酸;
7-氯-1-乙基-6-[2-甲氧基(苯乙氨基)]-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3- 羧酸;
7-氯-1-乙基-6-[4-溴(苯乙氨基)]-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-[4-氯(苯乙氨基)]-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-[4-氟(苯乙氨基)]-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(3-苯基丙氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(4-苯基丁氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(4-苯基丁基-2-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3- 羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(2-苯基环丙氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(2-苯基环丙氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(1-萘基乙基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3- 羧酸;
7-氯-1-乙基-6-(1-萘基甲氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸; 以及
7-氯-1-乙基-6-(2-苯氧基乙氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸。
实施例2
7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹 啉-3-(正丙基)羧酸酰胺
在-10℃下在7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代 -1,4-二氢喹啉-3-羧酸(37mg,0.093mmol)的5mL CHCl3溶液中加 入纯三乙胺(Et3N)(30μL,22mg,0.22mmol)和氯甲酸苄酯(17μL, 20mg,0.117mmol)。在搅拌冷却45分钟后,在-20℃下通过注射器 在反应液中加入纯丙胺(10μL,7.2mg,0.122mmol)。然后使反应液 经过2小时升温至室温并加入10%K2CO3水溶液和CHCl3各7mL。 分离有机层并用水(2×10mL)洗涤,用Na2SO4干燥,过滤并浓缩 至干燥。残余物溶解于CH2Cl2并加入到在直径为2cm柱中的10cm 闪蒸硅胶中。用100%CH2Cl2(100mL)和2.5%MeOH/CH2Cl2 (200mL)进行洗脱,得到37mg(91%)的标题化合物,其为黄色 固体。
利用在实施例2中提供的一般方法制备了下述化合物:
7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹 啉-3-(2-苯乙基)羧酸酰胺;
7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹 啉-3-(2-二甲基氨乙基)羧酸酰胺;以及
7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹 啉-3-(吡啶基甲氨基)羧酸酰胺。
实施例3
7-氯-1-(2-苯乙基)-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4- 二氢喹啉-3-羧酸
a.2-(2,4-二氯-5-氟苯甲酰基)-3-(二甲氨基)
丙烯酸乙酯。 在室温下搅拌3,3-二甲氨基丙烯酸乙酯(3.10g,21.6mmol)和N,N- 二异丙基乙胺(8.0mL,5.94g,45.9mmol)的混合物,并通过另外的 漏斗经20分钟逐滴地加入2,4-二氯-5-苯甲酰氯(4.92g,21.6mmol) 溶液。将形成的黄色混浊液放置在85-90℃的油浴中。经过3小时 后,过滤形成的混合物并用苯洗涤固体。将黑色滤液浓缩并用己烷 (50mL)研磨残余物。收集不溶解的固体并用己烷(20mL)洗涤。 生成的固体在水和乙酸乙酯(EtOAc)之间进行分配。乙酸乙酯层 用水(3×25mL)、盐水洗涤,用Na2SO4干燥,过滤并浓缩得到5.0g (69%)的所需要的化合物。
b.2-(2,4-二氯-5-氟苯甲酰基)-3-(2-苯乙基氨基)丙烯酸乙 酯。将2-(2,4-二氯-5-氟苯甲酰基)-3-(二甲氨基)丙烯酸乙酯(1.014g, 3.03mmol)在10mL
乙醇(EtOH)中的悬浮液用通过注射器逐滴加 入的纯苯乙胺(0.4mL,386mg,3.19mmol)进行处理。在室温下搅 拌75分钟以后,过滤形成的混合物并用EtOH洗涤固体,得到620mg (50%)的丙烯酸酯,其为白色固体。
c.7-氯-6-氟-1-(2-苯乙基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸乙酯。 在2-(2,4-二氯-5-氟苯甲酰基)-3-(2-苯乙基氨基)丙烯酸乙酯 (656mg,1.60mmol)的DMF(1.5mL)溶液中加入固体K2CO3 (227mg,1.64mmol)。将生成的混合物放置在130℃的油浴中16小 时。一旦冷却到室温后,在反应物中加入水。形成的胶质固体在水 和乙酸乙酯之间进行分配。水层用乙酸乙酯(2×10mL)进行萃取。 合并的有机层用水(2×15mL)、盐水洗涤,并用Na2SO4干燥。抽
真空除去溶剂,得到572mg(96%)所需要的喹诺酮。
d.7-氯-6-氟-1-(2-苯乙基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸。将在 5.7mL 6N HCl中的7-氯-6-氟-1-(2-苯乙基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉-3- 羧酸乙酯(516mg,1.38mmol)水溶液放置在113℃的油浴中3小时 40分钟。一旦冷却到室温后,过滤混合物并用水(2×10mL)洗涤, 得到466mg(98%)的酸,其为固体。
e.7-氯-1-(2-苯乙基)-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4- 二氢喹啉-3-羧酸。利用在实施例1中所述的方法,分离标题化合物, 其产率为6%。
利用实施例3中的方法,制备了以下化合物:
7-氯-1-(苄基)-6-(4-苯基丁基-2-氨基)-4-氧代-1,4-二氢喹啉 -3-羧酸。
实施例4
通过7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基)-4-氧代-1,4-二 氢喹啉-3-羧酸调节大鼠皮质中的[35S]TBPS结合
根据前述方法测定了7-氯-1-乙基-6-(1,2,3,4-四氢萘基-1-氨基) -4-氧代-1,4-二氢喹啉-3-羧酸抑制[35S]TBPS结合的能力。对于表1 和表2中的以下化合物也测定了其抑制或增强[35S]TBPS结合于大 鼠皮质的能力。
表1:通过6-取代的喹诺酮抑制或增强[35S]TBPS结合
在10μM下,在大鼠 皮质中2nM TBPS的抑 制或{增强}%
表2:通过喹诺酮酰胺和酯抑制[35S]TBPS结合于大鼠皮质
在10μM下,在大鼠 皮质中2nM TBPS的抑 制或{增强}%
相关
申请本申请要求2002年5月14日提交的美国临时申请第 60/380,641号的优先权。